SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORFISM GEN AGTR1

rs5186 PADA MASYARAKAT DI WILAYAH CIPUTAT

TIMUR DENGAN METODE REAL TIME PCR

“Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar SARJANA KEDOKTERAN”

OLEH:

Ariyona Insani

NIM 11161030000034

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1440 H/2019 M

ii

iii

iv

v

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuh Puji dan syukur saya

panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya

sehingga saya dapat menyelesaikan penelitian ini. Shalawat dan salam semoga

tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW. Penelitian ini memiliki judul SINGLE

NUCLEOTIDE POLYMORPHISM GEN AGTR1 rs5186 PADA

MASYARAKAT DI WILAYAH CIPUTAT TIMUR DENGAN METODE

REAL TIME PCR. Saat mengerjakan penelitian ini peneliti mendapatkan banyak

bantuan dari beberapa pihak. Oleh karena itu peneliti ingin mengucapkan terima

kasih kepada:

1. dr. Hari Hendarto, Sp.PD-KEMD, Ph.D, FINASIM selaku Dekan FK UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta

2. dr. Achmad Zaki, M.Epid, SpOT selaku Kaprodi Kedokteran FK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta

3. Seluruh staf pengajar yang telah memberikan banyak ilmu selama saya

menempuh pendidikan di Program Studi Kedokteran FK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Pak Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD dan dr. Siti Nur Aisyah Jauharoh,

Ph.D selaku pembimbing pertama dan kedua yang selalu membimbing,

memotifasi dan menyediakan waktunya untuk berdiskusi mengenai penelitian

ini.

5. drg. Laifa Annisa Hendarmin, Ph.D selaku Penanggung Jawab Modul Riset

Program Studi Pendidikan Kedokteran 2016.

6. Dr. Zeti Harriyati, S.Si, M.Biomed dan drg. Laifa Annisa Hendarmin, Ph.D

selaku penguji pertama dan kedua saya.

7. Kedua orang tua saya Sunaryoko dan Ariana Machyuni yang selalu

membimbing, manasihati, memotivasi dan memberikan dukungan penuh

selama hidup saya.

8. Kedua adik laki-laki saya Yoga Ary Leksono dan Yosa Satrio Ary yang selalu

membantu saya.

vi

9. Pak Chris Adhiyanto, M.Biomed, Ph.D selaku PJ Laboratorium Riset dan Dr.

Zeti Harriyati, S.Si, M.Biomed selaku PJ Laboratorium Biologi yang telah

memberikan izin untuk penggunaan laboratorium selama penelitian.

10. Laboran dan OB di laboratorium lantai 2, Mba Isur dan Pak Apung yang sudah

banyak membantu selama proses penelitian.

11. dr. Yosa Rini dan dr. Sarry Anisah sebagai dokter di Puskesmas Pisangan yang

telah membatu saya selama pengumpulan sampel.

12. Teman seperjuangan dalam penelitian ini yaitu Afifah Raisa Halim dan Chindy

Maylawati Putri yang telah berjuang bersama melewati suka dan duka.

13. Teman dekat saya Afifah Raisa Halim, Sintia Nuri Puspasari, Ayu Namirah

Filayeti, Sarah Hanifah, Putri Nur Baeti dan sejawat PACEMAKER FK UIN

2016 yang telah membatu saya selama menempuh pendidikan di FK UIN

Jakarta.

14. Sahabat saya Katherine Maulidina dan Aliffa Rizky Dessisyenumi yang telah

memberikan support kepada saya selama ini.

15. Seluruh responden penelitian, yaitu mahasiswa FK UIN angkatan 2016-2018

dan pasien di Puskesmas Ciputat Timur yang telah bersedia memberikan

salivanya untuk penelitian ini.

16. Serta semua pihak yang telah membantu saya yang tidak dapat saya sebutkan

seluruhnya pada penelitian ini.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan laporan ini masih banyak

ditemukan kesalahan. Kritik dan saran yang membangun dari semua pihak akan

sangat membantu untuk memperbaiki kesalahan tersebut. Diharapkan penelitian ini

akan memberikan manfaat bagi semua pihak yang memerlukan. Akhir kata, semoga

Allah SWT memberikan balasan serta rahmat dan ridhonya bagi kita semua.

Wassalamualaikum Wr. Wb.

Ciputat, 29 November 2019

Ariyona Insani

vii

ABSTRAK

Ariyona Insani. Program Studi Kedokteran. Single Nucleotide Polymorfism

Gen AGTR1 rs5186 pada Masyarakat di Wilayah Ciputat Timur dengan

Metode Real Time PCR. 2019.

Sistem Renin Angiotensin Aldosteron (RAA) merupakan komponen protein yang

meregulasi tekanan darah. Salah satu variasi genetik dari Sistem RAA adalah

rs5186, merupakan bagian dari gen AGTR1 atau pengkode reseptor angiotensin II

tipe I yang berkaitan dengan hipertensi esensial pada populasi Asia. Penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui gambaran polimorfisme rs5186 dengan kejadian

hipertensi esensial di wilayah Ciputat Timur. Penelitian ini merupakan penelitian

deskriptif dengan desain cross sectional dan metode purposive sampling.

Responden penelitian berjumlah 120 orang, terdiri dari 60 orang normotensi dan 60

orang dengan hipertensi. Saliva dari kedua kelompok responden dilakukan isolasi

DNA & diidentifikasi menggunakan RT PCR. Penelitian ini menunjukkan bahwa

gambaran polimorfisme rs5186 pada kelompok normotensi adalah 65% genotip

mutan, 27% heterozigot dan wild type sejumlah 8%. Sedangkan, persebaran pada

kelompok hipertensi adalah 52% genotip mutan, 33% heterozigot, dan 15% wild

type. Gambaran polimorfisme rs5186 ditemukan genotip CC (mutan) lebih tinggi

dibanding AC (heterozigot) dan AA (wild type) pada masyarakat Ciputat Timur.

Kata kunci: rs5186, AGTR1, Hipertensi Esensial, RT-PCR.

viii

ABSTRACT

Ariyona Insani. Medical Study Program. Single Nucleotide Polymorfism of

Gen AGTR1 rs5186 in Ciputat Timur Population using Real Time PCR. 2019.

Renin Angiotensin aldosterone System (RAA) is a protein component that regulates

the blood pressure. One of the genetic variation in the RAA system is rs5186 that

was a part of the AGTR1 gene that encodes type I angiotensin II receptor which

relates to essential hypertension in Asian populations. This research aims to

determine the distribution of rs5186 polymorphism with the incidence of essential

hypertension at Ciputat Timur region. This is a descriptive research with cross

sectional design and purposive sampling methods. The number of respondents were

120 people, consisting of 60 normotensions and 60 hypertension patients. Saliva of

both groups respondent were processed with DNA isolation & identified using RT

PCR. This study showed that the distribution of rs5186 polymorphism on

normotension consist of 65% mutant genotype, 27% were heterozygous and 8%

were wild type. Meanwhile, the distribution in hypertension patients were 52% of

mutant genotype, 33% of heterozygous, and 15% of wild type. The depiction of

rs5186 polymorphism showed that the genotype of CC (mutants) were higher

compared to AC (heterozygous) and AA (wild type) at Ciputat Timur area.

Keywords: rs5186, AGTR1, Essential Hypertension, RT PCR.

ix

DAFTAR ISI

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA. ............................................ ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii

PENGESAHAN PANITIA UJIAN ..................................................................... iv

KATA PENGANGTAR ......................................................................................... v

ABSTRAK ........................................................................................................... vii

ABSTRACT ........................................................................................................ viii

DAFTAR ISI ......................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL. .............................................................................................. xii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiv

DAFTAR SINGKATAN ...................................................................................... xv

BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1

1.1.Latar Belakang ............................................................................................... 1

1.2.Rumusan Masalah .......................................................................................... 2

1.3.Tujuan Penelitian .......................................................................................... 2

1.4.Manfaat Penelitian ........................................................................................ 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 4

2.1.Landasan Teori... ........................................................................................... 4

2.1.1. Hipertensi ............................................................................................ 4

2.1.1.1. Definisi Hipertensi ………………………………………………...4

2.1.1.2. Klasifikasi Hipertensi…………………………………………….. 4

2.1.1.3. Epidemiologi Hipertensi.…………………………………………..6

2.1.1.4. Etiologi Hipertensi…………..…………………………………….8

2.1.1.5. Patogenesis dan Patofisiologis Hipertensi…………………………8

2.1.1.6. Manifestasi Klinis Hipertensi…………………………………….14

2.1.1.7. Faktor Risiko Hipertensi………………………………………….14

2.1.1.8. Diagnosis Hipertensi……………………………………………..14

x

2.1.1.9. Komplikasi Hipertensi……………………………………………15

2.1.1.10. Prognosis Hipertensi…………………………………………….15

2.1.1.11. Tata Laksana Hipertensi………………………………………...15

2.1.2. Single Nucleotide Polimorfisme Terhadap Hipertensi ........................ 18

2.1.1.1. DNA……………………………………………………………...18

2.1.1.2. Mutasi Gen……………………………………………………….19

2.1.1.3. rs5186……………………………………………………………22

2.1.3. Identifikasi DNA .............................................................................. 25

2.1.1.1. PCR………………………………………………………………25

2.1.1.2. Sekuensing DNA ………………………………………………...27

2.1.1.3. Enzim Restriksi…………………………………………………..28

2.2.Kerangka Teori ............................................................................................ 29

2.3.Kerangka Konsep ........................................................................................ 30

2.4.Definisi Operasional .................................................................................... 31

BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 32

3.1. Desain Penelitian ....................................................................................... 32

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................... 32

3.3. Sampel Penelitian ...................................................................................... 32

3.4. Besar Sampel .............................................................................................. 32

3.5. Teknik Pengambilan Sampel ...................................................................... 33

3.5.1. Kriteria Inklusi .................................................................................. 33

3.5.2. Kriteria Ekslusi ................................................................................. 33

3.6. Alur Penelitian ........................................................................................... 34

3.7. Prosedur Penelitian ..................................................................................... 35

3.8. Cara Kerja Penelitian .................................................................................. 35

3.8.1. Pengumpulan Data ............................................................................ 35

3.8.2. Isolasi DNA ...................................................................................... 36

3.8.3. Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA .................................. 37

3.8.4. Real Time PCR (RT PCR) ................................................................ 38

3.8.5. Analisis Data .................................................................................... 42

xi

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 43

4.1. Hasil ........................................................................................................... 43

4.1.1. Karakteristik Responden Berdasarkan Jenis Kelamin ......................... 43

4.1.2. Karakteristik Responden Berdasarkan Usia ....................................... 43

4.1.3. Karakteristik Responden Berdasarkan Tekanan Darah ...................... 44

4.1.4. Karakteristik Responden Berdasarkan Genotip .................................. 45

4.1.5. Frekuensi alel rs5186 ........................................................................ 45

4.2. Pembahasan ............................................................................................... 46

4.3. Keterbatasan Penelitian .............................................................................. 49

BAB V SIMPULAN DAN SARAN ..................................................................... 50

5.1. Simpulan ..................................................................................................... 50

5.2. Saran ........................................................................................................... 50

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 51

LAMPIRAN .......................................................................................................... 56

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Klasifikasi Hipertensi Menurut JNC VIII ............................................ 4

Tabel 2.2 Klasifikasi Hipertensi Menurut WHO .................................................. 5

Tabel 2.3 Klasifikasi Hipertensi Menurut Perhimpunan Dokter Spesialis

Kardiovaskular Indonesia .................................................................... 5

Tabel 3.1 Komponen Campuran SNP untuk DNA Assay .................................. 38

Tabel 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Total Responden .................................... 43

Tabel 4.2 Karakteristik Responden Berdasarkan Usia ....................................... 44

Tabel 4.3 Karakteristik Responden Berdasarkan Tekanan Darah ....................... 44

Tabel 4.4 Karakteristik Sampel Berdasarkan Genotip ........................................ 45

Tabel 4.5 Distribusi Alel ................................................................................... 45

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Prevalensi Hipertensi Berdasarkan Hasil Pengukuran pada Penduduk

Umur > 18 Tahun Menurut Provinsi Tahun 2007, 2013, dan 2018 .... 6

Gambar 2.2 Prevalensi Hipertensi Berdasarkan Diagnosis Dokter pada Penduduk

Umur > 18 Tahun Menurut Provinsi, 2018 ....................................... 7

Gambar 2.3 Prevalensi Hipertensi (Diagnosis dokter) Menurut Kelompok Umur,

Gender, dan Tempat Tinggal pada 2018 ........................................... 7

Gambar 2.4 Faktor yang Memengaruhi Rerata Tekanan Arteri ............................ 9

Gambar 2.5 Pengaruh Persarafan Simpatis dan Parasimpatis Terhadap Rerata

Tekanan Arteri ............................................................................... 10

Gambar 2.6 Mekanisme Kompensasi Tubuh terhadap Perubahan Tekanan

Darah ............................................................................................. 13

Gambar 2.7 Tahapan Terapi untuk Hipertensi .................................................... 17

Gambar 2.8 Contoh Mutasi ............................................................................... 21

Gambar 2.9 Komponen Halotype ...................................................................... 22

Gambar 3.1 Langkah Isolasi Genom dengan Air Liur ........................................ 37

Gambar 3.2 Penyusun Utama dari The LightCycler® 480 Instrumen ................ 39

Gambar 3.3 Representasi Proses Endpoint Genotyping dengan

Pewarna Berbeda ........................................................................... 40

Gambar 3.4 Screen Genotyping Analysis ........................................................... 41

Gambar 3.5 Hasil Endpoint Genotyping pada LightCycler 480® Software ........ 42

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

LAMPIRAN 1 Susunan Basa Nitrogen gen AGTR1 pada Manusia .................... 56

LAMPIRAN 2 Karakteristik Responden Hipertensi ........................................... 69

LAMPIRAN 3 Karakteristik Responden Normotensi ......................................... 71

LAMPIRAN 4 Karakteristik Sampel Hipertensi ................................................. 73

LAMPIRAN 5 Karakteristik Sampel Normotensi............................................... 75

LAMPIRAN 6 Alat dan Bahan .......................................................................... 77

LAMPIRAN 7 Surat Persetujuan Etik ................................................................ 80

LAMPIRAN 8 Informed Consent ...................................................................... 81

LAMPIRAN 9 Questioner ................................................................................. 82

xv

DAFTAR SINGKATAN

SNP Single Nucleotde Polymorphism

AGTR1 Angiotensin II type 1 Receptor

AT1R Angiotensin II type 1 Receptor

AT2R Angiotensin II type 2 Receptor

RT PCR Real Time Polymerase Chain Reaction

JNC Joint National Committee

WHO World Health Organization

NO Nitrit Oksida

ACE Angiotensin Converting Enzyme

ENAC Amiloride-sensitive Epithelial Sodium

Channels

LDL Low Density Lipoprotein

HDL High Density Lipoprotein

TSH Thyroid Stimulating Hormone

PTH Parathyroid Hormone

DNA Deoxyribonucleic Acid

RNA Ribonucleic Acid

mRNA Messenger Ribonucleic Acid

GWAS genome wide assotiation study

RAAS Renin Angiotensin Aldosterone System

AGT Angiotensin

ADD1 Alpha Adducin

UTR Untranslated region

GPCR G protein-coupled receptor

dNTP Deoksiribonukleosidatrifosfat

ATP Adenosine Triphosphate

RFLP Restriction Fragment Length

Polymorphism

GFR Glomeration Filtration Rate

xvi

qPCR Quantitative Polymerase Chain

Reaction

MDR Multifactor Dimensionality Reduction

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Hipertensi atau tekanan darah tinggi adalah peningkatan tekanan darah

sistolik melebihi 140 mmHg dan tekanan darah diastolik melebihi 90 mmHg

ditemukan dalam dua kali pengukuran dengan jeda lima menit dalam keadaan

cukup istirahat/tenang.1 Kejadian hipertensi dari tahun ke tahun terus

meningkat. Prevalensi hipertensi di Indonesia berdasarkan RISKESDAS pada

tahun 2018 adalah sebesar 34,1% dan apabila dilihat prevalensinya

berdasarkan usia khususnya usia lebih dari 18 tahun, prevalensi paling tinggi

terdapat di Kalimantan Selatan (44,1%) selanjutnya di Jawa Barat lalu diikuti

oleh daerah Kalimantan Timur.2

Penyakit ini merupakan tantangan bagi dunia kesehatan baik di Indonesia

maupun di dunia karena hipertensi sering muncul tanpa disertai gejala

(asimptomatik) sehingga, para penderita tidak menyadari bahwa mereka sudah

menderita hipertensi. Pasien baru akan menyadari apabila mereka menderita

komplikasi pada organ jantung (hipertrofi ventrikel kiri, infark miokard, gagal

jantung), otak (stroke), penyakit ginjal kronis, penyakit arteri perifer, dan

retinopati.1

Hipertensi dapat disebabkan karena faktor internal dan faktor eksternal.

Faktor internal yang memengaruhi adalah gen pembawa dan faktor eksternal

dapat bersumber dari pola hidup yaitu kegiatan fisik dan makanan yang

dikonsumsi. Berdasarkan faktor penyebabnya maka hipertensi dibagi menjadi

hipertensi primer (95%) tidak diketahui penyebabnya (pengaruh genetik) dan

hipertensi sekunder merupakan penyakit multifaktoral (5%).3

Polimorfisme pada susunan genetik dapat memengaruhi prevalensi

hipertensi karena gen tersebut berperan dalam mengode susunan alel tertentu

yang berperan dalam hipertensi. Sudah banyak penelitian dilakukan untuk

membuktikan hubungan antara gen tertentu dengan hipertensi, salah satu

genom yang berperan adalah rs5186.4,5

2

Single Nucleotide Polymorphism ini merupakan bagian dari gen AGTR1

berperan dalam memediasi fungsi kardiovaskular dari angiotensin II. Beberapa

fungsinya yaitu mengakibatkan vasokonstriksi, meningkatkan tekanan darah,

dan memengaruhi kontraktilitas miokardium. Fungsi rs5186 tersebut berperan

dalam meregulasi tekanan darah.6

Menurut meta-analisis yang dilakukan oleh Dong-Xing Liu et al

menyatakan bahwa terdapat hubungan antara rs5186 dengan kejadian

hipertensi pada populasi Asian dan Kaukasian.4 Sudhir et al menemukan

bahwa rs5186 terdapat di dalam gen AGTR1(Angiotensin II Type 1 Receptor)

dan memiliki nama lain AT1R dan AT2R1 berkaitan dengan hipertensi di

populasi India.5 Sebaliknya, menurut Yu-Ling Yang et al rs5186 di populasi

Cina tidak berkaitan dengan hipertensi.7 Adanya perbedaan hasil penelitian

sebelumnya dan belum adanya penelitian tentang gambaran persebaran rs5186

di Indonesia mendorong peneliti untuk mengeksplorasi hal tersebut.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah yang telah disebutkan diatas, peneliti

dapat merumuskan pertanyaan penelitian, bagaimana gambaran Single

Nucleotide Polymorphism gen AGTR1 rs5186 pada masyarakat di Ciputat

Timur menggunakan teknik Real Time PCR?

1.3. Tujuan Penelitian

Mengetahui gambaran Single Nucleotide Polymorphism gen AGTR1

rs5186 pada masyarakat di Ciputat Timur menggunakan teknik Real Time

PCR.

3

1.4. Manfaan Penelitian

1.4.1. Bagi institusi

Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai referensi dalam perpustakaan

Fakultas Kedokteran Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

1.4.2. Bagi peneliti

Menambah ilmu pengetahuannya tentang Single Nucleotide Polymorphism

rs5186

1.4.3. Bagi masyarakat

Sebagai salah satu bahan acuan khususnya dalam faktor genetik sebagai

faktor risiko untuk tindakan preventif bagi hipertensi

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Landasan Teori

2.1.1. Hipertensi

2.1.1.1. Definisi Hipertensi

Hipertensi atau tekanan darah tinggi adalah peningkatan tekanan darah

sistolik lebih dari 140 mmHg dan tekanan darah diastolik lebih dari 90

mmHg pada dua kali pengukuran dengan selang waktu lima menit dalam

keadaan cukup istirahat/tenang.1

2.1.1.2. Klasifikasi Hipertensi

Hipertensi dapat diklasifikasikan berdasarkan beberapa kriteria yaitu dari

tingkat keparahan:

Tabel 2.1 Klasifikasi Hipertensi Menurut JNC VIII.8

Klasifikasi Tekanan darah

sistolik(mmHg)

Tekanan darah

diastolik (mmHg)

Normal <120 <80

Prehipertensi 120-139 80-89

Hipertensi stage 1 140-159 90-99

Hipertensi stage 2 >160 >100

Berdasarkan klasifikasi JNC VIII hipertensi dapat digolongkan

menjadi prehipertensi apabila tekanan darah sistolik sudah melebihi 120

mmHg dan tekanan darah diastolik melebihi 80 mmHg, hipertensi stage

1 jika tekanan darah sistolik antara 140-159 mmHg dan diastoliknya

antara 90-99 mmHg dan stage 2 dengan sistolik lebih dari sama dengan

160 mmHg dan diastolik lebih dari sama dengan 100 mmHg.8

5

Tabel 2.2 Klasifikasi Hipertensi Menurut WHO.9

Klasifikasi Tekanan darah sistolik

(mmHg)

Tekanan darah

diastolik (mmHg)

Normal <130 <85

Normal tinggi 130-139 85-89

Grade 1 140-159 90-99

Grade 2 160-179 100-109

Grade 3 > 180 >110

Sedangkan menurut klasifikasi WHO, hipertensi dibagi menjadi

normal tinggi, grade 1, grade 2, dan grade 3. Dengan tekanan darah

minimal sistolik sudah melebihi 130 mmHg dan diastolik sudah melebihi

85 mmHg. Klasifikasi ini dibuat pada tah2003.9

Tabel 2.3 Klasifikasi Hipertensi Menurut Perhimpunan Dokter Spesialis

Kardiovaskular Indonesia.10

Klasifikasi Tekanan darah

sistolik (mmHg)

Tekanan darah

diastolik (mmHg)

Optimal <120 <80

Normal 120-129 80-84

Normal tinggi 130-139 84-89

Hipertensi derajat 1 140-159 90-99

Hipertensi derajat 2 160-179 100-109

Hipertensi derajat 3 >180 >110

Hipertensi sistolik terisolasi >140 <90

Hipertensi dapat di golongkan berdasarkan jenis tekanan darah yang

mengalami peningkatan yaitu, Isolated Systolic Hypertension dimana

yang meningkat hanya tekanan sistoliknya saja sedangkan Isolated

Diastolic Hypertension dimana peningkatan terjadi hanya pada tekanan

diastoliknya. Penggolongan ini dibuat oleh British Hypertension

Society.3

6

Terdapat pula jenis hipertensi lain yakni hipertensi pulmonal.

Hipertensi jenis ini adalah suatu penyakit yang ditandai dengan

peningkatan tekanan darah pada pembuluh darah arteri paru-paru

sehingga mengakibatkan sesak nafas, pusing, dan pingsan pada saat

melakukan aktivitas. Kriteria diagnosis untuk hipertensi pulmonal

merujuk pada National Institute of Health, bila tekanan sistolik arteri

pulmonalis lebih dari 35 mmHg atau rerata tekanan arteri pulmonalis

lebih dari 25 mmHg pada saat istirahat atau lebih 30 mmHg saat aktivitas

dan tidak didapatkan adanya kelainan katup pada jantung kiri, penyakit

miokardium, penyakit jantung kongenital dan tidak adanya kelainan

paru.1

2.1.1.3. Epidemiologi Hipertensi

Indonesia memiliki prevalensi hipertensi 25,8% pada tahun 2013

dengan usia penderita diatas 18 tahun dan meningkat pada tahun 2018

menjadi 34,1%.Prevalensi tertinggi berada di provinsi Sulawesi Utara

(13,2%) dan terendah di Papua (4,4%).2

Gambar 2.1 Prevalensi Hipertensi Berdasarkan Hasil Pengukuran pada

Penduduk Umur >18 Tahun Menurut Provinsi Tahun 2007, 2013, dan

2018.2

Prevalensi hipertensi dari tahun ke tahun selalu mengalami

perubahan pada setiap provinsi, di Kalimantan Selatan terjadi

peningkatan prevalensi hipertensi begitu pula dengan DKI Jakarta serta

7

Banten dan secara keseluruhan di Indonesia. Terdapat penurunan

prevalensi hipertensi dari tahun 2007 hingga tahun 2018 di DIY,

Sumatera Selatan, Bangka Belitung, Sulawesi Tenggara dan daerah-

daerah lainnya.2

Gambar 2.2 Prevalensi Hipertensi Berdasarkan Diagnosis dokter pada

Penduduk Umur > 18 Tahun Menurut Provinsi Tahun 2018.2

Prevalensi hipertensi tertinggi di Indonesia per tahun 2018 adalah

daerah Sulawesi Utara dengan persentase 13,2% dan diikuti oleh DIY,

lalu pada posisi ke tiga terdapat Kalimantan Timur. Untuk prevalensi

terendah di Indonesia adalah Papua dengan persentase 4,4%.2

Gambar 2.3 Prevalensi Hipertensi (Diagnosis dokter) Menurut

Kelompok Umur, Gender, dan Tempat Tinggal Pada 2018.2

Prevalensi tersebut meningkat seiring dengan bertambahnya usia

dan lebih banyak terjadi pada perempuan dibandingkan laki-laki serta

lebih sering di daerah perkotaan dibanding pedesaan.2

8

2.1.1.4. Etiologi Hipertensi

Berdasarkan etiologinya hipertensi dibagi menjadi hipertensi primer

dan hipertensi sekunder. Hipertensi dikatakan primer apabila

penyebabnya tidak diketahui (90%) dan dikatakan sekunder apabila

diketahui penyebabnya (10%) yaitu penyakit lain seperti penyakit ginjal

kronik, Sindroma Cushing, koartasio aorta, obstructive sleep apnea,

penyakit paratiroid, feokromositoma, aldosteronism primer, penyakit

renovaskular, penyakit tiroid. Selain itu hipertensi juga dapat disebabkan

oleh obat-obatan seperti prednison, fludrokortison, triamsinolon,

amfetamin, antivascular endothelin growth factor agent, estrogen,

calcineurin inhibitor, dll. Makanan juga dapat menginduksi hipertensi

apabila dikonsumsi secara berlebihan seperti sodium, etanol, licorice.3

Terdapat juga potensial lain yang dapat menyebabkan hipertensi

primer yaitu gangguan regulasi garam oleh ginjal, asupan garam

berlebihan, diet kurang mengandung buah, sayuran, dan produk susu

(rendah K+ dan Ca2+), kelainan membran plasma misalnya gangguan

pompa Na+-K+, variasi dalam gen yang mengkode angiotensinogen,

bahan endogen mirip digitalis, kelainan pada NO, endotelin, dan bahan

kimia vasoaktif lokal lainnya, dan kelebihan vasopresin. Berikut adalah

beberapa contoh hipertensi sekunder yaitu, hipertensi ginjal, hipertensi

endokrin, hipertensi neurogenik.11

2.1.1.5. Patogenesis dan Patofisiologis Hipertensi

Untuk memahami patogenesis dan pilihan terapi untuk hipertensi,

harus diketahui terlebih dahulu faktor yang memengaruhi tekanan darah

normal ataupun patologis. Faktor utamanya adalah cardiac output dan

resistensi perifer. Cardiac Output dipengaruhi oleh stroke volume dan

denyut jantung, stroke volume berhubungan dengan kontraktilitas

miokardium dan ukuran kompartemen pembuluh darah. Resistensi

perifer dipengaruhi oleh perubahan ukuran diameter pada pembuluh

darah kecil.12

9

Gambar 2.4 Faktor yang Memengaruhi Rerata Tekanan Arteri.11

A. Volume Intravaskular

Natrium merupakan penyusun ion ekstraselular dan determinan

utama volume cairan ekstraseluler. Ketika intake NaCl melebihi

kapasitas ekskresi natrium dari ginjal, volume vaskular dan cardiac

output akan meningkat. Tubuh dapat mendeteksi kejadian tersebut

sehingga, akan melakukan autoregulasi dengan cara meningkatkan

resistensi perifer dan seiring waktu tekanan darah akan kembali normal.12

Ketika tekanan darah meningkat dalam respon terhadap asupan NaCl

yang tinggi, ekskresi natrium akan meningkat untuk mempertahankan

keseimbangan elektrolit. Mekanisme ini melibatkan peningkatan

bertahap laju filtrasi glomerulus, menurunnya kapasitas absorbsi dari

tubulus ginjal, dan faktor hormonal seperti atrial natriuretic factors.12

10

Gambar 2.5 Pengaruh Persarafan Simpatis dan Parasimpatis Terhadap

Rerata Tekanan Arteri.11

B. Sistem Saraf Otonom

Reflek adrenergik memodulasi tekanan darah dalam jangka pendek.

Fungsi adrenergik bersamaan dengan hormon serta faktor yang terkait

dengan volume darah berkontribusi terhadap regulasi jangka panjang

untuk tekanan darah. Aktivitas reseptor adrenergik dimediasi oleh

guanosine nucleotide-binding regulatory proteins atau protein G dan

penurunan konsentrasi intraselular dari second messengers. Berdasarkan

fisiologi dan farmakologinya, reseptor Adrenergik dibagi menjadi dua

jenis utama yaitu α dan β. Jenis ini dibedakan lebih lanjut menjadi

reseptor α1, α2, β1, dan β2.12

Reseptor α lebih teraktivasi oleh norepinefrin sedangkan reseptor β

oleh epinefrin. Reseptor α1 terletak pada postsinap di sel otot polos dan

mengakibatkan vasokonstriksi. Dalam ginjal, aktivasi reseptor α1

meningkatkan reabsorbsi natrium pada tubulus ginjal. Reseptor α2

terletak pada presinap membran terminal saraf postganglionik yang

menghasilkan norepinefrin. Ketika teraktivasi oleh katekolamin, reseptor

α2 berperan sebagai umpan balik negatif, menghambat sekresi dari

norepinefrin.12

11

Aktivasi reseptor β1 akan merangsang kecepatan dan kekuatan

kontraksi otot jantung dan meningkatkan cardiac output secara bertahap.

Selain itu stimulasi pada reseptor ini juga merangsang sekresi renin dari

ginjal. Reseptor β2 yang teraktivasi oleh epinefrin menyebabkan

relaksasi pada otot polos vaskular sehingga terjadi vasodilatasi.12

C. Renin Angiotensin Aldosteron

Sistem Renin Angiotensin Aldosteron berkontribusi terhadap

regulasi tekanan darah melalui mekanisme vasokonstriksi yang

disebabkan oleh angiotensin II dan fungsi retensi natrium oleh

aldosteron.12 Ketika renin disekresi dan berada di sirkulasi, renin akan

mengubah substrat angiotensinogen ke bentuk inaktif yaitu angiotensin

I. Kemudian angiotensin I akan diubah oleh enzim ACE menjadi

angiotensin II dengan melepaskan C-terminal histidyl-leucine dipeptide.

ACE juga akan memecah peptida-peptida lain, salah satunya adalah

inaktivasi vasodilator bradikinin. Angiotensinogen II pada Reseptor

Angiotensin II Tipe 1 (AT1R) atau yang disebut AGRT1, berperan

sebagai faktor utama sekresi aldosteron pada zona glomerulosa adrenal

dan juga merupakan mitogen yang menstimulasi sel otot polos vaskular

dan perkembangan miosit. Sehingga, angiotensin II juga diduga berperan

dalam patogenesis ateroskeloris karena bekerja di dinding vaskular. Di

sisi lain, Reseptor Angiotensin II Tipe 2 (AT2R) memiliki fungsi yang

bertolak belakang dengan reseptor angiotensin II tipe 1. Reseptor AT2R

menginduksi terjadinya vasodilatasi, ekskresi natrium dan inhibisi

pertumbuhan sel dan matriks.13 Studi experimental menyatakan Reseptor

Angiotensin II Tipe 2 (AT2R) berkontribusi terhadap regulasi laju filtrasi

glomerulus. Angiotensinogen, renin, dan angiotensin II juga disintesis

secara lokal di banyak jaringan yakni otak, hipofisis, aorta, arteri,

jantung, kelenjar adrenal, ginjal, sel adiposit, leukosit, ovarium, testis,

rahim, limpa, dan kulit.12

Terdapat tiga stimulus yang dapat meningkatkan sekresi renin,

pertama adalah menurunnya transport NaCl pada bagian distal dari

lengkung henle ascending yang berbatasan dengan makula densa. Kedua,

12

menurunnya tekanan atau regangan pada arteriol aferen ginjal

(mekanisme baroreseptor). Ketiga, terstimulasinya sistem saraf simpatik

sel yang menyekresi renin melalui adenoreseptor β1.12

Sebaliknya, sekresi renin akan dihambat apabila terjadi peningkatan

kadar NaCl pada lengkung henle ascending, dengan cara meningkatkan

peregangan arteriol aferen ginjal, dan blokade reseptor β1. Selain itu,

angiotensin II langsung menghambat sekresi renin jika terdeteksi

reseptor tipe 1 angiotensin II pada sel juxtaglomerular, dan sekresi renin

akan meningkat apabila terjadi blokade farmakologis baik dari reseptor

ACE atau angiotensin II. Setelah dikeluarkan ke sirkulasi, renin yang

teraktivasi akan mengubah angiotensin menjadi angiotensin I. Sebuah

enzim pengkonversi yang terdapat di sirkulasi pulmoner yaitu ACE

kinase II mengubah angiotensin I menjadi angiotensin II .12

Angiotensin II merupakan faktor utama yang meregulasi sintesis dan

sekresi aldosteron pada zona glomerulosa korteks adrenal. Aldosteron

adalah mineralokortikoid ampuh yang meningkatkan reabsorbsi natrium

oleh Amiloride-Sensitive Epithelial Sodium Channels (ENaC) pada

permukaan apikal sel di duktus kolektivus kortikalis ginjal.

Keseimbangan elektrikal sel dipertahankan dengan cara menukar

natrium dengan potassium dan ion hidrogen. Akibatnya, peningkatan

sekresi aldosteron dapat menyebabkan hipokalemia dan alkalosis.

Peningkatan aktivitas sumbu Renin Angiotensin Aldosteron tidak selalu

terkait dengan hipertensi. Apabila terdapat kondisi intake rendah NaCl

atau adanya perubahan kontraksi volume, tekanan darah dan volume

homeostasis dapat dipertahankan dengan meningkatkan aktivitas sumbu

Renin Angiotensin Aldosteron.12

D. Mekanisme Vaskular

Tekanan darah dipengaruhi juga oleh radius vaskular dan

compliance dari resistensi vaskular. Apabila terjadi sedikit penurunan

ukuran lumen pembuluh darah akan mengakibatkan perubahan besar

terhadap resistensi vaskular. Pada pasien hipertensi, perubahan

struktural, mekanis, dan fungsional dapat mengurangi diameter arteri dan

13

arteriol. Perubahan ini mengacu pada perubahan ketebalan dinding

pembuluh darah tanpa disertai perubahan volume darah. Hipertrofi atau

eutrofi vaskular menghasilkan penurunan ukuran lumen sehingga

meningkatkan resistensi perifer. Diameter lumen juga dipengaruhi oleh

elastisitas pembuluh darah. Pembuluh darah dengan tingkat elastisitas

tinggi dapat mengakomodasi peningkatan volume dengan perubahan

tekanan relatif sedikit, sedangkan pada sistem vaskular yang kaku,

kenaikan kecil volume vaskular menginduksi kenaikan tekanan darah

relatif besar.12

Susunan sel endothelial vaskular juga berperan dalam meregulasi

fungsi vaskular. Apabila terjadi perubahan regangan vaskular, susunan

substansi dalam sirkulasi, atau mediator inflamasi, sel tersebut akan

merespon dengan cara mengeluarkan substansi vasoaktif yaitu nitrit

oksida yang merupakan vasodilator kuat. Fungsi vasodilatasi dari nitrit

oksida pada pasien hipertensi umumnya terganggu sehingga terjadi

gangguan kompensasi terhadap peningkatan resistensi vaskular.12

Gambar 2.6 Mekanisme Kompensasi Tubuh Terhadap Perubahan

Tekanan Darah.11

14

2.1.1.6. Manifestasi Klinis Hipertensi

Gejala hipertensi dapat bervariasi pada masing-masing individu dan

hampir sama dengan gejala penyakit lainnya. Gejala-gejalanya itu adalah

sakit kepala/rasa berat di tengkuk, pusing (vertigo), jantung berdebar-

debar, mudah lelah, penglihatan kabur, telinga berdenging (tinnitus), dan

mimisan.1

2.1.1.7. Faktor Risiko Hipertensi

Faktor risiko hipertensi adalah umur, jenis kelamin, riwayat

keluarga, genetik (faktor risiko yang tidak dapat diubah/dikontrol),

kebiasaan merokok, konsumsi garam, konsumsi lemak jenuh,

penggunaan minyak bekas pakai, kebiasaan konsumsi minum-minuman

beralkohol, obesitas, kurang aktivitas fisik, stres, penggunaan estrogen.1,3

2.1.1.8. Diagnosis Hipertensi

Hipertensi dapat didiagnosis melalui 3 tahapan, pertama adalah

anamnesis yakni gejala-gejala yang timbul, sejak kapan terjadi, faktor

risiko pada pasien, riwayat penyakit pada keluarga pasien, indikasi

adanya hipertensi sekunder, gejala kerusakan organ, dan pengobatan anti

hipertensi sebelumnya.3

Tahap selanjutnya adalah pemeriksaan fisik dengan cara mengukur

tekanan darah. Terakhir adalah pemeriksaan penunjang untuk memeriksa

apakah komplikasi sudah terjadi yaitu, pemeriksaan darah rutin, glukosa

darah (sebaiknya puasa), kolesterol total serum, kolesterol LDL dan HDL

serum, trigliserida serum (puasa), asam urat serum, kreatinin serum,

kalium serum, hemoglobin dan hematokrit, urinalisis (uji carik selup

serta sedimen urin), elektrokardiogram.3

Memastikan ada tidaknya hipertensi sekunder dengan memeriksa

fungsi tiroid (TSH, FT4, FT3), fungsi paratiroid kadar PTH, Ca2+,

hiperaldosteronisme primer, feokromositoma, Sindroma Cushing,

hipertensi renovaskular.3

15

2.1.1.9. Komplikasi Hipertensi

Komplikasi dari hipertensi berupa kerusakan organ target seperti

pembesaran jantung, iskemia, aritmia, gangguan pembuluh darah, stroke,

retinopati hipertensif, nefropati hipertensif, albuminuria, dan penyakit

ginjal kronis.3

2.1.1.10. Prognosis Hipertensi

Hipertensi adalah penyakit yang akan berlangsung seumur hidup

sampai pasien meninggal akibat kerusakan target organ. Setiap kenaikan

sistolik/diastolik 20 atau 10 mmHg risiko morbiditas dan mortalitasnya

akan meningkat dua kali lipat. Pemberian obat antihipertensi akan diikuti

penurunan insiden stroke 35% sampai 40%, infark miokard 20% sampai

25% dan lebih dari 50% pada gagal jantung.3

2.1.1.11. Tata Laksana Hipertensi

Penatalaksanaan hipertensi dapat dilakukan dengan menggunakan

obat-obatan ataupun dengan cara modifikasi gaya hidup apabila masih

dalam tingkatan awal. Modifikasi gaya hidup dapat dilakukan dengan

membatasi asupan garam tidak lebih dari 6 gram/hari, menurunkan berat

badan, menghindari minuman berkafein, rokok, dan minuman

beralkohol.1

Terdapat beberapa makanan yang harus dihindari atau dibatasi oleh

penderita hipertensi yaitu, makanan berkadar lemak jenuh tinggi (otak,

ginjal, paru, gajih), makanan dengan kadar garam tinggi, makanan dan

minuman dalam kaleng atau diawetkan (dendeng, abon, ikan asin, telur

asin), makanan dengan sumber protein hewani yang tinggi kolesterol

(daging merah, kuning telur, kulit ayam), dan makanan atau minuman

yang mengandung alkohol (durian dan tape).1

Olah raga yang dianjurkan bagi penderita hipertensi yaitu, jalan, lari,

jogging, dan bersepeda dilakukan selama 20-25 menit dengan frekuensi

3-5 kali per minggu. Tidur cukup (6-8 jam/ hari) penting juga untuk

kesehatan dan tentunya mengendalikan stres dengan cara melakukan

16

istirahat sejenak. Untuk pemilihan serta penggunaan obat-obatan

hipertensi disarankan untuk berkonsultasi dengan dokter terlebih

dahulu.1

Terdapat banyak sumber yang menjelaskan alur tatalaksana

hipertensi, salah satunya yaitu JNC VIII yang dikeluarkan tahun 2014.

Penatalaksanaan awal digolongkan berdasarkan ada tidaknya penyakit

lain seperti gagal ginjal kronik atau diabetes, apabila tidak terdapat

keduanya maka akan digolongkan berdasarkan kelompok umur untuk

menentukan target tekanan darah. Untuk kelompok dengan diabetes dan

atau tanpa gagal ginjal kronik dan sebaliknya, langkah selanjutnya adalah

penggolongan target tekanan darah tanpa memerhatikan usia.8

WHO merekomendasikan diuretik dosis kecil sebagai pilihan utama

pengobatan hipertensi berdasarkan pertimbangan faktor harga dan

efektifitasinya. JNC VIII menyarankan untuk dilakukannya program

pencegahan dengan cara memperbaiki gaya hidup pada pasien dengan

klasifikasi prehipertensi. Untuk pilihan pertamanya direkomendasikan

golongan tiazid, dan dapat dikombinasi dengan golongan antihipertensi

lain apabila sudah masuk ke dalam keadaan mengkhawatirkan.8

Hipertensi tanpa penyulit dapat diberikan monoterapi, JNC VIII

menyarankan tiazid sebagai pilihan pertama dengan persentase mencapai

tekanan darah normal kurang lebih sebesar 40% dan untuk meningkatkan

persentasenya dapat dikombinasikan penggunaan dua obat atau lebih.8

17

Gambar 2.7 Tahapan Terapi untuk Hipertensi8

18

2.1.2. Single Nucleotide Polimorfisme Terhadap Hipertensi

2.1.2.1. DNA

DNA adalah materi genetik yang diwariskan oleh organisme dari

induknya serta merupakan penyusun gen dan tersusun dari dua rantai

polinukleotida yang saling mengikat atau bisa disebut double helix dan

disatukan oleh ikatan hidrogen oleh interaksi Van der Waals. Asam

nukleat adalah makromolekul yang terdapat sebagai polimer dengan

nama polinukleotida dan merupakan penyusun dari rantai ganda DNA.

Polinukleotida tersusun dari nukleotida, dengan setiap bagiannya

mengandung basa nitrogen, gula berkarbon lima (pentosa), dan gugus

fosfat.14

Terdapat dua family basa nitrogen, yaitu pirimidin dan purin.

Pirimidin mempunyai cincin beranggotakan enam atom yang terdiri dari

karbon dan nitrogen, contohnya adalah sitosin (C), timin (T), dan urasil

(U). Purin berukuran lebih besar daripada pirimidin dan cincinnya

beranggota enam yang menyatu dengan cincin beranggota lima,

contohnya yaitu adenin (A) dan guanin (G). Chargaff's rule ditemukan

oleh Erwin Chargaff menyatakan bahwa jumlah Adenin selalu sama

dengan jumlah Timin, dan jumlah Guanin selalu sama dengan Sitosin

yang merupakan gugus fosfat dari komponen DNA. 14

Gen adalah unit fungsional yang diatur oleh transkripsi dan mengode

produk RNA yang akan ditranslasi menjadi protein intra atau ekstra sel.

Exon merupakan bagian dari gen yang akan melalui proses splicing untuk

membentuk mRNA. Intron adalah daerah antara exon tempat

dilakukannya splicing dari prekursor RNA saat pembentukan RNA. Saat

ini diperkirakan terdapat 20,687 gen pengkode protein pada genom

manusia. Ekspresi tiap gen diatur oleh protein DNA-binding.12

19

2.1.2.2. Mutasi Gen

Bukti bahwa gen spesifik terdapat pada suatu kromosom muncul

pada tahun 1900an dinyatakan oleh Thomas Hunt Morgan dari

Universitas Kolombia. Hal ini semakin mendukung teori dari Mendel.

Setiap organisme memiliki sepasang alel pada suatu gen. Apabila alel

tersebut sama maka disebut sebagai homozigot, jika alelnya berbeda

disebut heterozigot. Setiap gen akan mengekspresikan sifat yang

dibawanya, apabila sifat tersebut nampak akan disebut sebagai fenotip

dan jika tidak akan disebut genotip. Genotip yang umum terlihat pada

populasi disebut wild type.14

Informasi genetik yang terdapat pada kromosom DNA bisa

ditransmisikan dengan replikasi secara langsung atau melalui beberapa

proses seperti pindah silang, rekombinasi, transposisi, dan konversi

gen.15 Beberapa enzim juga berperan dalam replikasi, perubahan, dan

perbaikan DNA. Adanya mutasi karena perubahan susunan basa pada

DNA diduga akibat kesalahan saat replikasi, transposisi, atau perbaikan

DNA yang terjadi setiap 106 pembelahan sel.15

Abnormalitas produk gen (RNA, fungsi protein, ataupun jumlah)

dapat terjadi karena mutasi saat transkripsi protein koding dan nonprotein

koding DNA atau nontranscribed regulatory-region DNA. Faktor seperti

virus, bahan kimia, sinar ultraviolet, dan radiasi ionisasi meningkatkan

jumlah mutasi. Mutasi juga berefek pada sel somatik tetapi hanya di

transfer secara horizontal atau hanya di dalam suatu organisme. Mutasi

sel germinal ditransmisikan secara vertikal sehingga dapat menyebabkan

penyakit bawaan.15 Perubahan kromosom selama proses meiosis dan

fertilisasi merupakan penyebab sebagian besar variasi muncul di setiap

generasi melalui proses pemilahan bebas pada kromosom, pindah silang

dan fertilisasi acak.14

Mutasi dapat diartikan sebagai perubahan susunan nukleotida primer

pada DNA terlepas dari konsekuensi fungsionalnya. Beberapa mutasi

mungkin mematikan, dan lainnya tidak, beberapa bahkan ada yang

menguntungkan. Mutasi saat proses perkembangan disebut mosaicism

20

dimana jaringan terdiri dari sel yang mempunyai susunan gen berbeda.

Mutasi sangat bervariasi, dapat melibatkan seluruh genom, seperti

triploidi (kelebihan satu set kromosom) atau perubahan kecil dalam

jumlah atau struktur setiap gen individu.12

Mutasi terjadi di tingkat kromosom dapat diakibatkan karena

terjadinya kesalahan saat meiosis atau agen perusak yang menyebabkan

kromosom terpisah. Terdapat empat jenis mutasi di tingkat kromosom

yaitu delesi yang terjadi jika suatu fragmen kromosom hilang, duplikasi

yang mengakibatkan sebuah segmen berulang, inversi yaitu terjadinya

pembalikan sebuah segmen dalam sebuah kromosom, dan translokasi

merupakan perpindahan segmen dari satu kromosom ke kromosom

nonhomolog.14 Delesi besar-besaran dapat memengaruhi beberapa

bagian atau seluruh gen, crossing over yang terganggu antara gen

homolog dapat menyebabkan mutasi fusi pada gen. 12

Mutasi yang melibatkan nukleotida tunggal disebut sebagai mutasi

titik (point mutation), tipe dari mutasi titik yaitu substitusi, insersi, atau

delesi.14 Substitusi adalah penggantian satu nukleotida dan pasangannya

dengan sepasang nukleotida lain, contohnya adalah transisi apabila purin

diganti dengan basa purin lainnya (A-G) atau jika pirimidin diganti

dengan pirimidin lainnya (C-T). Perubahan dari purin dan pirimidin atau

sebaliknya disebut sebagai transversi. Apabila sekuensi DNA mengalami

perubahan pada regio koding DNA merubah asam amino menjadi asam

amino lain, maka disebut sebagai mutasi salah makna (missense

mutation). Mutasi titik yang mengubah kodon untuk asam amino menjadi

kodon stop disebut mutasi tidak bermakna (nonsense mutation).12,14

Insersi (penyisipan) dan delesi (penghapusan) adalah penambah atau

pengurangan pasangan nukleotida pada gen yang mungkin mengubah

bingkai pembacaan pesan genetik, penggugusan tripley basa pada mRNA

yang dibaca saat translasi. Mutasi tersebut disebut mutasi pergeseran

bingkai pembaca (frameshift mutation).14

21

Gambar 2.8 Contoh mutasi gen.12

Polimorfisme adalah variasi sekuens yang mempunyai frekuensi

tidak lebih dari 1%. Biasanya tidak menyebabkan perubahan fenotip.

Tersusun dari substitusi basa tunggal yang tidak menganggu sekuensi

koding protein dari kode genetik, tetapi dapat merubah kestabilan

mRNA, translasi, atau sekuensi asam amino.12

Single Nucleotide Polymorphism adalah variasi satu pasang basa

pada DNA. SNP merupakan variasi sekuensing tersering (90%).

Biasanya terjadi setiap 100-300 basa dan merupakan faktor utama dari

herterogenetik. Tetapi sekuens DNA primer pada manusia memiliki

99,9% kesamaan apabila dibandingkan dengan manusia lainnya. SNP

yang memiliki kemiripan bisa disebut sebagai haplotype. HapMap atau

haplotype map information menjelaskan tentang lokasi dari tiap

haplotype SNP dan bagaimana penyebarannya di tiap individu dan

diantara populasi. Sehingga sangat membantu dalam GWAS (Genome

Wide Assotiation Study) untuk memahami interaksi antara beberapa gen

yang kompleks dan faktor gaya hidup di penyakit multi faktoral .12

22

Gambar 2.9 Komponen Haplotype.12

2.1.2.3. rs5186

Salah satu contoh dari penyakit multi faktoral adalah hipertensi

karena dipengaruhi oleh faktor genetik dan faktor lingkungan. Telah

banyak penelitian dilakukan untuk memahami gen apa saja yang ikut

mengambil peran menyebabkan hipertensi, sehingga dapat membantu

memahami patofisiologi penyakit dan dapat bermanfaat dalam pemilihan

obat antihipertensi, serta membantu mengenali mereka yang memiliki

risiko hipertensi agar dapat mencegahnya.

Berdasarkan beberapa penyebab hipertensi, Sistem Renin

Angiotensin Aldosteron disebutkan berperan dalam meregulasi tekanan

darah dan hemostasis vaskular. Komponen RAAS seperti

angiotensinogen, produk dari AGT merupakan satu-satunya prekursor

protein yang diaktifkan oleh renin untuk menghasilkan angiotensin I.

Angiotensin I merupakan prekursor dari angiotensin II. Angiotensin

Converting Enzyme (ACE) merupakan suatu enzim untuk hidrolisasi

angiotensin I menjadi angiotensin II. 13,16

Angiotensin II merupakan vasokonstriktor paten dan akan

meningkatkan tekanan resistensi perifer serta meningkatkan darah balik

23

vena, kemudian meningkatkan tekanan darah. Selain itu angiotensin II

juga menyebabkan retensi garam dan air pada ginjal melalui dua

mekanisme. Mekanisme pertama adalah mekanisme langsung melalui

konstriksi arteri renal yang akan menurunkan aliran darah, sehingga

menurunkan tekanan pada kapiler peritubular. Penurunan tekanan kapiler

ini akan meningkatkan reabsorpsi cairan dari tubulus kemudian

menurunkan output urin dan meningkatkan tekanan darah. Kedua,

apabila RAAS teraktivasi maka kadar sekresi aldosteron juga akan

meningkat dan mengakibatkan peningkatan reabsorbsi sodium oleh

tubulus ginjal. Peningkatan reabsorbsi sodium mengakibatkan

peningkatan kadar sodium pada total cairan ekstraseluler tubuh.

Sehingga terjadi retensi cairan dan peningkatan volume cairan

ektraselular yang akan menyebabkan tekanan darah lebih tinggi.13,16

Sehingga dapat disimpulkan bahwa variasi genetik komponen

RAAS yaitu angiotensinogen (AGT), angiotensin 1 converting enzim

(ACE), Angotensin II Tipe 1 Reseptor (AGTR1) dan adducin (ADD1)

dapat dilogikakan berhubungan dengan regulasi tekanan darah, seperti

yang dinyatakan kohli S et al16, martinez-rodriguez et al 17, jia-li wang et

al18.

Gen AGTR1 terletak pada kromosom 3q21-25, dengan panjang 55

kb dan terdiri dari 5 exon dan 4 intron dengan 4 exon pertamanya

mengode 5' Untranslated Region (UTR) dan exon yang ke 5 berada pada

regio koding.19 Gen ini mengode membran protein dengan 359 asam

amino, yang terbagi menjadi 7 bagian transmembran.20 Terdapat

perubahan susunan basa (polimorfisme) pada 3' untranslated region

AGTR1/AT1R dari adenin (A) ataupun sitosin (C) pada posisi 1166 (A/C

transversion) dan dinamakan AT1R A1166C (rs5186). Beberapa

penelitian menyebutkan bahwa polimorfisme ini berhubungan dengan

hipertensi esensial.18,21

AGTR1 mengode reseptor tipe 1, yang memediasi efek

kardiovaskular dari angiotensin II termasuk vasokonstriksi dan stimulasi

reabsorpsi Na+ serta sekresi aldosteron. Gen ini merupakan efektor

24

penting dari faktor pengontrol tekanan darah dan sistem

kardiovaskular.20 Reseptor angiotensin II tipe 1, merupakan G Protein-

Coupled Receptor (GPCR) yang meregulasi kerja Sistem Renin

Angiotensin pada sel target. Apabila reseptor ini berikatan dengan

senyawa agonis, akan mengaktivasi phospholipase C melalui protein Gq,

memobilisasi penyimpanan kalsium intraseluler dan protein kinase C.22

Fungsi GPCR berkaitan dengan konsep aktivasi konstitutif melalui point

mutations yang menstabilitaskan reseptor dengan cara konformasi

bersama ligan secara langsung. Hal tersebut menyebabkan aktivasi

permanen jalur persinyalan.23 Karenanya, pada mild phenotype dari gen

ini dengan aktivasi konsekutif dan delesi alel C pada reseptor

menyebabkan gangguan fosforilasi dan internalisasi, menghilangkan

desensitasi, dan meningkatkan hiperaktivitasnya terhadap angiotensin

II.24

Beberapa penelitian menyatakan adanya hubungan antara rs5186

dari AGTR1 dengan peningkatkan sensitifitas dinding vaskular dan

memengaruhi fungsi vasomotor, dan variasi alel rs5186 (A1166C) dapat

menyebabkan stroke hemorhagik.25 Polimorfisme rs5186 terletak pada

regio nonkoding dari gen AGTR1, karenanya tidak menyebabkan

pengaruh langsung terhadap transkripsi dan translasi gen ini. Alel rs5186

(A1166C) diduga memiliki hubungan disequilibrium dengan sekuensi

nukleotida fungsional dari AGTR1, sehingga memengaruhi regulasi gen

angiotensin.26

Receptor angiotensin II type 1 (AT1R) atau gen AGTR1 khususnya

rs5186 berperan penting dalam meregulasi tekanan darah dan berpotensi

untuk menimbulkan hipertensi jika mengalami polimorfisme.4 Seperti

yang terdapat pada penelitian meta-analisis Wang et al pada 2010

menyatakan adanya hubungan antara AT1R (A1166C) atau rs5186

dengan hipertensi di populasi China, mengindikasikan bahwa pembawa

alel rs5186 akan memiliki prevalensi kejadian hipertensi lebih tinggi.18

Niu dan Qi et al juga melakukan penelitian meta-analisis dan

menemukan hasil serupa.27

25

Penelitian yang dilakukan di Thailand oleh Charoen P. et al

merupakan penelitian pertama dan terbesar pada populasi Thai untuk

mengklarifikasi fungsi polimorfisme pada gen yang berhubungan dengan

RAAS (rs1799752, rs699, rs5186, dan rs1799998). Hasil penelitian ini

menyatakan bahwa tidak ditemukannya hubungan antara polimorfisme

tersebut dengan tekanan darah pada populasi Thai. Chaoren P. et al juga

menyatakan penelitian yang dilakukannya tidak memenuhi kriteria

statistik karena jumlah sampel tidak cukup mempresentasikan populasi.28

2.1.3. Identifikasi DNA

2.1.3.1. PCR

Dalam teknik PCR dibutuhkan 2 primer oligonukleotida, ukurannya

antara 17-30 nukleotida agar nantinya dapat membentuk sekuens DNA

target yang akan disalin. Salah satu primer memiliki sekuens yang sama

dengan untai DNA (Primer sense) sementara, primer lain memiliki

sekuens yang sama dengan untai DNA lainnya (primer antisense).

Primer sense akan terikat, melalui interaksi komplementer pasangan basa

dengan primer antisense dan akan menginisiasi sintesis untai sense DNA

baru. Primer antisense juga akan berikatan dengan untai sense DNA dan

akan terbentuk untai antisense DNA baru.29

PCR melibatkan beberapa tahap atau siklus dimana masing-masing

akan menduplikasi target DNA untai ganda. Untai ganda template akan

dipisahkan dengan denaturasi termal dan akan didinginkan hingga suhu

tertentu agar primer dapat menempel (annealing primer) pada target

DNA. Kemudian, target DNA tersebut akan diperpanjang dengan

bantuan DNA Polimerase dan buffer lain yang sesuai. Reaksi PCR dibagi

menjadi 3 tahap terpisah dan dalam prosesnya menggunakan suhu yang

berbeda-beda. Tahap tersebut yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi,

dan akan diulang selama 20-40 siklus untuk mendapatkan hasil

amplifikasi sekuens DNA spesifik yang memuaskan. Tahapan pada PCR

tersebut terdiri dari proses: 30

26

A. Denaturasi

Kedua untai target molekul DNA dipisahkan melalui proses

pemanasan. Proses ini bersifat reversibel terhadap proses

peningkatan dan penurunan suhu.

B. Annealing

Kedua untai target kemudian didinginkan untuk nantinya bereaksi

dengan primer. Salah satu primer akan membaca dan terikat dengan

satu untai DNA target, dan primer mengikat untai lainnya. Kedua

primer didesain dengan ujung 3’ bebas agar keduanya dapat saling

berhadapan tepat pada regio yang ingin di amplifikasi. Suhu pada

proses annealing bergantung pada panjang dan sekuens dari primer

serta level spesifisitas yang dibutuhkan pada reaksi PCR. Umumnya

suhu yang digunakan yaitu antara 45-60°.

C. Ekstensi

DNA polimerase akan terikat dengan ujung 3’ bebas dari

oligonukleotida dan menggunakan dNTP untuk menyintesis DNA

baru 5’-3’. Temperatur optimum untuk replikasi DNA dengan taq

DNA polimerase terdapat pada suhu 72°C.30

Polimorfisme dapat dideteksi menggunakan real time PCR. Pada

awalnya real time PCR dikembangkan sebagai variasi dari PCR

konvensional. Perbedaan utama real time PCR dengan PCR

konvensional adalah produk dari real time PCR dihitung pada saat reaksi

PCR berlangsung atau secara real time bukan setelah reaksinya selesai.

Real time PCR menggunakan Flourescent detector dapat mengukur

fluoresense dari tiap sampel setiap siklus amplifikasi. Real time PCR

menggunakan fluorescence-detecting thermocyclers untuk

memanjangkan sekuens asam nukleat spesifik dan menghitung

konsentrasinya secara bersamaan.31,32

Real time PCR digunakan untuk menghitung jumlah ekspresi genetik

dan untuk mengonfirmasi perbedaan ekspresi genetik pada laboratorium

riset. Pada laboratorium analitik, real time PCR digunakan untuk

mengukur jumlah sekuensi DNA atau RNA tertentu. Kesamaan kedua

27

laboratorium ini adalah real time PCR dapat digunakan untuk mendeteksi

mutasi dan single nucleotide polymorphism. 32

Kelebihan real time PCR adalah kemampuannya untuk mengukur

DNA yang teramplifikasi secara simultan sehingga meningkatkan presisi

perhitungan kuantitas sekuens target. Selain itu, real time PCR juga tidak

terpengaruh terhadap beberapa perubahan apabila terdapat kesalahan

dalam proses amplifikasi. Sensitifitas deteksi fluorometrik pada real time

PCR dalam mengukur konsentrasi DNA target antara 105 atau 106

konsentrasi awalnya.32

Pendeteksi pada real time PCR terdiri dari pewarna yang akan

berikatan dengan ikatan rantai ganda DNA atau probe oligonucleotide

spesifik yang mengikat target diantara bagian annealing primer.

Penggunaan pewarna fluoresensi lebih cocok untuk mendeteksi pada

tingkat genus dan tidak cocok untuk penggunaan multipel. Pada probe

oligonukleotida spesifik, dapat digunakan secara multipel karena setiap

probe memiliki reporter fluoresense spesifik sehingga hasilnya akan

lebih spesifik pada kelas spesies atau level untaian.31

2.1.3.2. Sekuensing DNA

Selain melalui real time PCR, polimorfisme atau perubahan susunan

basa pada DNA dapat dideteksi melalui beberapa metode, salah satu

metodenya adalah sekuensing. Fungsi dari metode ini adalah untuk

menentukan urutan nukleotida molekul DNA sehingga dapat digunakan

sebagai pendeteksi mutasi suatu gen. Sekuensing DNA pertama kali

dilakukan pada tahun 1975 dan teknik ini terus berkembang sampai

sekarang.33

Teknik sekuensing terbagi menjadi dua yaitu, manual dan automatis.

Pada awalnya hanya terdapat dua metode sekuensing manual yaitu

metode Sanger dan metode Maxam-Gilbert. Metode Sanger

menggunakan dideoksinukleotida spesifik untuk menghentikan sintesis

untaian DNA pada nukleotida tertentu saat untaian disintesis. Sedangkan

metode Maxam-Gilbert menerapkan metode kimia pada nukleotida

28

spesifik untuk memutus molekul DNAnya.15,33 Sekuensing DNA terus

berkembang, sehingga saat ini sekuensi juga dapat dilakukan dengan

menggunakan metode Dye-terminator sequencing, Automation and

sample preparation, Large scale sequencing strategies, and new

sequencing methods.34

2.1.3.3. Enzim Restriksi

Enzim yang dapat mengenali dan memotong kedua untaian DNA

pada urutan pasang basa tertentu merupakan definisi dari enzim restriksi.

Enzim ini akan mengenali sekuens spesifik pada DNA yang disebut

sebagai restriction site, kemudian akan mengubah konformasi enzim dan

DNA. Pengenalan ini dapat dideteksi secara in vitro sehingga, error yang

terjadi dapat diukur secara kuantitatif. Metode ini pertama kali ditemukan

pada tahun 1960an dan terus berkembang hingga saat ini. 35, 36, 37

Berdasarkan komposisi subunit enzim, kofaktor yang diperlukan,

target sekuensi, dan posisi dari restriction site sekuens, enzim restriksi

digolongkan menjadi 4 tipe. Tipe I memotong bagian yang jauh dari

sekuens pengenalannya dan memerlukan ATP serta S-adenosyl-L-

methionine sebagai kofaktornya. Selanjutnya untuk tipe II, Enzim ini

akan memotong pada situs pengenalan atau situs DNA yang dekat dan

memerlukan magnesium untuk bekerja. Tipe III akan mengenali dua

sekuens dengan orientasi berlawanan dan menempel pada urutan sejauh

20-30 susunan basa dari situs pengenalnya serta membutuhkan ATP dan

S-adenosyl-L-Methionine untuk restriction digestion dan metilasi.

Sedangkan untuk tipe VI enzim restriksi mengenali DNA termodifikasi

melalui proses metilasi, hidroksimetilasi, dan glucosyl-

hydroxymethylasi.37

Enzim restriksi dapat digunakan untuk berbagai hal. Yaitu, untuk

kloning gen dan ekspresi protein, mapping DNA, Restriction Fragment

Length Polymorphism (RFLP), mempelajari modifikasi epigenetik, dan

menganalisis ekspresi DNA. Pada analisis ekspresi DNA enzim restriksi

yang sering digunakan adalah ApeKI untuk proses sekuensing.37

29

2.2. Kerangka Teori

Faktor Risiko

Angiotensinogen

Pengaruh ginjal Viskositas cairan ↓

Intake sodium ↑ Stres/emosional

Gaya Hidup

rs5186

(AGTR1)

Polimorfisme Mutasi

Genetik Usia

Ekstrinsik Intrinsik

Angiotensinogen I

Angiotensinogen II

Jantung Berikatan dengan

Reseptor tipe 1

Kontraktilitas ↑

(+) Sel Otot Polos

vaskular

Keluar renin

saat aliran darah

ke ginjal sedikit

GFR ↓

Aliran darah

ke ginjal ↓

Hipertensi

↑ Tekanan Darah

Reabsorbsi

H2O & Na

Vasokontriksi

Aldosteron ↑

Perubahan RAAS

↑ Volume Intravaskular

30

2.3. Kerangka Konsep

Interpretasi Hasil

rs5186

Mutasi

Gen AGTR1

Genetik

Ekstrinsik

Faktor Resiko

Hipertensi

Intrinsik

Analisa RT PCR

Variabel yang

diteliti

Variabel yang

tidak diteliti

31

2.4. Definisi Operasional

Dalam penelitian ini, digunakan istilah-istilah yang didefinisikan sebagai

berikut:

No Variabel Definisi

Operasonal

Alat ukur Skala Keterangan

1. rs5186

pada gen

AGTR1

Reverence

sequence

5186 pada

gen AGTR1

yang

termasuk ke

dalam variasi

genetik dari

komponen

RAAS.

Menggunakan

RT- PCR

Kategorik 1. Wild Type

2. Mutant

3. Heterozigot

2. Hipertensi Peningkatan

tekanan

darah

melebihi

kadar normal

Sfingmomanometer Kategorik Hipertensi

Normotensi

32

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dengan desain cross

sectional. Dalam jenis penelitian ini, peneliti melakukan observasi atau

pengukuran variabel pada satu saat. Hal ini berarti bahwa setiap subjek hanya

diobservasi satu kali tanpa adanya pengulangan.38

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan mulai bulan Desember 2018 hingga

Agustus 2019. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Sel dan Biologi

Fakultas Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.3. Sampel Penelitian

Sampel penelitian ini adalah responden dengan hipertensi yang

terdiagnosis oleh dokter dan telah mengonsumsi obat antihipertensi secara rutin

serta responden dengan normotensi yang tidak memiliki riwayat hipertensi

pada keluarganya di wilayah Ciputat Timur.

3.4. Besar Sampel

𝑁=Z𝛼2 X P X Q

𝑑2

𝑁=1,9622 X 0,5 X 0,5

0,12

𝑁=96,4→97

Keterangan:

N = besar sampel

Zα = deviasi baku alfa

P = proporsi kategori variable yang diteliti

Q = (1-P)

d = presisi

33

Ditetapkan alfa sebesar 5% oleh karena itu nilai Zα menjadi 1,962 dan

pada penelitian ini presisi yang ditetapkan adalah 10%. Belum ada nilai dari

kepustakaan sebelumnya, sehingga nilai proporsi kategori variabel yang diteliti

ditetapkan 50%. Jika P=50% maka akan menghasilkan PxQ yang paling besar

sehingga didapatkan jumlah N yang maksimal. 39

3.5. Teknik Pengambilan Sampel

Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah Purposive Sampling.

Purposive Sampling termasuk ke dalam teknik non probability sampling,

sehingga tidak semua anggota populasi memiliki peluang yang sama untuk

dijadikan sampel penelitian. Pada Purposive Sampling, peneliti menentukan

kriteria inklusi dan kriteria ekslusi terlebih dahulu. Teknik ini dipilih karena

peneliti sudah mempunyai kriteria yang ditentukan untuk dapat memenuhi

pertimbangan-pertimbangan tertentu.40

3.5.1. Kriteria Inklusi

Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah:

A. Responden dengan rentan usia antara 18-75 tahun.

B. Responden hipertensi: pasien yang terdiagnosis dokter serta

mengonsumsi obat antihipertensi.

C. Responden normotensi: orang yang memiliki tekanan darah normal dan

tidak memiliki riwayat hipertensi dikeluarganya.

3.5.2. Kriteria Ekslusi

Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah:

A. Responden yang menolak untuk diambil sampelnya

B. Responden yang memiliki komplikasi seperti stroke dengan parese

nervus facialis atau ensefalopati hipertensi.

34

3.6. Alur Penelitian

Informed consent

Penentuan subjek

Normotensi:

mahasiswa FK UIN

2016-2018

Pasien hipertensi yang

telah mengonsumsi

obat antihipertensi

Pengambilan Sampel:

Sampel saliva

Isolasi genom

Hasil Riset

Identifikasi jumlah kejadian

polimorfisme rs5186 (AGTR)

Interpretasi alel AA, AC, CC

RT-PCR

Mengukur konsentrasi

dan kemurnian DNA

Nano Drops

35

3.7. Prosedur Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung sentrifuge plastik

15 ml untuk pengambilan sampel liur. Saat isolasi genom DNA dari liur

digunakan Microsentrifuge tuba 1,5 mL steril, Water bath AS ONE TRW -42TP

60oC, GD Collum, 2 mL Collection Tube, Eppendorfcentrifuge 5417 R,

Micropipet Nichipet Ex, Nichiryo (2 – 20 µL dan 20 – 200 µL), Micropipet

BIORAD ukuran 100 – 1000 µL, Microtip Biologix ukuran 200 µL dan 1000

µL, dan Biomedical Freezer SANYO. Untuk pengukuran kemurnian dan

konsentrasi hasil isolasi DNA digunakan Maestro nano drops, Aquadest,

Micropipet 2,5-2 µL, Microtip Biologix 10 µL. Lalu dilakukan RT PCR dengan

Light Cycler 480.

Bahan yang digunakan sebagai sampel adalah air liur sebanyak 15 ml.

Isolasi genom DNA dari liur menggunakan GB Buffer 200 µL, Ethanol

Absolute 200 µL, W1 Buffer 400 µL, Wash Buffer 600 µL, Elution Buffer 50

µL. Berikutnya digunakan Genom DNA sebanyak 1 µL, Blanko (Elution

Buffer) 1 µL untuk pengukuran kemurnian dan konsentrasi digunakan nano

drop. Pengenceran DNA dilakukan dengan menambahankan aquadest sesuai

konsentrasi dan kemurniannya dengan perbandingan 1:2. Berikutnya adalah

menambahkan larutan hasil pengenceran DNA dan larutan campuran yang

berisi nuclease water, rhAmp SNP master Mix, rhAmp SNP Assay, dan rhAmp

SNP Reporter Mix Ke dalam plate PCR dan memasukannya ke dalam mesin

Light Cycler 480 untuk dibaca alelnya.

3.8. Cara Kerja Penelitian

3.8.1. Pengumpulan Data

Menggunakan data primer dari responden yang sudah mengisi informed

consent dan menyetujuinya. Data berupa air liur dengan syarat subjek tidak

mengonsumsi makanan selama 1 jam sebelum pengambilan dan sudah

berkumur sebelum pengambilan sampel di dalam tabung sentrifuge plastic

sebanyak 15 cc dan kemudian sampel diberi label berupa nama dan tanggal

pengambilan, lalu disimpan dalam suhu -200 C.

36

3.8.2. Isolasi DNA

Langkah pertama isolasi DNA dengan air liur adalah persiapkan

sampel, dilakukan dengan cara menyentrifugasi 13-15 mL air liur selama 10

menit dengan kecepatan 3.000 rpm dengan sentrifuge. Kemudian, buang air

liur dan sisakan endapannya. Lalu, tambahkan reagen GST 200 μl.

Berikutnya, dihomogenkan dengan fortex dan pindahkan ke tube 1, 5 mL.

Kedua, adalah melakukan Cell Lysis dengan cara menambahkan 10 μl

Protease ke dalam tube dan kocok kuat-kuat. Setelah itu, menginkubasi

tabung selama 10 menit dengan suhu 60oC dalam Water Bath dan keluarkan

lalu tunggu hingga suhu tabung turun menjadi suhu ruangan. Kemudian,

tambahkan 200 μl GSB buffer ke dalam microsentrifuge tube. Lalu, inkubasi

tabung dalam suhu 60o C selama 20 menit (dikocok pelan setiap 10 menit).

Selama menunggu, siapkan tabung berisi Elution buffer sebanyak 50 μl dan

inkubasi pada suhu 60o C sampai akan digunakan. Berikutnya, dinginkan

microsentrifuge tube pada suhu ruangan.

Ketiga, yaitu proses DNA Binding dengan cara menambahkan 200 μl

Ethanol absolute ke dalam Microsentrifuge tube kemudian kocok tabung

selama 10 menit, berikutnya siapkan GS column pada 2 ml Collection tube

dan pindahkan campuran dari Microsentrifuge tube ke dalam GS column.

Selanjutnya, sentrifugasi GS column selama 1 menit dengan kecepatan

14.000-16.000 rpm dan buang cairan yang tersaring ( pada 2 mL Collection

tube) lalu pasang kembali GS column ke Collection tube.

Langkah keempat isolasi DNA yaitu proses Wash, tambahkan 400 μl

W1 buffer ke dalam GS column lalu sentrifugasi selama 30 detik dengan

kecepatan 14.000-16.000 rpm dan buang cairan dalam Collection tube.

Kemudian, letakan kembali GS column pada Collection tube. Berikutnya,

tambahkan 600 μl Wash buffer ke GS column dan sentrifugasi dengan

kecepatan 14.000-16.000 selama 30 detik. Selanjutnya, buang cairan pada

collection tube (yang sudah tersaring) lalu kembalikan GS column ke

Collection tube. Kemudian, sentrifugasi GS column selama 30 detik pada

kecepatan 3.000 rpm untuk memastikan tidak ada cairan tersisa.

37

Setelah kering, dapat dilanjutkan ke tahap terakhir isolasi DNA yaitu

DNA Elution. Pindahkan GS column kering ke dalam Microsentrifuge tube

steril dan tambahkan 50 μl Elution buffer (yang sudah didinginkan menjadi

suhu ruangan) dan dibiarkan selama 5 menit. Kemudian, sentrifugasi 14000

rpm selama 3 menit untuk mendapatkan hasil isolat DNA.

Gambar 3.1 Langkah Isolasi Genom Dengan Air Liur

3.8.3. Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA

Nilai jumlah konsentrasi secara kuantitatif dan kejernihan DNA secara

kualitatif dengan menggunakan nano drop. Konsentrasi diukur dengan

menggunakan nano drop spektofotometer ND-1000. Template DNA

diambil sebanyak 1 nano liter dan kemudian dibaca pada panjang

gelombang 260 dan 280 nm. Kemurnian DNA didapat dari perbandingan

absorbansi 260/280. Apabila hasilnya memenuhi kriteria minimum

konsentrasi dan kejernihan DNA yang diperlukan, hasil isolasi kemudian

disimpan di suhu 40C hingga dilakukan langkah selanjutnya.

38

3.8.4. Real Time PCR (RT PCR)

Setelah melakukan isolasi DNA hasil isolat diencerkan dengan

aquadest dengan perbandingan 2:4 apabila konsentrasi hasil isolasi DNA

lebih dari 50.000 dan 1:2 jika konsentrasinya dibawah 50.000. Berikutnya

DNA yang sudah diencerkan dihomogenkan dengan campuran berisi

nuclease water, rhAmp SNP master Mix, rhAmp SNP Assay, dan rhAmp

SNP Reporter Mix dengan menggunakan alat micro pippet ke dalam

LightCycler® 480 Multiwell Plate 96 white kemudian ditutup dengan

LightCycler® 480 Sealing Foil. Selanjutnya, LightCycler® 480 Multiwell

Plate 96 white dihomogenkan menggunakan gerakan tangan secara

horizontal, lalu dimasukkan ke dalam The LightCycler® 480 Instrumen

yang sudah dihidupkan.41

Tabel 3.1 Komponen Campuran SNP Untuk DNA Assay

Komponen dan konsentrasi bahan Volume akhir dalam larutan

Master Mix 0,95 x ((2n +1) x2,65) μl

rhAmp® SNP 0,25 x (2n+1) μl

Reporter Mix 0,05 x ((2n+1) x2,65) μl

dH2O 2 x ( 2n +1) μl

Penelitian ini menggunakan kit rhAmp® SNP Assay, S, 750 rxn dengan

Catalog Number: 297884076, SNP Id: rs5186, dan SNP Type: Exon. The

LightCycler® 480 merupakan instrumen rapid thermal block cycler yang

terintegrasi secara real time dengan kemampuan mendeteksi secara online.

Setelan ini memungkinkan dilakukannya PCR homogeny, yaitu amplifikasi

secara simultan dan deteksi target asam nukleat. Deteksi target asam nukleat

dilakukan dengan menambahkan fluorescent double-stranded-DNA-

specific dye atau sequence-specific oligonucleotide probes yang dilabeli

oleh fluorophores. Kedua pewarna tersebut memungkinkan pengukuran

produk PCR saat amplifikasi, yang merupakan dasar dari PCR Kuantitatif

(qPCR).41

39

Gambar 3.2 Penyusun Utama Dari The LightCycler® 480 Instrumen.41

Terdapat dua cara untuk menganalisis SNP pada The LightCycler®

480, yaitu Endpoint Genotyping Analysis dan Melting Curve Genotyping

Analysis. Penelitian ini menggunakan Endpoint Genotyping Analysis untuk

menganalisa hasil PCR. Endpoint Genotyping Analysis dilakukan dengan

cara deteksi sinyal fluorescent dengan 2 label probe hydrolysis (satu untuk

setiap alel) pada dua saluran. Probe digunakan untuk memberikan label

pada target DNA tipe wild type dan mutan dengan warna yang berbeda.

Sofware The LightCycler® 480 menentukan genotip berdasarkan distribusi

intensitas kedua pewarna setelah proses PCR. Di bawah ini merupakan

representasi dari Endpoint Genotyping dengan reporter pewarna berbeda.41

40

Gambar 3.3 Representasi Proses Endpoint Genotyping Dengan Pewarna

Berbeda.41

A : Sequence-specific probes dengan pewarna reporter yang berbeda.

B : Saat fase elongasi hanya probe sesuai yang akan dibelah,

memisahkan reporter pewarna dari pemadam.

C : Reporter pewarna yang terbelah akan memancarkan sinyal

fluoresensi.

D : Scatterplot akan menampilkan intensitas akhir fluorescence dari

beberapa sampel sehingga lebih mudah untuk diidentifikasi.

Intensitas tinggi dari probe alel X akan berada lebih kanan, intensitas

tinggi dari probe alel Y akan berada lebih tinggi, dan intensitas

tinggi dari probe kedua alel (heterozigot) akan berada lebih kanan

dan atas.41

41

Berikut adalah langkah penggunaan LightCycler® 480 Software.

Pertama aktifkan computer dan mesin LightCycler® 480. Kemudian buka

the LightCycler® 480 Software main window. Lalu masukan LightCycler®

480 Multiwell Plate 96 white ke dalam mesin LightCycler® 480. Berikutnya

isi informasi sampel pada Sample Editor dan klik tombol Analysis pada the

LightCycler® 480 Software bar module. Setelah itu pilih Endpoint

Genotyping pada Analysis Type, serta pilih subset All Sample dan klik

simbol Check. Kemudian dialog “Create New Analysis” akan terbuka dan

pilih kombinasi filter yang akan digunakan. Untuk list alel X pilih Fam dan

untuk list alel Y pilih Vic. Selanjutnya Screen Genotyping Analysis akan

terbuka seperti gambar di bawah ini.

Gambar 3.4 Screen Genotyping Analysis.41

42

Langkah berikutnya yaitu pilih tombol Standards (in run) dan klik

tombol Calculate. Tunggu hasil selama + 120 menit (60 siklus). Hasil

kalkulasi akan ditampilkan seperti gambar berikut dan simpan hasil dengan

cara klik tombol save.41

Gambar 3.5 Hasil Endpoint Genotyping pada LightCycler 480® Software.41

3.8.5. Analisa Data

Data yang telah diperoleh berupa genotip gen AGTR1 rs5186 (AA, AC,

dan CC), alelnya, dan jenis kelamin subjek penelitian dianalisis. Data

disajikan dalam bentuk tabel dan penjelasan deskriptif mengenai hasil yang

diperoleh.

43

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

4.1.1. Karakteristik Responden Berdasarkan Jenis Kelamin

Penelitian ini melibatkan 120 responden yang terdiri dari 60 responden

normotensi dan tidak memiliki riwayat hipertensi pada keluarga intinya

serta 60 responden lainya merupakan pasien terdiagnosis hipertensi dan

telah mengonsumsi obat antihipertensi secara rutin. Distribusi gender dari

seluruh responden lebih banyak perempuan pada kedua kelompok sampel.

Tabel 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden

Normotensi Hipertensi

Jumlah % Jumlah %

Jenis

Kelamin

Laki-Laki 15 25 14 23

Perempuan 45 75 46 77

Total 60 100 60 100

Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui bahwa lebih banyak jumlah

responden perempuan baik pada responden normotensi ataupun hipertensi,

dengan 75% perempuan dan laki-laki 25% pada responden normotensi.

Pada responden hipertensi yang berjumlah 60 orang terdiri dari 23% pasien

laki-laki dan 77% pasien perempuan.

4.1.2. Karakteristik Responden Berdasarkan Usia

Kategori yang digunakan untuk mengelompokkan usia responden

bersumber dari Departemen Kesehatan RI tahun 200942 yang terbagi ke

dalam 6 kategori yaitu:

44

Tabel 4.2 Karakteristik Responden berdasarkan Usia

Kategori Usia Variabel Jumlah %

Remaja akhir 17-25 tahun 60 50

Dewasa awal 26-35 tahun 1 1

Dewasa akhir 36-45 tahun 9 8

Lansia awal 46-55 tahun 22 18

Lansia akhir 56-65 tahun 23 19

Manula >65 tahun 5 4

Total 120 100

Sejumlah 50 % sampel merupakan kelompok remaja akhir yang berasal

dari seluruh responden normotensi (60 orang). Persebaran kategori usia

responden hipertensi lebih banyak pada lansia akhir (19%) dibanding

kategori usia lainnya. Terdapat 4% responden hipertensi yang sudah masuk

ke dalam kategori manula.

4.1.3. Karakteristik Responden Berdasarkan Tekanan Darah

Pengukuran tekanan darah dilakukan 1x saat pengambilan sampel

saliva dari responden. Setelah itu hasil pengukuran tekanan darah responden

diklasifikasikan menurut JNC VIII ke dalam 4 kelompok8, yaitu:

Tabel 4.3 Karakteristik Responden berdasarkan Tekanan Darah

Tekanan Darah Jumlah %

Normal 60 50

Prehipertensi 18 15

Hipertensi grade 1 32 27

Hipertensi grade 2 10 8

Total 120 100

45

Sejumlah 60 orang dengan tekanan darah normal merupakan responden

normotensi (50%). Sedangkan pada responden hipertensi 15% orang

termasuk ke dalam kategori prehipertensi, 27% orang memiliki hipertensi

grade 1 dan 8% orang memiliki hipertensi grade 2 .

4.1.4. Karakteristik Responden Berdasarkan Genotip

Probe yang terkandung di dalam rhAmp SNP akan berikatan dengan

sekuens dari rs5186, terdapat 2 label probe yaitu fam yang akan menempel

dengan alel A dan Vic yang akan menempel dengan alel C. Ikatan ini akan

terbaca saat proses RT PCR.

Tabel 4.4 Karakteristik Sampel Bedasarkan Genotip

SNP Risk

Allele

Alel Normotensi Hipertensi

Jumlah % Jumlah %

rs5186 C AA 5 8 9 15

AC 16 27 20 33

CC 39 65 31 52

Total 60 100 60 100

Berdasarkan tabel tersebut diketahui pada responden normotensi

terdapat 8% genotip tanpa alel berisiko (AA), 27% genotip heterozigot (AC)

dan 65% genotip mutan (CC). Untuk responden hipertensi terdapat 15% alel

AA, 33% dengan alel AC, dan 52% alel CC.

4.1.5. Frekuensi Alel rs5186

Hasil screening dari 120 responden dikelompokkan menjadi populasi

normotensi dan populasi hipertensi menghasilkan 240 alel. Distribusi alel

ditampilkan dalam tabel di bawah ini:

Tabel 4.5 Distribusi Alel

Alel Normotensi Hipertensi

Jumlah % Jumlah %

A 26 10,83 38 15,83

C 94 39,17 82 34,17

Total 120 50 120 50

46

Sejumlah 60 sampel pada responden normotensi didapatkan 10,83%

dengan alel A (nonrisiko) dan persentase jumlah alel C (risiko) adalah

39,17%. Pada responden hipertensi ditemukan distribusi alel serupa dengan

alel A sejumlah 15,38% dan alel C 34,17%.

4.2. Pembahasan

Hipertensi merupakan tantangan bagi tenaga kesehatan tidak hanya di

Indonesia tetapi juga di dunia, karena penyakit ini muncul tanpa gejala

(asimptomatik) dan baru akan terdeteksi apabila sudah muncul komplikasi.

Kejadian hipertensi di Indonesia dari tahun ke tahun juga meningkat.

Sebagian besar kasus hipertensi merupakan tipe hipertensi primer yang

dipengaruhi oleh genetik (95%). Telah banyak studi dilakukan untuk

mengidentifikasi marker genetik yang menyebabkan hipertensi primer, gen

pengkode Renin Angiotensin Aldosteron Sistem (RAAS) diidentifikasi

sebagai gen yang memengaruhi tekanan darah dan jika terjadi polimorfisme

akan menyebabkan hipertensi primer. Hasil akhir dari sistem RAAS adalah

angiotensin II yang merupakan vasokonstriktor paten sehingga meningkatkan

resistensi perifer dan darah balik vena. Peningkatan ini akan mengakibatkan

peningkatan tekanan darah.13,16

Salah satu SNP yang diduga berperan dalam regulasi gen RAAS adalah

rs5186 (AGTR1) yang merupakan pengkode reseptor angiotensin II tipe I,

berfungsi sebagai vasokonstriktor serta meningkatkan retensi garam dan air

pada ginjal lalu terjadi retensi cairan sehingga apabila teraktivasi akan

menyebabkan peningkatan tekanan darah.13,16 Beberapa studi dilakukan

untuk mengetahui apakah SNP rs5186 berhubungan dengan kejadian

hipertensi primer, tetapi masih terdapat pro dan kontra tentang kepastian

bahwa rs5186 berhubungan dengan hipertensi primer.

Meta-analisis yang dilakukan oleh Yang Y. et al menemukan adanya

asosiasi antara genotip rs5186 dengan hipertensi terutama pada Kaukasia.

Yang Y. et al menemukan 689 publikasi yang sesuai dengan topik tersebut.

Setelah dikaji kembali sesuai dengan kriteria inklusi dan ekslusi hasil

akhirnya menjadi 45 studi yang dimasukkan ke dalam meta-analisis.

47

Penelitian ini juga menemukan risiko hipertensi lebih tinggi pada alel C

dibandingkan A (P<0,00001). Tetapi terdapat limitasi pada meta-analisis ini

yaitu studi yang dievaluasi tidak heterogen, studi dievaluasi jika di terbitkan

dalam bahasa Inggris, hasil meta-analisis ini tidak memerhatikan faktor

eksternal (intake garam, riwayat merokok, dan obesitas) yang berhubungan

dengan progres hipertensi, dan hanya polimorfisme A1166C yang dievaluasi

sedangkan polimorfisme lain tidak.43

Studi yang di terbitkan pada tahun 2015 dilakukan oleh Yang C. et al

meneliti tentang interaksi genetik dari 8 Single Nucleotide Polymorphism gen

Renin Angiotensin Aldosteron Sistem terhadap asosiasinya dengan

hipertensi. Salah satu polimorfisme yang diteliti adalah rs5186 yang

merupakan bagian dari gen AGTR1. Penelitian ini menyebutkan bahwa

hipertensi disebabkan oleh interaksi beberapa gen risiko. Polimorfisme

rs5186 baru akan meningkatkan risiko hipertensi apabila terdapat 6-7 lokus

lainnya (rs4762, rs699, rs5051, rs5050, rs11568020, rs5049, dan rs4646994).

Penelitian ini menggunakan pendekatan MDR (Multifactor Dimensionality

Reduction) untuk mendeteksi interaksi antara gen. Penerapan pendekatan

MDR ini berisiko menyebabkan hilangnya informasi resampling sehingga

dapat mengakibatkan bias.44

Terdapat dua studi yang dilakukan di Jepang, menyatakan bahwa tidak

terdapat hubungan antara polimorfisme rs5186 dengan hipertensi.45,46 Ono K.

et al melakukan penelitian dengan 3,918 subjek yang terdiri dari 1,492 subjek

hipertensi dan 2,426 subjek normotensi dari populasi Jepang dan

mendapatkan hasil serupa yaitu tidak terdapat hubungan antara polimorfisme

A1166C dengan tekanan darah pada populasi Jepang. Tetapi Ono K. et al juga

menyatakan bahwa penelitiannya tidak menyangkal adanya hubungan antara

reseptor AGTR1 dengan hipertensi di Jepang karena masih terdapat

kemungkinan polimorfisme lain pada gen ini berhubungan dengan regulasi

tekanan darah.47

Karakteristik usia pada responden normotensi sejumlah 60 orang

termasuk ke dalam kategori remaja akhir. Pada responden hipertensi

karakteristik usianya tergolong kedalam kategori dewasa awal hingga

48

manula, tidak ditemukan hipertensi pada kategori remaja dan prevalensinya

yang terus meningkat seiring bertambahnya usia sesuai dengan data

RISKESDAS tahun 2018 mengenai prevalensi hipertensi berdasarkan usia.2

Berdasarkan tekanan darahnya responden normotensi seluruhnya memiliki

tekanan darah normal (50%). Berdasarkan klasifikasi tekanan darah

responden hipertensi lebih banyak memiliki hipertensi grade 1 (27%)

dibandingkan hipertensi grade 2 (8%) dan prehipertensi (15%). Adanya

responden hipertensi yang masuk ke dalam kategori prehipertensi dapat

diakibatkan dari penggunaan obat anthipertensi.

Persebaran genotip rs5186 di dunia adalah sebesar 78,9% genotip AA

(wild type), 18,7% genotip AC (heterozigot), dan 2,4% genotip CC (mutan).

Asia Timur khususnya wilayah Jepang, Cina, dan Vietnam memiliki

persebaran serupa yaitu 88,3% genotip AA (wild type), 11,5% genotip AC

(heterozigot) dan 0,02% genotip CC (mutan).48 Hasil tersebut berbanding

terbalik dengan penelitan ini. Persebaran genotip dari 120 sampel yang diteliti

yaitu 12% memiliki genotip AA (wild type), 30% genotip AC (heterozigot),

dan 58% genotip CC (mutan). Perbedaan tersebut dapat disebabkan karena

adanya variasi genetik dari suatu ras. Hal menarik lainnya pada penelitian ini

adalah ditemukanya genotip AA (wild type) pada responden hipertensi (15%),

hasil ini dapat disebabkan karena adanya faktor eksternal yang turut berperan

dalam terjadinya hipertensi esensial.

Persebaran alel A dari rs5186 sebagai alel mayor di seluruh dunia (88%)

dan alel C sebagai alel minor (12%). Asia Timur memiliki persebaran alel

yang sama, dengan A sebagai alel mayor (94%) dan C sebagai alel minor

(6%). Data Asia Timur yang digunakan berasal dari populasi Cina, Jepang,

dan Vietnam.48 Uniknya hal tersebut berbanding terbalik dengan penelitian

ini, pada penelitian ini alel C dinyatakan sebagai alel mayor (73,33%) dan

alel A sebagai alel minor (26,67%) karena alel C lebih banyak ditemukan.

Pada responden normotensi lebih banyak ditemukan alel C yang merupakan

alel mutan (39,17%) dibandingkan alel A atau wild type (10,83%). Persebaran

serupa juga ditemukan pada responden hipertensi dengan persentase alel C

atau mutan (34,17%) lebih banyak dibandingkan alel A (15,83%). Tingginya

49

persentase alel mutan pada responden normotensi dapat disebabkan karena

usia responden ini masih tergolong usia remaja akhir. Karenanya, pembawa

alel C (mutan) pada responden normotensi harus lebih menerapkan pola hidup

sehat agar mencegah terjadinya hipertensi esensial pada masa yang akan

datang.

4.3. Keterbatasan Penelitian

Penelitian ini memiliki keterbatasan antara lain:

1. Penelitian ini tidak memiliki data mengenai pola makan responden

(intake garam) yang berhubungan dengan kejadian hipertensi esensial.

2. Penelitian ini tidak memiliki data ras/suku responden normotensi dan

hipertensi.

3. Adanya perbedaan kuantitas dari sampel saliva yang dikumpulkan karena

responden sulit mengumpulkan saliva hingga batas yang ditetapkan.

50

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Gambaran persebaran polimorfisme rs5186 ditemukan genotip mutan

(CC) lebih tinggi dari heterozigot (AC) dan wild type (AA) pada masyarakat

Ciputat Timur.

5.2. Saran

1. Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengetahui apakah terdapat hubungan

antara rs5186 dengan kejadian hipertensi.

2. Diperlukan data tambahan berkaitan dengan faktor eksternal kejadian

hipertensi pada populasi penelitian.

3. Diperlukan data kuestioner mengenai ras/suku dari responden.

51

DAFTAR PUSTAKA

1. Pusat Data dan Informasi Kementrian Kesehatan RI. Hipertensi. 2014: 1-8.

2. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementrian Kesehatan RI.

Riset Kesehatan Dasar. 2018: 83-7.

3. Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, et al, editors. Buku Ajar Ilmu Penyakit

Dalam. Edisi VI Jilid II. Jakarta: Interna Publishing; 2014.p. 2259-300.

4. Liu D, Zhang Y, Hu B, et al. Association of AT1R polymorphism with

hypertension risk: An update meta-analysis based on 28,952 subjects.

Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System 2015; 16(4): 898-

909.

5. Chandra S, Narang R, Sreenivas V, Bhatia J, et al. Association of

Angiotensin II Type 1 Receptor (A1166C) Gene Polymorphism and Its

Increased Expression in Essential Hypertension: A Case-Control Study.

PLoS ONE 2014; 9(7): 1-9.

6. Nantel P, Cotret de RP. The evolution of angiotensin blockade in the

management of cardiovascular disease. Can J Cardiol 2010; 26: 7E-13E.

7. Yang Y, Mo Y, He Y, et al. Correlation between renin-angiotensin system

gene polymorphisms and essential hypertension in the Chinese Yi ethnic

group. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System 2015; 16(4):

975-81.

8. James AP, Oparil S, Carter LB, et al. 2014 Evidence-Based Guideline for

the Management of High Blood Pressure in Adults Report From the Panel

Members Appointed to the Eighth Joint National Committee (JNC8).

Journal of American Medical Association 2013; E1-14.

9. Afridi I, Canny J, Chonghua Y, et al. 2003 World Health Organization

(WHO)/ International Society of Hypertension (ISH) statement on

management of hypertension. Journal of Hypertension 2003; 21: 1983-92.

10. Perhimpunan Dokter Spesialis Kardiovaskular Indonesia. Pedoman

Tatalaksana Hipertensi Pada Penyakit Kardiovaskular. 2015; 1:1-16.

11. Lauralee S. 2016. Human Physiology From Cell to Systems. 9th ed. Canada:

Cengage; 2016.p. 365-74.

52

12. Kasper LD, Hauser LS, Jameson LJ, et al, editors. HARRISON'S Principles

of Internal Medicine. 19th Edition. United States: McGraw-Hill; 2015.p.

1611-26.

13. Hall EJ. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. 13th Edition.

Canada: Elsevier; 2016.p. 224-40.

14. Campbell KM, Farrell OS. Biochemistry. 8th Edition. USA: Cengage

Learning; 2015.p. 223-48.

15. Rodwell WV, Bender AD, Botham MK, et al, editors. 2018. HARPER'S

ILLUSTRATED BIOCHEMISTRY. 31st EDITION. New York: McGraw

Hill; 2018.p. 855-910.

16. Kohli S, Kumar R, Gupta M, et al. Impact of interaction between risk alleles

on clinical endpoints in hypertension. Heart Asia 2016; 8: 83–9.

17. Rodríguez MN, Romero PC, Cardoso G, et al. Association of angiotensin II

type 1-receptor gene polymorphisms with the risk of developing

hypertension in Mexican individuals. Journal of the Renin-Angiotensin-

Aldosterone System 2011; 13(1): 133–40.

18. Wang LJ, Xue L, Hao P, et al. Angiotensin II type 1 receptor gene A1166c

polymorphism and essential hypertension in Chinese: a meta-analysis.

Journal of the Renin-Angiotensin- Aldosterone System 2010; 11: 127-35.

19. Mottyl KA, Shoham AD, North EK. Angiotensin II type 1 receptor

polymorphisms and susceptibility to hypertension: A Huge review.

Genetics in Medicine 2008; 10: 560-74.

20. Yang H, Bai S, Wu Y, et al. Polymorphisms within angiotensin II receptor

type 1 gene associated with essential hypertension in Chinese Hani and Yi

minorities. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System 2015;

16(3): 653-59.

21. Bonnardeaux A, Davies E, Jeunemaitre X, et al. Angiotensin II Type 1

receptor gene polymorphism in human essential hypertension. Hypertension

1994; 24: 63-9.

22. Clauser E, Curnow MK, Conchon S, et al. Molecular structure and

mechanisms of action of mammalian angiotensin II receptors. Current

Opinion in Endocrinology and Diabetes 1995; 2: 404-11.

53

23. Cotecchia S, Exum S, Caron GM, et al. Regions of the alpha 1-adrenergic

receptor involved in coupling to phosphatidylinositol hydrolysis and

enhanced sensitivity of biological function. Cell Biology 1990; 87: 2896-

900.

24. Conchon S, Peltier N, Corvol P, et al. A noninternalized nondesensitized

truncated AT1A receptor transduces and amplified ANG II signal.

American Journal of Physiology 1998; 274: E336-45.

25. Lin J, Lin S, Wu Y, et al. Hypomethylation of the Angiotensin II Type I

Receptor (AGTR1) Gene Along with Environmental Factors Increases the

Risk for Essential Hypertension. Cardiology 2017;137: 126-35.

26. Nuyt MA, Szyf M. Developmental programming through epigenetic

changes. Circulation Research 2007; 100: 452-55.

27. Niu W, Qi Y. Association of the angiotensin II type I receptor gene +1166

A>C polymorphism with hypertension risk: evidence from a meta-analysis

of 16,474 subjects. Hypertension Research 2010; 33: 1137-43.

28. Pimphen C, Ahsunthornwattana EJ, Nisakron T, et al. Contribution of Four

Polymorphisms in Renin-Angiotensin-Aldosterone-Relates Genes to

Hypertension in a Thai Population. International Journal of Hypertension

2019; 1-8.

29. Reece RJ. Analysis of genes & genomes. England: John Wiley & Sons;

2004.p.153-81.

30. Handoyo D, Rudiretna A. Prinsip umum dan pelaksanaan PCR. Unitas

2001; 9:17-29.

31. Loftis DA, Reeves KW. Principles of Real-Time PCR. Veterinary PCR

Diagnostics 2012; 3-17.

32. Sambrook, J, Russel WD. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3rd

Edition. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press; 2001.p. 8.86-95.

33. Dale WJ, Scanhz VM. From Genes to Cells. New York: John Wiley & Sons;

2002.p. 161-73.

34. Munshi A. DNA sequencing-methods and applications. Croatia: In Tech;

2012.p. 1-13.

54

35. Pingoud A, Jeltsch A. Structure and function of type II restriction

endonucleases. Nucleic Acid Research 2001; 29: 3705-27.

36. Wilson GG, Wang H, Heiter FD, et al. Restriction Enzymes in

Microbiology. Encuentro 2012; 19-48.

37. Maurya KG. Restriction Enzyme. Encyclopedia of Animal Cognition and

Behavior. Switzerland: Springer Nature; 2019.p. 1-4.

38. Jasaputra KD, Santosa S. Metodologi Penelitian Biomedis. Bandung:

Danamartha Sejahtera Utama; 2008.p. 43-61.

39. Dahlan MS. Besar Sampel dan Cara Pengambilan Sampel dalam Penelitian

Kedokteran dan Kesehatan. Jakarta: Salemba Medika; 2013.p. 56-60.

40. Sugiyono. Metode Penelitian Kuantitatif, Kualitatif dan R&D. Bandung: PT

Alfabet; 2016.p. 117-32.

41. Roche Diagnostics GmbH. The Light Cycler® 480 Instrument Operator’s

Manual Book Software Version 1.5. Roche Applied Science; 2008.p. 90-

232.

42. Departemen Kesehatan RI. Klasifikasi Umur Menurut Kategori. Jakarta:

Ditjen Yankes; 2009.

43. Yang Y, Tian T, Lu J, et al. A1166C polymorphism of the angiotensin II

type 1 receptor gene contributes to hypertension susceptibility: evidence

from a meta-analysis. Acta Cardiologica 2017; 72: 205-15.

44. Yang HC, Lin DY, Wu JS, et al. High Order Gene-Gene Interaction in Eight

Single Nucleotide Polymorphisms of Renin-Angiotensin System Genes for

Hypertension Association Study. BioMed Research International 2015; 1-

11.

45. Takami S, Katsuya T, Rakugi H, et al. Angiotensin II type I receptor gene

polymorphism is associated with increase of left ventricular mass but not

with hypertension. American Journal of Hypertension 1998; 11: 316-21.

46. Kato N, Sugiyama T, Morita H, et al. Comprehensive analysis of the renin-

angiotensin gene polymorphisms with relation to hypertension in the

Japanese. Journal of Hypertension 2000; 18: 1025-32.

55

47. Ono K, Mannami T, Baba S, et al. Lack of Association between Angiotensin

II Type 1 Receptor Gene Polymorphism and Hypertension in Japanese.

Hypertension Research 2003; 26: 131-4.

48. Rs5186. Available via:

http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Explore?r=3:148741701-

148742701;v=rs5186;vdb=variation;vf=37049616. Diakses pada 10/09/19.

56

LAMPIRAN

Lampiran 1 Susunan Basa Nitrogen Gen AGTR1 pada Manusia

TATGTTATTGGATTCAATTTGCCTACATTTTGTTGAGAATTTTTATCTATACTCTTAAGA

AATATTGATCTGTAGTCTCGTGATGTCTTTATCTGGTTTTGTTATCAGGGTGATACTGGC

CTCATAGCATGAGTTGGGAGATCATCCTTACTCTTCTATTTTTTGGAAGAGTTTGTGAAG

AATTGATATTATTTCTTCTTTAAATATTTATTGGGTTTTTAAAATACATTTTTAAAATGC

AACTTGGGTAGCATGTCCAATAGGAACAAATGAGTGTCCACCCTTGAATTTCATAACCCT

GGAATTAATCCATGTAATCTATGATCCACAACTGTATTACCAAAGTTCGAGTTACTCATA

GGAAAGAGAAAGAAGTTCTCTAATTCGTCCTTAAAAGTTTTCCAAGTTCAGAAAAAAAAA

ATGTTGAAGAACACGAATCTCCGCAGGAAATGATACTCCTGTACCCCCAGCTCGCTCTCC

CTCACGACCCCTCGCTAGGCGGGGTTCGGGACCAGGTGAACGCTGATCTGATAGTTGACA

CGGGACGACTGTGGCATCATCCTTGCTGCCGTCAATATCCCGAGAGGGAGGAGGTTGGGC

CGGGAGGGTCTCCCGGGGCGGGGCGGAGGAGGAGGGAATGCAAAACAGAGCCTCGTCCCC

GGAACCCAAGAAGCAGCAACGCCCCTCACTATAAATTCGGAGCTGCCTCCTCGCCAATGA

TTCCAGCGCCTGACAGCCAGGACCCCAGGCAGCAGCGAGTGACAGGACGTCTGGACCGGC

GCGCCGCTAGCAGCTCTGCCGGGCCGCGGCGGTGATCGATGGGGAGCGGCTGGAGCGGAC

CCAGCGAGTGAGGGCGCACAGCCGGGACGCCGAGGCGGCGGGCGGGAGACCCGCACCAGC

GCAGCCGGCCCTCGGCGGGACGTGACGCAGCGCCCGGGGCGCGGGTGAGTCCGCGCGGAC

CGCCAGGCATGCTTGGGGGACTTCAAGGGCGGGGTGCTAAGTTTCATGTCACGGTGTCCT

AACTGCTGGCTCTATACTGGGAAGCTCTCGGGGACCAAGGAAAGAGCGACCGTAGTTCTG

GTCAGCGCCTGCCCCTGGAGCTGGCCACACTTTCCCAAATCAGGTGAGGGGCTTCTGGAA

TGGGAGGGAACAAGGTAGGTTTGTTTGCCACGTGCCTCGAAATTCTCAATCCATTTTAAC

CAAACTCTTCCGAGTGCAAGGAAGAAATCTACAGAAATAAGATGCAATTCAATAAACTTT

CTTCCTGAGGCTTTTAGTTAACTCTTGTATTTTAGCCATCATCTGAGCGGGAAGCCGGTA

TGACTCTGCAAGGCGTTCGTTTAAAAGTTGTGCTACTTTTGAGGTGAAGTTAAGAGTGTC

TCCATCCACGCCCTCTGCTTCCCAGTCAATGTCCCTGCACTGCTCACGTCCCTTTAGCTC

TCTCCCTGCAAACCATAGCGGTGGGTCCTAGACACGGGACATCGCTCCAACCTTGGCCAA

ACTCTCCCACCCTCAGGGTTCCCAGATGTCCTTTGAATAATCAAACTGAGGAAGGAGAAG

CAAGATGTCTCCACACCCCAATCCCTACAGCCTTAGCCAATGCATGTGTGTAACTGAGAC

AGAATTTTAGCAAAAGGTCTCCTGCTTCCAGGACTAAACAGAGCCTCTGGCAGGCCACTG

CCCGACACCCAACTCCATCCTCCAATTTTCTTAAATGTCCAGGTAAACATCTCCATAGTG

CCAGCCTGCTATAGTCTCCCGAAGACCTCAGCAATTCTTCCCCAAAGCGTCTCCTTCTGC

ACCGTTTTTTTCTTTGGGCAACCATTTGTGACCTGGCTATTGAGCCCACCTGGGCCTCTT

CTCTTTGTTTGCTGATAGCCTCGTTAAGTATTAAAAACCTACTCCCCCCCTTCAGGAGCC

CTCTTTTAATGAAAGTTTGGGTACTGGGATCAGATTTGGGACTTGGCTACATTTATTTCC

TGTGTCATTCTGAGAAGAGAAAGTAATAGAGGCAAGAAATTTGGCACCCTATTGATCTAT

TTTATTACTTTGTTGAGCAACTTGTGCTTCCCGCTGAAGATGCTGCATCCCAACATGATT

CTCTTATTATTAGTTACCACCTGAGGGTTTTGGATCTCCAGGTGTTTATTTCACATAGCA

TATGCTTTAACCCCCTTATAAGTCTTCTCTAAGGAAGAAACTGCCATACTTCCCTTGTCT

TCTCCGGTGTTTCCCTAGCTATAAAGGCCCCACCTGCATAACCTGTCCTCAGGCTGTGAT

GTATTCCCGGGTGCCCTGGTACCTTCTCCTTCCTCTCCACCACCCTTCCTGACAGTGCAG

GGGCAGGAAAGCATGGGGAGAAGGGAAATGGAGACTCCCACTTAACTTGCTGTGTGATAG

TAAGAGCATTATTTCACAACTCTGAACCTCAAGTCTCTGCCCATAAGGTTCCCTCCAGTG

ATATAATTCCTTAATTTCTTTTGTTTTGGTTATTGCTTTAAAATAAAAGTCTAAGCTTAA

GGCTAGGTTATAGAAACTGCCCATCATAATTGCTAGGTCTCAACATTTGCTTAAGTTTTG

TGATTCTTAGTTTCAAGTCTGTTACCCACTCTCTCTCCCCGCCACCTTTTTTCCCCCTGA

CTTCATTGTTCTTTGTTCCCATCCTGAGGCCTTGATTTCTGGTTCTGCTCTTCTTTGACC

TTAAACTGAATCAACTCTTCCATCATCCAACTCAGAATAAAATTGGTTTTCTTCCACCGG

TTCCACTGATGCCAATGGAAGACTTGTCTTCCTTGCGATTTGCAAAATGTCTTTCAGTCA

CAGGTGCTGCGGCAATGCTGCTGTCCCACAGCATTCTAAGCTTCAGTCTTTCTCTCTCTT

ATCGTGGGTCAGTATTCAGAAAAGGGCAGATTTGTGGGTTGTTCAGGTTTCTCACTTTTC

TTTTTCTTCTTTCTAGTTTGGGATCAGAGTTGTGTGAGTATTTGTGTATATAATTTTGTT

TTGGTTTTTTGTTCCTGCTGCTACTTACGACTGCTGTTATTATTTCAATTATGACTAATT

AATACTAATGACTAATTTTCCCCTATGCTAGAGGGAAAATAAGGAAGAAAAGTTTACTCT

GCTACTTACCCAAAGCCCAGGTAAAATGCTTAGCTGAGAAGGAATTTAAAACTCATAGTT

TAAATGCATGATGCATGTCTGCTGTCATTTTATCTGTGCTGCCACAGTGTCCTTTCAAGC

AGATAACTGAGAGTTGCTGTATTTTGCTTTCGAATTTGTTACAGGGACAAAAATAGTGAC

CCCTCACATTTAGGTGTTTTGGCTGCTTAATGCGAGCTCCTGCCCTCTAGCCGCATGCTT

ATTAGTTTACCTAGCCCTTTTTCTGGTCAGTCATGACTGGAGAATGCCAAAGAGTCTCCC

AAGTAGGCTACCAAATTAAGAATTGTGTTTAGAAGTTTGAAGTCAGTCCAAGTGTTGTAA

57

AGATTAAAACGTTGTTTTGAAGATATGCTGTGTCAATAAACAAATATGGAGCCAGAGCAA

CACAATGTGACCAAGTGTCCAAGCCCAGCTTAGGAACACTTTTCTCCCATGTTATCTAGC

AAACTGACAAATCAGCTTTCCAACACGTGATGATTGGAAAATGCTATTAGTTTCCTTCAA

AATTCTCCTAATGTTTCTTTTTCAAAATTGCCTAAGATCATTGGATTATGTGGTTTGTGT

TTCTTTTCACTGTAGCTGCTTGTTAAAGCAGTATACTCAATCTCTGATAAGCAACAGTAA

ATTTGATCGATTTGTATCCTAAATTTAGCTATCACTTTACATTTTGTTTTATTCATAATA

TGAACTTTAGCTTCTAAAAATCAACTTTTTAATAGCTTAATATATAAAGCCATCTTAAAT

CAAGGAATATCTATAGGGACTTAAGGTAATATTCAACTAAATTGGCAAGTGACTACCATT

ATCCTATTAAAGCTCTAAAATGCAATATTTCAATCACAGAAAAAAAATCTTATAATTTAA

AGAACTATAAATTGCCAGATGTTTCCCTAGTTATTACGTTAGTGACAAATTAGACAACTG

GAAATAGAAAACAGAGTATATGTTTGGAACAGTCATAAAAGGACTAGTGACTATTGCTGC

TAGCTGTGGTTGTATTAACATTAAAATATTTGCTATGGGATTTTTCTTCTTATCAAAGCA

GATGCTCAGATGAGGAAAAACTTTCTTGCATATGAAAATCAAAATTGTCTTCCAAAATAT

TTAAGTAACAAAAAATTCATTATGTAGTATAAATGCTGTATGATTACATTATTCTTATAG

TTAATTTAGAAGGGTTTGAATTTGTTTTTGTTTTGTTTGTGTTTGTTTCTTCGATAGGTG

CATTCTCTAACTGTCTTAAGTAGAAACAAATGTCTAGAATCTCTCAGTGATTATCAGTCT

CCTTCCTATTACCAAGAATGTTTTTATTGTGTTGTTAATCTCACATGTAATTTTTTTAAC

ATTTAAAAGTTTGGAAAATGGGTAAAAAATGAGTGTGCCTTGTTTCCTATTATTACAATG

TGCCTTCCTATTTCAAGTCCCAATTCTAGATTTCCTTAAAACTTAAAATCATAGAATTAA

TAATCTTTCAGTTTAAGTCAACTTTTGTGTGATTTCTTGTCCACTTATACACACATAGAT

GCCTTCATCTTCACCAAATAATGTAGAAATTTTATTTAGTTCAATGGATTTAAGTACTCT

GTATGCTTAAGTACAAAATAAGAATATTGAGAAATACACATATGATTGTGTACCTTTTTT

TTTTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTTGCTCTGTTGCCCAGGCTGGCGTGCAGTGGCATGAT

CTCGGCTCACTGCAACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAATGATTTTCCTGCCTCAGCCTCCTT

AGTAGCTGGGATTACAGGTGCATGCCGCCACGCCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGA

GAAGAGGTTCGCCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTTCTGACCTCAAGTGATCTCCCT

GCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGACATGAGCCACCTCACCTGGCCTGATTTT

GTACTTTTAAAGAGAATTTGTTGTTGCTAATTTGCTAAGTTTATTTAGATATTTTCTGAT

TCTATATTAGTCAAAGCTCCTCTTATCTACTTTGGAAAATGAAGAATTATGTCTATAAAA

TATATCAACAACAGCTGCAGGTACTTACAGAGGAAATACTGTGGATCTGAGTGATATTAG

GCCCTGAGGATACAAGCCAAAGTATAAAAATGGTCTTTGCCGTAGAGAGATAGTAGTCAA

GCTAAGCACATATTTTGGCATGGGTCTCTAATAGCCTAATGCTAGTAGGGTGGGAAGCCA

TTTAAAAATGGCCCCTCCTTCTGTCCTGCCTTTCAGACCAGATGGTGTGTCTAAAGTGGT

CACACTGTTTGGTTCTGGCCACTTCTGTAATAACCACTGCTCCTTTCCCCTCCTCGTGAG

ATTATAACTCCTTTGACAGTATGGATGGCACCTAACGCATCCTTGTTTTCTTTTACTAAA

TGTTCCACGGAGTCACTTGCTTGCCTGTTTGTTGCTTATTTGTTTGTTTTTGGCTAAAAC

TACAGAAAATGTTAAATACATTTTCAGACCTTTATATTTTAAAAAAGAAATGTTAAGAAA

TAAATAATTTTTCTAATCTCATTTAGATACACTGTCCTATTACACACAATGACAAATTTG

ATGCTTTTGTCTTGCTAATTGAAGAGCTAAGCATGAATACAGTTTTTCAGTCTACAGCAG

CAATGACAAGGGTAAAGTGGAGAAAAGAGTAAGGAAAGAAAAAATTAAAAAGAATAAAAG

GTTGAAATATCAAATCGGTGGTTCTTAAGATGACAGAGGCAGGTGAGACAAGAATACTGG

AATCACCCAGGGGGCATATGAAATCTGTACATTTCATCCACACCTTCTTTTCTCCCCCTG

TCCTCATTCCCCCTGTTGAGACACATTGTATTACAAATTAGGAGGAAACCATCTAAAATT

ATCTCACGTATCCCAGTTCCCATATTAGCATCATGAGTATCACCTGAGAGTTTGTTGGAA

CTGCAGAATCTCAGACCCTGTCCAGACCCATTGATTGCATAAGAATCTGCATTTTAGCAA

AATCCTCAGGTGATTCAAATGCACATTAAGGGAAAAGAAACACAGTGTACCGTACCTGTG

GCTTGTTTAGAATAATTATGAAGAGGTGTTTTCTTGGCTCTTAACTAACGTTTTTAATAA

AGCTAATATTTATTGAGTACATAAATGTGCCAAACACAACGTTCAGTCTTTCTTTAAATT

TTTTTTATTTAATCCTCACAACAACCCTGTGAGATAGTTTCTGTTTTATCCTTATTTTAT

AGATTGGGATACCAAGTAATAATGAGATAAGTAGTTTACCCAAAAGCTGTAACTGATACA

GTCGAGATGTAAACATAAGAATTCTAATTTCATTGCCTGTTCTCTTAGCTGTTACCTACA

GTGTCTGCTCTATACTGGGCTACCTACTTTTTAAGGCCAACTAATTATTTGAAAATTTAT

TTAAAGTTTTAATTTGAGATCAAAATCTGTTTCCCTCATAAATTTTTTTTAAAAAAAGCA

AACAAGATCTATTCCATTTTGATCTAATGTTTTCCTGTCACCTTACCTTTAAGTGCAATA

ATGGGAAATTCTAGAAATTCCTTCTTTAACTGTTTGAAAAAATACCAAAACTATGACAGC

CTGTCCAAATCCACTAAAATATATTTTTATATGCATGCTTTTTGTATATCAATTATACTT

CAATAAAGCTTTTTAAAAAAATAGTAGATGACATACTTTTAAAAATTAACTTTGGAGCCC

AGGTATGGTGGCTCAGACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGATCACTTGAGGCCAGGAG

TTTGAGACCAGCTGAGGCAACAAACTGAGACCCCCATCTCTACAAAAAATAAAAAATTGC

CAGAGCATGGTGGCGCACACCATGTAGTAGTTGGGACCTGTAGTCCCAACTACTCAGGAG

ACTGAGTTGGGAGGATTGCTTGAGTCTGGGAGGTGAAGGCTGCAGTGAGCCATGATCACA

CCACTGCACTCCAGCCTGAGCAACAGAGAAAGACCCTGTCTCGAATAATAATAATAATAA

TAACAACTTTTGATATCTCTATTTTTTCCCATAAAAATCCAAAATTTTCTGTTTACTTTT

TGGTGCTCTCATGCTATAAAGTAAATTCTCCCTTGGATTGGACAAGTTATTTTCTGTTTT

58

CTACATACACATAGACTGTTCAGCATTCCAACTCAAATTACATATTACTTTTTCAGCTTT

TAATATAAATGCTTATTTACTACAAGCATGGTTTACAAAAATGTAGTAAAATATAGTTAC

TAACCAGTCAATGCTCAAGCCAGTGACTCCCCAAATGATTCAGTCCCTGAGCTGTTTCAC

CCAGTGCAGGTAGATTCTCTGACAGCCATCAGTTGGATCTGTCCGAATATCTCCTGTTTT

GACAGGGGCTTATTGATGTTGGTCAAAAGACAGGTGTGTATGGGTTCCCTGGGATCATGT

TTGAGGGGAAACCTGTGCCAACAGGACTGAGCAGCCACTTTTTCAATGGTATTGAGAAAA

TTTGTAGGAGATAAAATTTCACCAGCTCCTTGAATCTAGAACTGTAGATATTCAGGTAGC

ACTGACATTACAACATCTAATTTGTAAGTTATGGGTTAGGGCAAAATCAATCCAGGGCTG

CCATCATGACAAGTAGTGGAAGTTTGAAAGAAGGAGAAATACCCAAAAGATATCTTACAC

ATAGCAGGCAGAGTTTCTTAGTACTAATAAAAAATAAAGTACCAGTGATCACCCTCTATA

GCCCCTAAGAGTCCCCTGGTTTCACTAAGCCCCAATATTTGTGGCTGTGGCTGAATGCAA

TCTGCACAAGGTTTTCTTTTTAACAGTTGGAAAAAATCTCATAGCATAGCATTTTTTTCT

TTTTAACAGTTGGAAAAATTCTCGTAGCATAGCATTTTTTTCTAGTAAATTTCATATACT

TAACAACTTTATCAGCACATATATTTTCCTTCACACTTACAATTTCATCAACACATATAC

TTTACTTTTTGACTCAAATTCTTCTTGCCATCAATTCAAATGCTCCTGCCCTTAGAATGA

GAATTTTCCATTAACCCAGCTTTAATAATCTAACTCTCCCATTCAAATGATGTCACTTCA

TATAAAACACATTTTATCATGATGTCTCCCAGCCCTCAGTTACACAGTTAATTGCTGCCA

CTTTATCATGAATGAAAAAGATGTGATTCTTGGGTAATGATTTCTTGAGTATGTCCTGGT

CTATTATCTACTGAGTTACCAGAGTGGATTTTTGAGAGAACACACAGTTATTCCTATTCC

TTTTAATTTCCATTAACTTAAGCCATATGATAGAACATTACAGTTGTTATATATTTTGTA

TAAATATAAAATGTAATATATAATTTATATATTTTAAAATATTTAGTGGCAAGTAAAGAT

AGTAGTAAGTGAAAAAATCACTGTATAACATATGAATCGTAAGTGTGATCCCATGTATGT

GTATACCTGGTAGATGCTTGTCAAGGTGCCATTAAGGTCTTGGGTTATTGGCATCTTAAT

GAAATTCATTTAATTATGTTAGGATTGATTTGTTAGTAAAATCACTTACATGTTTTTTAA

ATGCATGCATATCTGTGGAGCCAATAAGAAAAATTAGGAACAATATACAACAAATCTTAA

GAGCTTTTGAGGATGATTTTTTTTCTTTCTTTCTTTTGTATGTACCTACAAAATTTTCTA

TAATGGATCTCTATTGATTTTATATTTTTTACTTTCTATTTGTCTTGGAATTTCTATTAC

TTTATTTATAATTCACTCTAGATTTTAGGTACTAGACAACTACTATTAACTCTCTGGAGA

ATGGTACTATAAATCTGACCCTTTCTGTCATTTTTTTTTCCTGTGGTACACTAGTGTCTC

ACAAAGAGTCCACAGAATTCACACGGTCATGATATTTTATAGAAGAAATCATTTTATGGG

AACTTTCTTTTGTTAATAGATCCTTCCAATGCTAACATTATTCTGTATAACAGTGCTAAA

GTTGGTATGCCTAAATGCTAAACTTGGTATGCTAAAGTTGGTTTAAAAATTAACCTATAT

ACAATCTTCTTGAATAACTCTTCAACTTTAAATAAATTTCTTATTTAAAAAATCCTCCTA

TATATAATTAAAAATACTGATGAATTTGACTACATAAAAATAAATGCTTATACAGTAAAA

AGTACCATAAACAAAGTTATCATCTAAACAAGAAACCTGGGAAAGCTATTTGCCAGCCAT

TACATGTAAAATTTAAGTTTCCTTAACATAACATGAGCTCTTTAATGTGAGAAACAATAA

ACAACCTAATTGAAACATGAGCAAAAGCCATGGCTGAGAAAACTCGTAGAAGAATTACTA

TGGAAACAATAAGAAAATGAAAAGAAGTTCAACCTCATTCATAATTAACGAAATGCAAGT

CAAAACAAAGATATACCTTTTACTTATCAGATAAAGAAAAAATGATTTGATAAAACCCAG

ATTCTTGGTATTATAAATTGGTATAACCTTAACGGAGGACATTTTATGAATATCTATCAA

AAACTTAGCATATACAAACAATTTGGTTCAACAGTCTGTTAGAATTTATTATATAGATAC

ATTCATATAAGTACAAAAGTGCATATATGTAAATATTATTATTGGGACATTTTTGTAGCA

GCCAAAAGGAAAACTGAAAAAAAAGATTAAGGCTCATTAATAGCAGACTGGTTAAATAAA

CTATGTGTGAGTACAATGAATGAAATATTGTACAGCCATCAAAATGAATGAGGTAGATTT

ATATATGCTGATGTAGGAAATCTGCTAGCCATCATAAGTAAAATAAATGAAACAAAGAAG

AAAATACTATGATGTACAAAAAGAAAAAACTATAGATATACATATTTATATGCATGTGTA

TGCATTTTTTATGAATATACATATTTATATGCATGTGTATACAAGTCCTAGAAGGAGACA

TAGGTAACTATTAGTAGTACCTCTGGGAAGTAAATGCAGAGAAAAGTAATAGAGGGTAAG

GATATGTTTACTTTTATTTTACATCCTTCTGTAACTTGACATTTATACGACGCGTTAGCA

TTACTTCTGGGAAAAAGAAAAACAGAAAAGGTAATCTTTTAAAAAGGTATTTTTTAAATT

ATGGTACAATAAAATGTGCATAAGCTTTATACTAAGTAATAGAATCATTTAAGTTTAGCT

GTAGATTCACAAGTAAAAATCCAATCTATTTTCATATTCTTACATTTATAGACATTTCTT

ACATGTCTATAGAAAGAAATGGCTAGGAATGAGACTGCACTATTTTACCCTAAAACGTTC

TTTTTCTCTTTGCCTAATGTATATCTACAAGGGCATTGGGGAAGATGTTGACCACAGGCA

GGAAGATGATGAGATCCTGTGCCCACCACTTAATGCAGTCTAGCTCTATATAAGGAAAAA

TATGTTCTTGATGTGAACCAGATGGTTTCACTCCCTTCAAAAACACTCTTAAGATGCAGT

GTGGAAGCTTACTCTGTAAATTAAAAAATAAAAACCTGACTATATTCAGTGGAATGCGTT

AATCATTTTTTTCTTTTTAGGTTTGATATTTGACAAATTGATCTAAAATGGCTGGGTTTT

TATCTGAATAACTCACTGATGCCATCCCAGAAAGTCGGCACCAGGTAAATGCCTTACATC

TACAGCAGTGGGTCTGTCAGCAGTTTTCTTTAATGTGTCAGCAGTGGGGAGAGCGCAAAA

ACCCACACACACCATTATCTTGTGAAAGAAGTAGAGGAAGCAGAAAATAATGAAATCCCA

GTGTTACCACATCCCCTCCAATATACAGATTAAGAGCGTTTGTATTTATATGGTTTTAAA

CATAAATAACATCAGAATTACTAAGCTATTTCCATTCATGTACTGATAATGAATCATGTG

AGAAAGTCCTTTGGCAAGGACTCCACATGGCCACAGGTGATTCCTTTGAGCAGTGTTCTT

59

CCTGTATAGGGCTTAAGAGGACCAGAAGGGAAATGATTGTACTCTCTTGTCAGCTACTTC

CTGGGCGATTTGGGTTCTTTGATACCCCAGTGCTCACTTTCGGAAGTGTTAAGACCATAA

ACCTTAACAGTTGACCTTCTCACCTTCAGAAAACCCAAATGTCTCGGAGTTTCATTCTCA

CAAACTTCCACCTTCCTCCAATGATGAGATATAGGAAAAAAGACAATGTGAAATTGGAGA

TGGAGGTGCCCTCTTAGCCTCTTTACAGGCATGAGTCACATGGCAGGGCATTAAACTCTC

TCACAACCTGTTGTGGAGCTCAGCAGGGTTAGCCAGGACTGTTTTGTCTATCTAACTCTT

CTTACATGGGCCTATGTGATATTTTTCATAACAAGAGTCCGGGATTTACCTAACTAATAA

GATTTCCCCACGCCCCTCCTTACAAAAACTCAGTTCAAAGAACAAGCCCTCAGCTTCTCC

TAGTCCCCTCCAGGGAAAATGAAGAGTAGCTTGTCCTATTCTGAATATGTTGTGCTCCCA

TTTTATCAAAGTAGAGGATAGATACGTAGGTGCTGGGTGGGTAGATAAATATTAGAGGGA

TGCTTCTTCTTTGCTGTAACAGATTGGCAAGTAGGAATCATTTTCTGGAAGGTACTCCAC

AGTGGTGGTGTTAGAAAACTATTTAGAATGCCTTTAATCTTGGAGATAAAAATAGTAACA

CTTTACAGAGTTCTGTCAATGGATATCTTTAGGGATGTTTTGTTTTGGGAGGTTTTTTTT

CTGATTTTGTTTTTTTCAGGTATAGCGAAGCTTGGGAATCTGGACTGTGCAGATTTTCTG

CAAAAATCCAGCTCTGGAAAGAGTGTATTAAGATGCATATCCTAGGATGACACAAAGACA

GTATGCTTTATTTTACATCTTAAAAGTATTGAACAGAAGGAGTTTTGTCCATGATATCCC

ATCAGCCCACTAGCAGGAAAAGCAGGACACTTACCCAGGGGGTTCCTGCTGGAAATGATT

CTTGGAATCAGCCTTCCTTCTACTCTATTTGGGAAGTCTTTGGTTTCTAACATTCACACA

TTTGTAGCAAAGCTTCCAAAATAACTATGATGTTTTGCTTAGGAATAACAAAACATGGAA

GAAAACATTCTGTGAAATTTTAAACTTTTTCAAACCTTTAAGTTTCAGATGAATAAGCAA

AACATACTTAAGTCTAAGAAGCTATTTTTTGTTTGTCAAAGAACTGATGTTATACCAGTT

CTAATATTAATTAGCAACTTTGCCCTGGTTTTCCTGTAAAATAATCTCCAAGGCCCTATC

TCAATCTGTGGGCAGTATACTGAAATACAAAAAGTGTTCACAAAAGGACCTTCTGAACTT

TGCAATCTCCCTTTAAAACTTTTACCAACTTAAAACTACAGAACTCTGATCTCTTATTGA

TTTAAACTAGTGATATGTAAACAGCACTTCAGAGCTTGTTTCACAGGACCAAAAAATTTA

TGCTGAAATCTACTCATGACAAATGGGAAAACCCTGATTAGCACATTTAAATGAATAAAT

AAAGAACCGTATTCAATGGCTTAAAATTTATAGACCTGCATCATCCATTATGGTAGCCAT

TTACTATATGTGGCTATTTACATTTAAATATAAACGTATTAAAATTAAACTAAAAATTCA

GCCCCTCTGTTGCATTACCCCCATCTCAAGTGCTCAGTAGACACATGTGGTTAGTGGACA

ACACAGATTTAGAACATTTCTATCATAGGAAGTACTACTGGACAGTACTGCTGTAAACAC

ACTTATTAATAATGCAGCAGACTTTCTTGGCCACTTGGTAAGAAAGTTTTCTGCTCTTTT

AAACTTATTTGGGAAGTTTTTAATACTTTTGAAATTATGATTTCCTCAGTGTTAGATTAT

CTGATATACAGCTCTCACAGACCATTTTTTGTTTTTCCTGTTTGTTTGCATATTAAAATA

TATAGGATTCAATGTTTCACGTGCTTTTCTAAAGTTGCAGTTCTTGATTTCTTAAAATTG

TGAAAAGAAGTACCCACAGTTATATTAAGAACTAAAATATATGGCTGTTGGCTTGGTTAC

CAACATTGCTGACAGCTCCAAGTAAGCAAAAGTAAAAAAGATGTAGGATCATTTTTAAAG

GCCAATATTTTCTTCCTTACTCATTACCTTCTGTAAAATTCTGTAAGATTTTCTTTAGTT

TTCCAGTAATGATAAACATTTCACCATTGCATAGACATAATTAATTGATTTTTTAAGCAG

TTGGAGAGCCAAACAAAATAAGGGGTAGAATACTTCTTATTTTATTTTTTAATAAAAATG

TACATATTAGAAGCCTTTATTTTTATTTAAATTGTATGTCACTGATAAGGTTTGGATATT

TGCCCCTCCAAATCTCATGTTGAAATGTGATCCCCTGTGTTGGAGGTGGGGCCTGGTGGG

AGGTGTTTGGATCCTGCAGGCGGATCTCTCATGAATGGCTTGGTGCCCTCCCCATGTTAA

TGAAAGAGTTCTTGCTCTGAAACTGTGACACCTCCCCCCTCTCTCTCTTGCTCCTGCTCT

CGCCATGTGACATGCTGGTTCCCTATCACCTTCTGCCATGATTGTAAGCATCCTGTGGCC

TCACCAGAAGCAGAAGCTAACACCATGCTTCCTTGTAAGCCTGCAGAACCAGGAGTCAGT

TAAAGCTCTTTTCTTTATAAATTACCCAGTTTCAGGTATTCCTTTATAGCAACACAAGAA

TAGACCAACACAGTCACGGATAACAGTAGTTTTTCATTTTTCATCAATATAATGATCCTG

CTGTATTCTTAAAGTTCTTAATCACTATTTGTCACTAATACGATAACATTAATAAAATTT

GAGTCTCAGTTACTTTCCAGTCACTTATACCTAGCAGTTCAATAACATTTAGTTCCTGGA

CTAATGATCATGTGTTATATAAGGCAAAAAATTAAAAACAAATTTGTCTTTGAGTCATCA

AAGCATCAAGGGTTTGAAATAGCTATATAACTAGCTGTGAAAAAGGGATATAAATATCCA

GCTGATATTTCCTTTACACATTTAATAGTATCATTTTTCAATGAAAGCATAAATAAAATA

AGTTTGGAACCAGTTTGGAATTTTTAAATATTAATCGCAGAATCTTACTAACAGAAAACA

AAAGCAAGATAAATGCTAGTCATTTGTGCCTGAGTTTTTTTTTCAATAAACAGAAATGAA

GCTTGCTTTAGGAAACATGTGTACTCCAAATAACCTACTATTCACACAATTCTCAGTAAC

ATTCTTTCTTTGCTTAAATAATACAGCCAGATGTGCTTAGCACATAACTCTATAGAAAAT

AATAATTTAAATTAGATTTAAATAGAGATAGATAGACAGACAGACAGATAGACAGATATT

TTTGAGACAAAGTCTCACTTTGTCCTCTAGGCTAGAGTGTAGTGGCATGATCATAGCTCA

CTGCAGCCTTAAACTCCTGGGCTCAAGCCATCCTCCTATCTCATCCTCCCAAGTATCTAG

GACTACAGGCACATGCACTATGCCCAGCTAATTATTTTTTTAATTTTTTGTAGAGATGTC

GTCTTGCTACATTGCCTAGGTTGCTCATGAACCCCCAGCCTCAAGTGATCCTCCTGCCTC

AGCCTCCCAAAATGCTAAGATTACAGGCATGAACCACTGCACCCAACCAATATTAATATT

TTTAACAATTGAAAGAGCTCAAAGAAATAGGTTTTAAATTTAGAGGCCCTGTTTTGCTGA

CAGGAAAGGCTTTTAGCTGGAATCAAGAGTGCTGTTGTCTTTTCCCTTCAATTAGTCATT

60

CCTTTTAAGACTTTTAAGATTTAAATGTATGAGTCATTTTTTAAATCCCAGAAAGATCTA

GTATATCTCATAAATGTAATAATACAGTGCAGACCTGGTGGAAAATAATTATTTATCTGA

AACTGGGCCTCAGTGCCTTTCCTGAATCTAAACAAATGTTCATCTCACCCAGAGAACTGG

GACAACAGGAACAAGGTATTGCAAGTCCAAAATCCAATCCAAAGCAGCGTTCTTCCTCCC

CACCTCTAGGCAAGGCCAAAATACTTCTGCACACAGTATAGACACCAGAAAAAAACAGAG

CCACTGTAGATGAAACCAGTCAGGGGGTAAGAGCTGTCTTTTGATCTAGAGCTTGCACCT

TTGCTCCTCAGTAATACTCCCAGGTCAAAAAGGAAAAATAAGATGGGCAGTTGGCTGCCT

CCTGGTCCCTCCAGCCTGGTCAGTGAACAGAGTGGGAAGATAAAACAGCTAAGTATCTTC

CTTAACAATGCAAAGCAAGAAATCCAGTCTGCTTTGGGAAAGTGAAAGCAATGCAAATTC

AGATTATTAATCATAAGAGCATCTCATGTGATATACAAAATTATTGTATAGCAGTAATGG

GTCAGCCGTATTTTATTCAACACTGAACCATTAATGAATGCTAGCTAGTCTTCCTTTCAC

TTACAGAATGTTTATCTATACATGACTAAACAAAGAAGGAGCGCTGGAAATGATCCTGTG

AAAAATACTGGCTCACAATGTATCAGCTGAGTTTGGGGCAACTGAGGTAGTAGGAGGCGC

CCCCTGGACTTCTGCTGGAATTTAGATTTAAATAGATGGATGAATTAGACAAAACATACT

CTCTGAAAGAGTGAGAAATACAATATTCACCAATTAAGTGAAGGAAAAATCTACACTATG

AATAAAACAATAAATGTGGATACATTTGAAAATTTGAATTTCAAACCCCTTAAGATAATG

TGACAAATACAACAGGCCTAATTTAACATCTTAAAGAGATCTGTGTGACCTATTTTGCAG

TTTTATTTTCTTAGGACAATGCTTCAGTATCTTTAACTTTCATATTTAATCATTTTTTTT

CTTTTTTGGTTTCTATGGTATCACCATCCATCAATCCATATTGGTTGGAGGGGGGGAATA

TATATATATATATATGTATGTCTCCCAAGAGAAAGTAATTCTGCAATCTTCCTCAGCAAT

TCAGTCTAACAATTAAGAACCCTTAAGCTAAATAGAAAAATTCATTTCACAGGCAAGTTT

TACTCAATATGTATAATTAGTTTTAGTTAACTTTATTAATGAAATGTCGCAAATCAATTA

GGTTTGCAATAATCAGATGCCGAGGACCCAAGAGGAACCATTCCTCTCACAAGAGGGGAA

GGTGATACACAATTTAGTTGGGAAGCAAATGTAATTAGATTTGATCAATTGAGTATTCCT

GTCCTGATGTGGAGTCAGTCACATACCCAAGCCTGAGAATATATTTGAAAAGAGGTAGAA

AAAAACCCAGTATGACTTAGAAAATGTCCTTGTGGTCCTATTGGCCACAACTGGCAGCCA

AAAAGGGCTTTGAAGCCACAGGTAGACAGGTTTTGTTCAGACAGGGCTATGTTTTAGATT

TCTCTTTCAAATCTGAATGGTTTTACGTAGGGCAATATATAAACTTTCCTATTTGTCACA

GATTCTAGCACTCTTTAATGCCTTATACTGGGTGTTTCACACAGTTATTTAACTGCCCAA

ATCCCAATGGCACTTCAGTTTGCAACTATCATGACCTAGAAGTTAGTTATTGAACAGTTA

TGAGGTAACTTAAAGTTTCTTCCCTTTGCCTCTAGAATAAGAATATCAAAGAAATGTCAT

GATGATAGGAATACTACTGAAAGAGGATATTAAACACTAGGTATTCCTACTTAGGGCTAC

AGTTTGCAGCAGATTCTATTGTGTTTCAGTCAATAAGTGTTTTTGGACACCTACATGCCA

GACACTATTCTCAGCATTGAGCACAAAGTCGTGAGCAAGGTAGACAAAAATGCTTGGCCT

CATAAAACTTACATTCCAGTGCATAAAGATGAGAACAATCACGTAAAATTTATAATATGT

TGGATGGCATGGAAAATGGAAATAAAGTGGAAGGGAGGCTTCAGGTTAAAAAGAGTGTTT

AGGGAAGGTCTTCTTAGGAAGAAGGAGGAAGCTATGTGGACATCTGGGAGAAGATCGCTC

CAGGCAGAGGGTAGAGCAAATGCAAATTCCTTGAGGCAGCAATGTGCTGGCATGGTCAAG

GCACAGCGAGTATGCCAGGGTCTTCAGAAACCACAGAGAAGAGTGGATAACAAAAGTGAA

ATCAAGTATTGAAGAGTATGAACTGACAGGAACTAGAGACATATTTAGAATGGATGCCAG

AACAGGAGAAATGGGTGGGATTTTAAAAGCTAAATGATTTAAAGACTTAAAATGCTCTGA

AGTGTAGTGAAATGTTCCCCAAACTGCAGATTTTCCCAGGAAACCAGGTGCATAATTTAG

TCATCGATGACTGGTTCTGTGGCAATGACTCTAGTAATTAGACCCCTGCATTTTATGTCA

GTTCCTTCTGGATACTCAGCTACATTATTTGGTGCTTTTGGTATACTTCAAATATGCATT

GCCTATCACTGACCTGTAATCCTGTGTCTCTGGGCCTGAAAATATAACTTTTCATGTAGT

AGAGAATTAGGGCTGTGCAACATTGCCACTAGATTATTTTTAATGAAAGCTTTGCCCTTT

TAGATAAATACAGCAATGTATTCAAACAAGTCCTAGGGATACCACTGAGTGCAAAATGTC

ATGTACTAGTTATTCCATTTAAATTATTTTATCTTCAAGTCTAATAAGAAAATTCTAAAT

AAAATTATATATTTGGGATTGTGTGTGTATCATCCATCCACATGTAAGTAGGAATAAAAT

TATTTAATGGAAAATTTCAAATAGGCTAACTCTAAAAATGTACAGATAATCTGGATGAGA

GAAAACTATCCTCACTTTGTGTTATTTTTCAATGGTAGCATTTTCTCATAATCCCCATGC

TTTTTTCATGTCCTGCTATTCTTTAAGATTTCCTAATGAGGATTAGGGAATAGGCATATT

TAACAATCTGTGTTCGCAGGTTGAAAACAAGAAAATGAAGACTAATAGTTTCTCTCCTGT

TAATTTGATTTTCTACAGCTCCTCTCCTACCAGCTTAGGCAGAGGACTTAGTTACTATTT

CCAATAGATGGGAGCCAAGGAAAAGACAAGCATCTGTGATGTCATGTCTCCCCCAAACGG

GTAGCTGCCTCACCAGCCTCCATTAGAGACATCCCCCAGAGTAAGAAATAAGAAATAATC

ATGAGTAGAATGAGAAAAAAATGCAGCTTCCTTTATCTGAGAAAAACAATAGTAGCTCAA

TGCTGTGGCCTAAAGGGCTTTGAAAATAATGCAATTTCTGATAAAAATAAATGCCATTAT

TCTTGCTTATTGTCACTGTTTTAGTCAAATAAGATTTTAGCAAGCATATTTCAAATTGTT

CTAAATCTAAGTAAATTGGTAATTAAATGCTATCATTAGAAAGTATTTTAATATCAGAAA

AATTGGACCATAAGAAAGTTAGTTTACCCTTGTATTCATATATACATGTGCTTTGTGCTA

AAAATTGTTATCATTTAGTGAGAACCTGTGACTATATTAATTAATTTAATTTAATCTTCA

TATTTCTCTGACCGTTAGAGAGTTTGTGACTTGGATAACTTTCAAACAACTAGTACCCTG

ATGGAAATCCAGAATTTTGTTAACCCAGATCACAGCTGCATACTTAAATGCTATGCAACA

61

GTGGCACTTACCCCCAAACCGTATCCTATGGAAATGCCTTTTTAGCAAATTAAACTGAAT

TGTGTTCAGAGATCCACAGGTCTAAGCAACATTAGGGAAGGGGTAAAGTAGTCCTCAGCA

AGGCCCTTTTCAGAGCACTCCACCAGTGCCCTTGTCCTCCTGGGCAGAGCTCCTCAGCTA

TACTCCCTTTCCTAGTCTACCCTATCCCACAACGGAACCATACTTCTCTCATGGAAGCCC

TGGTCTCACAGAACTAAAAAGGAGGCTCCTAGAAATGGGGTTGTGTTGAGTTGACAGAGA

TGTGTGGCTCTTTAAACTGAAATATAATCCAAAGAGAACAAGATCTAGTAGAATTTCAGG

TCCTAAGCCTGGTTAAATTTCAGGTCCTAAGGCTGGTTAATAGTACAAATACAGTTATTT

ATTTATAACTAGTGCAAATACAGTTATTTATTTATAACTATACAGGAATTTATTTCCCAG

TACCTTCTATATTACTAACATCCCATAAAACCAGCCATGTAAGGAACTAGAACATTTTGA

GAATATGCAATACATAACCTTAAACAAGAAGTTTTCATTCCTAATTAAAAAAAATAAGCT

AGTTCATCACAACTTCCTTCAAATCCTTCTGCCACTGATTTCTCTCCTGAAAAGAGATAT

TATACGGCATTTTAGAGAAAACAAACATCTCTAAGTCACAAGGAGTGGAATAATCAAAGT

TGCATTTTAAGCAAGATTATGGTTTTTTCTTTGAGTTCTCTGAATTTGAATAGTTTCTTA

ACCTTAGTTTTTTAACTGCTCTGAAAATGGTTTCTGTCCCTGGTGGACTCTTGTTTCAAT

GCAGTTATTTTGTCTGGTAGAGTCACAGAGTTAAGCTGTCATTCAGATCAGAAAAAATAA

AAGAGAGAGATGAATTAATCTCAATGGCACAGTCTCCTTATTCAAAAAATAAAAATAAAA

ATAAATCTCAAGTCCAACAATGAATCATCTTTGAGACTCTCCCAAGTGATCTAGTTTTAA

GGGCAAAAACTTTGGGGAAACTGTTGGGGGAGCAACTGGTGCCCAGTACTGTTTCACACA

CGTGGTTTTTCTTATCTATTGCTCACACACTTAGACATAACTGGAATTATTGCCTTTGTA

TTGTTGTTGCCATTTTATAAAGGAAGACAAAAAAGATCAGACAAAATAATAGTGAACATC

TATTAATTGGACACTTACTGGTGTCAGGCACTGTGTCATGCACTGTGTCAGGCACTGTAT

TTTCTTATTTAATCCAACAAAAAAAAATAGGCTAAATTATCTTATTGGCTCAATTTTCTT

TACAGAAACTGAGCCTAAATTTCCCAAATGGCTAACCAATGCCAGGGCCAGCAACTCAAA

TTTGGGAGTAATTCCGACACCTAGGTTCCAACCATTTTTCTCCCAGAAATAACCCACCAA

ATTCACCAGAGTCTAAGATCTTACTGTTACTGTTTAATTAACTGCTACAATTGCAGCATT

TTAAAAAAATATAAATGAGCACTGTGCTAGTATTTAATTATAGCTTTATACTGATACTGG

GTACAAGTATAAGCTAACACCATTTTGAATTATAGTAGAAGAGTCAGGAGCTCTGAGAGG

AATGTTCAGGATAGAATAAAGCAGATATTTTAATGTCTCATTTCAGTGAGGAAAATTGTT

AATTCATATGCCACCAGCCATCGGCAGAAATGTAACAGGAAATGAAGAAAAACTTAATTA

CTTTAAATACAGTGGTCTGTAGTACAAATTATTGTGCCGTGAATTAGTTTCCTTCTGCTG

TAGAATTGATCATTTTGATTATGTAGCCAAGCAGTGTAAGACATTACTAAAATTATTCTT

GAATCCTACCTTTGAGATCTATATAAAACACTAGGCAATTTGCCTGCAAATACATAGAAA

ACAATTTTTAAAAGGATTGGGATGAGTTATTTTCCCCTCTGTTAAATATTAGCCTTTGAA

ATGAACCCAGCTGATCTGCCAAATAACACTTGGAAATTGTTGTGTTTTAATAAAGTGACA

GACTGAGAGGGAAGCCACACTAGACGTCCTTATGCTTTTAGAGGCCTTACAGGGCAGGAA

CATTATGCAATAATGCCTTTTAAAAGAAGTGAGCTTCCTAGTATTACACCTTGCCTGGCA

ACAAATGTAGCCACTTACTGAAATGCAGGCGTAATTAGAATCTATGAAAATCTAGCATCA

GAATCCCAAACCTCTATGCAATACTCAGTAAATTACAGCTTTTATGTCTGTAATATTTTC

AACCATTCTACTTAAATATGTGAATACATGAGTGTGGAGTTCTTTAGGAGGCCTGCTGCA

TATGCTAGGGAAAGGTTTCATCATTTCTAATCAGGATGGCTCTGTAAATGGGATGCCTCA

TGTTCAGGTTTCTGGAAGGCTCAGAGCCTGGGCTTCTACTGGCAGAGGGTAGACCCAAAT

GGACTACTCTAGTGAAAATCTCCAGGTGAACATGGAACGCAGTGAAAACCTGGGGTATCC

AACTTGCAGTATAGGCCACCAGCAAGTGTCACCTCTATTATAACTTTAACCAGGCAAGCT

CAGTCTCATGCATTAGTTTATAAAATTGCAACAGAGCCTTCTAAGACTGAAAGGACATTA

GTTTTTAAACCTATATATTATGACCTAATTAAATGAAATTTTATTTTAAAGCCCTCATAA

AAGTAGTAAAATTGGTGTTTTAAATAAACCAAATGGGAATTCAACCACTTTAATTTTTCT

TTTGTTCCAATAGGAAAATAAATGCTTTAAAATTTGAAGTTGAAACATGGGTTTTAAATA

TATTGAGATAAAAACTATTTTGCATAGGCATTTTGAAGAAAATAAATTTTGTTCTCGTGA

TTTGTGATTGGCCATTGATTTCCGTGTTTAAGATTATGAAGGTGTGCTCAGCTGTCTACT

AGAAATAACAGGGGAGACTCAGTCTTGTTTCAAATGGAAGGGCTCCTATTCGGTTTTCTC

CTTCATTTCTTAAAGTGTTGTGATTTTTTTATTCCCTGGTGTTATGTCTTGAGATTTTAA

ATCTTAAAACATGCAATTAGGTATTGAAGTTGAAAGCTGGAAGTCTCAGCCAGCTAGTAA

TGGTTTTTTAAAATAGGTAATACAGACCTCTAGTGGTTGAACAGTTTGAAAGCCTCTGCA

AGAAAAGGAAATTGCGCAGAAAGTGCCTGCATTTTAAGGGGAAAAGTTAGTTAAAATTAT

TCAGATGATAAAATTCACATATTTCATAGGAAAAAAAAAGCCAGAATGGGCTTCAAGGGA

AGGTGGCACACTTCCCATCCTTTTAGATGTTCCTCAATTCCTCTAAATAAGCAAAAACTC

TCTGGCCAAAGTCACAGTAAGAAGTCTGGATCTGTATTATTTTTCTCTAAAAGATCTTGT

GAACAGAGCTGCTAGATCTCTGTATTATATGAAACATATATTTTTGTACACAGTTTTGCC

TCACTGGGGCTTTGCTTCCTTTGTACTCCAGAGGCTCCCCATGAAAACAATCTGCAGCCA

CCTCAACTTGCCTGTGCTGTTCTCAGGTTCTGTCCATGGGGAGCCACACTTCAGTGAGCT

CAGCGATTGGATGGCTTTTTAGTCTACATGAGAGGGAAACTCCATGTGCCTCTAGACTAG

TGCTTCTCAAACTCTAATGAACACCCAAGTCATCTGGGGAATCTGCTTGAAATGCAGATT

CTATCTCGGTCTGGGGTGGGGCCTGAGGCTGTCTTGTTCGTAAACTCCCAGTTGATGCTA

ACGCTGCCCATCCAGGGCCACCCAGAGCAGCAAGCCGGTTCTATGACAGCTCTCTTTATT

62

TTTTAGTTACATATTTTGTTTTTACTCATTTCTTCTTTGTTTGCTCTTTTACTTTAATAA

CTTCTGTTAAATTTTTAATATTTGGATCTGTAAAACATTTAAAGTTCTCTTTCACTTCAC

TATGTACAAGTATCTCTGGGAATCTGTTATTGAAGTTTTGAGAAGTTGATCTCACATTTT

AAAAATAGATTCAGTGTCATCTCTTTATCTTGAAAAGTTCATGGTAGTTGTGAGCATCTC

TCTAACCACTTGAAGCTATTGGGTTAGAGGTAGCTACAATTAAATATCTGATTAGCCATA

TTGGGAGAGTGGGTGAAAACAGGTTTTGTGCATGTGGTAGATGTGTAGGAAGCTAAGGAC

CCAAAAAACAACCACATCATAAAATCAAGCAGAAACACACACACACCACACACACACACA

GAGGCTCAAAGCATAAGTGTCAACAGATCAGAAGAAAACATGGGAGAATGTATTTTTTCA

TACCAAATTATTAAAATTCCATCATCTAAATAACTTCCTATCATAGCATGTTGTCGACCT

CATTTTTCAAATCCATAATTTTAGAACTTATGTCGTGGGGTAGTCTAAAAGCCTCTTGCA

AACTTTTAACATCTAGTTTCAAATCAAAAATAATATATTAACAAGCTGTAGCATAGAGGG

AGTACATAAATTATCATCATTGCCCTGCATGAATAGTAATTCACAGGTTTGGCTCACACA

CAACTTAGATGAAATAATTAACTATGTACAGTACTTAACAGTATAAAAGTAATTAATCTA

GCTGCCTCGTACCGGTTTGGCCTAAATAAACATGCAATAAAAAAGCCATAGGATTTTATT

ATTTTTTTACTCACGTTACTACTTTAGTGTGTTGGAATTTTAATATGTCAGAAGAAAGAT

ATCTTTGCATTAAAAAATCATTTTCTTTTCAAATGTTAATGTACTGATTATAACTAAGTG

AATTCCATATATTTATAATTGTGGGCAGATGTTCTCAATTAATAGTTTTATTCATTCTAC

TTCACAGTTTAGTGAAAAGGATTATTTTAAATTAAGGTGTAAATAAGAACAAATGAGATT

TTTATTACTACAAATCACACAGAATTTGTTGGTGGTGCTATAATCCTGTGTAGGTATAGC

TTTGGCAAAACATTTCAGATAAGCTTGTTTTTTGCCCCATGGGTTCTGGGACGAGGTGAG

TTGTCTGTTTGTCCTATAAGGTTCAGAAAGGTAAAAGGGCAAGGTCATTAATTGGCTAGA

GGGCAACAAAGAAGGTAGTTATCCCTGTGTGGTCAAGAAAAAGTGGCTCAGGTTATCTTG

CTCGGGAGAGAAAATGTTCATTCAGCTCCAGTCCTTTTGGTAAAAGCCCACTCTCAGTGT

ATGAGTGTTCCTTTGCCTAATCATGTAGACTATAACATGTTTTCCCCTATATGACTCCAT

CGATTAATCATTGCAGTATTATCCCCACTTCATAAATGGGCAAAGAGGAGGATGAAGCCG

AGTAGTTCTTCCAAAATCAAGTAGCATGTAAGATGTAGGAGCAAAACTCAAATCCAGAGA

CTTCTGCTTCCAGCCAAGATGGAATAACAGGGACTAGATTTACCTCCCCACCTAAAACAA

TTTTAAAAACTGGACATACATATGAAACAATGGTTTTCAAGAGAGTGGACATCAGATAAC

AAAGGGCAGTGATCCCTGGAGGATAGGAAACAAATGACCTGGGATTGTCCCAGCCCACTG

CCTGGAGGGAGTTTGCAGGCATGATACAGGGATGGTACACCCAGGCAGAACTCGAGGTCC

TCTCTGAGTTAAGGACACAGAGCTGGGAGTCCAGAGAGGCCAAGGAGGCTAGAGTTCAGA

GTACCAGAGAGTTGAGAGCTGCACAGAGAACCCAGAGATCTGCAAATGGTACCCCTTGTG

CTTCAGTGCATGTGGGCAAATAATCACCCAAACGTATTAGAGAGAACAAGCCCCAGAGGT

CATCAAGAGCTAGAAAATAGTTGCTATTTCCACCAGCCACAGTGGAAAGTCTCATAATTC

ATGGAGCATCAGGTAGCATACTCAGTAGGTTCTTGCCTCAGGAATGGGAAAAATTTAGCC

CTAGACTAATTGCTGCTCTGGTACCACCTAAGAAACCGTAAAAGTCAGACTCAAAAGAAT

TAAATTATTTGCAAGTAACTCAACTGCTTTTCAGAAAACAACTGGAGAAATTTTGTAGGA

ATACAAAAGCATCCAATATCCAACAAAGTAAAATTCACAATGTTTAGCATCCATTATAAA

ATCACCAGGCATGCGAAGAAGCTGGAAAGTACAACCCATAAAAAGAAAAAAATGAATAGA

AACAGACCCAGTCAGTAATGACACAGATGATAGGATTATTACACTATTACATTAAATGGT

TATTATGACTATTTCATATGTTCAAAATGCTTGATGGAAGTTTGAACATATTAAATGAAG

ACATGGGAGATATAAAAAAGACTGAAATTGAACTTCTAGAGATGAAAACTACAATGTCTG

AGATGAAAACTTAAACTGAGACTTCAGATGCTAAGACTACATTTGTTTCACATCCCCACA

ACATTCTTCCCTGGACGCTGAGTTTCCTCCCAGCAGCTGAATACTTCATGCTTCATCCTT

TCTTAATGCTGAACTCTCAGAAAAAGTCCTTCATTCTAAGAAGAGGCGGGAGGGTGCCAC

TCTGTAGCCCCTTTCTCATCTCACTCTGGTCCCTGCTGGCCTGGAACAGATTCCACTCCC

TTCATGCACTGATACTCCACTCTAGACTGAGCCTCTTCATGAGGTAGCCATCAAGCCATC

CGCAGTCATCAACATGGCACCTTCTGAGTCAGTTACAAGAGTTTGCATCATCAGACCACC

ATTTTCCGTCTCTGTTTTCTGACTTACCCCAAAACTCTAGTTAAAACTCATGAAATATTA

TCTCTTCACATGAAATACAATTAATATGGAAGTCAGCATTTTTGCATCTCCCAACGCTTC

ACATCCAAGGAGCTGTGTATGAAATCATGAACTATGTTCTTCCAGCCAACCAAGCAATTA

ACCAAAGTATACATGTCCATGTTGTCCTTGTACAGAGTTTGAAATATGCTCATGAGAATT

AAACTATTTTTCAGTAAATCTGAAAAATCAACTTGCTTGTCCAGGAAGTTTTATTAGGGA

TAGAATCCCAAACAATGAATGTGCTAGCCAAGTGTTACTATTAATCAGAAATACTCCATA

TTCATCCAGGATTAATCCTGTGTAACTCCCTCAGTCAGTGTAGCAATGTGTTCTCTTCCT

GCACTTTTTTTATGTGTGTGTATTCCCAAATCTGCAGTGAATGTATTTAGGAAATACATT

AGTATCAAAAGGACAAATGTAGCCTTAAAACATAAATGTACAGATAATTTCCTATTTGTA

GCAAAGTTCACTTCAGAAACACTTGATAAGAACTATTCAAAAATAAATATTTTCAGTATT

TATTTAAAATATTTTAAAATGTAAACTCCTCACCAGTCATCTAGCCAGGGCCACTGAGTG

TGGCTCTATGAAATAGCTTCAGTCCCTTTCACTACTGATGACCTTTTGAACACAAGATAA

TATTTGTCGAGTAAATGTCAAAATAGTATAAGAATACCCAAATCATGGATTCTATGCTGT

ATTCACTCACATAGAGACTTCACTTTGGAGCACTTCAGAGCAGCAACAGCTCTAAGAGAT

GTAACAGTATGCTTTCCAGGATAGAAGAACGAAAAGGGAAAAATAAGTTGCTAGCAAGAA

CAATGAGGGGTAGGGGTGAAGTTCAGGCTGCCATTCTGAAAGCTTCCTCAGACTGAGTCA

63

GGCACATCTCACGAAGTGCAGACTATGCAAGCTGGCTGTGTGAGATCAAGGGTAGACAGT

TGACTCATCCTGTCACATCTCTGTGTTTTACCGTAACCTCCAACTATTCAGCCATGAATC

GCTGCATGTGGAATGGAAGGGGGAATGTCTAACAAACAGAGACATACTTCAAGTCTTCAG

TCTAGTTAAAACATTGGAATGAGGGTCTGCAACATCTTTCTGGGGCTTGGAGTCTCGTCT

CAGTTCTAAAATGAGATGGTTGGCCTGGATCCTAAGTTTCAAATTGGCAGCCTTTTTAAC

TAAATCTAATCTAGAAGAGTTCTGTTAGGTTCCACAGTGTTGGGTTTTAAAATATATATA

TATATTAGTTGAAAACATTTTAAAATAGGATCTTTCACATGAAATTTGAAATTTTAAGTT

TATATTTTAAAGTTAGCTGTTTTCCCCCACCTCATTACAATTGGCACAGTTGACTATAGC

TGAGAAGTGACCCCGTGGCCCCCCTCCAAGAAAGGGGGAGGGCCCTCCATTCACCACCAT

GTCCACTTCACCTATTTCTCCCAGCCTATATATGTATTTGAATATGTGAACCCTGGAATG

CATAATGTCTAGGGACCATAACAACAATAGAATGCTATGAATCTCTGACTTACAAGGACT

CTCTTATGAATCTCTGACTTACAAGGACTCTCTTATGAATCTCTGACTTACAAGGAAAAC

AAAAGACTGTAGAGAATAGTAGTTCAACCACATTTTAGGTTAAAATAGACTTTACTTGGA

TAACCTGACAACCAAAACATCTTTGATAATATAGTAATTGTGTATGTTTACCAGACAAAG

GGTATACATGTATATTCTTGTATTTCTCTTAAGAAGAAAATCAATAAATTTGACCCATGA

ATTTCTTTCTATAGCAGACATTTTTGTGACTTCCTGACTCACAGGAGATACAGCTACCCT

CCAAACCTAAATCAAAAGTCCGTAAGTTGCAGAATGACTTTTTATGTAAAGAGAACATAC

TAGTTTCTGATAAGATATAAAGAAACCATGTAATTTATCTAGGGAATGACTCTAAGCTGA

TCATTGACTTATTTACACAACTATAGCTACTGGAATAGACTGATTCCAAAAATATATTTT

CTCTGAATTAGAATCTTTTTCATATCAAAATATCCAAAATTATTAGCATATTATGTTATT

CTCACAAAGTCCTAATGAACTTCACAAATCTGCCTGCTCTATTCTGAGTACAAAAAATAT

TTAGCCTAATTTGTTTTTCCATTATTTTATATAGTAATAAAGTAATACCAAAAATGTTAT

TGCCAGAAACAATACAGTGTTGTATAATTATTAGAAAGTGAACTCATGAAATTCTATTAA

AAAACAACAATTACCACATGTTAAGTCAGATAATTCACAGAAGAGACTTATATGAATACT

AGGGGAGCTGTAGGCAACAAAATTTTTCTCTGAATCCTGCATTTTGAAGGAAGTTTCTGT

CATTTAATTAGTTGAGGTTTGATTCACCAACCAAAGGTCTATAGTGTGATATATTTTCTT

CCTCCAACATAAAGTTAACTTAAAGTCATTTGTACTTTATGTGTTTATTCTTTCACTTCT

TCCCCAAAAGTAATTCTTTAAATTGCTTTATGGGATTAATAACAAATTATATCATTATAT

ATTTTTGTATTATTAGGGCTTCTAACTTCATTATAATCAATTTATTGGCCATATATAATA

ATGCAACAAATTACATCTGTAAAGTAAAATTTTATGACGCAATTTACTTAGTATATGTAT

AAGTCTCATTCTGCTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCTTGGCTCACTGCAACCT

TCGCCTCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGACTCCCAAGTAGCTGGGATTAC

AGGCATCCGCCACCATGCCCAGCTAATTTTTGTATTTTTATTAGAGACGGGGTTTCACCA

TGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCTTGACCTCAAATGATCCACCCGCCTCAGCCTCCCA

AAGTGCTGGGATTACATGCATGAGCCACCACACCCGGCCGGAGACAGGTTCTCCCTGACC

TGTGAGACTGCAAAGGTGGTGTTTCCTATGAGTCCAGCCAGATAATAGACTCTGCTAACA

TTAATTAAATTAATATTCCTTTTTAAGATTCTAGGTGCTGAATATATATCTCTTGGTCTA

TAAATTAGCTTCGCACTTCAGCTATTTAGCAAACTTGTTTTTTATTGTATCTAGTGTATT

CATACTGAATGGGTATAATATACTGTCTTTTGAAAAAGTTATTTTGTACACATAATCTTA

AAACACTCTTCCAAGGGCAAGGTAGAGGCTTCATAATATTATTTCCATTTGTCAGATCAA

TGAAGGTTTAATGATTTGTCCAAGATCTCAATTTCTAGAGAAGCGAAGAAGAATCCCCCA

ATTCTAGTTCTAAGTTTCTTTTTTCCCTTGCTAAATCCTGCAGTCTACTGATTTTTTTTT

TTTTAGACGGAGTCTCGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCATGATCTCAGCTCA

CTGCAACTTCCACCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTACATCAGCCTCCCGAGTAGATGG

GATTACAGGTGCATGCCACCATGCCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTT

TCACCATGCTGGCCAGGCTGGTCTCGAGCTCCTGACCTTGTGATCCGCCCACCTTGGCCT

CCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCAACATGCCTGGCCTGCAGTCAACTGATTTA

TGTTCATCACCTTCTTAAGTTAAATTGCTCTTTTACTCATTGCCTTTGGTTTTGTGTGTT

AAGATTCAGCATCAGCATTCATGATATCTTTTCACTCTTAATTCTGAGTGTTTCCGTCCG

TTTTTTTAATTTTTGTACTTTATGGGCTTTTTCTTCATTTACCCCCAATTATGCGGGAAA

GGCTGTGTGCCTCTTTTGAAAGCTCTGATGTTCTCAATGAAGAGACCTTTTAAATGACCT

TGTTTGTCCCCCACCGAGTTGCATATCACAACTTCAAATGTCTCACTAAAATGTTACCCA

TTTGGCATCAGTATACAGAAAAGGCTGCACTCTGAGATAAGAAAGAACAGTGGTGTTTTC

ATAGTAAGAGAATAGAGTTCTTAATGGGAAAGGGGAGAGTATAATTTCCACTGATTTAGC

TGGTCTTTCAAACTTTATGATGCTTTTCTCCTTGAACTAGCCTATAAGAAATTTGTAGGG

AAAATACCACAGGAATCAAATTTTGGGCATAGATGTCTATTAATATTGCTCCTTACAAAG

CTTTTTCCCAGAATTGTTTCTCCTTGCCTACAAAAACTACTCCATGCCTTTATTAGTCAG

AAAAGCAGTTTTGTAGAGAAGGCAAGTAACAGAGAATCAAGCTAAGTAAGTGAAACTCTG

TAATTGTCAAACTTCCAGAAAGTAACATTTGTAACTAAGTATGGTATCTTTGTCCTCTCT

CTTTCTCTCTTCTCTCCACTTGGTTTCTAATGAAAGCCTTGATTACATGTTATATTTAAT

GTACTGTTCCACAAAGAAGAAAAGGCCTAATGTGAATGCAAGCTGAATTTACACTTAAAT

ATTGCAGTCAGTTCAGACCGGAAGGATACAGATCGATGCCCTCTGATCCTGTCAGATTCC

CCGAAGTGTCTATGGCAGTGATACCACAAGAGGGCAGGGTTTGACTTCCGGACTAGGTGG

CTTCCTCCCTTCAGTGCAGACCTTGGGGCCACGACAACAGCCATCAATCTCTTGAAACCC

64

TAATGATGAATCTGAGCTCAAATTCCCTCTTCAGCCTTATCTGTGCAGAATCCTGAAGTT

ATGAAAAATGCTTACAGAAGGTAATTTCTAGAATGATCTAACACAGCAGATATTTAGTAA

ACTCCCTGTTTGAGAGCTCCTACTAAGCACCCAACACAGCTTTAGACTTTGGTCACCCAA

TAGGATTTTATCTTTTGTGAGGGATCTGTAGTTTTCCCCGGAAGATATAATGCATGAAAT

AAAAGCCTCCAATAAAATTCAGTATACAGTTAATTTATTTCATAAAAGGTGAGAGATATA

AATTATCAAAGGTTAAAACAAAAAGTAGGAACCAGAGCAGGGTTTTTCAGTAGCAACTCT

ATTGACATTTTGGATTAGATAATTTTTTGGTGTGGGAGACTGTCCCACGCATTGTAAAAT

GGTTAGCAGTATCACTTGTCTGCCTGCTAGATGCTAGTAATACCCCCCACACCTCCCTCT

CCCACATTGGGAAAATCAAAAATGTCTCGAGACATTGCCAAATATCCCTGGAGTACAAAA

TCAGTCTAATTGAGAGGCACTAGACTGGAGTATAAAGAGATGACCATGCCAAAAAGTAAA

AATAATAATAATAGAGCCTTGAAACATTACTTACAGAATGTCAAAAACGTAAGGACCTGC

TCTCTATTCCTGTTTCTTAACCTGAGCAATGGGAATAATGATGCCTTCCCTCATAGGTCT

CTTGTAGAAATGAAAGCAATTAATGCAACACTTGGCACATAGTAAGCATCCAATGAATAA

TAAGTGATCAGTGTTACTATTGCTAATATTAAGCCACTATTATAAGTCCTTTCTGTTAAT

CAGCAGAAACAAAAAGAAGTATAAAATAATGGTACATTAAATGAACTTAAACACTTGTAT

GTCATTTTGTGCTAAAGTTATGAAGCTGAAAAGATTGAATTGACATTTTCCCCATTGATA

GAAATCATCTCAAAAATGCTCCATCTTCCTTGTGAAAGCCAAAGGCCAGCAGTTTCCACA

TACCCAGCATCTGATAAGTAGTTAATGATCCAGAAATAAACTGTTAGGTGCTTCAGGGAA

TTTCTGTGTATAGAGAAGTTCCATGTAAATATTTCTCCGAGAGGTGGATGGAGAATGATA

ATTCACTTTTACCCTCTGAATTTGATTTATAAGCTTCACCTATCTGGCAGGAGATAAGAA

CCAAAGTTAACTGAGGAGAAAAAAAATAAATGATTTCAAGTGACCATGATCTTCAGCTGG

AACCAGTTGAAACTGCAAAGCAACTGGGCTGAAGAAGTTCAGCCAAAATTATTTGTTTAT

AAAAACTAGAGAGTGTTAGATATTTCTATCACATTGGCTTATTTGAAATTTCTGCTGGCT

CAAATGAAATTGTATTCTTCTATTTCCTACTGCGGGGTTCCTTCCCTAACCACAATTGCT

TTTGGATTGGAGACTTGTAACTTTGAGAACAAGAGCCTCAGCTTAGCTAGCTGGAAGAAC

CAGAGGAGAGTTTTAATATCTCCTGAAGAAAGAAAAGCACTAACACGGTTATTATAGTTC

AGGACAAGTGGAGTCAAAGTTGACAGTTTCTGACTTGAACAGTTTTGTTGCTGGTAATAA

AAGCAGAAGTCACGTGCTGAACGTGAAGGTGAGCAGAGGAGAACTTGCGATGGCAAAGTT

AAAAACAAGAGGAGATGATGGTCTTGGTGTGGCACAGGATGTTAAAAAAATTCTCCTGTC

CTTAAGGAGTTACTGCTATTTGAGTAATGTGCCACTTCCCTACATAGCCTTCTATGCAGA

AATGCTATATTTCCACTTCACAACCCAGAACGTGCATTTTATTTTACATTTAGAGGAGGA

ACAAACAACCAGAAGGCAAAAACTGGTGCATTATTTTTTGCAATTCTCTTGGAAAGAGTT

CGTTTTTAACTTCTGCTCAGACAGCACACAACTACTGGGAATATATTTTAATTTCAAATC

TGATGTGTGACATCTGGTAACTCATTTATTGCTAATGAAGTTTTCACAGGAAGCAGCAGT

CACCAGTAGCTCATCTTATTTTTCAGTTGGCAAAGTGTTGTTTACCTTTTATTGGCCTGG

CATCGGTGTCTCTTATCACAGGATATTTAATTAGAAAACGCAAGTAGCCTAACATAGAAA

AGAAATGGAGTGGTAGATAATAGTAGATAGAATGGTCTAAATATTTTTATTACAGTGATG

TAATATCACTGTAATTTATGTTTAAAAATTATGTAATACTCAAAAGGAATTCTCAGAGCT

GGCGAAACAGTCTGGTCCAAGCAGCCTCTCAGCAGTGCCTTTCAGCCTCCCCTCTCTGAG

TCTTTCCACCCCTTGCTGGTACTTTAGTTTCTTCCACTTCTAGCACCACGTGTAGTTTCC

CAATTTCTCTTACCCAAATTTGCTCGCAGGGAAAAAAATAAATTAAATTAGCCATTTACA

CCACAGTGTGAACTTAATAACACCAACAAAAGTTCCAAAGCTCTAGGGTCTCATAGCACC

TCCAGATCCATGATCTCATTCGGTGTTTCCAACAATGTTTTGCACCAAACTGGACACATG

CTTGCTACTTCATCATCCTCATCGTGAACATTATTATTATTATCATCATTTTCCAGATGA

AGAAAATGAATCACAAGTCAACTGACAGTCCAAAGGCTCCACAGCTCAGAGGAGGTAAAT

CATGTGCTTAATTCAGAACTTTTGGCTCCCATCACTATGCTCTTCCCACTGTCTTAACTC

TGGTTGTCACCTGAGCCATTGTGTTTCTTCTCAGGTAGATCTTAGTTCTTCCTGAGAAGG

TATGAAGGTGGGTATTCCACCCTACCTGAATTATAGGAATTTCAGATATCTGTGAGCAGC

TGCAAAGGGGATTTTACTAGATGACATCCTGCTGGGCACACTTTACGCCAGTCCTGAATG

TGTAATAGAAATCTGCAGTTTAATGAGTAAGTTTCTCATATTCAGTTTTTGATGCTTCAT

AAATGTTAAATGAAAACATTTTAGCTGAGGGTACTTTTGTTGTTTGTTGGATTGGTTTTG

CCTGTTCATCAGGATTATCAGCATTTAAGCCAGAGTTGCAAATTAAGTTGCCTACAGGGC

AGTGCTTTTCAAATATTAGTGTGTATCAGAATTACCTGGAGGGCTCATTAAAAACAGCTT

GCCGAACCCCACCCACAGAGTTTCTGATTCAGTAGGTCTGTGGTGGGGCCAGAGATTTAC

ATCTCTAACAAATTTCTGGGTGATGCTGATGCTGTTGTTTCAGGGACCACACTTTCAGAA

CCATTGCTAGAGGGGCCAACTAGGGGACGTCTGTGAGTAAAAGCACCTACACTGTGCTTC

CAGTACAGCAGCCAGCCCCAGTGTGATGAGCACTTGAAATGTCGCTAGTGTAACTGAGGT

GTCCTGGAAGCATACATTATACCCTGGGTTTTGAAGACATGGTACAAAAAATGTAAAATA

TCTTAATAATTTTATATGGATTACATGTTGAAATGACAATAGTTTGGATATATTGGATTA

AATATTTTATCAAAATTAATTTTACCTGTTCCTTTTTACATGTCAAATGTTTTTAATAGA

AAAATTACAATTATATATGTGTCTCACTTTCTATTTCTTTTGGACAGCACTGAACTAAAG

AACCAGAAAATAGAGGGGTGTATTAGTGAACTACAGAAAATTCAAGTCCCAAAAGCTGTA

AATACTCTGAGGACCAAAGAAAATATATACGTTGTTCAGATTTGCCCTGAGGGGTCAGTT

TGTACCCAAACATTTGCTGCCACAAGTAGTAAATGTAGAAGCAATCCAATATCTACTATT

65

TTACTTTTCTTTCAGGGTTAATCAAGTGCCTTGTTATAATTCTTCAAACTAAAAACATTA

TTATAATAATGAAAAATATTTCTGCTGAACTTCCGAATAAAAAAATTTAGTAATATTTTG

AAAGTCTGAGCTTTATTTAATTCATTTTACTTACCCTTGTATTATAGAACAATTATATTT

TTAAAAATGCTTTTATGTCTTCCAAAGAACTTTTTATTTTTAGCAGTCCATGAAATAGAG

GTGAGAACAGGTGTTGGTATTCTCATTCTAAATATCTTGTAATATTTAAAGGAAACCAAA

GTGAAAGATTAAATTGCCATGTAAGATTGTGTTGCCGGTTACTGGCAGAGCAGACTCTTT

GCCAGGACAGCAGTCCAGTGCTTTCTCTTCCAGGCTGTTCTGCTCTTCCTCAATTTTTAC

AGCATTTTTATGTTAATCAATCAATAAATAAAAAGTAAAGAACTATAATGCATACAAAAC

TGTGATGGAAGAAAAGGAAACTATGTGATAAAATCAAATAAATATGACCCTTATAGCTTT

AGTTTTCTTAGAACAGAGGCCCTTTAACTTCAGAATGTTGAAACCTTCTCTTGAAGTTCT

CTTATAATACTCTGCCCTCACCTCTGTGTTTTTATCTGGGCAATTAGACCACATTAACTA

ATTGCTAAACTTTAAAAAGTTGTATTTTCTTACAAAGAATCTGAGAATAGGGTTGATTTT

CTATGTTATTTTAACAGTATCACATTGCGCCCCCCTCTTCACAGGACCATGTAATCTTGA

CTCTCTAACTTCATGGCAAGCTTTTAATTTTGATTTTCAACCATGTTCCAAACTGTACTC

TTTGACTTGGTAGTGTCAATAAATAACGTAAGGGATGTCTGACAGGCTTACAGCCTTTGG

CCATAAATGGAATGAAACAAAGTAGTCCAGATAGGGCTCAAACTCATAACATTGACCTCG

TTAGTCTAGAACCACAACCAGCTATCCAAATGTGCCTGGGAAATATTTCTTTGAGTAATA

GTTAATTTTTTAAAAGAAAGAAAAAAACCTGTGACTATGATAATCTTATGTTGAGTTTCT

TTATTCATCTTGAGTAAACAGTAAATTTTTTTCACTTTGTTGTTTCAATACAAAGAGTTC

TTGTGTTTAATATAGAATATTATTAAATTAGTGTGGGATTAAAAATATTTAGATAGCTGA

TTTAACAATATGTGATAGCATTAATCAACTGCCTTGTTATAATTCTTGAAATTGTTATTA

CTCTACTTGTCAAGCAATTTTGCCCTTCTCGTCAAATGATGCATACCTGTTCAATGGAAG

GATTATAAAAGTTCATGCTTCGGAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAC

GGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGGGATCTCGGCTCACTGCAAGC

TCTGCCTCCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAG

GCGCCCGCCACTACGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCGT

TTTAGCCGGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCCGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAG

TGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCGGCCCGGAAAATTTTTTTAAGAGTATAA

CCAACTCCCCGAGGATACAGGGGTCCAGGGAAGCTAAATGACTGCTTCAAGGTCACCCAG

CCAGTGAGTGGGAAAGCTAAAATTAGAACCTCAGTCCGCTCCCACATTTTCCACCAATTT

GCAGGCTATCGTTAAAGAATATTTCTTCTGCAATCAGAACATTGAGCAATTTGGAAAAAC

GTGTACAGTATATCGAATATTCTAGCTTCATTTAAAATTTATGGTTATGTGGCTTGTATA

ATGTTAAAAGCTTTAATCTAAAATGAATTGCCATGTGGCCAATAACCCCAACATAATACT

CATAATGCATATAAATTCTCTAATATTATCATAATTTCTTAAGGGTACAAATTAATTAGT

ACCTCTTTTCCTGCCCAATAACTTTCCTCACACCCCTTAAAATGGAATTTGAAATGAGAT

AAACAGTTGCTGCTGCTGAATTAAAGTTTCAAAGAAATAAAAGTGAGGTGGCTTCATATA

CAAAATCTGTAGTTTTTTTCACAAATTGGATGAAGCAATTGTTATTGACTAAGCCCATAT

TGGTGCTGCCCTTTTCTCTGTTGAAAAGAAAAGCTTGTGAGTAGTCTCCAAGAGCCATAT

TATTAAAAATGATGTTTCCTCCCCATGATGGCTGAGATACTAATCCATTGAAATGTGGCG

ATAATTCTTGTGAGAAAATTCTATGAGTCTATAAGTTTGAAGAATTTAGAAGTGTAAGAG

GACAGGGGTTCATTTACTTACAGGCCTTCTTCCAAGTTAGGTTTTATTTTCCTTTTCTCC

TAGTCTCTGGAGTCTCCTCTCTCCAGACACCCTGGAAAGCCATTCATGGCCTTTCATATT

TAACATAAGAGTATTTAATACTAACACTAACATGTCGAAGGAAGATGTTTAAAGCATGTG

AATTAGACTTGATCATATATGTTTCATTGGCACCTGTTTCTCTACTTTTTGGAATAAAAT

AAAAACGACAAAAACAGCTAAGAATTTTGGATAGTGATGTGGGTGGGAGGGATTGGGGCA

TTCATCACAACTGAGTTGTTTAATTTATAGTAAGTGGGAACTTTTAGAGTTGAGAGAAGT

TTAATTGTAGTTTAGAGTTTCATTATTAGACAGTAGTCTTAAACAATTCCCAAGAAGCTA

AAATGTGGGATTAACATTTTACTTTCATTGTAATTCATATCCTAAATATAAATGTTAATA

TAAATTATAAAGTTTCTGAATTTCCTTTCATAAAACTGGGTTCTTTGGGTTCTTAGTTAT

TTTGGATGAAACAAGGGGAGGGCTAGTTGGAAATGATGGAACATTTAACCACTGTCACCA

CAGTTAGTCACAATTGGTACATGCAGAATTAATAAAGCAGCTTGCCTTGTTTTTATTTCT

TGTGAGGTCAGATGACAGTGGATGATATTGACTTGGGAAGATGGCCAGAAGCCACTATTT

ACCATGTACATATATCAGAGAGCCATTTATTAAGTTTGAGGAGATTGGATCTTAAGTACT

TAATTAGAATGACATTAATAATTTTAATAAAATGTTTTGCATTGAGAGAACTATTCACTC

AGAAATAGCAGGGGTGAACAAAATCATCTCCAAAGAAATCATTTAACATGAAGTTAGTCT

AGGATTACCAACCAAGAGCATGGCATTCTCCCATGTATCTGACTTAAAAGCAATACTTGT

CTCTTGCCCCATGGTGCCAGGTGGTCTGCCATGCTTCCCTCTTCGTGGCTGCCAGGATTC

CCGGTATAGAGGCAAATACAACCTGTAAAGGCTCAAACGCTTCATCAAAAGCCATGACTA

TAATCCAAAGCTATTAGGTTTAAGCAACTTATTTGGAAATTATCACCTTCAAATAACATG

TAGGGCAACCTCAGTAGAGATGAAATGGACGAAGCAGGCATGGAAACTGCCCTTCCTGCC

TTAAATACAGAATGCCAGATCACAGCTCTGAATAAAAGTTAAGACCACATTGGGCCAGAT

CAGGACTAACACTAGATACACAGCTGAGATAAAGTTCCAGTGACTTTGGCAGTGTGAAAG

TCAGGACCAGTAGGCACATATACTGAAGGCAATTTAAGCTGTGTTTCCTGATTAAAGCCA

GGGACTGAAAAATCACTACCTATTCATGATGAAAGACTAGAAAACTTCTGAAGACCAGAC

66

AGAGTTTCAGAGTGGTATAGTTACTAATCTACTAAATACTGCAAATATATAGTATCTGCA

AATATATATATAAGGTTGAAAACTAAGCTCAGAAATGAGCATTAAAAACTTTTCCAGATC

AAGGGAGTGCTGTACCCCCAAGCTGAGGTTTCATAGGCTACCATCATCCAGGCACTCAGT

CTTCCCAAGCAAGTTAATTCCCACCAAAAATGAACACAGTCAAAGATTACAAAACCTAAG

CAGAAGTCCATTATCAAGAAACAGTGTCCACAAGTGCAATAAATATAATTTATACCTGAG

GAACTATAAATAGTAAAGCAATTGGGTAGGGGCTCTTAACAGACAGATATTCAAAATGTT

AAGGAAAATAAAAGAAGAAGTAGACTTCGTAAAATAGGAACAGAGGGCTAAGAAATAAGA

ACAAGTAGATCTGAAAAAGAAACGAGTAAAAAGCCTAGAAATATTAGTGCCAATTTCTAT

GGGTCAATGATTTCACAAGTGAATAGCTAACAGTTATTTCCTGTGGCCTTACTTGGCAGA

GAGAGGTGGGGGAAGCAACATAGGAGCAGAAACAGTTCCTTTCTAAGTCTGACTTATAAA

ATAGGAACAATAAAGACAACAGTTTATTGAACAGGATGGTTTATTGAGCTGTCCAGCACT

ATAAGCAAATGGCTTACAAACATTTTCCTACTCTTTTTGATGCTTGAGAGAGATACTTTG

ATAGAAGATTATTCCAAAATATAATTACTTGGTCATTTAGTTCTCTCTTTATTATCATAG

GAAACTATGGGGAATTTTTTTTTCTTTAGATTGCAAACTAGTTTTAAAAAGAGCTTGTAA

TGAACAATTTAATTAGATTGGTTTTGGCTTGCCTAAAAGCTTAAGAAGGTATTAATATTC

TAATCAAAAGTCTTGGGAAAGCATTCTTAGAATAAAAAAAGGAAAGAAAATCTTCATTCT

TATGCTTTAAGAACCAGGAAAGCTGTCAAAGGATATAAGGTAACTCTTACAAAAGCAATT

GTAAAATAAACGTGGTTTGGCCACAATGAGCCAACACCTATGTTTGCCACAGACTTAGAT

TCCCACCTCACTCATGGCAAATTTATTCAGCTGCTTAAGATTATTTTTTACTCATACTTC

GAAAGAACAACAGCCTGGAATTTTTAGACTTTTAATGGCAATGGAAGGAACTTACCTATG

ATAAACATTTTTCTTTACTCTCACGCTTTCTTAACCCATGGCTGTTCTGAGTCAATGTTT

GCCTTGCATTCAAAAAATAATAGTAAAGATTCAAGTAAAACATATTCATTAAGCACTATT

TGAAAGATATACCAAGTGCTTTAACATTATCTCACTTTATTCCTACAAAGATCATGTGCA

ATAAATATCACTGTTCATGTTTCCTACAGATGAAAAAAAACTGAGGGTCATGTTCAGAGA

AATTGGATGACTTACCCAGAGCCACACAGATTTGTACGTGGCAAAGGAGGATTCCATTTC

AAGTCTTTCAACCCCAAATTCATCTTCCTTTCTCTAAGGGGAAATGGTGCTATGGAATTC

ATGTAAGCCACAGAGCTTGGATAAAAGGAATAGTAAGACCAAAAATAGGAAAAGTAGGAA

GAGGTGGATCCTCCTATGTTTTTAATCAGGGTTCTATCTACCTGTAACTCTTCTGGGAAA

AGAAGCAGGATGTGACTGAAACATAGCTGCTTTCTAGATCTCACAAATCTGGCTTTTCTA

GTCAATCACATCTCTCTCTCCTTCGGCTTCTCACCAAACCAGCATCCGTTCAGCTTCAAA

GAAAAAAGAGCCCTACTGTTTCCCACTCATTTATCATCAATCTAAAGTAACTGCCAATCA

CAAAAGTCCCATCTTTATTTCTTTCCTTAGAAACAAATTTCTCTAGGGAAGCTTATCAGT

AGCAGAAGTGCAGACTGGGAAATGGCCTATGTCACCCTCCCATCTAGAAATGCCCAGTGC

ACATCCAGATCCCACACCCCCAAGAGCGTTGTGCAATATCTGTTAATTTATGAGAGCTGT

TTCCCATAGATGATGCTGCAGGCATTAGTAAGGAGGGCAAAGTTCAAGTGATGACACCAT

CTCTACTCCACCTGGCTGGTTTCCAGGTGCCATCTCCTGATCCCTCTCCCCACCCCCACT

GCCCTCTCACCATCCTTCCCCCAAACCCCACACTCCCCACCAATCTGGGTCAGTGATAAA

CACAGAGTATTCCACATGCCTCTGATATGATGTAACATTCGACACACTAAAGATAATACT

GCCTTTAAGGCTCCTGTCCCCCTGGCTAGACTTAAACTGTGTAGAGGAGGAGAACTGTGA

CTTTATTCCCCTTGCATCCTGGACACCCACACATGGTAGGTGTTCAGTGAATATGTGATG

AGTTGGTGAATACCCACTGAATGTGCTATTTGCATTGCTACTTCCTTGTGCTTCCTTCCA

CTGTTTCTATCGCCTAAAATTCTTCTCCCTTTTTCCTCCACCCTCGAGTAGGAAAAAATT

TGTTTCTTTATTGGGCAGGGAGTTCTGGTCATTATACATTTATGTAAAATGTTCTTCTAA

TTGGCATATTCCATGCTATGTCCAGATTCTTTCAAGCGAATTCTCATTAAGGTAATAATA

CCTCACCGAAGTTTCCAGGGATGATCCCCTAGCTGTTCAAAGCTACCTTTTATATATTAA

ATACCAGTCAATATGAATCAATGGTAACTGAAAAAAAGGCTGATAGCTTGTGAAGGAGTT

GGAGTACAAAACTATGCCTATAAATTGATCCTCACAAAGGCAGACTTTTTCCCACAGAAA

TTGTATTATGAATGCTAGTTATAGTTTGAGACTAGTTAATAAAATTCTACTCACTCCAAA

CATAGGATTAATGGAACCCACATGAGTTGTGTGCTGTCAAAGTCGAGTCAAGAGGAGAGA

GAAGGAGAAGAAAATTTCCTCCCTGTTCTCATAGCTCAGGGCACCCAAGGGATTCTAGAG

CGTAAAGTGTACTCCCTTCTATTTTTTACTGCCCTTATTCCCAAGCTGAACCAAATATTT

ACCTCTGCCCTCATTTTCAGTTATGGAGTTCACTCAGGCCCTTTTCAACCTTCGAGGTTC

CTTAACCTTTACATTATTAATTCTTTTTCTAAGCAAAATCCAGCTGATCTCTACTAGATG

GTTAAAAGGATAGTAAATAGGTAAATTAATCCACATTAAGCCACAAATGACTGCTAGCCC

TAACCCTTTAATGACTAATTAATTTTTAATAAAGAATATGTGTCTATATAAATGAATTTA

TACTTCTAAGTTGGCATAAGTTCAGAAAAAATAGTAAGATGAACTGGAAAATCTACAAGG

TATAGGGAAATCCTCTGGGTGAGGAAGAACTAGTCATACCTCCCTAAAAGCCTAGCCCTA

GTTTCTGTTACATTATTTCTTCTTTTCATCTTCTGTTTTCTAAACCACAAGTTTCTAAAA

GCACCAAGGAATTTTCTACCTGTTTATTTCGTTTTGTTTTTGTTTCTGTTTTTTTGTCCA

AGGTGAGGCCCAAGTTGACACTGAGTATTCTCTGTGAAACTCTGCAAGGAGCAACATGTG

ATTTCACAGAAATTAGTCTCGATACACTATATTCATGGCTGTAAGTTCTATGCTGCTCAC

CCATTCATTTGTCCATTCAGTCACTCATTCATGAGACATTTATCATCTGCCTCCTGGAAC

ATACCAGGGCCTACACCAGAAAACAAGGAAACAAGTAAACACTAGTAAACTTTAAACAGG

CTCTCCCCACAAGCAACTGACAGACCAGTGGAGAAGACAGATATGTCAACAGATGATTAC

67

AATAAAGTTTCAAGGCCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTGTAATTCCAACATTTTGGGAGGC

CAAGGCGGGTGGATCACCCGAAGTCAGGAGTTCAAGAGCAGCCTGGCCAACATGGCAAAA

CCCCGTCTCTACTAAAAATAAAAAAATTAGCTGGGCATGATGGTACACACTGGTAGTCCC

AGCTACTAGGGAAGCTGAGGCATGAGAATCACTTGAACCTGGGAGGTAGAGATCGCAGTG

AGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGCAATACAGTGACACTCTGTCTCAGAAA

AAAAAAAAAAAAGTGTCAAACCTACATCCAAAATGTCAAAGTGCTCAAAAAAGTTGGGAA

GGCTTCACCAAAGATGTGACATTTAGGGTAGATAACACCTGTTTGTGGATACTAATGTCC

TGGTGAGTCAAAGAAGAAAAGGATGTACATTATATAAGCTGGATGCAAAAAGGAACAATA

ATGAGGACATGCAACCAAAAACTTACATAGGGAGAACAACTTTACTTACTCAGGGAAGGC

AAAGAGACCACTTAAGAACTCCTTCACATGTGTTATGTCTTAAAAGCTGACTACTGGAGT

TGTATCCCTTGCACAGCATCCCTTTGCACCAAAGTGAACACTACTCTAAGAACATGTGTT

CAGCTCTCCTGAATGCCAAGCACAACCATGCTTGGCATGGCAGTGGTGTCTTATTTCTGC

TCCTCTTTTTCCCCAGGGCATGCCATTGCAAGAGAATGCTCAGCCATGTTCATCTGGGGA

CCTGCTCCTGGTAGAGCAATAGGATCTGTGTGCCCAGCACCACTGCCCACCTAGCTGTCC

TGGCCTGTGCCCAATGCTGACCTTCACCTCAGAGTGTGGCTGTACCACATTCGGTGATGT

CACTCTCACTGAACCTTCAGCCTCCTTCCTGGGACTTCCTGATGGACTGTTATCCAGGGC

AGAATGTGTTGATTTTCTAAATCACATAAATGAATAGCTTGACTGTTGATTATGTAGAAA

ATCAGAGCAAATATTTGCATGGCTTTGTGCAGCCCATTCTTGAGCATCTGATTCTCCCCA

GAATTCTAAAAAACCTGCTGCTTTCTCAAGCCCTCAGTAAAGACATGCTTTCTTGATAAT

CCTAGCCAAACCTATTCATTTGACATCTTTGTTACACAAATGGTTAACCACAGAGTTAAC

TTCAGAAATGGCTGGCAGGTATGAAGGTTAGAAGATTCATGCACTTTTGCTAGACTGAAT

TGGAAGTTAAAGAGTAAGTAGTTACTGACTGCAGAGGCCTGGAAAACCATGGAAAAAATC

CTATTCCTCAAAGTCGAGCCCTACCTCCTACGCCTCTTAAATCAATTGCCACAGTGACCA

ATTTGTCAGTCACCTAAAGGCAGCTATCCTGACCACTTAAGGGAGAATACTTATAATCTT

TATACCTAAGTAAAGATTGTGAGAGGAAAGAAATGGTTTAAAGAATATGAATGTGTCACA

CTTCTGAGGTTAATGATAAATGAATTGGTCCTGCTTACCTCAGGAAAAACTTTCAAGTCT

TTCTGAAAAACTAATTTAATTCAGTAGTATTTTCTAAGATTTAGGTTATGTTTTTAATCA

ATTTGGAAACCAAGATTTACTTATAGAAAAAAAGGAAAAGGACCTAGATAGGTTTATTCA

CATAGAATCCCAATTTCACTTCTCTGGATGATACCATTTTCTACAAAAGCAATTATGTTC

TAAAATTTAAGTGTGCTTTCTTAGGCTTTATCAGTTCACAGTGTTTCCTTAAGAAATATG

ATCCAGTATTTTTTCCTAAGACTAAAGTTGAGTTACTACGTTTATGACTGAGAAATGAAT

GTTTGTTAGTTTGTTTGTTTACAATAAGAATTTTTTCTTTACCATTTTATTTTTATTTTC

CCCAGGTGTATTTGATATAGTGTTTGCAACAAATTCGACCCAGGTGATCAAAATGATTCT

CAACTCTTCTACTGAAGATGGTATTAAAAGAATCCAAGATGATTGTCCCAAAGCTGGAAG

GCATAATTACATATTTGTCATGATTCCTACTTTATACAGTATCATCTTTGTGGTGGGAAT

ATTTGGAAACAGCTTGGTGGTGATAGTCATTTACTTTTATATGAAGCTGAAGACTGTGGC

CAGTGTTTTTCTTTTGAATTTAGCACTGGCTGACTTATGCTTTTTACTGACTTTGCCACT

ATGGGCTGTCTACACAGCTATGGAATACCGCTGGCCCTTTGGCAATTACCTATGTAAGAT

TGCTTCAGCCAGCGTCAGTTTCAACCTGTACGCTAGTGTGTTTCTACTCACGTGTCTCAG

CATTGATCGATACCTGGCTATTGTTCACCCAATGAAGTCCCGCCTTCGACGCACAATGCT

TGTAGCCAAAGTCACCTGCATCATCATTTGGCTGCTGGCAGGCTTGGCCAGTTTGCCAGC

TATAATCCATCGAAATGTATTTTTCATTGAGAACACCAATATTACAGTTTGTGCTTTCCA

TTATGAGTCCCAAAATTCAACCCTCCCGATAGGGCTGGGCCTGACCAAAAATATACTGGG

TTTCCTGTTTCCTTTTCTGATCATTCTTACAAGTTATACTCTTATTTGGAAGGCCCTAAA

GAAGGCTTATGAAATTCAGAAGAACAAACCAAGAAATGATGATATTTTTAAGATAATTAT

GGCAATTGTGCTTTTCTTTTTCTTTTCCTGGATTCCCCACCAAATATTCACTTTTCTGGA

TGTATTGATTCAACTAGGCATCATACGTGACTGTAGAATTGCAGATATTGTGGACACGGC

CATGCCTATCACCATTTGTATAGCTTATTTTAACAATTGCCTGAATCCTCTTTTTTATGG

CTTTCTGGGGAAAAAATTTAAAAGATATTTTCTCCAGCTTCTAAAATATATTCCCCCAAA

AGCCAAATCCCACTCAAACCTTTCAACAAAAATGAGCACGCTTTCCTACCGCCCCTCAGA

TAATGTAAGCTCATCCACCAAGAAGCCTGCACCATGTTTTGAGGTTGAGTGACATGTTCG

AAACCTGTCCATAAAGTAATTTTGTGAAAGAAGGAGCAAGAGAACATTCCTCTGCAGCAC

TTCACTACCAAATGAGCATTAGCTACTTTTCAGAATTGAAGGAGAAAATGCATTATGTGG

ACTGAACCGACTTTTCTAAAGCTCTGAACAAAAGCTTTTCTTTCCTTTTGCAACAAGACA

AAGCAAAGCCACATTTTGCATTAGACAGATGACGGCTGCTCGAAGAACAATGTCAGAAAC

TCGATGAATGTGTTGATTTGAGAAATTTTACTGACAGAAATGCAATCTCCCTAGCCTGCT

TTTGTCCTGTTATTTTTTATTTCCACATAAAGGTATTTAGAATATATTAAATCGTTAGAG

GAGCAACAGGAGATGAGAGTTCCAGATTGTTCTGTCCAGTTTCCAAAGGGCAGTAAAGTT

TTCGTGCCGGTTTTCAGCTATTAGCAACTGTGCTACACTTGCACCTGGTACTGCACATTT

TGTACAAAGATATGCTAAGCAGTAGTCGTCAAGTTGCAGATCTTTTTGTGAAATTCAACC

TGTGTCTTATAGGTTTCCACTGCCAAAACAATGCCCGTAAGATGGCTTATTTGTATAATG

GTGTTACTAAAGTCACATATAAAAGTTAAACTACTTGTAAAGGTGCTGCACTGGTCCCAA

GTAGTAGTGTCTTCCTAGTATATTAGTTTGATTTAATATCTGAGAAGTGTATATAGTTTG

TGGTAAAAAGATTATATATCATAAAGTATGCCTTCCTGTTTAAAAAAAGTATATATTCTA

68

CACATATATGTATATGTATATCTATATCTCTAAACTGCTGTTAATTGATTAAAATCTGGC

AAAGTTATATTTACTTTAAAATAAAATAATTTTATTGCAATGTATTTATCTTCATTACTT

AAAATAGATGCTAATTTATTTTAAAATAAGACTACCTTGAATGAGTATGAATATATTTTT

ATTTAAATTTTGATACAACTGATAGTTTAATACTATTGGTTATAGATTTTTTATCCTGAC

ATTGAAAAGTTAAAGAAAAAACATTTTGTTCTACTGCATGTCATGGAATAAACACATCGT

TTTGAATTTTTCAGTTTTTCACATAACAAAGAAAAAAATTAACTCTTGCTATAATGCTAG

AATAATACATTATTTTACAAGTAATTTAATAACAGAATTTTTCTAATTGTATACATTATC

ATTGTAGGAAAGTTAGAAGATATAGAATAACATAAAAATAAAAGTCATGTTTAGCTTCCC

CGGTCAAAAATCATTATTTTAACATTTGGGAACTTTATTTTCTACTTTTTTCATTCATTA

TACACACATATATGTGTCAATCCTGATACTGAAGTCATGATGTGTATAGTACTTTGTATA

CAGATCTTTCACTTAATGTCATAGCATAGTAGTTTCCTACCCAATTAAATATTTTTCTAA

AACATTTTAATATTTGTATAATACTACAAAATATGGACATACGCT

69

Lampiran 2 Karakteristik Responden Hipertensi

No. Kode Sampel Jenis Kelamin Umur (Tahun) Tekanan Darah

(mmHg)

1 H1 P 46 150/90

2 H2 P 58 130/80

3 H3 L 52 130/90

4 H4 P 43 140/90

5 H5 L 54 130/90

6 H6 P 37 140/90

7 H7 P 38 140/90

8 H8 L 52 130/90

9 H9 P 47 130/90

10 H10 P 63 130/90

11 H11 P 59 140/95

12 H12 P 53 145/90

13 H13 P 54 130/70

14 H14 P 59 140/90

15 H15 P 61 150/60

16 H16 P 63 150/90

17 H17 P 48 130/80

18 H18 L 67 130/90

19 H19 P 60 140/80

20 H20 P 44 140/80

21 H21 P 58 130/80

22 H22 P 46 135/100

23 H23 P 61 140/90

24 H24 L 64 140/80

25 H25 L 72 140/90

26 H26 P 73 130/60

27 H27 P 50 135/90

28 H28 P 47 140/80

29 H29 P 42 140/90

30 H30 L 61 140/90

70

31 H31 L 63 170/80

32 H32 L 37 130/90

33 H33 P 63 140/90

34 H34 L 65 140/90

35 H35 P 53 130/80

36 H36 P 53 140/100

37 H37 P 53 170/80

38 H38 P 42 160/90

39 H39 P 45 140/90

40 H40 P 51 160/90

41 H41 P 56 130/90

42 T1 P 44 140/80

43 T2 P 50 150/90

44 T3 P 50 160/90

45 T4 P 61 140/108

46 T5 P 51 160/100

47 T6 L 33 160/80

48 T7 P 50 150/80

49 T8 L 53 130/90

50 T9 P 60 150/100

51 T10 P 63 140/90

52 T11 P 60 160/90

53 T12 P 66 140/80

54 T13 L 60 160/100

55 T14 P 48 170/90

56 T15 P 64 130/90

57 T16 L 65 150/64

58 T17 P 60 140/90

59 T18 P 70 140/70

60 T19 P 49 140/90

71

Lampiran 3 Karakteristik Responden Normotensi

No. Kode Sampel Jenis Kelamin Umur (Tahun) Tekanan Darah

(mmHg)

1 A1 P 21 110/80

2 A2 L 21 120/80

3 A3 P 20 110/70

4 A4 P 21 120/80

5 A5 L 21 100/70

6 A6 P 21 120/80

7 A7 L 20 120/80

8 A8 L 21 120/80

9 A9 P 20 120/80

10 A10 L 21 120/80

11 A11 P 20 100/80

12 A12 P 20 110/70

13 A13 P 21 110/70

14 A14 P 20 120/80

15 A15 L 21 120/80

16 A16 P 21 120/80

17 A17 P 21 110/60

18 A18 L 22 120/80

19 A19 P 20 100/80

20 A20 P 23 110/80

21 A21 P 20 110/80

22 B1 P 21 110/70

23 B2 L 20 120/80

24 B3 P 20 110/70

25 B4 P 20 110/70

26 B5 P 20 110/80

27 B6 L 20 120/80

28 B7 P 19 90/60

29 B8 P 19 120/80

72

30 B9 P 20 110/70

31 B10 P 20 110/80

32 B11 P 20 120/80

33 B12 P 20 120/80

34 B13 P 18 110/70

35 B14 P 20 120/80

36 B15 P 19 110/80

37 B16 P 20 110/80

38 C1 P 18 110/70

39 C2 P 19 110/70

40 C3 L 18 110/80

41 C4 L 19 120/80

42 C5 P 20 120/80

43 C6 P 19 110/70

44 C7 P 18 120/80

45 C8 L 19 120/70

46 C9 L 18 100/70

47 C10 L 19 110/80

48 C11 P 18 120/70

49 C12 P 19 110/70

50 C13 P 18 110/80

51 C14 P 18 110/70

52 C15 P 19 110/80

53 C16 P 19 90/70

54 C17 P 18 100/80

55 C18 P 19 110/80

56 C19 L 18 110/70

57 C20 P 18 90/70

58 C21 P 20 110/70

59 C P 21 100/60

60 A P 24 120/80

73

Lampiran 4 Karakteristik Sampel Hipertensi

No. Kode Sampel Konsentrasi 260/280 Genotip

1 H1 57,420 1,81 CC

2 H2 371,230 1,51 CC

3 H3 93,334 1,43 CC

4 H4 79,906 1,53 CC

5 H5 74,645 1,65 CC

6 H6 94,285 1,64 AC

7 H7 37,627 1,64 CC

8 H8 86,591 1,56 AA

9 H9 353,935 1,55 AA

10 H10 146,332 1,78 AC

11 H11 14,403 1,35 CC

12 H12 70,271 1,28 CC

13 H13 66,854 1,82 AC

14 H14 37,997 1,81 CC

15 H15 87,265 1,87 AC

16 H16 14,788 1,74 CC

17 H17 116,406 1,93 CC

18 H18 56,315 1,79 AC

19 H19 145,712 1,33 AC

20 H20 146,829 1,53 AC

21 H21 21,858 1,68 CC

22 H22 281,287 1,56 AA

23 H23 220,553 1,8 AC

24 H24 32,190 1,86 CC

25 H25 48,303 1,92 CC

26 H26 124,263 1,83 AC

27 H27 66,1 1,84 AC

28 H28 102,260 1,54 AA

29 H29 148,496 1,72 AC

30 H30 80,810 1,71 AC

74

31 H31 35,111 1,86 CC

32 H32 65,908 1,43 AA

33 H33 63,636 1,72 AC

34 H34 130,897 1,75 AC

35 H35 24,571 1,84 CC

36 H36 28,823 1,78 CC

37 H37 28,373 1,50 CC

38 H38 44,266 1,84 CC

39 H39 33,772 1,48 AA

40 H40 96,813 2,00 AC

41 H41 40,480 1,66 CC

42 T1 70,818 1,73 AC

43 T2 61,591 1,81 AA

44 T3 24,628 1,59 CC

45 T4 24,322 1,59 CC

46 T5 43,048 1,52 CC

47 T6 54,823 1,57 AA

48 T7 98,346 1,55 AA

49 T8 8,167 1,18 CC

50 T9 51,587 1,8 AC

51 T10 44,428 1,89 CC

52 T11 67,047 1,4 CC

53 T12 10,098 1,52 CC

54 T13 38,925 1,06 CC

55 T14 66,881 1,49 AC

56 T15 47,585 1,66 CC

57 T16 108,649 1,89 AC

58 T17 90,252 1,66 AC

59 T18 27,466 1,48 CC

60 T19 35,168 1,9 CC

75

Lampiran 5 Karakteristik Sampel Normotensi

No. Kode Sampel Konsentrasi 260/280 Genotip

1 A1 58,868 1,54 CC

2 A2 88,313 1,51 CC

3 A3 205,483 1,25 AA

4 A4 80,526 1,57 CC

5 A5 102,049 1,41 CC

6 A6 88,186 1,79 AA

7 A7 111,565 1,52 AA

8 A8 177,062 1,47 CC

9 A9 48,881 1,93 AC

10 A10 278,166 1,87 CC

11 A11 94,908 1,92 CC

12 A12 232,566 1,55 CC

13 A13 151,503 1,41 CC

14 A14 141,514 1,61 CC

15 A15 75,512 1,55 CC

16 A16 45,869 1,59 AC

17 A17 63,628 1,78 CC

18 A18 704,057 1,37 CC

19 A19 24,632 1,55 AC

20 A20 199,572 1,55 CC

21 A21 29,267 1,79 AC

22 B1 40,392 1,74 AC

23 B2 28,838 1,5 AC

24 B3 21,316 1,98 AC

25 B4 242,299 2,13 CC

26 B5 539,301 1,55 CC

27 B6 223,078 1,76 CC

28 B7 10,809 1,72 AC

29 B8 90,588 1,71 CC

30 B9 128,532 1,56 CC

76

31 B10 316,435 1,44 CC

32 B11 33,097 1,6 AC

33 B12 234,754 1,68 CC

34 B13 56,239 1,81 CC

35 B14 46,953 1,53 AC

36 B15 20,821 1,68 AC

37 B16 53,477 1,4 CC

38 C1 78,243 1,53 CC

39 C2 63,407 1,38 CC

40 C3 36,680 1,76 AC

41 C4 52,915 1,68 CC

42 C5 92,446 1,78 CC

43 C6 35,072 1,33 AC

44 C7 52,502 1,79 CC

45 C8 101,437 1,49 AA

46 C9 442,876 1,42 CC

47 C10 457,611 1,49 CC

48 C11 84 1,72 CC

49 C12 258,214 1,47 CC

50 C13 49,937 1,46 AC

51 C14 66,898 1,76 CC

52 C15 18,534 1,60 AC

53 C16 45,324 1,56 AC

54 C17 28,515 1,82 CC

55 C18 459,795 1,44 CC

56 C19 54,793 1,35 CC

57 C20 45,026 1,95 AA

58 C21 62,384 1,61 CC

59 C 443,116 1,75 CC

60 A 521,285 2,01 CC

77

Lampiran 6 Alat dan Bahan

GS Column GB Column

GST Buffer, GSB Buffer, Protease K

Waterbath AS ONE TRW -42 TP 600C

W1 Buffer, Wash Buffer, Elution

Buffer Nuclease-Free Water

Tabung Centrifuge 15 ml Micropipet

78

Microtip dan Microsentrifuge Tube LightCycler 480 Instrument

Vortex SPROUT Biomedical Freezer SANYO

Kulkas penyimpanan -40C

Vortex CORNING LSE

Microsentrifuge H-19F KOKUSAN

Effendorf Centrifuge 5430

79

rhAmp Reporter Mix rhAmp Genotyping Mastermix

rhAmp SNP rs5186, rs4961, rs699

White Plate PCR

Nano Drop

Tube PCR

80

Lampiran 7 Surat Persetujuan Etik

81

Lampiran 8 Informed Consent Pengambilan Sampel

Surat Persetujuan

Yang bertanda tangan di bawah ini

Nama :

Usia :

Pekerjaan :

Alamat :

Nomor Telpon/hp :

Menyatakan bahwa saya telah mengerti sepenuhnya atas penjelas yang telah

diberikan Chindy Maylawati Putri, Ariyona Insani dan Afifah Raisa Halim dari Fakultas

Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dan bersedia menjalani penelitian mengenai

“Jumlah Kejadian Polimorfisme rs 4961, rs5186 dan rs699 dengan kejadian Hipertensi”.

Pernyataan ini dibuat dengan kesadaran penuh tanpa paksaan.

,

2019

Peneliti 1 Peneliti 2

{Chindy Maylawati Putri} {Ariyona Insani}

Peneliti 3 Peserta Penelitian

{Afifah Raisa Halim} { }

82

Lampiran 9 Questioner

Identitas

Nama :

Alamat :

Nomer Telepon :

Email :

Usia :

Jenis Kelamin :

Berat Badan :

Tinggi Badan :

Pekerjaan :

Pendidikan Terakhir :

Questioner Penelitian

1. Adakah penyakit yang diderita saat ini, jika ada tolong sebutkan!

2. Adakah obat-obatan yang dikonsumsi saat ini, jika ada tolong sebutkan!

3. Adakah riwayat Hipertensi di keluarga anda?

83

4. Jika pertanyaan nomer 3 dijawab ya, tolong sebutkan

(ayah/ibu/kakak/adik)!

5. Apakah anda menderita Hipertensi? (jika tidak langsung lanjut ke

pertanyaan nomer 10 )

6. Sudah berapalama anda menderita Hipertensi?

7. Obat anti hipertensi apa yang anda gunakan?

8. Berapa kali sehari anda meminum obat tersebut dan berapa dosisnya?

9. Berapa kali dalam sebulan anda pergi ke layanan kesehatan (rs/puskesmas)

untuk kontrol tentang hipertensi?

10. Berapakah tekanan darah anda saat ini?

11. Apakah anda merokok?

12. Apakah anda meminum alkohol?

13. Berapa kali dalam seminggu anda berolahraga?

84

CURICULUM VITAE

Identitas

Nama : Ariyona Insani

Jenis Kelamin : Perempuan

Tempat, Tanggal Lahir : Jakarta, 22 Maret 1999

Agama : Islam

Alamat : Jl. Batu Berlian no. 6 Kayu Putih, Pulo Gadung,

Jakarta Timur 13210

Email : ariyonai@yahoo.com

Riwayat Pendidikan

Taman Kanak-Kanak : TK Cindera Mata Bekasi Barat

Sekolah Dasar : SD Cindera Mata Bekasi Barat

SDN Ujung Menteng 01 Pagi Jakarta Timur

Sekolah Menengah Pertama : SMPN 193 Jakarta Timur

Sekolah Menengah Atas : SMAN 21 Jakarta Timur

Universitas : FK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pengalaman Organisasi

1. Anggota Pramuka SMPN 193 Jakarta

2. Anggota Paduan Suara SMAN 21 Jakarta

3. Sekertaris Kasprof HMPSKPD UIN Jakarta

4. Anggota Kasprof DEMA FK UIN Jakarta