Sinbiotik ekstrak pisang dan Bifidobacterium breve 1273 ... · Nama Lengkap : Ir. Komang Ayu...
Transcript of Sinbiotik ekstrak pisang dan Bifidobacterium breve 1273 ... · Nama Lengkap : Ir. Komang Ayu...
i
Kode/Nama
Rumpun Ilmu
: 362 / Bidang Kesehatan Umum
Lain yang belum tercantum
Tema : Kesehatan, penyakit tropis, gizi
dan obat-obatan
LAPORAN PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL
LAMA WAKTU KOLONISASI LACTOBACILLUS SP F213 PADA
SALURAN PENCERNAAN DIANALISIS MENGGUNAKAN
SIDIK DNA MIKROBIOMIK FESES DALAM PENGEMBANGAN
PROBIOTIK UNTUK MENURUNKAN KOLESTEROL
Ketua/Anggota Tim
Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc., Ph.D. NIDN: 00312 6651 (Ketua) Drs. Yan Ramona, M.App.Sc, Ph.D. NIDN: 0022106401 (Anggota) Ir. K. Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc. NIDN: 0008036801 (Anggota)
UNIVERSITAS UDAYANA
Nopember 2015
ii
HALAMAN PENGESAHAN
Judul Penelitian : Lama waktu kolonisasi Lactobacillus sp F213 pada saluran
pencernaan dianalisis menggunakan sidik DNA mikrobiomik
feses dalam pengembangan probiotik untuk menurunkan
kolesterol
Tema Isu Stragtegis Nasional : Kesehatan, Penyakit Tropis, Gizi dan Obta-obatan (Health,
Tropocal Diseases, Nutrition and Medicine)
Kode/Nama Rumpun Ilmu : 363/Bidang Kesehatan Umum Lain yang Belum Tercantum
Peneliti / Pelaksana
Nama Lengkap : Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc.P.hD.
NIDN : 0031126651
Jabatan Fungsional : Lektor Kepala
Program Studi : Ilmu Kesehatan Masyarakat
Nomor HP : 081338661516
Surel (e-mail) : [email protected]
Anggota Peneliti (1)
Nama Lengkap : Dr. Drs Yan Ramona, M.App.Sc
NIDN : 0022106401
Perguruan Tinggi : Universitas Udayana
Anggota Peneliti (2)
Nama Lengkap : Ir. Komang Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc
NIDN : 0008036801
Perguruan Tinggi : Universitas Udayana
Institusi Mitra (jika ada)
Nama Institusi Mitra : --
Alamat : --
Penanggung Jawab : --
Tahun Pelaksanaan : Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun
Biaya Tahun Berjalan : Rp. 81.250.000
Biaya Keseluruhan : Rp. 200.000.000
Denpasar, 8 Nopember 2015
Mengetahui,
Ketua LPPM
Prof. Dr. Ir. I Nyoman Gede Antara, M.Eng.
NIP/NIK : 196408071992031002
Ketua Peneliti
Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc.Ph.D.
NIP/NIK196612311993111002
iii
RINGKASAN
Penyakit tidak menular akibat pola makan dan gaya hidup seperti penyakit jantung
koroner (PJK) dan tekanan darah tinggi semakin meningkat di Indonesia. Diperkirakan
sebanyak 150 orang dalam 10.000 penduduk meninggal akibat PJK. Oleh karena itu
diperlukan upaya-upaya pemanfaatan biodivesitas Indonesia guna menurunkan PJK.
Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen
Indonesia dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian
kandungan kolesterol darah. Secara khusus, pada tahun pertama penelitian ini
bertujuan untuk mengembangkan sistem deteksi spesifik untuk melancak kolonisasi
dan populasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan manusia, melalui
pendekatan berbasis DNA mikrobiomik pada feses. Pengembangan sekuen pelacak
khusus Lactobacillus sp F213 didasarkan pada susunan nukleotida pada bagian
intrageneic spacer region (IGS) pada rDNA Lactobacillus sp F213 atau sekuen pita
khusus yang diperoleh dari random amplified DNA polymorphism (RAPD).
Pada tahap pengembangan pendeteksi khusus ini dilakukan PCR terhadap IGS
Lactobacillus sp F213 yang dibandingkan dengan Lactobacillus rhamnosus,
Pediococcus spp, serta strain dari kelompok non-bakteri asam laktat. Hasil penelitian
menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 mempunyai panjang IGS yang spesifik,
berbeda dengan L rhamnosus, Pediocoocus serta strain non-BAL, namun demikian
IGS Lactobacillus sp F213, L rhamanosus, dan Pediococcus spp menunjukkan pita
ganda / 2 buah IGS dengan panjang yang berbeda.
Lactobacillus sp F213 mempunayi dua buah IGS dengan susunan nukleotda
yang berbeda. Homologi yang dilakukan pada GenBank menunjukkan bahwa IGS tipe
I mempunyai panjang 290bp dan menunjukkan homologi sebesar 97%
( 283/290bp) dengan Weissella confusa 16S rRNA and 23S (AY342323|AY342323.1).
Sementara IGS tipe II dari LbF213 mempunyai ukuran 298bp dengan homologi
260/283bp (91%), W. confusa 16S rRNA and 23S sebesar >AY342323|AY342323.1.
Adanya sekuen nukleotida dengan variasi yang tinggi dibandingkan dengan galur
menyebabkan bagian IGS ini merupakan target yang baik untuk alat deteksi spesifik
(primer dan probe spesifik). Beberapa primer telah dirancang dan diuji dan diperoleh
primer bahwa B2FR mempunyai spesifisitas yang baik. Probe spesifik LbF213P juga
sudah didesign dan dilabel dengan label flourescens dengan satu set primer spesifik
untuk pengujian RT-PCR. Spesifisitas primer B2FR dapat mendeteksi 1.400 sel yang
setara dengan 3,4 pmol (3 x 10-9 gr) DNA. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
primer B2FR dapat dipergunakan untuk mendeteksi Lactobacillus sp F213 pada feses
manusia dengan metode pelacakan berbasis DNA.
iv
PRAKATA
Puji syukur kami panjatkan, karena atas rachmat-Nya laporan ini dapat diselesaikan.
Laporan ini merupakan capaian dari serangkaian rencana penelitian pada tahun 2015.
Tim peneliti mengucapkan terimakasih kepada Dirjen DIKTI melalui Litabmas, yang
telah membiayai penelitian ini, Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada
Masyarakat, Univ. Udayana yang telah memfasilitasi dari pengusulan proposal sampai
pada pencairan dana. Pada laporan ini, masih banyak hal yang belum tercapai,
sehingga peneliti akan bekerja keras untuk merampungkan penelitian tahun pertama
ini sesuai kontrak yang etlah disepakati.
Semoga laporan ini bermanfaat bagi kita semua.
Bukit Jimbaran, 8 Nopember 2015
Tim Peneliti
v
DAFATR ISI
Halaman
HAL PENGESAHAN ----------------------------------- ii
RINGKASAN ----------------------------------- iii
PRAKATA ----------------------------------- iv
DAFTAR ISI ----------------------------------- v
DAFTAR GAMBAR ----------------------------------- vi
DAFTAR TABEL ----------------------------------- vii
BAB I. Pendahuluan ----------------------------------- 1
BAB II. Tinjauan Pustaka ----------------------------------- 5
BAB III. Metode ----------------------------------- 12
BAB IV. Hasil dan Pembahasan ----------------------------------- 17
BAB V. Simpulan ----------------------------------- 31
DAFTAR PUSTAKA ----------------------------------- 32
LAMPIRAN ----------------------------------- 36
vi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1 Peta jalan penelitian pengembangan probiotik (disesuaikan
dengan guide line pengembangan probiotic foods
FAO&WHO 2002)
11
Gambar 2 Ilustrasi target gen sebagai strategi dalam pengembangan
sistem deteksi molekuler Lactobacillus sp F213.
12
Gambar 3 Ilustrasi design primer/probe dari seukuen IGS
Lactobacillus sp F213
14
Gambar 4A Morfologi koloni Lactobacillus sp F213 pada media MRS
agar
17
Gambar 4B Morfologi mikroskopik Lactobacillus sp F213 pada media
MRS both
17
Gambar 5 Genomik DNA dari Lactobacillus sp F213 18
Gambar 6A Hasil PCR IGS Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sp
F213, Pedioccocus spp, dan non LAB (isolat B3).
29
Gambar 6B Optimasi PCR dengan termal gradient. 20
Gambar 7 Panjang IGS Lactobacillus sp F213, L. rhamnosus
SKG34 dan Pediococcus spp.
21
Gambar 8 Teknik elusi DNA dengan memberikan muatan magnetik 22
Gambar 9
Gambar 10.
Gambar 11.
Gambar 12.
Gambar 13.
Gambar 14
IGS dari Lactobacillus sp F213, L rhamnosus SKG34 dan
hasil PCR pita tunggal dari Lactobacillus sp F213 dan L
rhamnosus SKG34
Spesifisitas primer spesifik IGS LbF213.
Spesifisitas primer B2FR terhadap beberapa species bakteri
asam laktat dan non-bakteri asam laktat.
Spesifisitas primer B2FR terhadap DNA feses.
Deteksi LbF213 pada DNA feses dengan primer B2FR.
Limit deteksi primer B2FR.
22
27
28
28
30
30
vii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1 Primer yang dipergunakan untuk RAPD 15
Tabel 2 Tabel 2. Sekuen primer yang dipakai pada PCR IGS
Lactobacillus sp F213
19
Tabel 3 . Susuan primer spesifik yang untuk mendeteksi
Lactobacillus sp F213.
1
BAB I. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Modernisasi memberikan andil pada pergeseran pola makan masyarakat dari
makanan tradisional berserat tinggi ke makanan gaya barat dengan lemak tinggi dan
rendah serat. Konsumsi makanan dengan kandungan asam lemak jenuh (asal hewani)
yang tinggi merupakan salah satu faktor resiko penyebab penyakit jantung koroner
(PJK), pembunuh nomor satu di dunia, sebagai akibat penimbunan kolesterol pada
pembuluh darah. Data WHO menunjukkan bahwa pada tahun 2002 diperkirakan PJK
menyebabkan 7 juta kematian di seluruh dunia dan pada tahun 2020 diperkirakan
akan naik menjadi 11 juta jiwa. Dan di Indonesia diperkirakan 150 orang dalam
10.000 penduduk meninggal akibat PJK (Anon, 2008).
Pembentukan asam empedu merupakan mekanisme utama untuk
megekskresikan kolesterol dari tubuh. Garam empedu (tauro-kolat dan gliko-kokolat)
merupakan produk antara metabolisme kolesterol. Hidrolisis garam empedu oleh
mikroorganisme saluran pencernaan yang mempunyai enzim bile salt hidrolase
(BSH) menghasilkan taurin atau glisin serta asam empedu bebas. Asam empedu
bebas ini berisfat tidak larut dan tidak direabsorbsi tubuh sehingga akan
diekskresikan melalui feses (Kurdi et al., 2000). Semakin banyak asam empedu yang
dibuang melalui siklus enterohepatik semakin banyak pula kolesterol darah
digunakan untuk sintesis asam empedu baru (Brisson, 1981).
Penurunan kolesterol darah dilaporan dapat dilakukan dengan mengkonsumsi
susu terfermentasi oleh Lactobacillus (Agerbaek et al., 1995; Bertolami et al, 1999;
Larsen et al, 2000; Schaafsma et al., 1998), walaupun secara mekanistik belum
diketahui secara pasti bagaiaman Lactobacillus berperan dalam proses ini di dalam
tubuh (De Rose dan Katan, 2000). Dari serangkaian hasil penelitian in vitro, diduga
bahwa mekanisme penurunan kolesterol oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium
meliputi efek fisiologis dari asam lemak rantai pendek (short chain fatty acids) dalam
saluran pencernaan (Kurdi et al, 2000; 2003), asimilasi kolesterol oleh Lactobacillus
dan Bifidobacterium (Klaver et al., 1993; Gilliland et a.l, 1985), pengikatan
2
kolesterol pada permukaan sel Lactobacillus dan Bifidobacterium (Lin dan Cheh,
2000) serta dekonjugasi enzimatis garam empedu oleh Lactobacillus dan
Bifidobacterium (Tahri et al., 1985; Tahri et al., 1996).
Mengingat bahaya dari kandungan kolesterol yang terlalu tinggi pada darah
sebagai penyebab utama penyempitan pembuluh darah dan PJK sementara di terapi
medis yang dilakukan dengan mempergunakan obat-obatan yang sangat mahal, maka
dipandang perlu dilakukan penelitian untuk menggali potensi mikrobial alam
Indonesia guna menanggulangi masalah kolesterol dan PJK. Probiotik merupakan
salah satu pilihan yang menjanjikan.
Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan
secara in vitro dan in vivo. Penelitian in vitro dari aspek ketahan pada kondisi saluran
pencernaan meliputi ketahan Lactobacillus sp F213 pH rendah, enzim pencernaan,
dan asam empedu. Dari aspek keamanan meliputi bahwa Lactobacillus sp F213 tidak
melakukan transformasi asam empedu primer (tidak memicu kolon kanker), tidak
menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan, sifat tidak beracun (tidak me-lisis
sel darah meras) serta Lactobacillus sp F213 tidak akut pada larva udang. Aspek
fungsional meliputi kemampuan Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran
pencernaan mencit untuk mencegah diare dan stimulasi sistem imun serta
Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolsisi garam empedu sebagai potensi dalam
menurunkan kolesterol darah. Potensi in vitro telah teruji dalam penelitian in vivo
seperti kemampuan berkompetisi untuk melekat apda saluaran pencernaan mencit
yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp F213 berpotensi untuk
mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213 mampu bertahan dalam
saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan menurunkan 35% dari
total kolesterol tikus (Nursini et al., 2010). Penelitian pada subjek manusia
menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik
feces, serta dapat menurunkan 6,29% kolesterol dan dapat menurunkan TNF alfa
sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi 0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian
Lactobacillus sp F213). Disamping itu pemberian Lactobacillus sp F213 dapat
3
meningkatkan kenyamanan buang air besar (mencegah konstipasi) (Sujaya et al.,
2012, 2013).
Rumusan Masalah
Setelah melakukan serangkaian penelitian untuk mengembangankan Lactobacillus sp
F213 sebagai probiotik dengan potensi dapat menurunkan kolesterol, serta
berdasarkan persyaratan WHO bahwa probiotik adalah mikroorganisme hidup yang
dikonsusmsi dan dapat memberikan manfaat kesehatan bagi host, maka probiotik
harus mampu bertahan dan berkembang biak pada saluran pencernaan. Oleh karena
itu, rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :
Apakah Lactobacillus sp F213 dapat tumbuh pada saluran pencernaan dan
berapakah populasi Lactobacillus sp F213 pada feses?
Berapa lamakah Lactobacillus sp F213 dapat berada pada saluran pencernaan
manusia sehat ?
Bagaimankan efek pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap profile lipid
darah subjek yang diberikan Lactobacillus sp F213 ?
Tujuan Penelitian
Tujuan Umum :
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen Indonesia
dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian kandungan
kolesterol darah.
Tujuan khusus penelitian :
Untuk mengembangkan metode deteksi spesifik yang dapat diperguankan
untuk diagnostik Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan ?
Untuk mengetahui lama waktu kolonisasi dan populasi Lactobacillus sp F213
pada saluran pencernaan (feses)?
Untuk mengetahui efek fungsional pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap
profile lipid darah.
4
Manfaat khusus:
Manfaat dari penelitian ini adalah, secara teoritis, dapat menjelaskan
bagaimana prilaku (aktivitas) dan pengaruh Lactobacillus sp F213 terhadap
kesehatan saluran pencernaan serta profile lipid pada darah.
Manfaat aplikasinya adalah dapat menjadi salah satu pilihan dalam terapi
biologis dalam penanggulangan masalah kolesterol darah dan berkontribusi
dalam menurunkan kejadian penyakit PJK di Indonesia.
5
BAB II. STUDI PUSTAKA
Kasus Penyakit Jantung Koroner
Penyakit jantung koroner (PJK) telah menjadi penyebab utama kematian di dunia
dewasa ini. Badan Kesehatan Dunia (WHO) mencatat lebih dari 7 juta orang
meninggal akibat PJK di seluruh dunia pada tahun 2002. Angka ini diperkirakan
meningkat hingga 11 juta orang pada tahun 2020. Di Indonesia, kasus PJK semakin
sering ditemukan karena pesatnya perubahan gaya hidup. Meski belum ada data
epidemiologis pasti, angka kesakitan/kematiannya terlihat cenderung meningkat.
Hasil Survei Kesehatan Nasional tahun 2001 menunjukkan 3 dari 10.000 penduduk
Indonesia menderita PJK (Anon., 2008).
Penyakit jantung koroner (PJK) terjadi karena penyempitan/ penyumbatan
pembuluh darah koroner yang berfungsi mendistribusikan darah dan oksigen ke otot
jantung. Penyumbatan (plak aterosklerosis) disebabkan tertumpuknya endapan lemak
(terutama kolesterol LDL), sel-sel otot polos pembuluh darah dan matriks
ekstraseluler lainnya di sepanjang dinding arteri sebagai hasil proses yang
berlangsung bertahun-tahun. Jika aliran darah berkurang secara bermakna, maka
penderita perlu segera mendapat tindakan medis. Karena pentingnya penyakit ini dan
kecendrungan peningkatan kasus dari tahun ke tahun maka telah diterbitkan pedoman
teknis penemuan dan penatalaksanaan penyakit hipertensi yang merupakan salah satu
faktor resiko dari PJK (Anon 2006, Depkes)
Kejadian PJK bervariasi antar negara dan lebih umum terjadi di negara-negara
industrialis sehingga penyakit ini juga dipandang sebagai akibat gaya hidup dan pola
makan. Western diet dengan kandungan lemak jenuh tinggi cenderung berasosiasi
pada PJK. Di Inggris (UK) ditemukan bahwa 27% kematin disebabkan oleh PJK serta
12% disebabkan oleh strok, walaupun mortality rate PJK bervariasi antar negara.
Mortality rate PJK ii Jepang dilaporkan sebesar 15 per 100.000 penduduk, sementara
di Finland sebanyak 198 per 100.000 penduduk (Marila-Sandholm dan Saarela, 2003).
Metabolisme kolesterol
6
Beberap studi epidemiologi menunjukkan bahwa ada korelasi positif antara
kandungan kolesterol khususnya low dencity lippprotein (LDL) dengan PJK.
Akumulasi LDL pada plasma menyebabkan penumpukan kolesterol pada dinding
pembuluh darah arteri, proses yang berhubungan dengan oksidasi LDL. LDL
teroksidasi akan diambil oleh makrofag yang segera menjadi gelembung sel yang
merupakan plak awal. Sehingga diperkirakan setiap kenaikan 1% LDL kolesterol
setara dengan peningkatan 2-3% resiko PJK (Lovegrove dan Jackson, 2003). Tetapi
sebaliknya, high dencity lipoprotein (HDL) memberikan efek yang berlawanan
dengan LDL terhadap resiko PJK sehingga HDL dianggap sebagai kolesterol baik.
Kolesterol merupakan penyebab utama hipertensi dan PJK, oleh karena itu
dalam penatalaksanaan PJK dan hipertensi kadar kolesterol dalam serum menjadi
salah satu acuan. Individu dengan kandungan kolesterol darah 8.0 mmol/lt dan atau
triasil gliserol di atas 3.0 mmol/lt tidak hanya memerlukan modifikasi diit tetapi juga
disarankan mengkonsumsi obat penurun kandungan lemak dalam darah untuk
membantu menurunkan faktor resiko PJK dan hipertensi. Pemberian obat yang ada
efektif pada beberapa hal yaitu: menurunkan sintesis very low dencity lippprotein
(VLDL) dan LDL, meningkatkan penghilangan VLDL, meningkatkan penghilangan
LDL dan penghambatan enzim hidroksi metil glutaril CoA reduktase (Martilla-
Sandholm dan Saarela, 2003).
Sintesis dan metabolisme kolesterol merupakan jalur metabolik utama dalam
penaggulangan PJK. Kolesterol homeostatis dipelihara dalam tubuh mamalia melalui
pengaturan tiga jalur metabolisme. Dua jalur metabolik adalah bagaimana mensuplai
kolesterol ke dalam sel yang meliputi endogenus sintesis kolesterol dari prekursornya
(asetat) dan eksogenus sintesis dimana LDL yang merupakan pembawa kolesterol
pada darah (Ramirez et al., 1994). Ketiga jalur metabolik adalah konversi kolesterol
yang melibatkan konversi kolesterol menjadi asam empedu. Kelainan pada regulasi
metabolisme kolesterol berimplikasi pada penyakit karena jalur metabolisme utama
dalam ekskresi kolesterol pada mamalia adalah melalui pembentukan asam empedu.
Sehingga eliminasi kolesterol merupakan faktor kritis pada beberapa penyakit seperti
7
atherosclerosis, gallstone diseases, dan penyakit selain pada penyimpanan lemak
(Ramirez et al., 1994).
Empedu merupakan produk utama metabolisme kolesterol yang tersimpan di
dalam kantung empedu yang terdiri dari asam empedu, kolesterol, pospolipid dan
pigmen bilirubin. Empedu disintetsis dalam sel hati dan akan disekresikan ke usus
dua belas jari setelah adanya makanan yang masuk. Sehingga fungsi utama dari
empedu adalah sebagai detergent biologis dan pelarut lemak dalam tubuh. Empedu
juga berfungsi sebagai salah satu zat antimikrobial dalam tubuh (Begley et al., 2006).
Probiotik dan kolesterol
Persyaratan pengembangan probiotik baru
Probiotik didefinisikan sebagai bakteri hidup yang apabila dikonsumsi dalam
jumlah yang memadai akan memberikan efek yang menguntungkan bagi yang
mengkonsumsinya (FAO-WHO, 2001). Pada awal perkembangan era probiotik,
L.casei strain Shirota (Yakult) serta L. rhamnosus GG, merupakan dua strain
lactobacilli yang mengawali (pionir) perkembangan probiotik bakteri. Seiring dengan
kemajuan teknologi, beberapa strain baru dikembangkan sebagai probiotik dengan
berbagai keunggulan spesifik pada aspek kesehatan yang diharapkan (Klaenhammer
dan Kullen, 1999).
Probiotik memberikan dampak menyehatkan pada individu yang
mengkonsumsinya. Beberapa aspek menyehatkan probiotik antara lain: ekslusi,
antagonis terhadp patogen, sebagai imun stimulator dan modulator, antikarsinogenik
dan mutagenik, peningkatan simpton laktosa intoleran, menurunkan kolestrol darah,
menurunkan tekanan darah, menghambat dan mencegah diare, mencegah vaginitis
dan memelihara integritas mukosa usus (Sanders, 1998; Tannock, 1999; Mattilla-
Shandholm et al., 1999). Adanya berbagai aspek menyehatkan tersebut, maka
memberi potensi baru dalam pengembangan makanan fungsional dan bahkan formula
makanan khusus untuk bayi dan manusia usia lanjut seperti yang telah dikembangkan
di Jepang melalui konsep FOSHU (food and ingredient for spesified health use).
8
Dalam pengembangan probiotik, strain yang dipergunakan sebaiknya telah
teridentifikasi dengan baik, umumnya dengan susunan gen 16S rDNA sudah
terdepositkan di bank data internasional. Adanya data genetik memungkinkan untuk
mengembangkan sistem monitoring untuk menentukan secara spesifik populasi
probiotik bakteri yang dikonsumsi di dalam saluran pencernaan agar efek fungsional
yang ditimbulkan bisa dijelaskan dengan lebih baik. Disamping identifikasi strain dan
sistem deteksi, ada beberapa kriteria yang diharapkan dalam pengembangan probiotik
baru seperti: (1) kecocokan (untuk probiotik konsumsi manusia sebaiknya diisolasi
dari saluran pencernaan manusia sehingga mengurangi resiko toksisitasnya); (2)
kecocokan dalam teknologi pengembangan/produksi dimana diharapkan mudah
diproduksi secara masal/skala besar, viabilitas yang tinggi, tidak mengganggu nilai
sensoris bahan pangan apabila diikutkan dalam bahan pangan tertentu, stabil secara
genetis dan memungkinkan dilakukan rekayasa genetika; (3) kemampuan bersaing
(competitiveness) seperti mampu bertahan dan berkembang biak di dalam saluran
pencernaan, tahan terhadap kondisi saluran pencernaan (asam empedu, pH rendah),
mampu bersaing dengan flora normal di dalam saluran pencernaan, dan mampu
melakukan adhesi pada sel epitel saluran pencernaan; (4) efek fungsional seperti
mampu menimbulkan dampak menyehatkan, antagonis terhadap patogen, produksi
zat antimikrobial, imunstimulator, anti karsinogenik dan anti mutagenik, produksi
bioaktif (enzyme, vaccines, peptida) (Klaemhammer dan Kullen, 1999).
Guna memahami peranan dari probiotik Lactobacillus sp F213 pada
kesehatan manusia dan marker biologi, merupakan hal penting untuk mengetahui
efeknya terhadap komunitas bakteria pada saluran pencernaan manusia yang
diberikan Lactobacillus sp F213. Pada penelitian ini perhatian difokuskan pada
deteksi Lactobacillus sp F213 dan lama waktu kolonisasinya pada saluran pencernan
yang dilihat dari DNA mikrobiomik feses serta pengaruh fungsional kesehatan yang
ditimbulkannya.
Probiotik dan mekanisme penurunan kolesterol
Hiperkolesterolemia (peningkatan kadar kolesterol di dalam darah) telah
diketahui sebagai salah satu pemicu PJK. Beberapa jenis obat-obatan telah tersedia
9
untuk mengobati PKJ, namun demikian masih dipandnag belum optimal karena
harganya yang relatif mahal serta adanya efek samping yang tidak diinginkan.
Konsumsi oral dari probiotik mampu menurunkan 22-33% dari total kolesterol darah
(De Smet et al. 1994:1998: Torano et al., 1998). Efek penurunan kolesterol ini dapat
disebabkan oleh aktivitas BSH (Kluver et al., 1993; Liong dan Saha, 2005). Asam
empedu yang telah mengalami dekonjugasi mempunyai kelarutan yang lebih rendah
dari pada bentuk garamnya sehingga menyebabkan ekskresi asam empedu bebas
lebih banyak dalam feses. Asam empedu bebas juga mempunyai kemampuan yang
kurang baik dalam melarutkan lemak serta kurang bisa diabsorbsi untuk
dipergunakan kembali (siklus enterohepatik). Dengan demikian dekonjugasi garam
empedu mempunyai peranan penting dalam menurunkan kolesterol di dalam darah.
Karakter inilah menyebabkan adanya BSH dalam strain probiotik memberikan
keuntungan ganda guna menurunkan kolesterol darah dan menjaga keseimbangan
bakteri saluran pencernaan.
Pemberian susu terfermentasi dengan mempergunakan Lactobacillus
menurunkan kolesterol darah dari pasukan Masai pria sebanyak 9.8% (Lovegrove dan
Jackson, 2003). Disamping itu, yoghurt yang difermentasi dengan mempergunakan
Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus dapat menurunkan total
serum kolesterol dan LDL (Jasper et al., 1984). Hal ini menunjukkan bahwa probiotik
memberikan kontribusi dalam penurunan kolesterol darah.
Beberapa mekanisme telah diusulkan, yang meliputi efek fisiologis dari asam
lemak rantai pendek yang terbentuk akibat aktivitas probiotik, kolesterol asimilasi,
pengikatan kolesterol pada sel bakteri, serta aktivitas dekonjugasi garam empedu
(Lovegrove dan Jackson, 2003). Mekanisme lain yang diperkirakan erat kaitannya
dengan penurunan kolesterol darah adalah melalui transport kolat oleh Lactobacillus
dan Bifidobacterium (Kurdi et al., 2000:2003), dimana asam kolat dapat terakumulasi
di dalam sel dan kemudian ikut terbawa feses. Aktifitas fermentatif probotik
cenderung menyebabkan pH saluran pencernaan menjadi lebih asam. Asam empedu
umumnya mempunyai derajat disosiasi pada pH agak netral (pH 64-6,5, untuk asam
10
kolat dan deoksi kolat). Sehingga pada pH saluran pencernaan relatif rendah (lebih
rendah dari pH 6,4) maka asam empedu akan mengendap dan terbawa feses. Hal ini
akan menyebabkan penurunan kolestrol darah.
Studi pendahulaun dan Hasil yang sudah dicapai
Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan.
Penelitian in vitro dari aspek ketahanan pada kondisi saluran pencernaan meliputi
ketahan Lactobacillus sp F213 terhadap pH rendah di lambung, enzim pencernaan,
dan asam empedu. Dari aspek keamanan ditemukan bahwa Lactobacillus sp F213
tidak dapat mentransformasi asam empedu primer (sehingga diduga tidak memicu
kolon kanker), tidak menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan (histolgi
saluran pencernaan mencit), bersifat tidak beracun (tidak me-lisis sel darah) serta
tidak akut diuji menggunakan larva udang. Aspek fungsional meliputi kemampuan
Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran pencernaan mencit untuk
mencegah diare dan diduga dapat menstimulasi sistem imun. Ditemukan juga bahwa
Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolisis garam empedu dan berpotensi
menurunkan kolesterol darah.
Potensi in vitro tersebut di atas telah teruji dalam penelitian in vivo seperti
kemampuan berkompetisi untuk melekat (competetive exclusion) pada saluran
pencernaan mencit yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp
F213 berpotensi untuk mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213
mampu bertahan dalam saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan
menurunkan 35% dari total kolesterol pada tikus hiperkolesteromik (Nursini et al.,
2010). Penelitian pada subjek manusia menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213
terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik feces, serta dapat menurunkan 6,29%
kolesterol darah, serta menurunkan TNF alfa sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi
0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian Lactobacillus sp F213). Lebih jauh diperoleh
bahwa pemberian Lactobacillus sp F213 pada subjek manusia dapat meningkatkan
kenyamanan buang air besar (berpotensi untuk mencegah konstipasi) (Sujaya et al.,
2012, 2013).
- 11 -
Output: Lactobacillus sp F213
4. Safety assesment a. Uji in vivo atau pada
hewan
Toksisitas pada larva
udang
Kerusakan salaruan
pencernaan mencit
b. Studi pada manusia
(Fase 1)
Stimulasi pertumbuhan
bakteri menguntungkan
Populasi dan durasi
Lactobacillus sp F213
pada sal. pencernaan
3. Karakterisasi fungsional
Uji in vitro
Bile salt hydrolase (penurun
kolesterol)
Adhesi pada epitel (mencegah
pelekatan patogen spt E coli dll)
Studi pada hewan
Menurunkan kolesterol
Menghalangi pelekatan E coli
O157
Output:
Probiotik
5. Double blind,
randomized, placebo-
controlled (DBPC) pengujian pada manusia atau
dengan desain lain untuk
mengetahui efikasi produk
(Fase 2)
6. Percobaan yang lebih
efektif, untuk
membandingkan probiotik
dengan standar terapi
dalam kondisi yang
spesifik (Fase 3)
Pelabelan :
Contents : penandaan
genus, spesies, strain
Jml. minimum
bakteri hidup
Kondisi penyimpanan
Layanan informasi
konsumen
Fase 4: Post Marketing 2. Identifikasi strain
Fenotip: API50 CHL
Genotif : Seq. 16S rDNA
Genus, spesies, strain
ISOLAT
Lactobacillus sp koleksi
UNUDCC
1. Skrining karakteristik
probiotik Ketahanan pada kondisi
saluran pencernaan : pH
rendah, asam empedu, enzim
pencernaan
Produksi zat antimikrobial
Ketahan terhadap antibiotika
Modifikasi asam empedu
primer
Output:
Probiotic
foods
2006 – 2011 (1-4a) 2012 – 2017 (fase 1. 4b)
Strain disimpan di
International Culture Collection
Penelitian yg
disusulkan
Sudah dilakukan
Gambar 1. Peta jalan penelitian pengembangan probiotik
(disesuaikan dengan guide line pengembangan probiotic
foods FAO&WHO 2002)
- 12 -
BAB III. METODE PENELITIAN
Usulan Tahun 1. Pengembangan metode deteksi Lactobacillus sp F213
Untuk mengembangkan metode diagnostik Lactobacillus sp F213 ada beberapa target
gen yang akan dipergunakan (Gambar 2).
Gambar 2. Ilustrasi target gen sebagai strategi dalam pengembangan sistem deteksi
molekuler Lactobacillus sp F213.
Pada ilustrasi Gambar 2 terlihat bahwa kemungkinan target adalah berdasarkan variasi
susunan basa nukleotida seperti variable region 1-3 pada 16S rDNA pada
Lactobacillus sp F213. Namun dalam penelitian sebelumnya 16S rDNA dari
Lactobacillus sp F213 menunjukan 99.9% homology dengan strain lain sehingga
pendekatan yang akan dipergunakan adalah bagian intragenik spacer region (IGS),
molekul 23S rDNA, 5,8S rDNA dan bahkan bagian tertentu dari keseluruhan DNA
genom Lactobacillus sp F213. Pada penelitian ini akan dicoba beberapa kemungkinan
yaitu (1) sekuensing IGS serta (2) pita spesifik yang diperoleh dengan Random
Amplified DNA Polymorpism (RAPD).
Strain dan kondisi pembiakan strain bakteri
Strain yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah Lactobacillus sp F213 yang
- 13 -
merupakan strain potensial probiotik. Selain strain Lactobacillus sp F213 juga
dipergunakan strain lain yang merupakan koleksi UNUDCC.
Strain Lactobacillu spp. dibiakkan dalam MRS broth, dalam keadaan anaerob
(menggunakan anaerobic OXOID gas pouch) dan diinkubasi selama 24-48 jam pada
suhu 37oC.
Isolasi Genomic DNA dari Lactobacillus sp F213
DNA diisolasi dengan mepergunakan Kit Isolasi DNA (Promega) sesuai petunjuk dalam
kit. Sebanyak 2 uL suspesi DNA dielektroforesis pada 1,2% agarose dan divisualisasikan
pada UV transiluminator untuk mengkonfirmasi keberhasia proses isolasai DNA.
Selanjutnya DNA dilarutkan dengan TE-buffer dan disimpan pada suhu -20oC sampai
dilakukan analisis selanjutnya.
PCR dan Sequencing IGS
Typing Lactobacillus sp dilakukan dengan sekuensing intragenic spacer region (IGS),
bagian rDNA dengan susunan nukleotida yang sangat variatif pada seluruh prokaryota
menggunakan primer: FGPS1490F- TGC GGC TGG ATC ACC TCC TT dan
FGPS132R- CCG GGT TTC CCC ATT CGG (Laguere et al., 2006) dan primer lain
sesuai dneagn kebutuhan. Reaksi campuran PCR dilakukan pada total volume 12,5 μl
yang mengandung: 10 mM masing-masing dNTPs, primer 27F dan 520R (25 pmol), 1X
PCR Buffer II, 75 mM MgCl2, 0.45 U AmpliTaq, 1 μl DNA. Reaksi amplifikasi
dilakukan sebagai berikut: satu kali siklus pada 94oC selama 5 menit, diikuti dengan 35
kali siklus pada 94oC selama 20 detik, 55oC selama 2 menit, dan 72oC selama 30 detik.
Tahap akhir ditambahkan dengan satu kali siklus pada suhu 72oC selama 5 menit. Produk
PCR selanjutnya dielektroforesis dengan menggunakan 1% agarosa dengan 1X TAE
bufer, dilakukan pewarnaan dengan EtBr (50 ng/ml), divisualisasikan pada UV
iluminator dan difoto.
Produk PCR dimurnikan dengan menggunakan PCR SUPRECTM PCR (Takara
Biomedicals, Otsu, Japan) dan selanjutnya disekuen dengan menggunakan Big Dye
Primer Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) dengan
- 14 -
menggunakan sekuensing automatis 3100 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems).
Untuk studi homologi, sekuen dilakukan di NCBI/GenBank.
Untuk men-desing primer/probe spesifik untuk deteksi Lactobacillus sp F213
dengan target IGS dilakukan dengan melalukan multiple alligment dari sequence IGS dari
Lactobacillus sp F213 dengan IGS strain species yang sama yang dapat di ambil dari
GenBank (NCBI/DDBJ). Dari multiple alligment akan diketahui sekuen nucleotida yang
paling berbeda diantara sekuen IGS yang ada. Selanjutnya sekuen yang berbeda ini dapat
dijadikan probe/dapat juga di pakai sebagai primer spesifik (ilustrasi Gambar 4)
Gambar 3. Ilustrasi design primer/probe dari seukuen IGS Lactobacillus sp F213 setelah
di align dengan IGS dari Lactobacillus lain (misal: IGS Lb-1, IGS Lb-2, IGS
Lb-3 dst).
RAPD dan sekuensing pita spesifik
Tahapan RAPD dilakukan mengacu pada prosedur Ivanova et al., (2008). Campuran
reaksi RAPD dilakukan pada total volume 12,5µl dengan komposisi 6,25µl Master Mix
Solution Intron Biotechnology, 1,25µl primer (Tabel 2), 1µl DNA dan 4µl air steril
sehingga total volume reaksi 12,5µl. Amplifikasi dilakukan pada mesin Infinigen
thermocycler, dengan kondisi satu siklus pada 940C selama 5 menit, diikuti dengan 40
siklus pada 940C selama 20 detik, 400C selama 2 menit dan 720C selama 30 detik, dan
tahap akhir yaitu elongasi tambahan pada 720C selama 5 menit. Setelah reaksi selesai
sampel dikeluarkan dari mesin dan diambil sebanyak 5µl untuk dielektroforesis.
Tabel 1. Primer yang dipergunakan untuk RAPD
Target probe/primer
- 15 -
Primer Susunan primer (5´-> 3´)
OP-1 CAg gCC CTT C
OP-2 TgC CgA gCT g
OP-3 AgT CAg CCA C
OP-4 AAT Cgg gCT g
OP-5 Agg ggT CTT g
OP-6 ggT CCC TgA C
OP-7 gAA ACg ggT g
M13F CgA CgT TgT AAA ACg ACg
gCC AgT
M13R CAg gAA ACA gCT ATg AC
Gambar 4. Ilustrasi design
primer/probe spesifik dari
genom LbF213
Dari hasil RAPD dengan mempergunakan primer pada Tabel 1, akan dihasilkan pita
yang paling berbeda (ukuran panjang pita) dengan strain yang lainya yang dipakai
sebagai pembanding. Pita yang paling berbeda ini menunjukkan sesuan basa basa
nukleotida yang paling khas yang ada pada genom Lactobacillus sp F213. Selanjutnya di
pita pada gel di potong, dimurbikan dan disekuen untuk mendapatkan susunan
nuklotidanya yang dapat dijadikan primer/probe spesifik untuk deteksi Lactobacillus sp
F213 (Gambar 3).
Optimasi Primer
Primer didesign memeprgunakan susuan nukleotida specifi dari Lactobacillus sp F213,
yang kemungkinan terletak pada sesuan nukleotida IGS atau pita RAPD. Primer di-
design memeprgunakan software Primer express.
Optimasi dan spesifisitas primer dilakukan sesuai kondisi penelitian/percobaan yang
tergantung dari jenis reagent PCR yang dipakai. Dengan demikian optimasi spesificitas
PCR dilakukan dengan mengatur konsentrasi suhu annealing (pelekatan/hibridisasi)
primer dengan target sekeun pada DNA yang di-amplifikasi, serta dengan mengatur
DNA LbF213
PCR
Pita spesifik
Sekuens
Primer/probe
spesifik
- 16 -
stringency reaksi polimerasi dengan mangatur konsentrasi ion MgCl2 pada campuran
reaksi PCR (Innis et al., 1990).
Setelah didapatkan kondisi spesifik untuk Lactobacillus sp F213 maka selanjutnya
dilakukan PCR dengan mempergunakan DNA yang diisolasi dari feces yang sengaja
ditambahkan dengan Lactobacillus sp F213. Isolasi DNA feces dilakukan untuk
mengetahui konsentrasi/populsi Lactobacillus sp F213 minimal di mana DNA
Lactobacillus sp F213 dapat di-recovery dengan protokol isolasi DNA yang dipergunakan.
Dengan demikian akan diketahui kosntrasi sel Lactobacillus sp F213 yang ada pada feces
yang mungkin dapat di deteksi deangan primer spesifik ini. Disamping itu dilakukan pula
optimasi dengan mempergunakan RT-PCR dengan pewarna cyber green untuk
mengetahui hubungan antara intenstitas flourisensi dengan kosnntrasi DNA/sel. Dari
langkah ini akan diketahui jumlah sel yang ada pada sampel berdasarkan tingkat intensitas
flouresensi dari cyber green.
Analisis data
Data dianalisis secara deskriptif berdasarkan ada tidaknya produk PCR yang dihasilkan
yang terlihat dari foto gel elektroforesis.
- 17 -
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyegaran strain Lactobacillus sp F213
Lactobacillus sp F213 disegarkan dari stok beku (-50oC). Strain di segarkan dalam
MRS broth dan diinkubasi dalam keadaaan anaerob selama 24 jam pada suhu 37oC.
Setelah tumbuah, strain di streak pada MRS agar dan koloni yang tumbuah (Gambar
4A) diisolasi secara tunggal (single colony isolation) untuk menjamin kemurnian strain
yang dipergunakan dalam penelitian ini. Konfirmasi strain dilakukan dengan
mengamati pembutukan gas pada MRS broth serta pengecatan Gram (Gambar 4B).
Gambar 4A. Morfologi koloni
Lactobacillus sp F213 pada media
MRS agar
Gambar 4B. Morfologi mikroskopik
Lactobacillus sp F213 pada media MRS
both
Isolasi Genomic DNA
Genomik DNA diisolasi dari 2,5 ml kultur Lactobacillus sp F213 (strain no 1 dan no 6).
Dengan metode isolasi sekala kecil ini, diperoleh DNA yang masih mengandung RNA,
walaupun pita DNA genomik pada gel tidak tampak dengan jelas (Gambar 5), tetapi
hasil analisis menunjukkan bahwa konsentrasi DNA Lactobacillus sp F213 (2) dan
Lactobacillus sp F213 (6) yang berhasil diperoleh sebanyak masing-masing 37,5 ng/ul
dan 26,5 ng/ul.
- 18 -
Gambar 5. Genomik DNA dari Lactobacillus sp F213 (no 1 adalah
Lactobacillus sp F213 strain no 2); no 2 adalah Lactobacillus sp F213 strain
no 6. M : DNA ladder (100 bp). Pita DNA genom (ditunjukkan dengan tanda
panah, tidak begitu jelas pada foto gel), sementara RNA tampak seperti smear
pada bagian bawah gel.
Amplifikasi Intragenic Spacer Region (IGS) Lactobacillus sp. F213
Primer yang dipergunakan dalam amflifikasi IGS Lactobacillus sp F213 dapat dilihat
pada Tabel 2.
1 2 M
RNA
DNA
- 19 -
Tabel 2. Sekuen primer yang dipakai pada PCR IGS Lactobacillus sp F213.
Name Seq 5’->3’ Referensi
FGPS1490F TGC GGC TGG ATC ACC TCC TT Laguere et al., 2006
FGPS132R CCG GGT TTC CCC ATT CGG
L1F GAA GTC GTAACA AGG Jensen et al., 1993
Lt1-R CAA GGC ATCCAC CGT
Nour 514F TGG ATC ACC TCC TTT CTA Nour, 1998(*)
Nour 601R GTG CGC CCT TTA TTA ACT T
(*) belum dilakukan karena primer sedang disintesis oleh suplier
Hasil PCR dengan primer FGPS1490F/FGPS132R terlihat bahwa Lactobacillus
sp. F213, Lactobacillus rhamnosus dan Pediococcus spp., menunjukkan pita ganda,
sementara hanya non bakteri asam laktat (Isolat B3) menunjukkan pita tunggal
(Gambar 6A). Lactobacillus sp. F213 menghasilkan pita dnegan ukuran 500bp dan 400
bp; Lactobacillus rhamnosumenghasilkan pita 500 bp dan 350; Pediococcus spp.
Menhasikan pita dengan ukuran 400 bp dan 350bp, semantar non bakteri asam laktat
(Isolat B3) menghasilkan pita tunggal dnegan estimasi ukuran 700 bp.
Laguere et al 2003) juga menemukan pita ganda dan tunggal pada beberapa
species bakteri Rhyzobium yang diteliti. Dalam peleitian ini dilakukan konfirmasi
kembali khususnya optimasi suhu annealing guna menghindari terjadinya miss-priming
pada primer FGPS1490F/FGPS132R.
Peningkatan suhu annealing primer, denagn gradient 1oC, dari suhu tengah
55oC dari suhu 48oC sampai 62oC, denan 12 jenis suhu annealing dimuali dari: 48;
48,7; 49,8;51,1; 52,6;54,2;55,8; 57,5; 58,9; 60,2; 61,3; dan 62oC. Dari 12 jenis suhu
annealing ini dilakukan PCR Lactobacillsus sp F213 dilakukan pada suhu 55,8 sampai
62oC. Hasil gradient PCR menggunakan primer ini menujukkan bahwa amplifikasi
dengan primer FGPS1490F/FGPS132R semakin berkurang apabila suhu annealing
lebih dari 55oC (Gambar 6B). Hal ini menunjukkan bahwa suhu anneling optimum
- 20 -
primer FGPS1490F/FGPS132R adalah 55oC sesuai yang dilaporkan oleh
FGPS1490F/FGPS132R dimana produk IGS dari Lactobacillus sp F213 selalu
ditemukan dua pita. Hasil ini menujukkan bahwa dengan primer ini selalu diperoleh 2
pita IGS dari Lactobacillus sp F213.
Gambar 6B. Optimasi PCR dengan termal gradient.
Keterangan gambar 6B:M: 100 bp DNA ladder. No 1,2 3 4 5,6 adalah suhu
annelaing primer FGPS1490F/FGPS132R untuk amplifikasi DNA Lactobacilus
sp F213 masing-masing 55,8oC; 57,4oC; 58,9oC; 60,2oC; 61,3oC; 62oC.
Konfirmasi Intragenic Spacer Region (IGS) Lactobacillus sp. F213
Untuk meyakinkan bahwa Lactobacillus sp F213 mempunayi 2 buah IGS yang
berbeda, dilakukan PCR dengan mempergunakan primer yang lain. Amplifikasi IGS
Lactobacillus sp F213 dengan primer L1-F (GAA GTC GTAACA AGG) / Lt1-R
500 bp
500 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
400 bp
M 1 2 3 4 5 6
500 bp
A
B
Gambar 6 A. Hasil PCR IGS
Lactobacillus rhamnosus,
Lactobacillus sp F213,
Pedioccocus spp, dan non LAB
(isolat B3). M; 100 bp DNA
ladder.
- 21 -
(CAA GGC ATCCAC CGT) juga menghasilkan produk IGS dua pita dengan panjang
pita sekitar 500 bp dan 400 bp sementara L rahmnosus SKG34 dengan panjang pita
sekitar 500 bp dan 350 bp, serta Pediococcus sp dengan pajang pita IGS sekitar 400 bp
dan 350 bp (Gambar 7). Hal ini menjukkan kembali bahwa IGS Lactobacillus sp F213
terdiri dari dua buah pita. Hal ini memperkuat dugaan bahwa Lactobacillsus sp F213, L
rhamnosus SKG34, dan Pediococcus spp mempunyai 2 helai IGS dengan panjang
yang berbeda.
Gambar 7. Panjang IGS Lactobacillus sp F213 (1, 2), L. rhamnosus SKG34 (3) dan
Pediococcus spp (4,5)
Adanya pita IGS ganda dengan ukuran panjang yang berbeda menyebabkan
kesulitan kalau dilakukan direct sequencing, sehingga harus dipisahkan terlebih daulu
melalui subcloning masing-masing pita atau cara lainnya. Pita IGS dapat dipisahkan
menjadi pita tunggal sehingga dilakukan Direct Sequening PCR dengan me-motong
gel mengandung IGS selanjutnya DNA pada gel dimurnikan atau di-elusi dari dalam
matrik gel. Dalam penelitian ini dicoba dengan meng-elusi DNA dengan memberikan
daya magnet sehingga DNA yang bermuatan negatif di tarik dengan magnet kutub
positif (Gambar 8). Elusi dilakukan dengan merendam gel di dalam 25 ul buffer TE
dan diberikan magnet pada satu sisinya. Elusi dilakukan pada suhu 5oC selama 12 jam
(semalam) dan selanjutnya DNA yang telah keluar gel di PCR dengan mempergunakan
primer yang sama dengan primer yang dipergunakan pada saat PCR (L1-F / Lt1-R
(Gambar 9).
500 bp
M 1 2 3 4 5
- 22 -
Hasil PCR dari DNA yang telah dielusi dari gel dapat dilihat pada Gambar 9.
Setelah re-PCR justru menghasilkan pita tunggal dengan ukuran yang lebih pendek
(sekitar 350 bp) dibandingkan dengan panjang pita sebekumnya. Belum diketahui
secara pasti kenapa hal ini terjadi dan akan dilakukan sequencing guna memanstikan
IGS dari Lactobacillus sp F213 dan IGS L rhamnosus SKG34.
Gambar 8. Teknik elusi DNA dengan memberikan muatan magnetik.
Gambar 9. IGS dari Lactobacillus sp F213 (A), L rhamnosus (B) dan hasil PCR pita
tunggal dari LbF213(C dan D) dan L rhamnosus (E dan F). Terlihat PCR pita dengan
panjang 500 bp pada A dan B menghasilkan produk PCR dengan ukuran 300 bp (C
dan E).
M A B C D E F
500 bp
300 bp
(+) (-) DNA
- 23 -
Susunan Nukleotida Intragenic Spacer dari Lactobacillus sp F213
Hasil sekuensing IG Lactobacillus sp F213 pita IGS 1 dan 2 diberikan seperti di bawah
ini.
>Lactobacillus sp F213 IGS band no 1.
ttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaaggccacaagcgattttaaactaattta
aaaaactcaaaaaattacgcggggtattttttcggctcaatttatattgattaacaata
ttaaatgaatttaaaaatttacaattatgattcagttttcaaagaactaattttgagtg
taaatcactcaaaactgaatatcgtttcaacgaatgtgtaggtttcccattttccttat
aaaggaggtgatccacccccaggttctcctacggctaccttgttacaacttcaca
Homology BLAST untuk menentukan susunan nukleotida yang
paling dekat dengan IGS 1. Score E
Sequences producing significant alignments: (bits) Value
AY342323|AY342323.1 Weissella confusa 16S ribosomal RNA and 23S ... 519 e-144
JX118838|JX118838.1 Lactobacillus brevis strain GDA-4 16S riboso... 446 e-122
KJ880099|KJ880099.1 Weissella cibaria strain C34 16S ribosomal R... 444 e-121
JX118839|JX118839.1 Lactobacillus brevis strain GDA-1 16S riboso... 444 e-121
AF158558|AF158558.1 Lactobacillus sp. GTH2 16S-23S ribosomal RNA... 363 9e-97
>AY342323|AY342323.1 Weissella confusa 16S ribosomal RNA and
23S ribosomal RNA genes, partial sequence.Length = 918
Score = 519 bits (262), Expect = e-144
Identities = 283/290 (97%)
Strand = Plus / Minus
Query: 8 ttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaaggccacaagcgattttaaactaatttaa 67
Sbjct: 389 ttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaaggccacaagcgattttaaactaatttaa 330
Query: 68 aaaactcaaaaaattacgcggggtattttttcggctcaatttatattgattaacaatatt 127
Sbjct: 329 aaaactcaaaaaattacgcggtgtattttttcggctcaatttatattgattaacaatatt 270
Query: 128 aaatgaatttaaaaatttacaattatgattcagttttcaaagaactaattttgagtgtaa 187
Sbjct: 269 aaatgaatttaaaaatttacaattatgattcagttttcaaagaactaagtttgagtgtaa 210
Query: 188 atcactcaaaactgaatatcgtttcaacgaatgtgtaggtttcccattttccttataaag 247
Sbjct: 209 atcactcaaaactgaatatcgtttcaacgaatgtgtaggtttccgattttccttagaaag 150
Query: 248 gaggtgatccacccccaggttctcctacggctaccttgttacaacttcac 297
Sbjct: 149 gaggtgatccagccgcaggttctcctacggctaccttgttacgacttcac 100
Aligment IGS I dari LbF213 dengan data yang ada pada genbank (BLAST),
menujukkan bahwa IGS LbF213 I mempunyai homologi tertinggi (97%) dengan W
confusa. Nukleotida yang berbeda ditunjukkan dengan warna biru.
- 24 -
Sekuen nukleotida Lactobacillus sp F213 IGS band no 2. 304
bp
1st_BASE_1960555_2_L1F.ab1
ccatcttactgacgttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaggcccaagcgattt
taaactaattaaaaaactcaaaaaataacgcggggtattttttcggctcattttatatt
gctaaacaatattaaatgaatttaaaaatttacaattttgattcagttttcaaagacct
aagtttgagcgtaaatccctcaaaactgattatcgtttcaacgaatgtggaggtttccc
attttccttagaaagggggggatccacccccccgttctcctccggctcccttgttccac
ctccacaat
Homology BLAST untuk menentukan susunan nukleotida yang
paling dekat dengan IGS 1. s
Score E
Sequences producing significant alignments: (bits) Value AY342323|AY342323.1 Weissella confusa 16S ribosomal RNA and 23S ... 355 2e-94
F158558|AF158558.1 Lactobacillus sp. GTH2 16S-23S ribosomal RNA... 317 5e-83
JX118839|JX118839.1 Lactobacillus brevis strain GDA-1 16S riboso... 315 2e-82
JX118838|JX118838.1 Lactobacillus brevis strain GDA-4 16S riboso... 315 2e-82
KJ880099|KJ880099.1 Weissella cibaria strain C34 16S ribosomal R... 307 5e-80
AF158570|AF158570.1 Lactobacillus sp. GTH24 16S-23S ribosomal RN... 307 5e-80
AF158569|AF158569.1 Lactobacillus sp. GTH22 16S-23S ribosomal RN... 295 2e-76
Score = 355 bits (179), Expect = 2e-94
Identities = 260/283 (91%), Gaps = 3/283 (1%)
Strand = Plus / Minus
Query: 12 acgttgatgatataagtttgagtatgtggctcaa-ggcc-caagcgattttaaactaatt 69
Sbjct: 392 acgttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaaggccacaagcgattttaaactaatt 333
Query: 70 -aaaaaactcaaaaaataacgcggggtattttttcggctcattttatattgctaaacaat 128
Sbjct: 332 taaaaaactcaaaaaattacgcggtgtattttttcggctcaatttatattgattaacaat 273
Query: 129 attaaatgaatttaaaaatttacaattttgattcagttttcaaagacctaagtttgagcg 188
Sbjct: 272 attaaatgaatttaaaaatttacaattatgattcagttttcaaagaactaagtttgagtg 213
Query: 189 taaatccctcaaaactgattatcgtttcaacgaatgtggaggtttcccattttccttaga 248
Sbjct: 212 taaatcactcaaaactgaatatcgtttcaacgaatgtgtaggtttccgattttccttaga 153
Query: 249 aagggggggatccacccccccgttctcctccggctcccttgtt 291
Sbjct: 152 aaggaggtgatccagccgcaggttctcctacggctaccttgtt 110
Aligment IGS I dari LbF213 dengan data yang ada pada genbank (BLAST),
menujukkan bahwa IGS LbF213 II mempunyai homologi tertinggi (91%) dengan W
confusa. Nukleotida yang berbeda ditunjukkan dengan warna biru.
- 25 -
Hasil sekuensing pita IGS I dan II pada LbF213 menunjukkan persen homologi yang
berbeda. Pita IGS-I menunjukkan homologi sebesar 97% dengan
AY342323|AY342323.1 Weissella confusa 16S ribosomal RNA and 23S ...sementara
IGS-type II menujukkan homologi sebesar 91%. Hal ini menujukkan bahwa LbF213
membawa dua IGS dengan ukuran dan sekuen yang berbeda. Perbedaan sekuan yang
tinggi ini menjadi target yang baik dalam pengembangan nukleotida untuk mendeksi
LbF213.
Diagnostik spesifik F213 yang dapat dikembangkan adalah primer spesifik dan
probe spesifik. Untuk tahap awal, dikembangankan beberapa set primer spesifik
dnegan mempergunakan berdasarkan apda IGS tipe I dan Tipe II (Table 3). Primer ini
selanjutnya dipergunakan untuk mengamplifikasi IGS pada LbF213. Hasil PCR
menunjukkan bahwa primer yang dikembangkan mengamplifikisi dua IGS yang
berbeda, karena IGS mempunyai susunan nukleetida yang sama /komplementer dengan
susunan nukleotida primer, tetapi pada posisi yang berbeda sehingga menghasilkan
pita yang berbeda (Gambar 10). Dari set primer yang dikembangkan tersebut (Tabel ...)
diperoleh bahwa primer dnegan target IGS-type II menunjuukan hasil yang paling
spesifik dimana terbenu 2 pita, yang satu dengan ukuran 300 p dan yang kedua dnegan
ukuran sekitar 200 bp. Design primer B2F-R ini dihitung berdasarkan posisi prier pada
susuan IGS type II, secara teoritis menghasilkan panjang produk PCR 197bp.
Berdasarkan data ini, maka B2F-R secara spesifik dapat mengamplifikasi IGS type II
(Gambar ..).
SUSUNAN PRIMER SPESIFIK LbF213
Beberapa set primer spesifik dicoba dikembangakna dari susunan nukleotida pada IGS
1 dan IGS 2 dari LbF213. Primer disusun berdasarkan rekomendasi melalui
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast (Tabel ...).
Sekuen nukleotida IGS1 pada Lactobacillus sp F213
Target primer (warna merah., 241 bp). Susunan nukleotida primer yang diberi latar
- 26 -
belakang hijau.
TTGATGATATAAGTTTGAGTATGTGGCTCAAAGGCCACAAGCGATTTTAAACTAATTTAAAAAACTCAAAAAATTACGCGGGGTATTTTT
TCGGCTCAATTTATATTGATTAACAATATTAAATGAATTTAAAAATTTACAATTATGATTCAGTTTTCAAAGAACTAATTTTGAGTGTAA
ATCACTCAAAACTGAATATCGTTTCAACGAATGTGTAGGTTTCCCATTTTCCTTATAAAGGAGGTGATCCACCCCCAGGTTCTCCTACGG
CTACCTTGTTACAACTTCACA
Sekuen nukleotida IGS2 pada Lactobacillus sp F213
Targt primer (wrana merah, 197 bp), Susunan nukleotida primer yang diberi latar
belakang hijau.
CCATCTTACTGACGTTGATGATATAAGTTTGAGTATGTGGCTCAAGGCCCAAGCGATTTTAAACTAATTAAAAAACTCAAAAAATAACGC
GGGGTATTTTTTCGGCTCATTTTATATTGCTAAACAATATTAAATGAATTTAAAAATTTACAATTTTGATTCAGTTTTCAAAGACCTAAG
TTTGAGCGTAAATCCCTCAAAACTGATTATCGTTTCAACGAATGTGGAGGTTTCCCATTTTCCTTAGAAAGGGGGGGATCCACCCCCCCG
TTCTCCTCCGGCTCCCTTGTTCCACCTCCACAAT
Tabel 3 . Susuan primer spesifik yang untuk mendeteksi Lactobacillus sp F213.
TARGET Name Seq. 5’ 3’ Produc size
BAND-1 F213B1F1 TTGAGTATGTGGCTCAAAGGC
F213B1R1 GGGGTGGATCACCTCCTTTA 241
F213B1F2 TCAAAGGCCACAAGCGATTTTA
F213B1F3 CTCAAAGGCCACAAGCGATTTTA
F213B1F4 GTTTGAGTATGTGGCTCAAAGGC
F213B1R4 AGGAGAACCTGGGGGTGGAT
BAND-2
F213B2F CTCAAGGCCCAAGCGATTTT 197 bp
F213B2R TGGGAAACCTCCACATTCGT
- 27 -
SPESIFISITAS PRIMERS
Spesifisitas primer diuji dengan mempergunakan DNA LbF213. PCR dilakukan
mempergunakan PCR kit (Kappa PCR Master Mix 2X) dengan campuran reaksi PCR
sebegai berikut : PCR master mix 12,5 ul; DNA 1 ul; primer F dan primer R masing-
masing 2,5 ul (konsntrasi primer 2 mM), dan akuades sampai volume 25 ul. PCR
dilakukan pada pre-denaturasi pada suhu 94oC selama menit, diikuti sebanak 30 siklus
yang terdiri dari denaturasi 2 menit pada suhu 94oC, annealng pada suhu 60oC selama
30 detik; elongasi pada suhu 72oC selama 30 detik. Siklus terkahir diikuiti dengan
ekstensi selama 2 menit pada suhu 72oC. Hasil PCR dielektrofooresisi pada agarose gel
2%, diwarnai dnegan EtBr dan divisualisasi dengan UV iluminator.
Gambar 10. Spesifisitas primer spesifik IGS LbF213. Hhanya primer B2FR yang
memberikan panjang produk PCR sesuai dengan yang diharapkan
(berdasarkan susuan nukleotida IGS2)
Dari 6 set primer yang diuji, tenraynata hanaya B2FR (primer dnegan target IGS2 dari
LbF213) menunjukkan hasil ynag spesifik dansesuai dengan ukuran pandajnag DNA
yang diharapkan (197 bp).
M : 100 bp DNA Ladder
1. B1F1-B1R1
2. B1F2-B1R4
3. B1F3-B1R4
4. B2F-B2R
5. B1F2 –B1R4
6. B1F3-B1R4
7.
4 3 2 1 M 4 6 5 M
197 bp
- 28 -
SPESIFISITAS PRIMER B2FR PADA SPESIES LAINNYA
Spesifisitas B2FR selanjutnya diuji pada DNA dari beberapa spesies BAL lainnya (L
rhamnosus, Pediococcus) an non BAL (Gambar 11).
Gambar 11. Spesifisitas primer B2FR terhadap beberapa species bakteri asam laktat
dan non-bakteri asam laktat. Terlihat primer B2FR hanya memberikan
hasil positif dnegan LbF213 (tanda panah).
Gambar 12. Spesifisitas primer B2FR terhadap DNA feses. Terlihat primer B2FR
memberikan hasil positif dengan eberapa DNA feses yytetapi hasil hanya
dneagn DNA LbF213 diperoleh ukuran pita yang berbeda dneagn DNA
lainnhya (tanda panah).
8 7 6 5 4 3 2 1 M
1. L rhamnosus GME10
2. L rhamnosus SMM53
3. Pediococcus sp M58
4. Pediococcus sp GMB30
5. L rhamnosus SMM55
6. L rhamnosus Skg34
7. B3 (non LAB)
8. F213
9. M ladder
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M 1. F213
2. DNA feses 51
3. DNA feses 52
4. DNA feses 53
5. DNA feses 54
6. DNA feses 55
7. DNA feses 56
8. DNA feses 57
9. DNA feses 58
10. DNA feses 59
11. DNA feses 60
- 29 -
Pada kondisi pennelitian, dimana annealing pada suhu 60oC primer B2FR tidak
menghasilkan pita dengan strain lain selain LbF213. Selanjutnya ditemukan bahwa
B2FFR mengasilkan pita dari DNA yang diisolasi dari feses manusia, tetapi dengan pola
yang berbeda dengan DNA LbF213 (Gambar 12). Hal ini menunjukkan bahwa B2FR
dapat dipakai sebagai pendeteksi spesifik keberadaan LbF213 dalam konsorsium
mikroorganisme.
Selanjutnya untuk lebih meyakinkan kehandalan dari primer ini serta limit deteksi B2FR
(konsnetrasi DNA yang masih dapat di amplifikasi) maka dilakuakn isolasi DNA feses
yang telah ditambahkan dengan LbF213. Dengan memeprgunakan B2FR tdiak terdeteksi
keberadaan LbF213 pada DNA feses, walaupun sebelum diisolasi dnegan MoBioSOOIL
KIT feses sudah ditambahkan 50 dan 100 ul kultur LbF213 (setelah diinkubasis leama 48
jam). Seanjutnya setelah dilakukan PCR ternyata masih terbentuk pita pada konsnetrasi
DNA 3,75 piko gram (Gambar 13). Hal ini menjukkan bahwa hasil negatif pada Gambar
13., disebabkan karena DNA LbF213 todak daat diektraksi pada campuran konsorsium
mikorb feses (DNA lebih rendah dari 3,7 piko gram). Hal ini mungkin sbeagia akibat
rendahnya jumlah LbF213 pada feses.
- 30 -
Deteksi LbF213 pada DFNA feses
1. DNA feses
2. DNA Feces
3. PCR DNA F213
4. PCR DNA feses dgn B2FR
5. PCR DNA feses +F213 dgn B2FR
6. PCR DNA fese dgn 27F-520R
7. PCR DNA fese dgn 27F-520R
8. PCR DNA feses dgn B2FR
9. PCR DNA feses dgnB2FR
10. PCR DNA F213 dgn B2FR
M : 100 bp DNA marker
Gambar 13. Deteksi LbF213 pada DNA feses dengan primer B2FR. Primer B2FR
tidak memberikan hasil positif pada DNA yang diisolasi dari feses yang
ditambahkan LbF213. Hal ini menunjukkan bahwa DNA dari LbF213 tidak
dapat ter-ekstraski.
Gambar 14. Limit deteksi primer B2FR.
Gambar 14 di atas menunjukkan bahwa B2FR masih menunjukkan pita positif pada
kosnnetrasi LbF213 sebedar 3,75 pg. Jika satu (1) sel bakteri mengandung 1,6-2,4 fg
DNA (1 fg = 1x10-12 g). (Lars Reier Bakken, Rolf Arnt Olsen. Soil Biology and
1 2 M 3 4 5 6 7 8 9 10 M
1. 3,75 pg
2. 37,5 pg
3. 375 pg
4. 3,75 ng
5. 37,5 ng
M : 100 bp DNA marker
1 2 3 4 5 M
- 31 -
Biochemistry, 21(6): 789–793 (1989) maka 3,57 pg = 3.570 f gr yang setara dnegna +-
1.487 sel. Tetai, walaupun LbF213 ditamvahkab pada feses tetapi tdiak menunjukkan pita
dnegan B2FR. Hal ini menunjukkan recovery DNA LbF213 pada feses dangat rendah.
VI. SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan dari hasil penelitian ini adalah :
1. Lactobacillus sp F213 merupakan strain probiotik yang unik yang mempunyai
2 buah Interagentic spacer regions (IGS) dengan ukuran yang berbeda dnegan
L rhamnosus dan Pediococcus spp.
2. Lactobacillus sp F213 mempunyai dua buah IGS dnegan susuann ukleotida
yang berbeda dan menunjukkan homologi yang rendah dneagn strain lainnya
sehingga potensial sebaa target pengemabnag sistem deteksi spesifik.
3. Primer spesifik telah dikembangkan B2FR dan dapat membedakana LbF213
dengan straian BAL dan non BAL lainnya.
Saran
Perlu dilakukan optimasi primer/probe spesifik Lactobacillus sp F213 pada
kondisi feses manusia.
- 32 -
DAFTAR PUSTAKA
Agerbaek, M. Gerdes, L.U., Richeslsen, B. 1995. Hyphoschelesterolemic effect of a new
sfermented milk product in healthy middle-aged men. Eur.J. Clin, Nutr., 49: 346-352.
Anonimous. 2001. Health and nutritional properties of probiotics in food including powder
milk with live lactic acid bacteria, Food and Agriculture Organization for the United
Nations (FAO) and World Health Organization (WHO).
Anonimus. 2006. Pedoman teknis penemuan dan tatalaksana penyakit hipertensi.
Direcktoral Pegendalian Tidak Menular, Direktoral Jenderal PP dan PL, Departemen
Kesehatan Republik Indonesia.
Aryantini, P.D. 2008. Isolasi dan karakterisasi bifidobacterium dari feces bayi. PS Ilmu
Kesehatan Mayarakat. Univiersitas Udayana, Denpasar.Skripsi.
Artatai, LPSA. 2009. Karakteristik Probiotik dari Lactobacillus sp F212 dan F213 serta
kemampuan kompetisi pelekatannya dengan Eschericia coli O157 pada enterosit
Mencit. Skrip PS Farmasi, FMIPA Unud.
Begley, M., Hill, C., Gahan, C.G.M. 2006. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Appl.
Environ. Microbiol. 72: 1729-1738.
Bertolami, M.C., Faludi, A.A., Batlouni, M. 1999. Evaluation of the effect of a new
fermented milk product (Gaico) on rimary hypercholesterolemia. Eur.J. Clin, Nutr.,
53: 97-101.
Debruyne, P.R., Bruyneel, E.A., Li, X., Zimber, A., Gespach, C., Mareel., M.M. 2001. The
role of bile acids in carcigonesis. Mutation Res. 359-369.
De Smet, I., van Hoorde, I., De Saeyer, M., Vande, W.M., Verstraete, W. 1994. In vitro
study of bile salt hydrolase (bsh) activity of bsh isogenic Lactobacillus plantarum 80
strains and estimation of cholesterol lowering through enhanced BSH activity.
Microbiol. Ecol. Haelth Dis., 7:315-329.
De Smet, I., De Boever, P., and Versetraete, W. 1998. Cholesterol lowering in pigs through
enhanced bacterial bile salt hydrolase activity. Br. J. Nutr. 79:185-194.
De Rose, Nicole M and Martijin B. Katan. 2000. Effect of probiotic bacteria on diarrhea,
lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and
1998. Am J. Clin. Nutr. 71: 405-411.
Dwipayanti, N.M., Suariani, Pt., K.A. Nocianitri. 2007. Isolasi dan karakterisasi bakteri
asam laktat dari susu kuda sumbawa. PS Ilmu Keseahatn MAsyarakat Universitas
Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Dwipayanti, N.M., Suariani, Pt., K.A. Nocianitri. 2008. Identifikasi bakteri asam laktat dari
susu kuda sumbawa. PS Ilmu Keseahatn Masyarakat Universitas Udayana. Laporan
Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Gilliand, S.E., Nelso, C.R. and Maxwell, C. 1985. Assimilataion of cholesterol by
Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 49: 377-381.
Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. 1990. PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications. Academic Press. San Diego, New York.
- 33 -
Jasper, D.A., Massey,, L.K., and Luedecke, L.O. 1984. Effect of consuming yoghurt
prepared with three culture strains on human serum lipoproteins. J. Food Sci.,
49:1178-1181.
Jensen, M.A., Webstr, J.A., Straus, N. 1993. Rapid Identification of Bacteria on the Basisi
of Polymeras eChain Reaction-Amplified Ribosomal DNA Spaser Polymorphisms.
Appl. Environ. Microbiol. 59: 945-952.
Klaenhammer, T.R. and Kullen, M.J. 1999. Selection and design of probiotics. Int. J. Food
Microbiol. 50: 45-57.
Klaver, F.A.M. and van der Meer, R. 1993. The assume assiliation cholesterol by
lactobacilli dan Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugation activity.
Appl. Environ. Microbiol. 59: 1120-1124.
Kurdi, P., Tanaka, H., van Veen, H., Asano, K., Tomita, F., Yokota, A 2003. Cholic acid
accumulation and its deminuation by short chain fatty acids in bifidobacteia.
Microbiology 149:2031-2037.
Kurdi, P., Van Veen, H, Tanaka, H., Mierau, I, Konings, W.N., Tannock, G.W., Tomita, F.,
Yokota, A. 2000. Cholic acid is accumulated spontaneously, driven by membrane
▲pH, in many lactobacilli. J. Bact. 182:6525-6528.
Larson, L.A., Raben, A., Haulrik, N., Hansen, A.S., Manders, M., Astrop, A. 2000. Effetct
of 8 weeks intake of probiotic milk products on risk factors for cardiovascular diseases.
Eur.J. Clin, Nutr., 54: 288-297.
Liong, M.T. and Saha, N.P. 2005. Bile slat deconjugation ability, bile salt hydrolase activity
and cholesterol co-precipitation ability of lactobacilli strains. Int. Dairy J., 15:391-398.
Lovegrove, J. and Jackson, K. 2003. Coronary heart diseases. In: Mattila-Sandholm, T. and
Saarela, M. (Ed), Functional Dairy Products. Woodhead Pub.Limited, Sambridge,
Englan. Pp: 54-87.
Mattilla-Shandholm, T., Blum, S., Collins, J.K., Crittenden, R., de Vos, W., Dunne, C.,
Fonden, R., Grenov, G., Isolaury, E., Kiely, B., Marteau, P., Morelli, L., Ouwehand,
A., Reniero, R., Saarela, M., Salminen, S., Shanahan, F., Vaughan, E., von Wright, A.
1999. Probiotics: towards demosntrating efficacy. Trend Food. Sci. Technol., 10:393-
399.
Nocianitri, K. A., dan I.D.G.M. Permana. 2006. Seleksi Bakteri Asam Laktat Sebagai Galur
Probiotik Untuk Bayi Alergi Susu Formula. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas
Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan
Nocianitri, K. A., dan I.D.G.M. Permana. 2008. Identifikasi Lactobacilus sp. F16 dan
Lactobacillus sp. BY85 dan kemampuan adhesinya pada epitel saluran pencernaan
mencit. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Laporan Penelitian Dosen
Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Nocianitri, K.A., Aoyama, Y. 2001. Different response to choline deficiency of the serum
ornithine carbamoyltransferase activity in four strains of rats. J. Biosci. Biophysics
Biochem. 65: 935-938.
Nocianitri, K.A. Sakata, S., Kanno, T., Kikuchi, H., Kurasaki, M., Aoyama, Y. 2002.
Influence of dietary methionine level on the liver metallothionein mRNA level in rats.
J. Biosci. Biophysics Biochem. 66:2465-2470.
Nour, M. 1998. 16S-23S-5S intragenic spacer regions of Lactobacilli: nucleotide sequence,
secondary structure and comparative analysis. Res. Microbiol., 149: 433-448.
- 34 -
Nursini, W., NP. Desy Aryantini, K.A. Nocianitri, Y. Ramona, W. Redi Aryanta and I N Sujaya. Colonization of Lactobacillus sp. F2 in the Intestinal Tract and its Functional Effect to Reduce Blood Cholesterol Content of Rats (Rattus Norvegicus). The 2nd International Conference on Bioscience and Biotechnology, Udayana University, Bali, Indonesai, 23-24 Sept. 2010.
Ramirez, M.I., Karaoglu, D., Haro, D., Barrilas, C., Bashirzadeh, Gil, G. 1994. Cholesterol
and bile acid regulate cholesterol 7a-hydroxylase expression at the ranscriptional level
in culture and in transgenic mice. Mol. Cell. Biolog. 14: 2809-2821.
Rayuda, M.A. 2006. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari berbagai sumber alami.
Jur. Biologi, FMIPA, Universiats Udayana. Denpasar. Skripsi.
Sanders, M.E. 1998. Overview of functional foods: emphasis on probiotic bacteria. Int.
Dairy J. 8: 341-349
Schaafsma, G., Meuling, W.J.A., van Dokkum, W., Bouley, C. 1998. Effect of a milk
product , fermented by Lactobacillus acidophilus and with fructo-oligosaccharides
added, on blood lipid in male volunteers. Eur.J. Clin, Nutr., 52: 436-440.
Sugita, I.M., Wijaya, N.K., Sujaya, I N. 2007. Rekayasa Starter dan Pembuatan Tablet
Kunyah DAKULI , Untuk Menekan Pertumbuhan Kanker Dan Penurun Kolesterol
Darah.Ditjen Dikti, Penelitian Hibah Bersaing.
Sujaya, I N, Ramona, Y. , Widarini, NP., Suariani, NP, Dwipayanti, N.M.U, Nocianitri ,
K.A., Nursini, N.W. 2008a. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Susu
Kuda Sumbawa. J. Vet. 9:33-40.
Sujaya, I.N., Dwipayanti, N.M.U., Suariani, N.L.P., Widarini, N.P., Nocianitri, K.A.,
Nursini, N.W., 2008b. Uji in vitro ketahanan Lactobacillus spp. isolat susu kuda
Sumbawa pada model saluran pencernaan. J. Vet. 9:52-59.
Sujaya, I N. Amachi, S. Yokota, A. Asano, K. and Tomita, F. 2001. Identification and
characterization of lactic acid bacteria in ragi tape. W. J. .Microbiol. Biotechnol., 17:
349-357.
Sujaya, I N., D.M. Sukrama, K.J.P. Pinatih. 2006. Efek bifidogenik pisang secara in vitro
dalam usaha pengembangan probiotic bifidobacterium. Laporan hasil penelitian Riset
Pembinaan Ilmu dan Teknologi Kedokteran (RISBIN IPTEKDOK-2006)
(unpublished)
Sujaya, I N. 2010. Development of Probiotic for Diarrheagenic Pathogens. International
Symposium on Bioscinece and Biotechnology, Udayana University, 14-17 Sepet.
2010
Sujaya, I.N, DWM Sukrama, Y. Ramona, K.A Nocianitri, T Sone, K Asano. 2012.
Resistantce of Lactobacillus sp. F213 in human gastrointestinal tract as reveal by
Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal
microbiome. (Hlaporan peneklitian Kerja sama luar negeri, Unud).
Sujaya, I.N, DWM Sukrama, Y. Ramona, K.A Nocianitri, T Sone, K Asano. 2013.
Resistantce of Lactobacillus sp. F213 in human gastrointestinal tract as reveal by
Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal
microbiome. (Hlaporan peneklitian Kerja sama luar negeri, Unud).
Tannock, G. 1999. Introduction. In: Tannock, G.W. (Ed).Probiotics: A Critical Review.
Horizon Scientific Press. Norfolkm UK. Pp:1-4.
- 35 -
Torano, M.P., Medici, M., Perdigon, G., Ruiz Holgado, A.P., Valdae, G.F. 1998. Efidennce
of hypocholesterolemic effect of Lactobacillus reuteri in hypercholesterolemic mice. J.
Dairy Sci., 81:2336-2340.
Yustiantara, PS. 2009. Aspek Keamanan dari Lactobacillus sp F213 dalam
penegmabngannya sebagai probiotik endogen Indonesia. Skripsi PS Farmasi, FMIPA
Unud.
- 36 -
Lampiran: UNDANGAN SEBAGAI PEMBICARA the 5th IC-ISLAB
Hasil penelitian ini akan dipresentasi dalam The 5th International Conference of Indonesian
Society for Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)
Guest Speaker Invitation for The 5th International Conference of Indonesian Society for
Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)
Islab Islab
Dear Dr. I Nengah Sujaya,
Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria (ISLAB) would like to organize its 5th International
Conference at Faculty of Agricultural Technology, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,
Indonesia in November 13-14, 2015, and now being proposed to be Scopus indexed.
During this conference we would like to invite you as a guest speaker in this conference.
However since we are limited in budget, we are truly sorry that we couldn't afford your airfare
from your country to Indonesia, but we will provide your local transportation and accommodation
during your stay in Yogyakarta.
We also would like to ask your permission to put your name as our guest speaker in the
conference's publication.
We are looking forward to your positive respond.
Thank you and I look forward to hearing from you.
CC: Prof. Dr. Endang S. Rahayu (Chairperson of Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria)
With kind Regards,
Linda Windiarti
Organizing Committee
The 5th International Conference of Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)
Faculty of Agricultural Technology, Gadjah Mada University,
Bulaksumur, Yogyakarta, 55281. Indonesia
Phone/Fax : +62-274-549650,
http://islab.tp.ugm.ac.id
Email: [email protected]
- 37 -
Resistance of Lactobacillus sp F213 in Human Gastrointestinal Tract and Its Health
Promoting Effects.
I Nengah Sujaya
Lab. Bioscience and Biotechnology, School of Public Health, Fact. Medicine Udayana
University, Badung Bali Indonesia
ABSTRACT
Increasing death causing by noncommunicable diseases (NCD) is not only more common
in modern societies but also in developing countries. Tis disease is thought associated
with unhealthy life style. Probiotic offers opportunities in managing NCD and becoming
popular world wide. This research was aimed to determine the resistance of
Lactobacillus sp F213 (LbF213) in human gastrointetstinal tract and its health
promoting effects. Fifteen healthy human subjects participated in this study were
administered with a capsule containing 7.5 x 108 cfu for 28 days. Fecal and blood
samples were collected before, during and after 28 days administration. The population of
lactic acid bacteria and anerobes in fecal samples was enumerated by culture methods,
while the LbF213 in fecal samples were detected using PCR-DGGE of fecal
microbiomic DNA. Health promoting parameters such as lipid profile and TNF alfa were
analysed in blood samples.
The results showed that administration of 7.5 x 108 cfu for 4 weeks increased LAB
population, 2.19X109 cfu/g before administration to 1.58x1010 after 28 days
adminstration, while total anaerob decreased from 4.47x1010 before admnistration to
1.78x1010 cfu/g after 28 days. Lactobacillus sp F213 was detected in fecal samples
suggested that the LbF213 survived in the human GI and play role in modulation of
human intestinal microbiota. The LbF213 altered lipid profile of human subjects, which
likely to be subject dependent. The F213 reduced 6,29% cholesterol, 7,70% HDL and
8,54% LDL and increased 0,19% of TG after 28 days administration. The effect of
LbF213 in lowering blood cholesterol was found to be higher in high blood cholesterol
subjets compared to normal blood cholesterol subjects, 8.1% and 4.06%, respectively.
Administration of F213 for 28 days lowered about 36% of TNF alfa titer in serum, 0.91
pg/dL before and 0.59 pg/dL after adinistration. Those results demosntrated that LbF213
resisted in human GI, slightly modify human normal intestinal microbiota and excerted
health promoting effects.
Keywords : Lactobacillus sp F213, intestinal microbiota, probiotic, cholesterol