PP Seminar Tugas Akhir.pptx

SUBKLONING FRAGMEN p25-M2e dan Fragmen TT-M2e MENGGUNAKAN VEKTOR

pJET 1.2 DALAM E. coli TOP10F’

TUTU TAUPANIYA140210060072

CINTHA AYU LESTARI140210060024

SEMINAR TUGAS AKHIR

Tutu Taupaniya : latar belakang Identifikasi masalah Maksud dan tujuan

penelitian Kegunaan

penelitian Metodologi

penelitian Waktu dan tempat

penelitian Influenza A Vaksin Protein M2 Epitop M2e T helper cell Epitop TT Prosedur desain

primer TT-M2e Hasil dan

pembahasan TT-M2e

Kesimpulan dan saran TT-M2e

Cintha Ayu Lestari : Peptida Th p25 Urutan protein fusi CDV Urutan peptida Th CDV-F Adjuvant Mekanisme kerja adjuvant vektor pJET1.2 Keunggulan vektor pJET1.2 Kloning Peta vektor pTYB21 Prosedur penelitian p25-M2e dan TT-M2e Hasil dan pembahasan p25-M2e Kesimpulan dan saran p25-M2e

METODOLOGI PENELITIAN SECARA KESELURUHAN

1. Sintesis nukleotida pengode epitop P25-M2e dan pengode epitop TT-M2e

2. Amplifikasi dengan metode PCR dan sub-kloning menggunakan vektor pGEM-T dalam E. coli Top 10‘

3. Ligasi urutan nukleotida pengode epitop P25-M2e dan epitop TT-M2e ke vektor pTYB21

4. Kloning urutan nukleotida pengode epitop P25-M2e dan epitop TT-M2e dalam E. coli ER 2566

5. Karakterisasi

LATAR BELAKANG

Penyakit yang mudah menyebar dan

mematikan

Menyebar ke Asia sejak tahun 2003

Influenza A

Vaksinasi

KOMPONEN VAKSIN BERBASIS PEPTIDA

PEPTIDA TARGET (M2e)PEPTIDA TH (P25)

SLLTEVETPIRNEWGSRSSDSSDKLIPNASLIENCTKAEL K

PEPTIDA TH (TT)

QYIKANSKFIGITE

IDENTIFIKASI MASALAH

• Apakah peptida TT-M2e dan p25-M2e dapat disintesis dengan metoda PCR.

• Bagaimana hasil subkloning fragmen TT-M2e dan p25-M2e menggunakan vektor pJET-1.2 dalam bakteri E. coli TOP10F’.

MAKSUD DAN TUJUAN PENELITIAN• Maksud : mensintesis dan mengkloning

peptida TT-M2e dan p25-M2e dalam bakteri E. coli yang nantinya akan digunakan sebagai vaksin peptida untuk melawan virus influenza A.

• Tujuan : - Mendapatkan fragmen TT-M2e dan p25-M2e dengan metoda PCR.

- Mendapatkan transforman E. coli yang membawa plasmid pJET-1.2-TT-M2e dan plasmid pJET-1.2-p25-M2e.

KEGUNAAN PENELITIAN

Ekpresi vaksin peptida TT-M2e dan p25-M2e pada sistem ekpresi E. coli. Adanya

produksi vaksin tersebut diharapkan dapat diperoleh jenis vaksin berbasis peptida yang bersifat self adjuvant.

METODOLOGI PENELITIAN

• Desain primer oligonukleotida pengode peptida p25-M2e dan TT-M2e.

• Amplifikasi primer oligonukleotida p25-M2e dan TT-M2e dengan metode PCR.

• Ligasi urutan nukleotida P25-M2e dan TT-M2e dengan vektor pJET 1.2.

• Subkloning pJET 1.2-P25-M2e dan pJET1.2- TT-M2e dalam E. coli TOP10F‘.

• Isolasi pJET 1.2-p25-M2e dan pJET1.2- TT-M2e dan analisis hasil isolasi pJET 1.2-p25-M2e dan pJET1.2-TT-M2e.

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Singaperbangsa, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Padjadjaran, Bandung.

WAKTU DAN TEMPAT

Penelitian dimulai pada bulan Agustus 2010 sampai dengan selesai.

TINJAUAN PUSTAKA

INFLUENZA A• Influenza A : infeksi saluran pernafasan yang

disebabkan oleh virus influenza A.

(Tamam, 2009).

VAKSIN

Vaksin

Vaksin konvensional Vaksin sub unit

Vaksin sub unit non rekombinan

Vaksin sub unit rekombinan

Vaksin konvensional : vaksin yang terbuat dari mikroorganisme utuh yang dilemahkan.

Kelemahan vaksin konvensional :Mikroorganisme yang diinduksikan ke dalam tubuh memiliki kemungkinan untuk aktif kembali dan menginfeksi sel tubuh.

VAKSIN KONVENSIONAL

Vaksin subunit : vaksin yang terbuat dari bagian antigen ( bakteri atau virus ) yang bersifat virulent.

Contoh vaksin subunit: vaksin hepatitis B, influenza, rabies.

VAKSIN SUBUNIT

Pada tahun 2003-2004 dikembangkan vaksin

konvensional berbasis virus influenza A strain

A/Fujian/411/2002

Vaksin konvensional influenza A dikembangkan pada embrio

telur ayam dan kultur jaringan

Kelemahan vaksin konvensional influenza A : kurang aman untuk

digunakan karena virus yang telah dilemahkan dapat aktif kembali dan

menginfeksi tubuh, tidak bersifat universal, dan membutuhkan suplai

telur ayam dalam jumlah banyak sehingga kurang ekonomis.

Perlu dikembangkan vaksin subunit influenza A berbasis peptida M2e

Keunggulan Vaksin Berbasis Peptida

merupakan Vaksin hepatitis B

Vaksin berbasis peptida

Pemakaianya lebih aman dibanding vaksin konvensional

Tidak terdapat agen penginfeksi di produk akhir

Tidak menimbulkan penyakit

Rangkaian komponen vaksin berbasis peptida

Peptida TH K Peptida target

S

S

Adjuvant

1. Ion channel untuk keluar masuknya ion dari dalam dan luar virus

2. Pengontrol pH di dalam endosom

3. Pengatur lepasnya RNP ke dalam sitoplasma

M2 HemagglutininM2

Saluran masuknya proton

Menjaga pH tetap rendah selama

terjadi sintesis HA

Hemagglutinin M2e

N-terminal M2

Bersifat virulent

Terdiri dari 23 asam amino

M2 protein tetramerik tipe III

2 3 Asam amino pada ujung N

19 Asam amino hidrofobik

54 Asam amino pada ujung C

M2eM2e bagian N terminal protein M2 yang ditemukan pada permukaan ekstraselular virus influenzamerupakan epitop yang cocok digunakan sebagai bahan vaksin sub unit(Fiers et al ., 2004).

23 Asam amino pada ujung N

T helper cellsel T ini tidak memiliki aktifitas sitotoksik dan tidak membunuh

sel yang terinfeksi atau membersihkan patogen secara

langsung

mengontrol respon imun dengan mengarahkan sel lain untuk

membunuh sel yang terinfeksi

Memproduksi molekul protein sitokin, yaitu :• interleukin 2 (IL2)• interferon gamma

(IFN-γ)

berpengaruh besar pada CTL

cytotoxic lymphocytes

T helper cell

APC (Makrofag)

Antigen

Molekul MHC II

Fragmen antigen

Reseptor sel T

Sel Th Sel Tc

Interleukin 1 mengaktifkan sel Th

Interleukin 2 & sitokin mengaktifkan

sel Th, sel B

& sel Tc Sel B

Sistem imun

selular

Sistem

Imun

humoral

(Boursalian & Bottomly, 1999)

CONTOH EPITOP T-HELPER

1. Epitop T helper P25 (KLIPNASLIENCKAEL)

2. Epitop T helper Tetanus Toxoid (QYIKANSKFIGITE)

EPITOP TETANUS TOXOID

Clostridium tetani

tetanospasmin Tetanus toxoid

RACUN

Sifat racunnya lemah sehinggadapat digunakan sebagai bahan vaksin imunitas untuk melawan

penyakit tetanus

formaldehyde

• Keitel et al menyatakan bahwa :epitop TT dikenali oleh T helper dapat digabungkan dengan epitop target MSP-I19 sebagai kandidat vaksin malaria

Jurnal penelitian tentang vaksinasi malaria

(Keitel et al., 2000)

Tutu Taupaniya : latar belakang Identifikasi masalah Maksud dan tujuan

penelitian Kegunaan

penelitian Metodologi

penelitian Waktu dan tempat

penelitian Influenza A Vaksin Protein M2 Epitop M2e T helper cell Epitop TT Prosedur desain

primer TT-M2e Hasil dan

pembahasan TT-M2e

Kesimpulan dan saran TT-M2e

Cintha Ayu Lestari : Peptida Th p25 Urutan protein fusi CDV Urutan peptida Th CDV-F Adjuvant Mekanisme kerja adjuvant vektor pJET1.2 Keunggulan vektor pJET1.2 Kloning Peta vektor pTYB21 Prosedur penelitian p25-M2e dan TT-M2e Hasil dan pembahasan p25-M2e Kesimpulan dan saran p25-M2e

virus ke dalam genus morbillivirus dari famili

paramyxovirus.

Protein fusi dari morbillivirus berperan dalam penetrasi

virus dan interaksi sel dengan sel.

CDV memiliki dua selubung glikoprotein, protein

pengikatan (H) dan protein fusi (F).

(Ghosh et al., 2001)

Protein Fusi CDV

Peptida p25

Peptida p25

(Ghosh et al., 2001)

Peptida p25

Sekuens protein fusi Canine distemper virus

Peptida Urutan asam amino Peptida Urutan asam amino

P2

P4

P6

P8

P10

P24

P22

P23

P25

P27

P28

P29

P32

SSKTQTHTQQDRPPQPS

QPSTELEETRTSRARHS

RHSTTSAQRSTHYDPRT

PRTSDRPVSYTMNRTRS

TRSRKQTSHRLKNIPVH

SHQYLVIKLIPNASLIE

IGTDNVHYKIMTRPSHQ

YKIMTRPSHQYLVIKLI

KLIPNASLIENCTKAEL

AELGEYEKLLNSVLEPI

KLLNSVLEPINQALTLM

EPINQALTLMTKNVKPL

SGRRQRRFAGVVLAGV

P33

P34

P35

P36

P37

P38

P39

P47

P62

P68

P64

P74

P75

FAGVVLAGVALGVATAA

GVALGVATAAQITAGIA

TAAQITAGIALHQSNLN

GIALHQSNLNAQAIQSL

NLNAQAIQSLRTSLEQS

QSLRTSLEQSNKAIEEI

EQSNKAIEEIREATQET

TELLSIFGPSLRDPISA

PRYIATNGYLISNFDES

CIRGDTSSCARTLVSGT

DESSCVFVSESAICSQN

TSTIINQSPDKLLTFIA

SPDKLLTFIASDTCPLV

(Walker et al., 2007)

Titer antibodi

paling tinggi

sangat potensial dan efektif digunakan sebagai peptida Th untuk komponen

suatu vaksin berbasis peptida

Urutan peptida CDV-F sebagai peptida T-helper

Immunogenisitas Epitop (M2e) dapat meningkat jika dalam bentuk multimerik

Neirynck et al ., 1999 Peptida M2e dengan VLPs-HBV

Jegerlehner et al ., 2002 Peptida M2e dengan VLPs-HBV

Ionescu et al ., 2006 Peptida M2e dengan VLPs-HPV

Bessa et al ., 2008 Peptida M2e dengan phage Q-β

Huleatt et al ., 2008 Peptida M2e dengan flagellin

Denis et al ., 2008 Peptida M2e dengan PapMV-CP-VLPs

Dapat digabung dengan molekul lain (ex : adjuvant)

Adjuvant : zat kimia yang dapat meningkatkan respon kekebalan tubuh terhadap vaksin.

ADJUVANT

Peran adjuvant pada vaksin berbasis peptida :• Pembawa peptida target• Untuk merekatkan peptida • Sebagai “danger signal” yang akan

mengaktifkan sel dendrit sehingga terbentuk respon imun

MEKANISME KERJA ADJUVANT MPL

(Mygind et al., 1996).

VEKTOR pJET 1.2

lacZ Eco47IR

Bersifat lethal terhadap E. coli

Mempermudah seleksi E. coli pada

media seleksi

KEUNGGULAN VEKTOR pJET 1.2

• Pada daerah MCS terdapat ujung T sedangkan produk PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada umumnya mempunyai tambahan nukleotida A pada ujung 3’-nya sehingga pJET 1.2 mudah diligasi ke DNA sisipan.

• waktu yang dibutuhkan untuk ligasi vektor pJET 1.2 dengan produk PCR hanya 5 menit.

• Tidak diperlukan seleksi koloni biru-putih pada saat seleksi bakteri yang mengandung plasmid rekombinan.

• Mudah ditransformasikan ke E. coli karena pJET 1.2 berasal dari plasmid E. coli (pUC19).

KLONING• Kloning :proses perbanyakan sel secara in vivo yang akan menghasilkan sel baru

yang bersifat identik dengan sel awal.• Tahapan kloning :

Sel inangDNA sisipan

PROSEDUR PENELITIAN



Fragmen p25-M2e

Amplifikasi dengan metode PCR

Subkloning menggunakan vektor pJET 1.2

Kloning dan ekspresi menggunakan vektor pTYB21

Murnikan dengan sistem IMPACT

Gabungkan dengan adjuvant

Analisis kemanjuran vaksin

Fragmen p25-M2e hasil subkloning

Peptida p25-M2e

Vaksin berbasis p25-M2e

Nukleotida pengode p25-M2e dan TT-M2e

Desain primer oligonukleotidanyaTambahkan sisi restriksi NdeI dan EcoRI

Primer oligonukleotida p25-M2e dan TT-M2e

Amplifikasi dengan metode PCRFragmen DNA p25-M2e dan TT-

M2eKarakterisasi menggunakan elektroforesis gel agarosa

Ligasi dengan vektor pJET 1.2

Plasmid rekombinan pJET 1.2-p25-M2e dan pJET 1.2-TT-M2e

Kloning dalam E. coli TOP10F’Transforman pJET 1.2-p25-M2e

dan pJET 1.2-TT-M2eIsolasi dengan metode miniprep maniatisRestriksi dengan enzim NdeI dan EcoRI

Fragmen DNA p25-M2e dan TT-M2e

DESAIN PRIMER OLIGONUKLEOTIDA p25-M2e

KLIPNASLIENCTKAEL-K-SLLTEVETPIRNEWGSRSSDSSD

- Deduksi urutan nukleotidanya

- Tentukan codon preference yang cocok dengan E. coli TOP10F’

5’-GAGCTCAATGAAGCTTATCCCTAATGCTTCTCTTATCGAAAATTGTACGAAGGCAGAACTTAAGTCTCTTCTTACCGAAGTTGAG-3’

3’-AGAGAAGAATGGCTTCAACTCTGCGGATAGTCTTTACTTACCCCAACATCTACATTACTAAGAAGACTACTTAAGAGGAG-5’

Kloning pJET 1.2-p25-M2e dan pJET 1.2-TT-

M2e dalam E. coli TOP10F’

Pembuatan sel kompeten E. coli

TOP10F’

Tramsformasi plasmid ke dalam sel kompeten

PEMBUATAN SEL KOMPETEN E. coli TOP10F’E. coli TOP10F’

Tumbuhkan dalam LB cair selama 17 jamPipet sebanyak 250 μL ke dalam LB cair 20mL yang telah mengandung tetrasiklin

Inkubasi sampai OD600 0,2-0,4Masukan ke tabung eppendorf 1,5 mLSentrifugasi 5000 rpm T=4oC t=5 menit

Pelet sel E. coli TOP10F’

Resuspensi dengan 1 mL CaCl2 0,1 M dinginInkubasi dalam es selama 10 menitSentrifugasi 5000 rpm pada T=4oC t=10 menit

Pelet sel E. coli TOP10F’

Resuspensi dengan 100 μL CACl2 0,1 M dinginSimpan pada T=4oC selama 2-24 jam

Sel kompeten E. coli TOP10F’

TRANSFORMASI PLASMID REKOMBINAN KE DALAM E. coli TOP10F’

DNA hasil ligasi

Pipet ke dalam sel kompetenInkubasi 30 menit di dalam esHeat shock pada T=42oC selama 90 detikInkubasi di dalam es selama 2 menitInkubasi pada suhu ruang selama 2 menitTambahkan 900 μL LB cairInkubasi pada T=37oC t=2 jam dengan kecepatan pengocokan 150 rpm

Sentrifugasi 12000 rpm selama 30 detik

800μL supernatan

Supernatan + pelet

Resuspensi Tumbuhkan sebanyak 150 μL dalam LB padat +ampicillin +tetrasiklin

Transforman

PROSEDUR ISOLASI PLASMID DENGAN METODE MINIPREP

Transforman pJET 1.2-TT-M2e

Inkubasi dalam LB cair 5 mL pada T = 37oC selama 16-18 jamSentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 30 detik, buang supernatan

Ulangi sentrifugasi sampai pelet terkumpulTambahkan 500 μL buffer STE, vortexSentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 detik, buang supernatanTambahkan 300 μL larutan A, resuspensiTambahkan 150 μL larutan III, inversi, diamkan 3 menitSentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menitMasukan 400 μL supernatan ke tabung eppendorf baruTambahkan 100% etanol p.a 2 kali volume, vortex , diamkan 5 menitSentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menitCuci pelet dengan 1 mL etanol 70% p.a, vortexSentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 3 menit, buang supernatan

Telungkupkan tabung dalam concentratorTambahkan 50 μL ddH2OKarakterisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%Isolat pJET 1.2-TT-M2e

Transforman pJET 1.2-p25-M2e

Isolat pJET 1.2-p25-M2e

Prosedur Restriksi pJET1.2-TT-M2e dan pJET1.2-p25-M2e dengan Enzim EcoRI dan NdeI

Isolat pJET 1.2-TT-M2eIsolat pJET 1.2-p25-M2e

15 μL plasmid hasil isolasi ditambahkan buffer 10x enzim restriksi (buffer tango) sebanyak 6 μLditambahkan 0,5 μL enzim restriksi EcoRI0,5 μL enzim restriksi NdeI ddH2O sehingga volume total reaksi restrikasi adalah 30 μLdiinkubasi pada suhu 370C selama 3 jam

Isolat pJET 1.2-TT-M2e [EcoRI+NdeI]Isolat pJET 1.2-p25-M2e [EcoRI+NdeI]

HASIL DAN PEMBAHASAN



Zeng et al pada tahun 2005 meneliti bahwa p25 dapat dijadikan

sebagai peptida TH pada vaksin berbasis peptida

Dapat dikenali oleh CD4+

sel TH

Dapat berinteraksi dengan sel TH

KLIPNASLIENCTKAEL K SLLTEVETPIRNEWGSRSSDSSD

Kowalczyk et al meneliti bahwa urutan asam amino ke 2-9 tidak berubah pada setiap strain virus

influenza A (Kowalczyk et al , 2009).

Zou et al pada tahun 2004 asam amino EVETPIRN dapat merangsang respon imun yang spesifik terhadap M2e dalam jumlah yang tinggi (Zou

et al., 2004)


Tm=60oC

Peta Vektor pTYB21

Optimasi Ta p25-M2e1. Marker 1 kb2. Fragmen p25-M2e

Kondisi PCR :Denaturasi awal 94oC 30 detikDenaturasi 94oC 45 detikAnnealing 58oC 45 detikElongasi 72oC 30 detikTerminasi 72oC 5 meint


1. Marker 100 pb2. Fragmen p25-M2e

250pb

200pb

100pb

100pb

AMPLIFIKASI FRAGMEN DNA p25-M2e DENGAN METODE PCR

200pb ±140pb

1 2 1. Marker 100 pb2. Fragmen p25-M2e


SUBKLONING pJET 1.2-p25-M2e dalam E. coli TOP10F’

Koloni Tunggal Hasil Transformasi pJET 1.2-p25-M2e dalam E. coli TOP10F’.

Hasil replika transforman [pJET 1.2-p25-M2e]

Replika dilakukan untuk peremajaan bakteri dan seleksi transforman di

media seleksi yang baru.

Tidak digunakan seleksi koloni biru-putih karna pJET 1.2 tidak memiliki gen lacZ

dan telah mengandung gen Eco47IR yang bersifat lethal

bagi E. coli

Pada E. coli yang mengandung pJET

1.2-p25-M2e terjadi metilasi kognitif yang dapat menginaktifasi

Eco47IR

Hanya E. coli yang mengandung

plasmid rekombinan yang dapat hidup

pada media seleksi.

ISOLASI PLASMID pJET 1.2-p25-M2e DENGAN METODE MINIPREP MANIATIS

1 2 3 4 5 6 7 8

1. pJET 1.2-p25-M2e k.412. pJET 1.2-p25-M2e k.343. pJET 1.2-p25-M2e k.254. pJET 1.2-p25-M2e k.155. pJET 1.2-p25-M2e k.146. pJET 1.2-p25-M2e k.97-8. pJET 1.2-p25-M2e k.8

pJET 1.2-p25-M2e k.8 kemudian direstriksi . K.8

dipiliha karena menghasilkan pita DNA

yang paling jelas di antara koloni lainya

ANALISIS RESTRIKSI PLASMID pJET .12-p25-M2e

Hasil restriksi plasmid pJET 1.2-p25-M2e dengan enzim restriksi EcoRI dan NdeI belum terbukti hasilnya karena setelah dilakukan

karakterisasi dalam gel agarose 1,5%, tidak diperoleh pita-pita plasmid rekombinan yang terpotong, dikarenakan kemungkinan isolat plasmid pJET-1.2-p25-M2e disimpan terlalu lama, sehingga

fragmen p25-M2e mengalami degradasi.

KESIMPULAN DAN SARAN


• KESIMPULAN1. Fragmen p25-M2e berhasil disintesis dengan metode

PCR.2.Fragmen p25-M2e berhasil disubkloning menggunakan

vektor pJET 1.2 dalam E. coli TOP10F’ dengan diperolehnya plasmid rekombinan pJET 1.2-p25-M2e.

• SARAN1. Perlu dilakukan analisis restriksi pJET 1.2-p25-M2e untuk

memastikan apakah E. coli TOP10F’ benar-benar telah mengandung plasmid rekombinan pJET 1.2-p25-M2e.

2. Perlu dilakukan analisis DNA sequencing untuk mengetahui kostruksi plasmid rekombinan pJET 1.2-p25-M2e.

DESAIN PRIMER OLIGONUKLEOTIDA

Asam amino penyusun TT-M2e

Tentukan urutanya melalui studi literatur

Deduksi nukleotidaTT-M2e

Tentukan codon preference yang cocok dengan E. coli TOP10F’

Desain primer oligonukleotida TT-M2e yang disesuaikan dengan codon preference

Primer oligonukleotida TT-M2e

DESAIN PRIMER OLIGONUKLEOTIDA TT-M2e

TPIRNEWGSRSSDSSD

- Deduksi urutan nukleotidanya

- Tentukan codon preference yang cocok dengan E. coli TOP10F’

QYIKANSKFIGITE-K-SLLTEVE

5’GAGGACATATGGGATATATCAAGACTAATTCTAAATTCATCGGAATCACCGAACTTAAGTCTCTTCTTACCGAAGTT-3’

3’AGAGAAGAATGGCTTCAACTCTGCGGATAGTCTTTACTTACCCCAACATCTACATTACTAAGAAGACTAGAGGAGAATTC-5’

NdeIEcoRI

HASIL DAN PEMBAHASAN


Primer forward

Primer reverse

PCR tanpa template

Urutan nukleotida dan asam amino N-terminal peptida

Tetanus toxoid

5’-GAA UAU AUU AAG GCG GAU AGC AAG UUU AUU GGC AUU ACC GAA AAG AGC CUG CUG AAC GAA GUG 3’

Q Y I K A N S K F I G I T E K S L L T E V

Urutan nukleotida dan asam amino N-Terminal peptida

M2e

5’-AAG AGC CUG CUG AAC GAA GUG GAA ACC CCG AUU CGU GAU GAA UGG GGC UGC GAU GAU AGC AGC 3’

K S L L T E V E T P I R N E W G C N D S S

Urutan nukleotida TT-M2e yang disesuaikan dengan codon preference

E. coli

Tabel 1 Urutan asam amino dan nukleotida TT-M2e

Desain Primer Oligonukleotida TT-M2e

Gambar 1 Desain urutan asam amino dan nukleotida TT-M2e dengan penambahan sisi restriksi EcoRI dan NdeI

Tm= 620C

Gambar 2 Amplifikasi TT-M2e dengan T annealing 550C. Lajur 1 marker DNA 100 pb, lajur 2 amplikon TT-M2e 141 pb

200 pb

100 pb

141 pbPita hasil PCR TT-M2e berada di antara 100 pb dan 200 bp, sehingga dapat diduga bahwa pita lajur 2 pada gel agarosa merupakan pita nukleotida hasil PCR TT-M2e yang berukuran 141 pb.

Amplifikasi Fragmen DNA TT-M2e dengan PCR


Gambar 3 Transforman E. coli [pJET 1.2-TT-M2e] cawan 1 (atas) dan cawan 2 (bawah).

Transformasi E. coli TOP10F’ [pJET 1.2-TT-M2e]

52 koloni tunggal

52 koloni tunggal

Hanya E. coli yang mengandung plasmid

rekombinan yang dapat hidup pada media seleksi.

Replika

Replikasi E. coli TOP10F’ [pJET 1.2-TT-M2e]

Gambar 4 Replikasi E. coli [pJET1.2-TT-M2e]. Replikon cawan 1 (kanan) replikon cawan 2 (kiri)

Setiap transforman E. coli [pJET 1.2-TT-M2e] yang didapat, berada dalam bentuk yang seragam yaitu koloni putih, sehingga untuk mengetahui apakah

transforman E. coli TOP10F’ telah mengandung plasmid pJET 1.2-TT-M2e maka dilakukan isolasi plasmid pJET 1.2-TT-M2e dengan metode miniprep.

Mempertahankan hidup bakterimeremajakan bakteri

Isolasi Plasmid pJET-1.2-TT-M2e dengan Metode Miniprep (Sambrook et al., 1989)

Gambar 5 Isolasi plasmid pJET1.2-TT-M2e cawan 1.

1 2 3 4 5 6 7 8

Lajur 1 marker DNA 1 KbLajur 2 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 14Lajur 3 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 16Lajur 4 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 18Lajur 5 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 22Lajur 6 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 30Lajur 7 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 32Lajur 8 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 45

transforman E. coli [pJET 1.2-TT-M2e] yang mengandung plasmid rekombinan posisi pita berada di atas pita yang tidak mengandung plasmid rekombinan. Namun dikarenakan fragmen TT-M2e hanya mengandung 141 pb, sehingga sulit dibedakan koloni mana yang mengandung plasmid rekombinan dan koloni mana yang tidak mengandung plasmid rekombinan.

1 2

Gambar 6 Isolasi plasmid pJET1.2-TT-M2e cawan 2.

Lajur 1 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 1Lajur 2 plasmid pJET1.2-TT-M2e koloni 26

pJET 1.2-TT-M2e koloni 26 menghasilkan pita DNA yang paling jelas di antara koloni

lainya sehingga pada pJET 1.2-TT-M2e koloni 26 dilakukan

analisis restriksi.

ANALISIS RESTRIKSI PLASMID pJET1.2-TT-M2e

Hasil restriksi plasmid pJET-TT-M2e koloni 26 dengan enzim restriksi EcoRI dan NdeI belum terbukti hasilnya karena setelah dilakukan karakterisasi dalam gel agarose 1,5%, tidak diperoleh

pita-pita plasmid rekombinan yang terpotong, dikarenakan kemungkinan isolat plasmid pJET-1.2-TT-M2e disimpan terlalu

lama, sehingga fragmen TT-M2e mengalami degradasi.

KESIMPULAN DAN SARAN


• KESIMPULAN1. Fragmen TT-M2e berhasil disintesis dengan metode PCR.2.Fragmen TT-M2e berhasil disubkloning menggunakan

vektor pJET 1.2 dalam E. coli TOP10F’ dengan diperolehnya plasmid rekombinan pJET 1.2-TT-M2e.

• SARAN1. Perlu dilakukan analisis restriksi pJET 1.2-TT-M2e untuk

memastikan apakah E. coli TOP10F’ benar-benar telah mengandung plasmid rekombinan pJET 1.2-TT-M2e.

2. Perlu dilakukan analisis DNA sequencing untuk mengetahui kostruksi plasmid rekombinan pJET 1.2-TT-M2e.

Sekian dan Terima Kasih

1 2 31 2 3

100 pb

141 pb

200 pb

Chart Title

Series1 Series2

Lajur pita fragmen

SISTEM IMPACT

( Chong et al., 1998; Dubendorff & Studier, 1991 ).

Vaksin Toxoid tetanus

Toksik yang terinaktivasi

Induksi humoral immunity Antibodi

Bukan vaksin hidup

Imunitas tubuh menurun perlu booster Meningkatkan

imunitas

Virus Influenza Virus RNA Rentan mutasi

genom

Tidak ada proof reading oleh RNA

Polymerase

antigenic shift & antigenic drift.

Fragmen p25-M2e

Amplifikasi dengan metode PCR

Subkloning menggunakan vektor pJET 1.2

Kloning dan ekspresi menggunakan vektor pTYB21

Murnikan dengan sistem IMPACT

Gabungkan dengan adjuvant

Analisis kemanjuran vaksin

Fragmen p25-M2e hasil subkloning

Peptida p25-M2e

Vaksin berbasis p25-M2e

Run amplikon tgl 18 Jan’11 T annealing 550C1. Marker 1 Kb2. p25-M2e3. TT-m2e

18 Januari 2011, PCR TT-M2e

Run amplikon tgl 20 Jan’11T annealing 580 C1. Marker 1 Kb2. p25-M2e3. TT-m2e

20 Januari 2011, PCR TT-M2e

PP Seminar Tugas Akhir.pptx

Documents

Transcript of PP Seminar Tugas Akhir.pptx