TEKNIK ISOLASI

Hal-hal yang perlu dipersiapkan dan diperhatikan dalam isolasi 1. Isolasi harus dilakukan di dalam ruang isolasi (kotak isolasi atau laminair flow)

yang berada dalam ruangan tersendiri yang bersih. 2. Tidak boleh terlalu banyak orang yang masuk dalam ruangan isolasi untuk

menghindari kemungkinan kontaminasi. 3. Selalu menggunakan alat-alat gelas atau plastik yang telah disterilisasi, seperti

cawan petri, tabung reaksi, pipet. Steriliasi dapat dilakukan dengan panas kering (150 160 C selama 1 jam), atau dengan autoklaf, atau dengan mencelupkan peralatan tersebut dalam larutan formalin 5 % atau alkohol 95 %.

4. Meja tempat bekerja, laminair flow atau kotak isolasi dilap dengan larutan Clorox (bahan pemutih) 10 % atau alkohol 70 %.

5. Sebelum bekerja cuci tangan anda sampai bersih dan disinfeksi dengan alkohol 70%.

6. Alat-alat yang digunakan, seperti pisau skalpel, jarum ose, pinset dicelupkan ke dalam alkohol 70 % dan dibakar, kemudian ditunggu sampai dingin sebelum dipakai.

7. Siapkan larutan untuk disinfeksi permukaan jaringan tanaman atau patogen. Larutan yang biasa digunakan adalah 0.525 % larutan sodium hipoklorit (1 bagian bahan pemutih/Clorox dalam 9 bagian air steril) atau etil alkohol 95 % (biasa digunakan untuk mencelup material yang akan diisolasi selama 3 detik).

8. Siapkan media untuk membiakkan cendawan atau bakteri yang sudah disterilkan ke dalam cawan petri steril secara aseptik.

9. Kadang-kadang dalam isolasi cendawan tertentu (terutama klas Deuteromycetes), untuk menghindari kontaminasi oleh bakteri, media perlu ditambah dengan 1 atau 2 tetes asam laktat 25 % atau 50 %.

A. PENANAMAN SKLEROTIA Bahan: Sklerotia Sclerotium rolfsii, media PDA, larutan sodium hipoklorit 0.525%, alkohol 95 %, air steril Alat : Cawan petri steril, scalpel atau cutter, pinset Cara kerja : 1. Tuangkan media Potato Dextrose Agar (PDA) ke dalam cawan petri steril secara

aspetik. 2. Tuangkan larutan sodium hipoklorit 0.525 % ke dalam cawan petri steril (bagian

bawah). 3. Pilih beberapa (empat) sklerotia (jika berasal dari lapang/tanaman cuci terlebih

dahulu dengan air kran). Dengan menggunakan pinset celupkan satu persatu sklerotia tersebut ke dalam alkohol 95 % selama 3 detik dan kemudian dimasukkan ke dalam disinfektan (larutan sodium hipoklorit) selama 5, 10, 15 dan 20 menit.

4. Pindahkan sklerotia pada petri steril (penutup).

5. Dengan menggunakan pinset yang steril tanam potongan sklerotia tersebut secara beraturan pada cawan petri yang telah berisi PDA. Masing-masing petri berisi 4 potongan yang diletakkan sejauh 2 cm dari pinggiran cawan petri.

6. Perhatikan pertumbuhan cendawan tersebut pada setiap perlakuan lama pencelupan di dalam larutan sodium hipoklorit.

B. ISOLASI DENGAN PENGUMPANAN

Bahan : tanah dari (lapang) pertanaman, benih caisin, tomat dan ketimun; media PDA, asam laktat 50 %, air steril. Alat : Pot 3 buah, baki plastik 3 buah, skalpel atau cutter, pinset Cara kerja: 1. Siapkan 3 buah pot/wadah yang telah diisi dengan tanah (diisi kira-kira

volume), kemudian siram dengan air sampai kapasitas lapang (kira-kira sampai air menetes pada dasar pot).

2. Tanam beberapa benih ketimun, caisin, dan tomat secara terpisah pada pot tersebut. Letakkan pot pada baki yang diisi air untuk menjaga keadaan air tanah.

3. Amati jumlah rebah kecambah dari masing-masing benih, sampai kecambah membentuk 2 atau lebih daun sejati.

4. Ambil kecambah yang sakit (rebah) dari pot. 5. Cuci dengan air kran sampai tanah yang menempel hilang. 6. Bilas dengan steril pada petri yang disterilkan beberapa kali. Setiap kali

pembilasan dilakukan pada petri yang berbeda. 7. Tuangkan media PDA ke dalam cawan petri yang telah ditetesi dengan 1 tetes

asam laktat 50 %. 8. Potong-potong kecambah yang sakit dengan pisau (skalpel/cutter) yang telah

dipanaskan. Dengan menggunakan pinset yang telah dipanaskan, kemudian tanam potngan jaringan tanaman tersebut pada media PDA yang telah diberi 1 tetes asam laktat 50 %. Setiap cawan ditanam dengan 5 potongan jaringan.

9. Jika muncul pertumbuhan miselia, potong pada koloni yang paling pinggir, kemudian pindahkan pada media PDA segar dalam cawan petri, inkubasikan selama 5 hari.

10. Simpan koloni yang muncul ke dalam PDA miring.

C. ISOLASI DENGAN PENANAMAN JARINGAN SAKIT Bahan : Media PDA, media agar air + 1 % glukosa, sodium hipoklorit 0.525 %, alkohol 95 %, asam laktat 50 %, daun mengkudu yang menunjukkan gejala bercak daun, buah cabai atau apel yang menunjukkan gejala antraknosa, tanaman kacang panjang dengan gejala layu, air steril, kertas tissue steril. Alat : Cawan petri steril, skalpel/cutter, pinset Cara kerja C.1. Bercak daun pada mengkudu

1. Potong jaringan tanaman di antara yang sakit dan sehat dengan ukuran kira-kira 4 x 4 mm (Gambar 1), dan celupkan dalam larutan sodium hipoklorit 0.525 % selama 30 detik, 60 detik, 90 detik dan 2 menit.

Gambar 1. Cara memotong jaringan tanaman sakit 2. Dengan menggunakan pinset yang sudah dipanaskan, pindahkan potongan-

potongan tersebut di antara dua lembar kertas tissue steril sampai kelebihan larutan sodium hipoklorit terserap.

3. Letakkan keempat potongan jaringan tanaman dengan lama pencelupan yang berbeda ke dalam satu cawan petri yang telah berisi media PDA yang telah diberi 1 tetes asam laktat 25% (Gambar 2)

30" 60" 90" 2' Gambar 2. Cara meletakkan potongan jaringan tanaman pada media 4. Setelah kurang lebih 2 hari, amati ada tidaknya pertumbuhan miselia, jika ada

pindahkan ke media PDA segar dengan cara memotong bagian koloni paling ujung.

5. Simpan ke dalam PDA miring C.2. Antraknosa pada apel atau cabai 1. Siapkan buah apel atau cabai yang menunjukkan gejala antraknosa. Khusus untuk

apel, jika tidak diperoleh buah yang menunjukkan gejala, buah yang masih terlihat sehat terlebih dahulu disimpan pada suhu kamar untuk beberapa hari. Jika sudah menunjukkan gejala bercak kecoklatan, buah tersebut sudah siap untuk digunakan.

2. Usap seluruh permukaan buah dengan kapas atau kertas tisu yang sudah dibasahi dengan alkohol 70 % hingga merata, kemudian potong jaringan tanaman seperti pada petunjuk c.1.1. dengan ketebalan kurang lebih 2 mm.

3. Langkah selanjutnya seperti pada petunjuk c.1.

C.3. Layu pada kacang panjang 1. Siapkan tanaman kacang panjang yang menunjukkan gejala kelayuan. Jika

mengambil langsung dari lapang, cabut tanaman yang bergejala tersebut bersama akarnya, kemudian potong batang sekitar 15 cm di atas permukaan tanah. Untuk memperoleh hasil yang baik, pilih tanaman bergejala yang bagian pangkal batang dan akarnya belum hancur.

2. Bersihkan tanah yang menempel pada perakaran dengan air keran yang mengalir. 3. Bersihkan akar-akar cabang dengan menggunakan gunting atau pisau dan sisakan

akar utama saja. 4. Dengan menggunakan kapas atau kertas tisu yang telah dicelupkan dengan

alkohol 70 % usap seluruh permukaan jaringan tanaman. 5. Potong-potong jaringan tanaman tersebut setebal 1 2 mm dengan menggunakan

pisau yang telah didisinfeksi dengan alkohol 70 %. 6. Celupkan potongan tersebut ke dalam larutan sodium hipoklorit 0.525 % selama

30 detik, 60 detik, 90 detik dan 2 menit. 7. Dengan menggunakan pinset yang sudah dipanaskan, pindahkan potongan-

potongan tersebut di antara dua lembar kertas tisu steril sampai kelebihan larutan sodium hipoklorit terserap.

8. Letakkan keempat potongan jaringan tanaman dengan lama pencelupan yang berbeda ke dalam satu cawan petri yang telah berisi media PDA yang telah diberi 1 tetes asam laktat 25% (Gambar 3)

30" 60 "

90" 2 ' Gambar 3. Letak potongan jaringan tanaman kacang panjang 9. Setelah kurang lebih 2 hari, amati ada tidaknya pertumbuhan miselia, jika ada

pindahkan ke media PDA segar dengan cara memotong bagian koloni paling ujung.

10. Simpan ke dalam PDA miring

D. ISOLASI BAKTERI Bahan : Daun padi atau singkong yang menunjukkan gejala hawar daun, daun kubis dengan gejala busuk lunak, tanaman tomat atau kacang tanah terserang layu bakteri, media Tetrazolium Chloride Agar (TZC), media Nutrient Agar (NA), air steril dalam tabung reaksi, alkohol 70 %, kertas tissue. Alat : Cutter/skalpel, cawan petri, tabung reaksi, jarum ose, gelas objek Cara kerja d.1. Layu pada kacang tanah atau tomat

1. Bersihkan tanah yang melekat pada akar tanaman tomat/kacang tanah yang menunjukkan gejala layu bakteri dengan air keran.

2. Potong semua akar lateral, sehingga hanya tertinggal akar utama, kemudian lap permukaan akar utama (kira-kira 2 cm di bawah batang) dan batang diatasnya sepanjang kira-kira 4 cm dengan menggunakan kapas/kertas tissue yag telah dibasahi dengan alkohol 70 %.

3. Siapkan cawan petri dan gelas objek yang telah dibersihkan dengan dengan alkohol 70 %.

4. Letakkan beberapa lembar kertas tissue yang telah dibasahi dengan air di dalam cawan petri, kemudian letakkan gelas objek di atasnya.

5. Potong-potong sepanjang 2 cm batang dan sebagian akar yang telah dibersihkan permukaannya dengan alkohol 70 %. Pemotongan dilakukan menyudut ( Gambar 3)

Gambar 3. Bentuk potongan batang dan akar 6. Letakkan potongan tersebut di atas gelas obyek dalam cawan petri yang telah

disiapkan dan biarkan selama 24 jam sampai muncul eksudat bakteri berwarna putih keruh di permukaan potongan.

7. Dengan menggunakan jarum ose yang telah dipanaskan terlebih dahulu, ambil eksudat bakteri yang muncul dan goreskan pada cawan petri yang berisi media TZC (Gambar 4).

Gambar 4. Bentuk goresan pada cawan petri (pada ujung goresan diperoleh koloni tunggal )

8. Pindahkan koloni tunggal berlendir yang berwarna merah muda di bagian

tengahnya dan dikelilingi warna putih kotor pada cawan petri yang berisi media NA dengan cara menggoreskan seperti pada nomor 7.

9. Pindahkan kembali koloni tunggal dalam media NA ke agar miring dan simpan untuk percobaan berikutnya.

Selain dengan cara di atas, isolasi bakteri layu dari tanaman tomat atau kacang tanah dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut:

1. Bersihkan tanah yang melekat pada akar tanaman tomat/kacang tanah yang

menunjukkan gejala layu bakteri dengan air keran. 2. Potong semua akar lateral, sehingga hanya tertinggal akar utama, kemudian lap

permukaan akar utama (kira-kira 2 cm di bawah batang) dan batang diatasnya

sepanjang kira-kira 4 cm dengan menggunakan kapas/kertas tissue yang telah dibasahi dengan alkohol 70 % dan biarkan mengering sampai sisa alkohol yang melekat di permukaan jaringan tanaman hilang.

3. Celupkan batang yang tersebut ke dalam tabung reaksi yang telah berisi air steril. Jika kelayuan tersebut disebabkan oleh bakteri akan keluar masa bakteri (oose) berwarna keruh dari permukaan potongan tanaman, kemudian angkat jaringan tanamannya (Gambar 5).

4. Ambil sedikit cairan dari tabung tersebut dengan menggunakan jarum ose yang telah dipanaskan sebelumnya, kemudian goreskan pada medium yang sama.

5. Langkah selanjutnya sama seperti tahap seperti di atas. d.2. Hawar daun pada singkong atau padi dan busuk lunak kubis 1. Siapkan daun singkong, padi atau kubis yang menunjukkan gejala penyakit seperti

yang disebutkan. 2. Usap kedua permukaannya dengan kapas atau kertas tisu yang telah dibasahi

dengan alkohol 70 %, dan biarkan menguap sisa-sisa alkohol yang menempel. 3. Potong potong jaringan daun dengan cara seperti pada Gambar 1. 4. Ambil potongan daun tersebut dengan menggunakan pinset yang telah

dipanaskan. 5. Celup potongan daun tersebut ke dalam tabung reaksi yang berisi air steril sampai

terlihat oose bakteri yang keluar dari jaringan (Gambar 5). 6. Ambil sedikit cairan dari tabung tersebut dengan menggunakan jarum ose yang

telah dipanaskan sebelumnya, kemudian goreskan pada medium nutrien agar (NA). Cara penggoresan seperti pada gambar 4.

7. Pindahkan koloni tunggal berlendir yang berwarna kuning (untuk hawar daun singkong atau padi) atau putih kotor (untuk busuk lunak daun kubis) dengan cara penggoresan pada cawan petri berisi medium NA.

8. Pindahkan kembali koloni tunggal dalam media NA ke agar miring dan simpan untuk percobaan berikutnya.

Gambar 5. Cara isolasi bakteri patogen tanaman

Usap permukaan jaringan dengan alkohol 70%

kocok