Sekuensing DNASekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan

urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA,

yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung

instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup.[1] Sekuensing DNA dapat

dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan

cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.[2] Teknik ini

digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti kedokteran,[3] bioteknologi, forensik,[4] dan antropologi.[5]

Teknik sekuensing DNA mulai dikembangkan pada tahun 1970-an dan telah menjadi hal rutin

dalam penelitian biologi molekular pada dekade berikutnya berkat dua metode yang

dikembangkan secara independen namun hampir bersamaan oleh tim Walter Gilbert di Amerika

Serikat dan tim Frederick Sanger di Inggris sehingga kedua ilmuwan tersebut

mendapatkan Penghargaan Nobel Kimia pada tahun 1980.[6][7] Selanjutnya, metode Sanger

menjadi lebih umum digunakan dan berhasil diautomatisasi pada pertengahan 1980-an. Sejak

tahun 1995, berbagai proyek genom yang bertujuan menentukan sekuens keseluruhan DNA

pada banyak organisme telah diselesaikan, termasuk Proyek Genom Manusia. Sekuensing DNA

seluruh genom semakin terjangkau dan cepat dilakukan berkat pengembangan sejumlah teknik

sekuensing generasi berikutnya mulai tahun 2000-an.

Aplikasi Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi makhluk hidup untuk

melangsungkan hidup dan berkembang biak. Dengan demikian, penentuan sekuens DNA

berguna di dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai mengapa dan bagaimana makhluk hidup

dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis. Karena DNA merupakan ciri kunci

makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA dapat berguna dalam

penelitian biologi manapun. Sebagai contoh, dalam ilmu pengobatan sekuensing DNA dapat

digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit

genetik. Demikian pula halnya, penelitian pada agen penyebab penyakit (patogen) dapat

membuka jalan bagi pengobatan penyakit menular. Bioteknologi, yang dapat pula memanfaatkan

sekuensing DNA, merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan

banyak barang dan jasa berguna. Pengetahuan akan sekuens DNA berguna untuk mengetahui

sekuens asam amino yang disandikan oleh gen.[8]

Karena RNA dibentuk dengan transkripsi dari DNA, informasi yang dikandung RNA juga terdapat

di dalam DNA cetakannya sehingga sekuensing DNA cetakan tersebut sudah cukup untuk

membaca informasi pada RNA. Namun, sekuensing RNA dibutuhkan khususnya pada eukariota,

karena molekul RNA eukariota tidak selalu sebanding dengan DNA cetakannya karena

pemotongan intron setelah proses transkripsi.

MetodeMetode Maxam-GilbertMetode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian,

sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukan kloning untuk membentuk DNA untai

tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-

Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia

berbahaya, dan kesulitan dalam scale-up.

Metode Sanger

Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.

Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan metode

terminasi rantai yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya [1]. Teknik

tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA in vitro yang spesifik untuk

sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.

Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai

pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang

disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. Primer tersebut

diperpanjang menggunakan DNA polimerase, enzim yang mereplikasi DNA. Bersama

dengan primer dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis

basa deoksinukleotida (satuan pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai

(terminator rantai) dalam konsentrasi rendah (biasanya di-deoksinukleotida). Penggabungan

nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA

menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA

tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu

dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis gel poliakrilamida, atau sekarang semakin

lazim dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa kapiler) yang diisi

dengan polimer kental.

Seiring dengan perkembangannya, kini terdapat beberapa macam metode sekuensing terminasi

rantai yang berbeda satu sama lain terutama dalam hal pendeteksian fragmen DNA hasil reaksi

sekuensing.

Metode Sanger asli

Pada metode yang asli, urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkan dengan membuat

secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salah satu dari empat jenis basa

pemutus rantai pada masing-masing reaksi. Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk

dideteksi dengan menandai (labelling) primer yang digunakan dengan fosfor radioaktif sebelum

reaksi sekuensing dilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesis pada

empat lajur yang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida.

Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macam primer yang ditandai dengan

pewarna berpendar (fluorescent dye). Hal ini memiliki kelebihan karena tidak menggunakan

bahan radioaktif; selain menambah keamanan dan kecepatan, keempat hasil reaksi dapat

dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel. Metode ini dikenal sebagai metode dye

primer sequencing.

Sekuensing dye terminator[

Contoh hasil bacaan suatu sekuensing metode dye terminator.

Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebut metode

sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat

dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada

penggunaan primer berlabel. Pada cara tersebut, masing-masing dideoksinukleotida pemutus

rantai ditandai dengan pewarna fluoresens, yang berpendar pada panjang gelombang yang

berbeda-beda. Cara ini lebih mudah dan lebih cepat dibandingkan penggunaan primer berwarna,

namun dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (peak) yang disebabkan

oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada

pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah tersebut

telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim dan pewarna

baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan.

Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana

dan lebih murah. Primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel secara terpisah (yang bisa

jadi cukup mahal untuk primer yang dibuat untuk sekali pakai), walaupun hal tersebut tidak

terlalu bermasalah dalam penggunaan universal primer.

Automatisasi dan penyiapan sampel

Mesin sekuensing DNA automatis modern mampu mengurutkan 384 sampel berlabel fluoresens

sekaligus dalam sekali batch (elektroforesis) yang dapat dilakukan sampai 24 kali sehari. Hal

tersebut hanya mencakup proses pemisahan dan proses pembacaan kurva; reaksi sekuensing,

pembersihan, dan pelarutan ulang dalam larutan penyangga yang sesuai harus dilakukan secara

terpisah.

Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan, metode

"sekuensing daur" (cycle sequencing) paling lazim dilakukan. Dalam metode ini dilakukan

berturut-turut penempelan primer (primer annealing), ekstensi oleh polimerase DNA, dan

denaturasi (peleburan atau melting) untai-untai DNA cetakan secara berulang-ulang (25–40

putaran). Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih efisiennya penggunaan pereaksi

sekuensing yang mahal (BigDye) dan mampunya mengurutkan templat dengan struktur

sekunder tertentu seperti hairpin loop atau daerah kaya-GC. Setiap tahap pada sekuensing daur

ditempuh dengan mengubah temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (thermal

cycler) PCR. Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang komplementer

akan saling menempel (berhibridisasi) pada temperatur rendah dan berpisah (terdenaturasi)

pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara tersebut adalah penggunaan

enzim DNA polimerase dari organisme termofilik (organisme yang hidup di lingkungan

bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai pada temperatur tinggi yang digunakan pada

cara tersebut (>95 °C).

Sekuensing generasi berikutnyaPyrosequencing

Pyrosequencing adalah teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi

terhadap pirofosfat (PPi) yang dilepaskan selama sintesis DNA.[19] Teknik ini

memanfaatkan reaksi enzimatik  yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase untuk

pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.[19]

Illumina(Solexa)

Metode sekuensing ini ditemukan oleh perusahaan Illumina. Sekuensing Illumina menggunakan

primer yang akan berkomplemen dengan adaptor yang telah disediakan oleh perusahaan pada

sebuah plat. Proses sekuensing ini menggunakan teknik bridge PCR, yaitu terbentuknya

jembatan pada saat elongasi. Nukleotida penghenti akan diberikan dan pendaranan fluoresens

akan direkam oleh kamera

Analisis sequen DNA dengan Blast        Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang menggunakan tools  ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA Sequencing.

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.2.7.1. Sequencing Chemistries                      Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas

proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.2.7.2. Sequencing menggunakan Dye Primers         Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5′-nya dengan menggunakandye fluorescent yang berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer (gambar 2).2.7.3. Sequencing menggunakan Dye Terminators                      DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warna dye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3′-nya (gambar 3)