Istilah-istilah yang umum digunakan dalam kultur jaringan adalah:

Bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan untuk inisiasi suatu kultur disebut eksplan.

Pemindahan kultur ke media lain baik media yang sama ataupun yang lain disebut subkultur.

Setiap masa inkubasi disebut passage. Passage pertama adalah subkultur pertama dari jaringan yang terbentuk dari eksplan awal.

Bahan yang diambil pada setiap subkultur disebut sebagai inokulum. Eksplan harus diusahakan supaya dalam keadaan aseptic melalui prosedur sterilisasi dengan berbagai bahan kimia. Dari eksplan yang aseptic kemudian diperoleh kultur yang asenik yaitu kultur dengan hanya satu macam organisme yang diinginkan.

Eksplan yang ditanam pada media tumbuh yang tepat dapat beregenerasi melalui proses yang disebut

organogenesis atau embriogenesis. Organogenesis artinya proses terbentuknya organ-organ seperti pucuk dan

akar. Pucuk yang terbentuk pada tempat yang bukan berasal dari jaringan asal yang biasa, disebut pucuk adventif. Contohnya, pucuk yang terbentuk dari kalus, pucuk yang terbentuk dari hipokoyil, dari kotiledon atau akar.

Embriogenesis adalah proses terbentuknya embrio somatic. Embrio somatic adalah embrio yang bukan berasal dari zigot, tetapi dari sel biasa dari tubuh tanaman. Bila embrio terbentuk langsung dari anther atau mikrospora, prosesnya disebut androgenesis. Proses pembentukan embrio dari ovari yang belummengalami fertilisasi, disebut gynogenesis.

Tanaman lengkap hasil regenerasi dalam kultur jaringan disebut plantlet. Plantlet sebelum dipindah ke lapangan dan diperlakukan sebagai bibit harus mengalami masa adaptasi dari kultur heterotropik menjadi autotropik. Masa adaptasi plantlet disebut aklimatisasi.

Pucuk-pucuk yang terbentuk dari jaringan kalus terutama yang sudah mengalami subkultur dapat bervariasi. Variasi ini disebut variasi somaklonal. Penyebabnya belum diketahui secara pasti, ada kemungkinan variasi ini sudah ada dalam eksplan asal karena kromosom mosaik dalam sel-sel somatic; tau terjadi akibat lingkungan dalam kultur. Salah satu variasi yang terjadi adalah aneuploid: jumlah kromosom 2n-1 atau 2n+1.

Media kultur jaringan tanaman Apa perlunya?

Apa yang dilakukan oleh tanaman pada KJT? Sel-sel tanaman – Dediferensiasi Pembelahan sel tanaman – Sel-sel

tanaman adalah diploid Mitosis – kromosom menduplikasikan

diri dan membentuk klon Meiosis – Proses pembentukan sel

sex, 2n memisahkan diri dan menjadi gamet 1n

MEDIUM KULTUR

Keberhasilan dalam teknologi serta penggunaan metode in vitro terutama disebabkan pengetahuan tentang kebutuhan hara sel dan jaringan.

komponen utama penyusun media kultur. Garam mineral Hara

Makro: C,H,O, N,S,P,K,Ca,Mg & mikro :Fe,Mn,B,Zn, Cu,Mo,Cl dan Co.

Sumber karbon: glukosa 2-4% dan sukrosa (terbaik)

Vitamin : Tiamin, piridoksin,as.nikotinat dan mio-inositol.

Pengatur tumbuh: untuk menginduksi pembelahan sel Auksin : IAA,NAA & 2,4-Diklrofenoksi- asetat(2,4-D). Sitokinin : kinetin, benziladenin(BA), 6-benzilaminopurin (BAP).

Pelengkap organik: dapat merangsang laju pertumbuhan sel.

GARAM-GARAM MINERAL Unsur hara makro & mikro diberikan dalam

bentuk Garam anorganik pada media. Larutan garam makro konsentrasi rendah

lebih baik drpd media dengan konsentrasi tinggi.

Perbaikan pada penambahan garam mineral NO3 & K Menunjang pertumbuhan kalus,pertumbuhan pucuk dan embriogenesis pada banyak tanaman.

SUMBER KARBON Sukrosa dalam media dihidrolisa jadi

monosakarida selama masa kultur. Dalam kultr kalus dan puck 2-4 %

optimum, sdgkan kultur embrio dapat mencapai 12%

Selain sumber energi, gula berfungsi sebagai tekanan osmotik dalam media

VITAMIN Thiamine(B1) yang paling sering dan

penting digunakan. Piridoksin ( B 6 ) , as.nikotianat untuk kultur akar.

Mio-inositol (vit.tanaman) untuk mem perbaiki pertumbuhan &morfogenesis

Vit.E juga dapat merangsang pembentukan kalus dalam kultur emb rio jagung.

ZAT PENGATUR TUMBUH AUKSIN dgunakan

untuk merangsang pertumbuhan kalus

Level dlm eksplan tergntung dr bgian dan jenis tanaman

Alamiah:indole acetic acid (IAA)

2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4D)

naphthaleneaceic acid (NAA)

Pengaruhnya terha dap pertumbuhan jaringan melalui 2 cara yi :

Menginduksi sekre si ion H keluar sel mellui dinding sel

Mempengaruhi metabolisme RNA yang berarti meta bolisme protein

ZAT PENGATUR TUMBUH SITOKININ turunan

adenin. Sangat penting dlm

pembelahan sel dan morfogenesis.

Kinetin diisolasi dr DNA ikan Herring yg diautoklaf dalm larutan asam oleh Prof.Skoog dr WI merangsang pembelahan sel & diffrensiasi sel.

Gliberilin kadang mem bantu morfogenesis

Sitokinin yg biasa digunakan : Kinetin, Zeatin, ZiP,BAP & BA (benzyladenine ).

-auxin - Roots -cytokinin - Shoots -gibberellin – Cell Enlargement -abscisic acid – Plant stress hormone -ethylene – BAD!

BAHAN PEMADAT MEDIA Paling banyak digunakan

adalah agar agar mengandung Ca,Mg,K dan Na.

Keuntungan pemakaian agar-agar :

1.membeku pd suhu 45 C dan cair pd suhu 100 C.

2.Tidak dicerna oleh enzim tanaman.

3.Tdk bereaksi dgn penyusun media yang lain.

Kons agar : 0,1-1,0%

Konsentrasi agar yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke arah eksplan shg pengambilannya kurang sedangkan zat pengham bat dari eksplan tetap berkumpul disekitar eksplan.

PELENGKAP ORGANIK Air kelapa dapat

digunakan untuk mempertahankan pertumbuhan.

Auksin tertentu & air kelapa dapat bersifat sinergis.

Kandungannya: as.amino, as.orgnk as.nukleat,purin, gula,gula alkohol dan zat pengatur tumbuhn

Zat pengatur tumbuh yi :Zeatin, N-N-Difenil urea & 9-ß-D ribo furanosil zeatin.

Casein Hidrolisat sbg as.amino yang murah

Digunakan dlm media yg tdk mengandung ion amonium

Digunakan 200mg/l dpt memperbaiki pertumbuhan kalus.

PELENGKAP ORGANIK Ekstrak Ragi

digunakan pd awal sejarah KJT oleh White dan Robbins

As.amino,peptida, vitamin untuk per tumbuhan kultur akar

Kons.0,5-2 g/l

Jus Tomat, ekstrak Pisang dan kentang merupakan sumber gula, vit dan zat pengatur tumbuh.

Penggunaannya dihindarkan karna tdk spesifik & hasil yg diperoleh kadng tidak dapat diulangi kembali

ARANG AKTIF Arang yang sudah

dipanaskan dengan uap atau udara panas, bersifat adsorp si sangat kuat.

Dapat ditambahkan kedalam media pd berbagai tahap perkembangan kul tur.

Dpt ditambahkan pd media inisiasi, m.regenerasi, dan m.perakaran.

Pengaruh arang aktif : 1.mengadsorpsi senyaw

toksik yg terdpt dlm media;Seny.Fenolik

2.mengadsopsi zat pengatur tumbuh shg mencegah pertumbhan liar & membantu embri ogenesis.

3.merangsang perakarn dgn mengurangi tingkt cahaya yg sampai ke bagian eksplan yg terdpt dalam media.

pH MEDIA Harus diatur agar

tdk mengganggu fngsi membran sel dan pH sitoplasma

Selain memperhati kan kepentingan fisiologi sel jugahrs memperhatikan:

1.Kelarutan dr garam garam penyusun

2.pengambilan dr zat pengatur tumbuh.

3. Efisiensi pembeku an agar.

Sel tanaman mem butuhkan pH yang sedikit asam 5,5 – 5,8.

Penambahan asam amino sbg buffer organik

BEBERAPA KOMPOSISI MEDIA

Components Murashige-

Skoog(1962)

White(1963

Gamborg(1968)

Nitsch(1951)

Heller(1953)

Schenk-Hildebrandt

(1972)

Nitsch -Nitsch(1967)

Kohlenbach -

Schmidt(1975)

Knop(1865)

(NH4)2SO4 - - 134 - - - - - -

MgSO4× 7H2O 370 720 500 250 250 400 125 185 250

Na2SO4 - 200 - - - - - - -

KC1 - 65 - 1,500 750 - - - -

CaC12× 2H2O 440 - 150 25 75 200 - 166 -

NaNO3 - - - - 600 - - - -

KNO3 1,900 80 3,000 2,000 - 2,500 125 950 250

Ca(NO3)2×

4H2O- 300 - - - - 500 - 1,000

NH4NO3 1,650 - - - - - - 720 -

NaH2PO4× H2O - 16.5 150 250 125 - - - -

NH4H2PO4 - - - - - 300 - - -

KH2PO4 170 - - - _ - 125 68 250

FeSO4× 7H2) 27.8 - 27.8 - - 15 27.85 27.85 -

Na2EDTA 37.3 - 37.3 - - 20 37.25 37.25 -

MnSO4× 4H2O 22.3 7 10(1H2O) 3 0.1 10 25 25 -

ZnSO4× 7H2O 8.6 3 2 0.5 1 0.1 10 10 -

CuSO4× 5H2O 0.025 - 0.025 0.025 0.03 0.2 0.025 0.025 -

H2SO4 - - - 0.5 - - - - -

Fe2(SO4)3 - 2.5 - - - - - - -

NiC12× 6H2O - - - - 0.03 - - - -

CoC12× 6H2O 0.025 - 0.025 - - 0.1 0.025 - -

A1C13 - - - - 0.03 - - - -

FeC13× 6H2O - - - - 1 - - - -

FeC6O5H7×

5H2O- - - 10 - - - - -

K1 0.83 0.75 0.75 0.5 0.01 1.0 - - -

H3BO3 6.2 1.5 3 0.5 1 5 10 10 -

Na2M0O4× 2H2O 0.25 - 0.25 0.25 - 0.1 0.25 0.25 -

SucroseGlucose

30,000-

20,000-

20,000-

50,000or

36,000

20,000-

30,000-

20,000~30,000-

10,000-

--

Myo-Inositol

100 - 100 - - 1,000 100 100 -

Nicotinic Acid

0.5 0.5 1.0 - - 0.5 5 5 -

Pyridoxine HC1

0.5 0.1 1.0 - - 0.5 0.5 0.5 -

Thiamine HC1

0.1-1 0.1 10 1 1 5 0.5 0.5 -

Ca-Pantothenate

- 1 - - - - - - -

Biotin - - - - - - 0.05 0.05 -

Glycine 2 3 - - - - 2 2 -

Cysteine HC1

- 1 - 10 - - - - -

Folic Acid - - - - - - 0.5 0.5 -

Glutamine - - - - - - - 14.7 -

The significant feature of the MS medium is its very high concentration of nitrate, potassium and ammonia.

The B5 medium established by Gamborg et al. (29) is also being used by many researchers. The levels of inorganic nutrients in the B5 medium are lower than in MS medium.

Many other media have been developed and modified and nutrient compositions of some typical media will be described in Table.

However, it is not always necessary to test many kinds of basal media when a callus is induced. It would be better to use only one or two kinds of basal media in combination of different kinds and concentrations of phytohormones. The most suitable medium composition should be optimized afterwards in order to obtain higher level of products as well as higher growth rate.

Effects of Different Media on Growth and Serpentine Production in

Cell Suspension Cultures of Catharanthus roseus BasalMedium *

Cell yieldg dwt/1

Serpentinemg/1

Serpentine Content% dwt

BlaydesGamborg - B5; + 2,4-D: 1 mg/1Gamborg + 2,4 D: 2 mg/1Gamborg + NAA : 1.86 mg/1GamborgHeller + IAA:O.175; BA: 1.13 mg/1Linsmaier and SkoogMurashige and SkoogNitsch and NitschVelicky and MartinWhite

7.64.65.27.65.15.49.38.92.35.00.8

4.40.50

1.20

6.60

10.42.000

0.060.01

00.02

00.12

00.120.09

00

* IAA = Indole-3-acetic acidNAA = 1-Naphthalene acetic acid2,4-D = 2,4-Dichlorophenoxy acetic acidKin = KinetinBA = Benzyladenine

Media harus menyediakan nutrien yang dibutuhkan untuk:pertumbuhan sel dan biosintesis produk.

Pengembangan medium awal harus diawali dengan menjawab:1. Apa efek dari perbedaan konsentrasi setiap komponen

medium?2. Apakah ada nutrien pembatas?3. Apa efek penggantian setiap komponen dengan sumber

nutrien alternatif?4. Adakah kombinasi sumber nutrien mayor alternatif yang

mendukung produksi hasil yang tinggi?Jika belum ada pengetahuan tentang hal tersebut, harus: penelitian pendahuluan, untuk memanipulasi tipe & level

sumber C dan N yang meningkatkan jumlah produk.

Karena senyawa ini sangat banyak, maka dibuat kelompok senyawa, gula-gula C-6, C-5, C-4; mono-, di-, & polosakarida; minyak & lemak; asam organic.Produk yest, pepton, ekstrak daging, biji-bijian & tepung, bahan anorganik, dst.Harus dipilih berdasarkan ketersediaan, biaya, dan efek-efek yang mungkin timbul pada jalannya proses.

Rancangan penelitian:1. Satu factor pada satu waktu Tradisional Tidak dapat mengidentifikasi factor yang penting Tidak ada interaksi tiap factor2. Faktorial penuh Data komprehensif tentang efek & interaksi setiap faktor Makan waktu & biaya, misal untuk meneliti 4 faktor membutuhkan 256 treatmen Tidak dapat ditentukan mana factor yang efeknya kecil atau tidak berefek terhadap produk3. Faktorial sebagian

Oleh Plackett & BurmannSetiap komponen media diuji dengan dua level yang berbeda; missal medium kontrol (yang sudah ada) mengandung glukosa 2%, maka diujikan glukosa 1% dan 4%. Dengan metodestandar-orde maka medium yang komponennya tujuh setidaknya harus dilakukan 8 kali treatmen.

4. Array testing Meneliti pasangan factor, masing-masing pada tiga level yang berbeda (biasanya level kontrol, 2 x

kontrol, dan 0,5 x kontrol). Misal pasangan factor: level sumber C vs level sumber N tipe sumber N vs level sumber C

Preparation of Media For example, MS medium is prepared as follows:a.    MS-Micronutrient stock solution (store in freezer)

       Ingredient mg/100 ml       H3BO3 620       MnSO4 4H2O 2230       ZnSO4 7H2O 860       Na2MoO4 2H2O 25       CuSO4 5H2O 2.5       CoCl2 6H2O 2.5

b.    Vitamins (store in freezer)       Vitamins mg/100 ml       Nicotinic acid 100       Thiamine HCl 1,000       Pyridoxine HCl 100       Myo-Inositol 10,000

c.    Calcium chloride       CaCl2 2H2O 15 g/100 ml

d.    Potassium iodide (store in amber bottle in refrigerator)       KI 75 mg/100 ml

e.    2,4-D (2.2 mM)        Dissolve 50 mg 2,4-D in 2 to 5 ml ethanol, heat slightly and gradually dilute to 100 ml with water. (Store in refrigerator).

f.     NAA (2.8 mM)       Prepare the same as 2,4-D above.

g.    Kinetin (1 mM) Dissolve 21.5 mg of kinetin in a small volume of 0.5 N HCl by heating slightly and gradually diluting to 100 ml with distilled water. (Store in refrigerator) Similar procedures can be used for other cytokinins.

A certain volume of each stock solution is mixed and an appropriate carbon source is added to the mixture. After pH is adjusted to around 5.5 with 0.2 N K0H or 0.2 N HCl, distilled or deionized water is added to the mixture up to the certain volume required. Agar (0.6 to 1.0% wt/vol) is added for a solid medium.

The medium thus prepared is distributed into vessels such as Erlenmyer flasks (for example, 50 ml of the medium in a 300 ml volume Erlenmyer flask) and sterilized by using an autoclave at 120° C for 15 minutes. The sterilization conditions should be varied based on the volume of the medium and the size of the vessel.