Teknik Prosedur Pewarnaan GramAlat : Object Glass Cover Glass Pipet Tetes Botol Semprot Bunsen Bahan : Apusan Bakteri Zat Warna Gentian Violet Iodine Alcohol Zat Warna Safranin/ Air Fuchsin Aquades Spiritus

Prosedur : 1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya.2. Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet) ke atas area apusan, biarkan selama 20 detik.3. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik.4. Teteskan 1 tetes Larutan Iodine ke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1 menit.5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak berwarna (sekitar 10 20 detik).6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik.7. Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin), biarkan selama 20 detik. 8. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik.9. Keringkan di suhu ruang.10. Amati di atas mikroskop dengan perbesar 100 x Objektif, dengan bantuan minyak imersi.

2.3 Prinsip Pewarnaan GramPewarnaan gram merupakan suatu metode pemeriksaan mikroskopik yang paling banyak dilakukan di laboratorium yang bertujuan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan perbedaan struktural dinding selnya. Bakteri yang diwarnai yaitu bakteri gram negatif dan bakteri gram positif. Bakteri gram positif yang terwarnai ungu memiliki dinding sel yang tebal, hal ini karena bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal biolet setelah dicuci dengan alkohol sehingga tampak berwana ungu tua dan berdinding tebal di bawah mikroskop. Bakteri ini mempunyai dinding sel yang tersusun oleh sebagian besar peptidoglikan yang mampu mengikat zat warna dan tidak rusak pada saat dicuci dengan alkohol. Sedangkan bakteri gram negatif terwarnai merah, memiliki dinding sel yang relatif tipis dilapisi oleh membran luar yang mengandung lipoposakarida dan tidak bisa mempertahankan zat warna. Hal ini karena bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak bewarna merah. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin dan iodine. Dari penjelasan diatas dapat disimpulkan bahwa prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dari dinding sel bakterinya, jadi pada saat pencucian dan pewarnaan akan terjadi perbedaan reaksi permeabelitas zat warna dan penambahan larutan pencuci. 2.4 Zona hambatan bakteri pada uji sensitivitas antibiotika Untuk mengukur zona pada disk yaitu dari bagian belakang disk menggunakan pantulan sinar. Pegang disk beberapa inci diatas permukaan gelap yang tidak terkena sinar. Ukur dengan menggunakan caliper.

Interpretasi hasil dari uji sensitivitas antibiotika yaitu: Zona disekitar antibiotik menunjukkan bahwa tidak ada pertumbuhn , zona ini disebut sebagai zona inhibisi karena pada zona ini diperkirakan konsentrasi minimum dari antibiotik cukup untuk mencegah pertumbuhan bakteri pada tes isolasi. Zona ini kemudian diukur dalam mm dan dibandingkan dengan grafik standar interpretasi yang digunakan untuk mengkategorikan isolasi apakah termasuk susceptible, intermediately susceptible atau reistent. Minimal Inhibitory Concentration (MIC) pengukuran tidak bisa ditentukan dari tes kualatif ini, yang mana pengklasifikasiannya isolasi sederhana seperti sebagai susceptible, intermediate, dan resistent. Pada agar disk ini, bakteri isolasi dites untuk resistensi dari masing-masing antibiotik yang berbeda sebanyak 12 buah. Clear zone sekitar masing-masing disc adalah zona inhibisi yang mengindikasikan bahwa zona tersebut adalah luas ketidakmampuan organisme terhadap antibiotik. Adanya zona inhibisi tidak menginterpretasikan secara otomatis sebagai kerentanan terhadap antibiotik, karena hasil pengukuran akan dibandingkan dengan referensi standar pengukuran yang mempunyai range tertentu yaitu kategori susceptible, intermediate, dan resistent. Contoh : pada pengukuran disamping bakteri E. Coli mempunyai zona inhibisi 10.1mm disekitar ampicillin (AM). Interpretasi dari diameter zona menurut range nya yaitu : Resistent : 13mm atau kurang Intermediate : 14mm-16mm Susceptible : 17mm atau lebih. Dapat disimpulkan bahwa E. Coli merupakan kategori organisme yang resistent terhadap ampicillin.

Referensi : 1. www.google.books.co.id Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium edisi 11. Ronald A. Sacher, Richard A. McPherson. Penerbit Buku Kedokteran. 2004. Terakhir akses Kamis, 6 Maret 2014, pukul 21.30 WIB. 2. Microbilogy Module 2 http://amrls.cvm.msu.edu/microbiology . Terakhir akses Jumat, 7 Maret 2014, pukul 05.00 WIB