PRAKTIKUM VI : UJI AKTIVITAS ANTI MIKROBAB. METODE DILUSI CAIRI. TUJUANSetelah melakukan praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat menentukan kadar hambat minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel terhadap mikroba uji.II. PENDAHULUANA. Uji Antibiotik MikrobaTujuan assay mikroba (termasuk antibiotik dan substansi antimikroba nonantibiotik, misalnya : fenol, bisfenol, dan aldehid) adalah untuk menentukan potensi dan control kualitas selama proses reproduksi senyawa antimikroba di pabrik, untuk farmakokinetik obat pada hewan atau manusia dan untuk memonitor kemoterapi obat. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efisien. Terdapat bermacam-macam metode uji antimikroba seperti ini :1. Metode Difusi Metode disc diffusion E-test Ditch-plate technique Cup-plate technique Gradient-plate technique2. Metode DilusiMetode dilusi dibedakan menjadi dua, yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat (solid dilution). Metode dilusi cair/broth dilution test (serial dilution)Metode ini mengukur kadar hambat minimum dan kadar bunuh minimum. Cara yang digunakan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai kadar hambat minimum. Selanjutnya diukur ulang pada media cair tanpa oenambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam.

Metode dilusi padatMetode ini serupa dengan dilusi cair, namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adlaah satu konsentrasi agen mikroba uji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.B. AntibiotikAntibiotika adalah zat kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang menghambat mikroorganisme lain. Diberikan pada produk metabolic yang dihasilkan mikroorganisme tertentu, dalam jumlah kecil mampu merusak atau menghambat mikroorganisme lain (Pelezar,1988).Cara yang biasa digunakan untuk mengetahui kemampuan antibiotik adalah dengan uji kepekaan antibiotik terhadap bakteri penyebab penyakit. Kemampuan antibiotik ditentukan dengan melihat konsentrasi terendah antibiotik yang masih poten membunuh/menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Metode penentuan ini disebut KHM (Kadar Hambat Minimum). KHM merupakan petunjuk konsentrasi antibiotik yang poten menghambat pertumbuhan mikroorganisme dan memberi petunjuk tentang dosis yang diperlukan dalam pengobatan penyakit. Sedangkan KBM (Kadar Bunuh Minimum) adalah konsentrasi terendah bahan antimikroba yang mematikan. KHM dan KBM dapat ditentukan dengan prosedur tabung dilusi. Prosedur ini digunakan untuk menentukan konsentrasi antibiotik yang masih efektif untuk mencegah pertumbuhan pathogen dan mengindikasikan dosis antibiotik yang efektif (Lay, 1994).III. ALAT DAN BAHAN1. Alat Cawan petri (1) Mikropipet, blue tip, dan yellow tip (10) Tabung reaksi 5 mL (10) Gelas ukur 10 mL (1) Ose bulat2. Bahan Sampel minyak atsiri yang akan diuji Media antibiotik no.1 dan media Tryptic Soya Agar (TSA) Pelarut DMSO Larutan baku antibiotik Suspensi bakteri uji S.aureus atau E.coli dalam kaldu nutrien yang ditanam sehari sebelumnya

IV. CARA KERJADibuat 6 seri pengenceran kelipatan (two fold dilution : 2-0,06%v/v) dengan DMSO (maksimal 10% volume akhir) dalam tabung reaksi 5 mL.

Disiapkan suspensi bakteri Staphylococcus aureus atau Escherichia coli dalam larutan salin dan dibandingkan kekeruhannya dengan standar Mc. Farland sehinggan diperoleh konsentrasi bakteri dalam larutan sebesar 108 CFU/mL.

Ditambahkan sebanyak 20 L suspensi bakteri ke dalam tabung yang telah berisi minyak atsiri uji.

Ditambahkan media Mueller-Hinton cair hingga 2mL (kadar akhir mikroba uji setara dengan 106 CFU/mL).

Digunakan 4 buah kontrol :a. Kontrol negatif; berupa 20 L suspensi bakteri dalam tabung yang ditambah dengan media MH hingga volume mencapai 2 mLb. Kontrol antibiotik; yaitu 20 L suspensi bakteri dan ditambah tetrasiklin 200 L dan MH hingga 2 mL.c. Kontrol media (MH 2 mL)d. Kontrol pelarut; terdiri dari 20 L suspensi bakteri 1,8 mL MH ditambah 0,2 mL DMSO serta 20 L suspensi bakteri.Diinkubasi seluruh tabung selama 18-24 jam pada suhu 370 C.Diamati kejernihan/kekeruhan larutan dalam tabung yang telah diinkubasi.

V. HASIL PENGAMATANKontrol

Inkubasi

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus

VI. PEMBAHASANPraktikum ini bertujuan agar dapat menentukan kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM) dari suatu sampel terhadap mikroba uji. KHM adalah konsentrasi terendah antibiotik yang masih poten menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Sedangkan KBM adalah konsentrasi terendah bahan antimikroba yang mematikan.Antibiotik sendiri merupakan substansi yang dihasilkan mikroba dalam jumlah kecil dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroba lain. Penentuan kadar antibiotik dalam suatu sampel sangat diperlukan, antara lain untuk memeriksa kadar antibiotik dalam suatu sediaan obat, kadar antibiotik dalam susu dan daging, serta penetapan kadar antibiotik yang dihasilkan dari proses fermentasi.Metode yang digunakan pada percobaan kali ini untuk uji aktivitas antimikroba adalah metode dilusi cair. Metode dilusi cair dapat menentukan KHM dan KBM dari kejernihan dan kekeruhan sampel yang dites.Langkah pertama yang dilakukan adalah membuat 6 seri pengenceran kelipatan dengan sampel minyak atsiri dan DMSO 10%. Pada praktikum ini digunakan 2 sampel minyak atsiri untuk 2 macam seri pengenceran yang berbeda. Dalam kerja praktikum ini, mulai dari preparasi dilakukan seluruhnya di dalam LAF, agar tidak terjadi kontaminan dan tetap steril. Kemudian disiapkan suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan Eschericia coli dalam larutan salin, dan ditambahkan sebanyak 20 L suspensi bakteri ke dalam tabung yang berisi minyak atsiri uji. Ditambah media Mueller-Hinton 2mL, sehingga kadar akhir mikroba uji setara dengan 106 CFU/mL. Langkah terakhir seluruh tabung diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 370C. Dalam suhu 370C mikroba dapat bertumbuh baik, tetapi hambatan antibiotik akan sangat mempengaruhi perkembangan mikroba. Sehingga akan diperoleh nilai KHMnya ditandai dengan kejernihan larutan yang menandakan bahwa mikroba tidak dapat berkembang pada kadar antibiotik tersebut.Kontrol digunakan sebagai pembanding hasil praktikum yang kita lakukan. Kontrol yang digunakan ada 4 buah kontrol : Kontrol negatif berupa 20 L suspensi bakteri dalam tabung yang ditambah dengan media MH hingga volume mencapai 2 mL; Kontrol antibiotik yaitu 20 L suspensi bakteri dan ditambah tetrasiklin 200 L dan MH hingga 2 mL; Kontrol media (MH 2 mL); Kontrol pelarut terdiri dari 20 L suspensi bakteri 1,8 mL MH ditambah 0,2 mL DMSO serta 20 L suspensi bakteri.Dari hasil pengamatan didapat kekeruhan bakteri Staphylococcus aureus paling sedikit dimulai dari kadar 2% dan paling keruh adalah kadar 0,06% sama pada kontrol (-). Sehingga didapat KHMnya pada kadar 2%.Setelah selesai, sampel dalam tabung digoreskan dalam media TSA dan diinkubasi kembali selama 18-24 jam pada suhu 370 C. Lalu diamati ada/tidaknya koloni bakteri yang tumbuh di media.Pada media TSA dengan sampel uji Staphylococcus aureus dengan kadar 0,25%, 0,12%, dan 0,06% ditemukan adanya koloni bakteri yang tumbuh. Namun pada kadar 0,5% tidak ditemukan bakteri yang tumbuh. Maka KBM nya ada pada kadar 0,5%. Hasil yang diperoleh tidak sesuai teori, dimana KBM akan didapat pada kadar sampel minimum. Pada beberapa bagian tidak terlihat koloni bakteri yang jelas, disebabkan oleh kontaminan dan kurang steril LAF yang digunakan. Pada waktu praktikum digunakan LAF yang lama.VII. KESIMPULAN1. Metode dilusi cair digunakan untuk mengukur kadar hambat minimum dan kadar bunuh minimum mikroba (uji aktivitas mikroba).2. KHM bakteri Staphylococcus aureus inkubasi I terdapat pada kadar 2%3. KBM bakteri Staphylococcus aureus inkubasi II terdapat pada kadar 0,5%VIII. DAFTAR PUSTAKADwidjoseputro, D., Prof., Dr., 1987, Dasar-dasar Mikrobiologi, Jakarta, DjambatanFramesti, 2010, Dasar-dasar Mikrobiologi, Jakarta, Jantaran Pratiwi, S, 2008, Mikrobiologi Farmasi, Jakarta, ErlanggaVolk, W. A, dan Wheeler, M. F, 1993, Mikrobiologi Dasar Jilid I Ed. Kelima, Jakarta, Erlangga

Yogyakarta, 26 Mei 2014Praktikan,ttd.Annisa MaulinaFA/09664Nathaniel AndikaFA/09665Kusumaningtyas DwiFA/09666Wenny WidyastutiFA/09667