Protein adalah suatu makromolekul yang tersusun atas molekul-molekul asam amino yang berhubungan satu dengan yang lain melalui suatu ikatan yang dinamakan ikatan peptida. Sejumlah besar asam amino dapat membentuk suatu senyawa protein yang memiliki banyak ikatan peptida, karena itu dinamakan polipeptida. Protein berada di aliran darah dan diedarkan ke seluruh tubuh terbawa oleh cairan darah yang disebut plasma darah. Protein beredar sampai ke hati dalam bentuk paling sederhana yaitu asam amino. Kelebihan protein di dalam darah umumnya tidak akan disimpan akan tetapi dirombak kembali oleh hati menghasilkan senytawa-senyawa yang mengandung unsure Nitrogen (N) misalnya ammonia yang bersifat toksik untuk tubuh sehingga akan dikeluarkan melalui urin,serta dirombak pula menjasi senyawa-senyawa yang tidak mengandung unsure Nitrogen yang kemudian akan disintesis kembali.Pada praktikum kali ini dilakukan tes total protein yang merupakan salah satu bagian dari tes fungsi hati (Lever Function Test/LFT). Tujuan dari dilakukannya tes ini adalah untuk melihat terjadinya defisiensi protein, adanya gangguan pada hati, ginjal, gastrointestinal atau untuk melihat adanya keganasan dari suatu penyakit.Penetapan kadar protein dalam serum biasanya mengukur protein total, dan albumin atau globulin. Total protein terdiri atas albumin (60%) dan globulin (40%). Bahan pemeriksaan yang digunakan untuk pemeriksaan total protein kali ini adalah serum. Karena, Bila menggunakan bahan pemeriksaan plasma, kadar total protein akan menjadi lebih tinggi 3 5 % karena pengaruh fibrinogen yang masih terdapat dalam plasma.Dalam penetapan kadar protein total ini tidak diperlukan persiapan khusus untuk pasien hanya saja ingatkan pasien untuk menghindari/tidak mengonsumsi zat yang menyebabkan peningkatan total protein invivo seperti steroid, androgen, dll. Begitu pula dengan zat yang menyebabkan penurunan protein total invivo seperti laksansia, rifamfisin dll. Sebelum pemeriksaan dilakukan. Untuk persiapan sampel perlu dierhatikan/dihindari terjadinya hemolisis karena hemoglobin pada sampel yang lisis dapat menyebabkan meningkatknya jumlah total protein, begitupula pada saat pengambilan sampel darah pemakaian torniquet yang lama perlu dhindarkan.Pada pratikum kali ini dilakukan penetapan kadar protein dengan menggunakan metode spektrofotometri visible atau yang lebih dikenal dengan metode biuret, metode ini adalah metode yang bersifat kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer. pada prinsipnya metode ini melakukan pengukuran terhadap serapan cahaya kompleks berwarna ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret, dengan adanya pereaksi biuret ini akan memebentuk kompleks adalah protein dengan ion Cu2+ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap maka semakin tinggi pula kandungan protein dalam serum yang diperiksa. Penyerapan cahaya oleh protein disebabkan oleh ikatan peptide residu ritosil triptofonil dan fenilalanin, juga turut dipengaruhi oleh gugus non protein yang mempunyai sifat menyerap cahaya. Penyerapan maksimum (absorbansi maksimum) albumin pada serum terlihat pada panjang gelombang 546 nm, oleh karena itu ditetapkanlah panjang gelombang 546 nm sebagai panjang gelombang dalam pengukuran ini.Walaupun metode ini telah dipergunakan secara luas namun tetap memiliki kelemahan, adapun kelemahan dari metode ini adalah penetapannya tidak murni menunjukan kadar protein, melainkan bisa saja kadar senyawa yang mengandung benzena gugus fenol, gugus sulfhidrin, ikut terbaca kadarnya.Sebelum dilakukan pengukuran terlebih dahulu sampel diidentifikasi. Sampel yang kami periksa merupakan sampel serum yang memiliki kode 1, tidak disertai nama pasien dan jenis kelamin, dan diketahui pula sampel ini adalah sampel orang dewasa. Identitas sampel ini sangat penting diketahui agar nantinya saat hasil keluar tidk terjadi kesalahan yaitu sampel tertukar, selain itu usia dan jenis kelamin pasien dibutuhkan untuk menyesuaikan hasil pemeriksaan dengan nilai rujukan normal agar tidak terjadi kekeliruan.Sebelum mengerjakan sampel, perlu diperhatikan untuk menggunakan alat pelindung diri, dengan baik benar dan lengkap, karena bahan yan kita kerjakan adalah serum yang berpotensi sangat infeksius dan dapat menularkan penyakit terhadap diri kita. Setelah APD digunakan dengan lengkap barulah pengerjaan dapat dilanjutkan.Dalam praktikum ini dibuat tiga macam larutan yang terdiri dari campuran bahan yang berbeda-beda, yang absorbansinya akan diukur menggunakan spekrofotometer. Ketiga larutan tersebut adalah larutan Blanko, larutan standard dan larutan tes. Larutan blanko atau larutan blank adalah larutan yang diperlakukan sama seperti sampel, diberi pereaksi atau reagen biuret dalam konsentrasi dan volume yang sama, namun dalam campurannya tidak ditambahkan sampel yang diuji, dimana sampel digantikan dengan aquadest, hal ini dilakukan karena blanko berfungsi sebagai larutan pengkalibrasi yang nantinya digunakan untuk mengenolkan alat. Selain blanko dibuat pula larutan standar, larutan standar ini merupakan campuran antara pereaksi biuret dengan serum yang telah diketahui konsentrasi protein yang terkandung di dalamnya, dari konsentrasi dan absorbansi standar inilah nantinya kita akan bandingkan dengan hasil pengukuan absorbansi sampel sehingga dapat dihitung dan diketahui kadar protein total di dalam sampel pasien yang diuji. Yang terakir adalah larutan Test, di dalam larutan tes inilah serum pasien yang ingin diketahui kadar total proteinnya direaksikan dengan cara dicampur dengan pereaksi biuret yang kemudian bersama-sama dengan blanko dan standar diinkubasi selama 20 menit dan nantinya diukur pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 546nm untuk dapat mengetahui kandungan total protein di dalam sampel serum pasien tersebutPerbandingan volume reagen dan sampel baik itu blanko, standar maupun test, adalah 50 :1 dimana volume pereaksi biuret yang digunakan adalah 2,50 ml sedangkan sampel (blanko, standar maupun test) adalah 0,05 ml. karena volume penambahan sampel sangat kecil dan diperlukan ketepatan dan ketelitian volume yang sangat tinggi dalam pemeriksaan ini, maka digunakanlah bantuan mikropipet berukuran 50 uL untuk memindahkan sampel (aquadest, standar protein maupun serum pasien) ke dalam tabung serologi untuk direaksikan dengan pereaksi biuret, atau dapat pula digunakan mikropipet ukuran 10 UL, namun kita memipet sebanyak 5 kali, jangan lupa untuk mengelap ujung tip mikropipet sebelum memindahkan bahan ke tabung seroogi untuk direaksikan karena kelebihan volume walaupun kelihatannya sepele dapat menggangu hasil pemriksaan, karena kita bekerja dalam ukuran mikroliter.Setelah aquadest, standar protein maupun serum pasien masuk ke dalam tabung serologi yang telah berisi larutan biuret, kemudian larutan-larutan ini dihomogenkan agar reagen dan sampel tersebar merata di seluruh bagian larutan kemudian diinkubasi selama 20 menit. Inkubasi selama 20 menit ini memberikan kesempatan reagen dan reaktan/protein untuk bereaksi maksimal membentuk ikatan senyawa kompleks berwarna violet yang nantinya akan diukur menggunakan spektrofotometer.Setelah 20 menit lartan-larutan ini siap diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjanggelombang 546 nm, panjang gelombang ini dipilih karena pada panjang gelombang inilah intensitas cahaya berwarna violet paling maksimal diabsorpsi/diserap oleh alat. Sebelum diukur larutan-larutan ini harus dihomogenkan dan dipindahkan ke dalam kuvet, Pada saat sampel dihomogenkan/dikocok jangan sampai menimbulkan busa karena akan mempengaruhi pengukuran absorbansinya. Jika terbentuk busa atau gelembung udara, bisa diatasi dengan menyerapnya menggunakan kertas saring, hingga busa-busa/gelembung tersebut habis terserap, pengukuran dapat dilanjutkan.Pada saat mengukur dengan spektrofotometer harus dipastikan panjang gelombag yang digunakan telah diatu dengan baik yaitu 546nm, penempatan kuvet harus tepat dengan garis yang ditunnjukkan pada kuvet dan tempat kupet serta urutan dalam pengukuran blanko, standar aupun test harus berurutan. Hal ini dilakukan agar pengukuran yang kita lakukan representative dan valid. Sebelum memasukkan blanko, standar, maupun tes terlebih dahulu dimasukkan aquadest tanpa reagen untuk mencapai titik nol alat. Dari ketiga larutan uji (blanko, standar, test) yang Pertama dimasukkan adalah blanko yang berfungsi untuk mengkalibrasi alat atau mengenolkan alat dan menyesuaikan dengan jenis larutan yang akan diuji, dimana larutan blanko ini sebagai titik nol, dan seharusnya saat diukur akan menunjukkan angka nol, karena tidak mengandung protein yang dapat bereaksi dengan biuret menghasilkan warna violet. setelah blanko menunjukkan nilai pengukuran nol dilanjutkan dengan larutan standar protein dan yang terakhir larutan test yang berisi sampel serum yang ingin diketahui kadar proteinnya.Dalam pengukuran menggunakan spektrofotometer diperoleh nilai absorbansi larutan standar adalah sebesar 0,322 sedangkan absorbansi sampel adalah 0,342. Larutan standar yang kita gunakan telah diketahui sebelmnya memiliki konsentrasi total protein sebesar 5 g/dl, sehingga dapat dihitung kadar total protein serum yang kita uji dengan membandingkan nilai absorbansi sampel berbanding nilai absorbansi standar dikalikan dengan konsentrasi larutan standar adalah sebesar 5,3105 g/dL. Nilai ini menunjkkan kadar dibawar normal dari nilai rujukan normal kadar protein total untuk orang dewasa yang berada pada kisaran 6,6-8,8 g/dL. Penurunan kadar total protein ini dapat memberi tanda bahwa terjadi gangguan kesehatan pada pasien seperti Gangguan hati,Malabsorbsi, Malnutrisi, Nefrosis, Luka bakar, DM, Toksemia gravidarum, Glomerulonefritis kronik, atau Shok berat.Dari hasil pengukuran ini walaupun didapat hasil yang mengindikasikan terjadinya gangguan kesehatan seperrti di atas, namu tetap harus dilakukan tes penunjang laboratorium lainnya, karena seperti yang kita ketahui tes fungsi hati tidak dapat berdiri sendiri,tes terhadap fungsi hati ini terdiri dari serangkaian tes, dan diagnosis terhadap gangguan fungsi hati sendiri tidak bisa dikeluarkan hanya dengan melakukan satu jenis tes saja, melainkan harus dikuatkan dengan tes-tes lainnya yang kemudian disesuaikan dengan data-data hasil pemeriksaan klinis pasien.Adapun hal-hal yang dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan tes ini sehingga hasil menjadi melenceng dari yang seharusnya antara lain adalah faktor alat serta bahan dan faktor praktikan (yang mengerjakan). Faktor alat dan bahan misalnya kuvet yang digunakan tergores atau kotor dan berlemak, jumlah serum bahan pemeriksaan yang volumenya kurang, reagen biuret yang sudah kadaluarsa, alat spektrofotometer yang kurang terkalibrasi, tidak tersedianya mikropipet dalam variasi volume yang diperlukan, dll. Sedangkan faktor dari praktikan antara lain pemipetan yang kuarang baik, lupa menghomogenkan serum ketika akan dicampur dengan reagen, serum yang keruh, lisis, dan terpapar sinar matahari langsung yang agak lama, kesalahan penyimpanan bahan/serum, keterlambatan pemeriksaan bahan, perbedaan pengamatan karena sampel dikerjakan oleh beberapa orang, oleh karena itu sebaiknya dalam pengukurn sampel, penempatan kuvet dan pembacaan hasil sebaiknya dlakukan oleh satu orang, karena pengamatan mata masing-masing orang berbeda-beda sehingga seringkali menimbulkan perbedaan hasil pemeriksaan.