PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI · VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU AZOXYSTROBIN DALAM BUAH...

VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU AZOXYSTROBIN DALAM

BUAH MELON (Cucumis melo L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Rizki Seviana Puspitasari

NIM : 118114167

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU AZOXYSTROBIN DALAM

BUAH MELON (Cucumis melo L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Rizki Seviana Puspitasari

NIM : 118114167

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

What ever you do, do it well. Do it so well that when people see you do it they

will want to come back and see you do it again and they will want to bring

others and show them how well you do what you do.

Do it for people who want to see you fail.

Bukan bahagia yang menjadikan kita bersyukur tetapi dengan bersyukur

akan menjadikan hidup kita bahagia.

“Cintailah pekerjaan mu, lakukanlah dengan hati gembira maka kamu akan menerima hasil yang kamu inginkan” ~Ibu.

Sebuah karya sederhana ini, saya persembahkan kepada semua harta ku yang tak ternilai:

Allah SWT Ayah dan Ibu ku tercinta

Almarhum Mbah Mo tersayang my beloved sister Herlin Indah Noviandika

Serta Sahabat & Kekasih Ku

iv


v


vi


PRAKATA

Puji syukur penulispanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena

penyertaan dan kasih karunia-Nya, sehingga penulisdapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah

Melon (Cucumis melo L.) ” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi

persyaratan memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Keberhasilan dalam menyelesaikan skripsi ini tidak terlepas dari berbagai

pihak yang selalu mendukung pada proses penyusunan skripsi ini. Maka dalam

kesempatan ini dengan kerendahan hati saya mengucapkan terimakasih kepada :

1. Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt., selaku dosen pembimbing yang amat luar

biasa, yang dengan sabar telah membimbing kami, memberikan saran,

pengarahan, kritikan dan semangat dari awal, selama berproses hingga

terselesaikannya skripsi ini.

2. Bapak Sanjayadi, M.Si. yang ikut berperan dalam penentuan kondisi

optimum sistem GC-ECD dalam menganalisis residu azoxysstrobin dalam

buah melon serta selaku ‘pembimbing hati nurani’ yang telah meluangkan

waktu, tenaga dan fikiran untuk membantu menyelesaikannya skripsi ini serta

selalu memberikan motivasi hidup untuk menjadi orang yang lebih baik

disetiap harinya.

3. Ibu Aris Widayati, M.Si., Apt., PhD selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata

Dharma Yogyakarta.

vii


4. Bapak Jeffry Julianus, M.Si selaku dosen penguji atas semua saran, kritik dan

bimbingannya.

5. Bapak F. Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku dosen penguji atas semua saran,

kritik dan bimbingannya.

6. Ibu Agustina Setyawati M.Sc. Apt., selaku kepala laboratorium yang telah

memberikan izin menggunakan laboratorium selama proses penulisan

7. Ayah & Ibu ku tersayang, adik tercinta Herlin Indah Noviandika yang selalu

sabar menanti penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

8. Almarhum Mbah Mo dan Mbah Harjo yang sangat ku sayang, beserta seluruh

keluarga yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu terimakasih atas kasih

sayang, semangat dan doa untuk penulis.

9. Teman-teman seperjuangan geng melon Florentina Silviana Devi, Serlika

Rostiana dan Rushadi Jatmiko atas kebersamaan dan kerjasamanya dalam

menjalani jatuh bangunnya skripsi ini.

10. Tidar Pangestu sosok penyemangat dalam mewujudkan harapan atau impian,

dan sosok yang selalu menenangkan fikiran penulis mulai dari berawalnya

skripsi ini hingga terselesaikannya skripsi ini.

11. Anak-anak ‘Alumnus Kost Putri Ayu‘ Vivin, Tata, Kristrin, Mela, Lia, Indah,

Betrik dan Iyah, yang bersama dengan kalian penulistidak merasa sendirian di

Sanata Dharma, karena sudah 4 tahun kita bersama layaknya sebuah keluarga.

12. Fajar Risda Astuti, Margareta Tri Nova, Wirna Niki Suprobo, yang selalu

memberikan dukungan dan semangat di saat penulis lelah dan jenuh dalam

mengerjakan skripsi.

viii


13. Teman yang jauh dimata tapi dekat di hati Nuriyati, Sekar Permata Sari, Rina

Setyaningrum terimakasih atas semua kecerewetan yang masih terngiang

sampai saat ini, semua itu membangun diri saya menjadi lebih baik.

14. Teman-teman seperjuangan dilantai 4; Teresa Devina, Sophia Sari, Yolanda,

Adit makasih atas canda tawa kalian yang menghidupkan suasana penat kami

disetiap pagi hingga sore.

15. Teman-teman satu keluarga bimbingan Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.,

Verni, Shiro, Canly, Erita, Yolanda, Adit, Yolana, Eva dan Meli atas bantuan

dan dukungan dalam terselesaikannya skripsi ini.

16. Mas Bimo, Pak Parlan, Pak Kunto, Pak Kethul, Pak Mus dan seluruh staf

laboratorium Fakultas Farmasi serta Staf Keamanan dan Kebersihan

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas canda tawanya, kerjasama dan

bantuannya selama ini.

17. Seluruh dosen, laboran, karyawan dan teman-teman angkatan 2011 yang

sudah membantu dan mendukung dalam proses perkuliahan maupun

praktikum selama ini.

18. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu dalam proses

perkuliahan dan penyusunan skripsi.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan

sehingga segala bentuk masukan, kritik dan saran yang bersifat membangun

sangat penulis harapkan. Penulis juga berharap kiranya karya tulis ilmiah ini dapat

bermanfaat bagi pembaca sekalian. Salam sehat sejahtera, terima kasih.

Penulis

ix


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI............................. vi

PRAKATA ........................................................................................................ vii

DAFTAR ISI ...................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xvi

INTISARI ....................................................................................................... xvii

ABSTRACT ................................................................................................... xviii

BAB I. PENGANTAR ....................................................................................... 1

A. Latar Belakang . ............................................................................................. 1

1. Permasalahan ............................................................................................. 5

2. Keaslian Penelitian ..................................................................................... 5

3. Manfaat Penelitian ...................................................................................... 5

B. Tujuan Penelitian ........................................................................................... 6

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA................................................................. 8

A. Fungisida ........................................................................................................ 8

1. Pengertian Fungisida ................................................................................. 8

2. Efek Buruk Fungisida ............................................................................... 9

3. Fungisida Sistemik .................................................................................. 11

B. Azoxystrobin ................................................................................................ 13

1. Mekanisme Aksi Azoxystrobin ............................................................... 13

2. Sifat Fisika Kimia Azoxystrobin ............................................................. 14

C. Buah Melon .................................................................................................. 15

x


1. Pengertian Melon ..................................................................................... 15

2. Taksonomi Tanaman Melon .................................................................... 15

3. Kandungan Buah Melon .......................................................................... 16

D. Ekstraksi ....................................................................................................... 16

1. Pengertian dan Prinsip Ekstraksi ............................................................. 19

2. Pemilihan Pelarut ..................................................................................... 19

E. Sentrifugasi .................................................................................................. 20

F. Solid Phase Extraction (SPE) ....................................................................... 21

G. Kromatografi Gas ......................................................................................... 23

1. Pengertian ................................................................................................ 23

2. Prinsip Pemisahan ................................................................................... 24

3. Performance GC ...................................................................................... 26

4. Instrumentasi............................................................................................ 27

H. Metode Kuantifikasi .................................................................................... 33

1. Metode Standar Eksternal ........................................................................ 34

2. Metode Standar Internal .......................................................................... 34

3. Metode Standar Adisi .............................................................................. 35

I. Validasi Metode Analisis ............................................................................ 35

1. Akurasi .................................................................................................... 36

2. Presisi ....................................................................................................... 36

3. Linearitas dan Rentang ........................................................................... 36

4. Limit of Quantitation (LOQ) .................................................................. 37

J. Landasan Teori ............................................................................................. 37

K. Hipotesis ..................................................................................................... 38

BAB III. METODE PENELITIAN................................................................... 39

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................................. 39

B. Variabel Penelitian ...................................................................................... 39

1. Variabel Bebas ...................................................................................... 39

2. Variabel Tergantung ............................................................................... 39

3. Variabel Pengacau Terkendali ................................................................ 39

C. Definisi Operasional ..................................................................................... 40

xi


D. Bahan Penelitian .......................................................................................... 41

E. Alat Penelitian ............................................................................................. 41

F. Tata Cara Penelitian ................................................................................... 41

1. Prosedur Pencucian Alat-alat Gelas .................................................... 42

2. Pembuatan Larutan Stok Azoxystrobin dan DCB ............................... 42

3. Pembuatan Larutan Intermediet Azoxystrobin ................................... 42

4. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD ........................................................ 43

5. Preparasi Sampel Melon .................................................................... 46

6. Optimasi Clean-up Menggunakan SPE C18 ....................................... 46

7. Validasi Metoe Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah

Melon .................................................................................................. 50

G. Analisis Hasil .............................................................................................. 50

1. Analisis Kualitatif GC-ECD ............................................................... 51

2. Analisis Kuantitatif GC-ECD ............................................................. 52

3. Pengukuran Kadar Air dalam Sampel Melon .................................... 53

4. Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah

Melon ................................................................................................. 54

H. Rancangan Penelitian .................................................................................. 55

1. Optimasi Washing SPE ....................................................................... 55

2. Fraksinasi Metanol untuk Menarik Analit .......................................... 57

3. Validasi Metode Analisis .................................................................... 59

4. Preparasi Sampel Buah Melon ............................................................ 60

5. Uji Kelayakan SPE ............................................................................. 62

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 64

A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD untuk Menganalisis

Azoxystrobin ................................................................................................. 66

1. Optimasi Sistem GC-ECD ................................................................. 66

2. Kinerja Kualitatif GC-ECD ................................................................ 67

3. Kinerja Kuantitatif GC-ECD .............................................................. 69

B. Preparasi Sampel Melon .............................................................................. 73

1. Homogenisasi ...................................................................................... 73

xii


2. Ekstraksi dengan Metode QuEChERS ................................................ 74

3. Optimasi Clean-up .............................................................................. 78

C. Validasi Metode Analisis ............................................................................. 82

1. Kinerja GC-ECD dalam Mendeteksi Azoxystrobin pada

Matriks Ekstrak Melon Bersih (Jalur C) ............................................. 83

2. Kinerja Clean-up dengan Kolom SPE C18 (Jalur B) .......................... 87

3. Akurasi dan Presisi Metode Analisis Teroptimasi (Jalur A) .............. 89

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 94

A. Kesimpulan .................................................................................................. 94

B. Saran ............................................................................................................ 95

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 96

LAMPIRAN .................................................................................................... 100

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 114

xiii


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Sifat Fisika Kimia Azoxystrobin ...................................................... 14

Tabel II. Kandungan Buah Melon ................................................................. 16

Tabel III. Kriteria % RSD Validasi Metode Analisis ...................................... 52

Tabel IV. Hasil Optimasi GC-ECD Sanjayadi (2014) ..................................... 66

Tabel V. Hasil Performance GC-ECD ........................................................... 68

Tabel VI. Hasil Keajegan Sistem GC-ECD ..................................................... 68

Tabel VII. Hasil %RSD RF Analisis Kuantitatif GC-ECD ............................... 69

Tabel VIII. Hasil Uji Sensitivitas GC-ECD .................................................... 71

Tabel IX. Hasil % D Analisis Kuantitatif GC-ECD ..................................... 73

Tabel X. Kadar Air dalam Buah Melon .......................................................... 74

Tabel XI. Hasil Optimasi Clean-up ................................................................. 78

Tabel XII. Hasil Presisi dan Akurasi Kelayakan SPE ....................................... 80

Tabel XIII. Kinerja GC ECD dalam Mendeteksi Azoxystrobin

dalam Buah Melon ........................................................................... 84

Tabel XIV. Hasil Presisi Jalur C ......................................................................... 85

Tabel XV. Hasil Akurasi Jalur C ....................................................................... 85

Tabel XVI. Hasil % D Jalur C ............................................................................ 86

Tabel XVII. Hasil Presisi Jalur B ......................................................................... 86

Tabel XVIII. Hasil Akurasi Jalur B ....................................................................... 86

Tabel XIX Hasil % D Jalur B ........................................................................... 85

Tabel XX Hasil Presisi Kurva Adisi ................................................................. 90

Tabel XXI. Hasil Akurasi Kurva Adisi ............................................................... 91

Tabel XXII Hasil % D Validasi Metode Analisis ............................................... 92

xiv


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Stuktur Azoxystrobin ................................................................... 13

Gambar 2. Kandungan Buah Melon .............................................................. 16

Gambar 3. Tahapan SPE ............................................................................... 23

Gambar 4. Diagram Skematik Kromatografi Gas ......................................... 27

Gambar 5. Gas yang Digunakan dalam Kromatografi Gas .......................... 28

Gambar 6. Pemisahan Standar Internal, Difenoconazole

dan Azoxystrobin .......................................................................... 67

Gambar 7. Kurva Hubungan Kadar Azoxystrobin Vs Rasio AUC Azoxystrobin/DCB ................................................................... 70

Gambar 8. Pengaruh Ph Terhadap Jumlah Co-Extractant ............................ 75

Gambar 9. Hasil Optimasi Lama Waktu Sentrifugasi ................................... 77

Gambar 10. Jenis-jenis SPE dan Kapasitasnya................................................ 79

Gambar 11. Hasil Eluat Metanol Setelah Washing 5% Metanol dan 100%

Aquabidest ................................................................................... 80

Gambar 12. Hasil Tampungan Washing Menggunakan 100% Aquabidest ..... 81

Gambar 13. Fraksinasi Elusi Metanol untuk Menarik Analit .......................... 81

Gambar 14. Blangko Matriks Melon (a) dan Blanko yang

Diadisi Standar Azoxystrobin (b) ................................................. 83

Gambar 15. Kurva Baku vs Kurva Adisi C ..................................................... 86

Gambar 16. Kurva Baku vs Kurva Adisi B ..................................................... 88

Gambar 17. Linearitas Kurva Baku Adisi ....................................................... 89

Gambar 18. Kurva Baku vs Kurva Adisi A ..................................................... 91

xv


Daftar Lampiran

Halaman

Lampiran 1. Perhitungan Sensitivitas Alat .................................................. 101

Lampiran 2. Kurva Adisi Azoxystrobin pada Sampel Buah Melon ............ 103

Lampiran 3. Perhitungan Resolusi (Rs) dan Resolusi DCB ........................ 104

Lampiran 4. Certificate of Anaylisis DCB ................................................... 105

Lampiran 5. Certificate of Anaylisis NaCl ................................................... 106

Lampiran 6. Certificate of Anaylisis MgSO4 ............................................... 107

Lampiran 7. Certificate of Anaylisis Na2HCitr ............................................ 108

Lampiran 8. Certificate of Anaylisis Na3Citr ............................................... 109

Lampiran 9. Certificate of Anaylisis Acetonitrile ........................................ 110

Lampiran 10. Certificate of Anaylisis Hexane ............................................... 111

Lampiran 11. Certificate of Anaylisis Methanol ............................................ 112

Lampiran 12. Certificate of Analysis Azoxystrobin Donasi

dari PT Syngenta ..................................................................... 113

xvi


INTISARI

Indonesia yang berada dalam iklim tropis dengan suhu dan kelembaban yang mendukung penyebaran dari penyakit anthracnose (Colletotrichum gloesporioides) menyebabkan kerusakan yang signifikan terhadap tanaman melon (Cucumis melo L.). Pengontrolan penyakit anthracnose oleh para petani dilakukan dengan menggunakan Azoxystrobin (methyl(E)-2-{2-[6-(2-cyanophenoxy) pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate). Berdasarkan alasan tersebut, untuk memastikan keamanan konsumen, jumlah residu Azoxystrobin dalam buah melon harus dipantau. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan suatu metode analisis yang valid dalam penetapan kadar residu Azoxystrobin dalam buah melon yang dapat dilakukan di laboratorium pestisida di Indonesia.

Prosedur baku dalam analisis residu azoxystrobin menggunakan cara ekstraksi dan clean-up QuEChERS diikuti dengan penetapan kadar LC/MS/MS. Dalam penelitian ini dilakukan modifikasi clean-up dengan kolom SPE C18 agar dapat di deteksi dengan GC-ECD, oleh karena itu harus dilakukan validasi penuh. Uji kesesuaian instrumen pada kondisi GC yang optimum menunjukkan efisiensi, kesetimbangan sistem dan selektivitas yang bagus, % RSD ratio area dan tR, RF dan rata-rata %D <20%, linearitas 0,9913-0,9997 pada kisaran linearitas 0,0456 ng - 0,912 ng, dengan IDL 0,003 µg/ml – 0,01 µg/ml dan IQL 0,047 µg/ml.

Validasi metode analisis dilakukan pada sampel blanko dan sampel yang di fortifikasi. Recovery fortifikasi 0,137-0,730 ng pada ekstrak sampel blanko sebelum di injeksikan ke GC-ECD 93-117% dan kesalahan determinasi sebesar 3,8%, sedangkan fortifikasi sebelum clean-up dengan kolom SPE C18 sebesar 84-107%, dan kesalahan clean-up 3,1%. Recovery fortifikasi 0,091 ng – 0,684 ng pada buah melon berkisar antara 84-119% dan kesalahan ekstraksi sebesar 9,1%. Linearity range 0,002 µg/g – 0,014 µg/g dengan LOQ 0,0008 µg/g dan LLMV sebesar 0,005 µg/g. Dengan demikian validasi metode ini memenuhi persyaratan untuk memantau kadar Azoxystrobin dalam buah melon dibawah positif list sebesar 0,01 µg/g.

Kata kunci : azoxystrobin, melon, QuEChERS, SPE C18, GC-ECD, validasi

metode

xvii


ABSTRACT

Indonesian tropical climate which is warm and humid promote the development and spread of anthracnose (Colletotrichum gloesporioides) causing significant damage in melon (Cucumis melo L.). To control the anthracnose, farmers used Azoxystrobin (methyl (E)-2-{2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate). For that reason, to assure the safety of the consumer, the level of Azoxystrobin residue in melon should be monitored. The purpose of this study is to develop a valid analytical method for Azoxystrobin residue in melon which can be done in common pesticide residue laboratory in Indonesia.

The extraction process of the developed method was done following the assisted LLE method of QuEChERS, while the clean up process was done using C18 SPE catridge and determined by GC-ECD and quantified by internal standardization using decachlorobiphenyl (DCB) as internal standard. The performance of GC-ECD shows precision of ratio area, retention time less than 20%, while. the standard integrity shows % RSD of response factor and % difference < 20%. Linearity range was 0.0456 ng – 0.912 ng with r value 0.9913-0.9997. Range of Instrumental Detection Limit (IDL) was 0.003 µg/ml- 0.01 µg/ml and Instrumental Quantitation Limit (IQL) was 0.047 µg/mL. Recovery of fortified blank extract at 0.14 - 0.73 ng was 93-117% and no matrix effect was observed. The error at extraction step, clean up step and determination step were 9.1%, 3.1%, and 3.8% respectively. The recovery of fortified sample at 0.09 ng – 0.68 ng was 84-119%. The LOQ was 0.0008 µg/g and the LLMV 0.005 µg/g, therefore this method is fit for monitoring Azoxystrobin in melon, which has a positive list of 0.01 mg/kg.

Keywords: azoxystrobin, melon, QuEChERS, SPE C18, GC-ECD, method validation

xviii


BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Bidang pertanian saat ini berkembang semakin pesat dengan adanya

banyak penelitian serta usaha yang dilakukan untuk mendapatkan produk-produk

pertanian yang melimpah, berkualitas dan unggul. Produk pertanian di Indonesia

yang semakin meningkat daya tariknya adalah melon (Cucumis melo L.) (Nuryanto,

2000).

Indonesian Tropical Fruit Festival yang digelar di Expo Shanghai pada 1

Oktober 2010 lalu, telah menghadirkan beragam buah-buahan tropis asal

Indonesia yang unik dan eksotis. Keadaan lingkungan Indonesia yang unik,

mempunyai potensi besar dalam produk buah-buahan eksotis salah satunya adalah

buah melon. Menteri Pertanian mengatakan bahwa agrobisnis Indonesia dengan

keunikan produknya mempunyai potensi yang sangat besar untuk menembus

pasar Tiongkok atau ekspor ke negara-negara lain (CRI, 2010).

Berdasarkan Dirjen Budidaya dan Pascapanen Buah Ditjen Hortikultura

Kementerian Pertanian, (2012) Indonesia saat ini hanya mampu mengekspor buah

melon setiap satu bulan sekali, hal ini dikarenakan pasokan melon yang belum

mencukupi pasar dalam negeri karena semakin meningkatnya permintaan di

dalam negeri. Oleh sebab itulah ketersediaan buah melon perlu untuk ditingkatkan

guna memenuhi permintaan pasar baik dalam negeri maupun luar negeri.

1


2

Tanaman melon tidak terlepas dari adanya kendala serangan jamur yang

menyebabkan melon cepat membusuk. Serangan jamur yang berat dapat

menurunkan produktivitas tanaman atau bahkan menyebabkan kegagalan panen,

oleh karena itu usaha pengendalian dan pemberantasan hama dan penyakit harus

mendapatkan perhatian secara khusus (Samadi, 2007). Jules (2012) menyatakan

bahwa melon dan semangka merupakan tanaman jenis cucurbitaceae yang sering

terkena penyakit jamur. Kondisi iklim Indonesia yang berada di daerah tropis

menjadi faktor tumbuhnya penyakit jamur dengan baik. Kelembaban yang tinggi

menjadi pemicu tingginya penyakit jamur di Indonesia. Salah satu jenis jamur

yang sering menyerang tanaman buah melon adalah anthracnose. Kondisi inilah

yang menyebabkan kurangnya penyediaan buah melon. Tidak jarang kita temukan

penggunaan fungisida yang berlebihan guna memberantas penyakit jamur

tersebut. Hal inilah yang menjadi poin penting bagi Indonesia agar saat buah

tersebut berada di pasar dalam negeri maupun saat di ekspor, telah memenuhi

persyaratan keamanan bagi konsumen.

Pestisida secara harfiah berarti hama (pest: hama dan cide: membunuh).

Pestisida sebenarnya telah lama digunakan orang sebagai bahan pembunuh hama

atau sebagai pelindung tanaman. Mengingat peranannya yang sangat besar,

perdagangan pestisida dewasa ini semakin ramai. Berdasarkan data pencatatan

dari Badan Proteksi Lingkungan Amerika Serikat, saat ini lebih dari 2.600 bahan

aktif pestisida yang beredar di pasaran (Sudarmo, 1991). Pestisida memiliki

berbagai dampak bagi keselamatan pengguna, konsumen dan cemaran lingkungan

(Djojosumarto, 2008).


3

Beberapa produk fungisida yang baru gencar di pasaran menonjolkan

kombinasi antara zat aktif azoxystrobin dengan difenoconazole, fenpropimorph,

cyproconazole, propiconazole, maupun chlorothalonil dengan pesentase yang

berbeda-beda. Produk ini untuk mengatasi penyakit jamur yang menyerang

tanaman melon. Aksi kerja dari azoxystrobin ini adalah menginhibisi respirasi

mitokondrial di dalam jamur (Mastovska, 2008). Fungisida yang populer

digunakan oleh petani saat ini adalah AMISTARTOP yang mengandung

azoxystrobin 200 g/L dan difenoconazole 125 g/L. Penggunaannya menurut

INDOGAP sesuai label adalah maksimum tiga kali aplikasi dengan konsentrasi

0,5 mL/L.

Berdasarkan standar prosedur operasional Syngenta RAM 305/03,

mendiskripsikan secara garis besar bahwa determinasi residu pestisida dilakukan

dengan cara mengekstraksi sampel dengan asetonitril:air secara LLE kemudian

dilakukan sentrifugasi dan clean-up menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)

C18 dan final determinasi menggunakan high performance liquid chromatography

dengan triple quadrupole mass spectrometer (LC-MS/MS) (RAM 305/03, 2004).

AOAC Official Method 2007 menyatakan bahwa cara menganalisis

residu pestisida dengan menggunakan metode ekstraksi single-step buffered

asetonitril (MeCN) dan clean-up menggunakan dispersive-solid-phase extraction

(dispersive-SPE) yang berkombinasi dengan Primary Secondary Amine (PSA)

sorbent dan MgSO4. Kemudian dianalisis menggunakan mass spectrometry (MS)

setelah dipisahkan menggunakan kromatografi (AOAC, 2007).


4

Metode European menggunakan sodium chloride untuk mengurangi

interfensi dari senyawa polar dan menggunakan buffer asam sitrat untuk

mengawetkan analit yang sensitif terhadap basa. Ekstraksi pada metode ini

menggunakan magnesium sulfate anhydrous, sodium chloride, sodium citrate

tribasic dihydrate dan sodium citrate dibasic sesquihydrate yang kemudian

menggunakan sentrifuge dan clean-up menggunakan PSA, MgSO4 dan GCB.

Analisis menggunakan GC-MS atau LC-MS/MS dalam 5% formic acid dalam

asetonitril (Anonim1).

Beberapa metode QuEChERS yang disajikan diatas di determinasi

menggunakan instrumen yang selektif dan spesifik dengan menggunakan GC-

MS/MS atau LC-MS/MS. Keterbatasan GC-MS/MS atau LC-MS/MS di

laboratorium Indonesia, memotivasi peneliti untuk mengembangkan metode

analisis residu azoxystrobin pada matriks buah melon yang memang belum

tersedia di Indonesia agar tetap dapat memantau keamanan menggunakan GC-

ECD yang lebih mudah ditemukan di laboratorium Indonesia. GC-ECD yang

kurang selektif jika dibandingkan dengan GC-MS/MS atau LC-MS/MS

mengakibatkan perlunya dilakukan pengembangan metode QuEChERS dan

clean-up yang sesuai dengan menggunakan Sholid Phase Extraction (SPE) C18.

Melalui kesetimbangan yang berulang di dalam kolom diharapkan hasil ekstraksi

yang diperoleh akan menjadi lebih bersih sehingga mampu dideterminasi dengan

GC-ECD. Validasi yang dilakukan meliputi akurasi, presisi, linearitas, kisaran/

range linearitas. limit of detection (LOD), dan limit of quantification (LOQ).


5

Oleh sebab itulah peneliti bermaksud untuk menetapkan sebuah metode

yang valid dalam mendeteksi baik secara kualitatif maupun kuantitatif kadar

residu fungisida azoxystrobin dalam buah melon setelah pengaplikasian saat

budidaya agar tidak melebihi kadar maksimum yang diperbolehkan guna

melindungi kesehatan konsumen dalam negeri dan luar negeri karena Maximum

Residue Limit (MRL) atau Batas Maksimum Residu (BMR) azoxystrobin dalam

buah melon yang belum tercantum dalam codex.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dirumuskan permasalahan

penelitian sebagai berikut :

a. Bagaimana pengembangan metode QuEChERS dalam analisis penetapan

kadar residu fungisida azoxystrobin dalam buah melon hingga didapatkan

hasil yang valid?

b. Bagaimana validasi metode analisis pengukuran residu fungisida

azoxystrobin dalam kulit dan daging buah melon dengan menggunakan

instrumen GC-ECD?

2. Keaslian Penelitian

Berdasarkan penelusuran literatur yang dilakukan, belum pernah ada

penelitian mengenai “Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah

Melon (Cucumis melo L).


6

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat metodologis. Penelitian ini dapat memberikan tambahan

pengetahuan terhadap perkembangan metode QuEChERS dalam analisis residu

fungisida azoxystrobin dengan menggunakan Gas Chromatography Electron

Capture Detector pada sampel buah melon.

b. Manfaat praktis. Penelitian ini dapat digunakan sebagai prosedur

analisis penetapan kadar residu fungisida azoxystrobin dalam buah melon dengan

hasil yang akurat dengan menggunakan Gas Chromatography Electron Capture

Detector (GC-ECD).

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum dari penelitian

a. Dapat mengembangkan metode QuEChERS dalam analisis penetapan kadar

residu fungisida Azoxystrobin dalam buah melon hingga didapatkan hasil yang

valid.

b. Mampu melakukan validasi metode analisis residu fungisida Azoxystrobin pada

buah melon (Cucumis melo L.) dengan instrumen Gas Chromatography

Electron Capture Detector (GC-ECD).

2. Tujuan khusus penelitian

a. Mengetahui proses ekstraksi QuEChERS serta pelarut yang cocok untuk

menyari azoxystrobin dari buah melon (Cucumis melo L.)

b. Mendapatkan proses clean-up yang optimum menggunakan SPE C18.


7

c. Mampu menetapkan kadar residu fungisida azoxystrobin dengan kondisi Gas

Chromatography Electron Capture Detector (GC-ECD) yang optimal.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Fungisida

1. Pengertian Fungisida

Fungisida merupakan bahan kimia yang digunakan untuk mengontrol

penyakit tanaman yang disebabkan oleh jamur. Jamur merupakan tanaman tidak

berklorofil. Mereka bersifat parasit untuk tanaman lainnya (Burton, 2010).

Fungisida azoxystrobin memiliki sifat sebagai protective fungicide dan

curative fungicide yang dapat digunakan pada daun, biji atau perawatan tanah.

Azoxystrobin sama efektifnya dengan atau lebih dari standar industri mancozeb

(Martha, 2012).

Berdasarkan SK Menteri Pertanian RI Nomor 434.1/Kpts/TP.270/7/2001,

tentang Syarat dan Tata Cara Pendaftaran Pestisida, yang dimaksud dengan

pestisida adalah semua zat kimia dan bahan lain serta jasad renik dan virus yang

dipergunakan untuk :

a. Memberantas atau mencegah hama-hama dan penyakit-penyakit yang

merusak tanaman, bagian-bagian tanaman atau hasil-hasil pertanian.

b. Memberantas rerumputan.

c. Mematikan daun dan mencegah pertumbuhan yang tidak diinginkan.

d. Mengatur dan merangsang pertumbuhan tanaman atau bagian-bagian

tanaman tidak termasuk pupuk.

8


9

e. Memberantas atau mencegah hama-hama luar pada hewan-hewan piaraan dan

ternak.

f. Memberantas atau mencegah hama-hama air.

g. Memberantas atau mencegah binatang-binatang dan jasad-jasad renik dalam

rumah tangga, bangunan dan dalam alat-atat pengangkutan.

h. Memberantas atau mencegah binatang-binatang yang dapat menyebabkan

penyakit pada manusia atau binatang yang perlu dilindungi dengan

penggunaan pada tanaman, tanah atau air (Djojosumarto, 2008).

Menurut The United States Environmental Control Act pestisida

didefinisikan sebagai berikut.

a. Pestisida merupakan semua zat atau campuran zat yang khusus digunakan

untuk mengendalikan, mencegah, atau menangkis gangguan serangga,

binatang pengerat, nematode, gulma, virus, bakteri, atau jasad renik lain yang

terdapat pada hewan dan manusia.

b. Pestisida merupakan semua zat atau campuran zat yang digunakan untuk

mengatur pertumbuhan atau mengeringkan tanaman (Djojosumarto, 2008).

2. Efek Buruk Fungisida

Beberapa fungisida mengandung logam berat dalam struktur kimianya.

Apabila dipakai secara membabi buta, fungisida ini menimbulkan pencemaran

lingkungan oleh logam-logam berat yang terkandung dalam fungisida tersebut

(Sumardjo, 2009).

Masalah utama yang sering ditimbulkan oleh pestisida ini adalah sifat

racunnya yang dapat mengenai manusia, hewan piaraan, serangga penyerbuk,


10

musuh alami hama dan tanaman serta dapat mencemari lingkungan. Bahkan

penggunaan pestisida dengan dosis yang tidak tepat dapat menyebabkan hama

menjadi kebal atau resisten (Wudianto, 1992).

Beberapa paparan yang kemungkinan terjadi meliputi:

a. Pengaruh terhadap lingkungan. Fungisida mengandung racun yang

disamping dapat mengendalikan jamur juga mempunyai pengaruh racun terhadap

lingkungan. Tiap jenis fungisida mempunyai pengaruh yang berbeda terhadap

lingkungan. Pengaruh terhadap lingkungan tergantung dari daya racun (toksisitas),

cara dan kekerapan aplikasi, serta persistensi (Sumardiyono, 2013).

Dalam praktik penyemprotan tanaman dengan fungisida, sebagian

fungisida ada yang jatuh ke atas tanah sekitar tanaman. Hal ini menyebabkan

tanah sekitar tanaman terpapar fungisida, sehingga dapat mempengaruhi kualitas

air tanah yang berbahaya bagi kesehatan manusia. Pada keadaan cuaca yang

beranging kencang, sebagian bahan semprot akan memberikan drift (cipratan) ke

tempat bukan sasaran yang dapat menyebabkan pencemaran lingkungan berupa

kontaminasi akibat cipratan misalnya akan mencemari sekitar lahan pertanian.

Kontaminasi pada lingkungan juga terjadi akibat dari pencucian alat semprot

setelah aplikasi. Pencucian sprayer tidak boleh dilakukan pada saluran air irigasi,

sungai kecil atau sumber air lain. Pencucian dilakukan dengan sisa dibuang jauh

dari pemukiman atau tempat bermain anak-anak (Sumardiyono, 2013).

b. Pengaruh terhadap organisme tanah. Pestisida yang persisten termasuk

didalamnya fungisida yang persisten, sangat berbahaya bagi tanah dan air tanah.

Klasifikasi pestisida yang berbahaya di dalam tanah didasarkan atas


11

persistensinya. Makin persisten suatu pestisida, maka semakin berbahaya.

Umumnya fungisida tidak berbahaya, kecuali PCP dan golongan merkuri

(Sumardiyono, 2013).

c. Pengaruh terhadap manusia. Pengaruh terhadap manusia dapat bersifat

langsung atau tidak langsung. Bersifat langsung adalah pengaruh terhadap

kesehatan pekerja. Para pekerja dan pemakai fungisida tentu akan terpapar

fungisida sewaktu melakukan aplikasi. Bila fungisida yang diaplikasikan berdaya

racun tinggi, akibat terhadap para pekerja menjadi sangat berbahaya. Para pekerja

akan terpapar fungisida melalui udara yang terhirup karena sebagian bahan yang

disemprotkan akan terbawa angin dan masuk ke dalam saluran pernafasan. Para

pekerja juga rentan terpapar fungisida bila terjadi kecelakaan atau tumpahan yang

mengenai tangan atau kulit (Sumardiyono, 2013).

Secara tidak langsung, manusia mendapatkan kontaminasi fungisida

melalui makanan yang kita makan. Manusia mengkonsumsi daging, ikan, sayur,

beras, atau produk-produk pertanian yang lain. Bila produk tersebut mengandung

residu pestisida maka manusialah yang akan mendapatkan residu yang paling

banyak (Sumardiyono, 2013).

3. Fungisida Sistemik

Fungisida sistemik adalah fungisida yang dapat masuk melewati kutikula

dan terserap oleh tanaman, bersifat mobile (bergerak) atau ditranslokasikan dari

tempat aplikasi ke bagian tanaman yang lain, atau bergerak dari akar melalui

xilem ke daun. Fungisida sistemik dapat diaplikasikan sebagai fungisida protektan

atau terapeutan. Fungisida jenis ini berfungsi mencegah perkembangan penyakit


12

sehingga dapat menyembuhkan (cure) tanaman yang sudah sakit atau

menghambat perkembangan penyakit atau disebut juga fungisida kemoterapeutan.

Fungisida sistemik yang baik harus memenuhi beberapa kriteria :

a. Senyawa tersebut harus bersifat fungisidal atau dapat diubah menjadi

senyawa yang beracun dalam tanaman.

b. Senyawa tersebut harus mempunyai fitotoksisitas yang sangat rendah karena

terserap oleh tanaman.

c. Senyawa tersebut harus dapat terserap oleh akar, daun atau biji sebelum dapat

ditranslokasikan ke bagian tanaman yang lain (Sumardiyono, 2013).

Fungisida sistemik dapat diaplikasikan dengan cara perlakuan benih,

penyuntikan batang, penyemprotan pada permukaan tanaman, pembasahan tanah

sekitar perakaran. Setelah perlakuan dengan fungisida ini akan terjadi penetrasi ke

dalam jaringan tanaman, kemudia di translokasikan ke bagian tanaman yang lain.

Fungisida sistemik bekerja sampai jarak yang jauh dari tempat aplikasi

dan dapat menyembuhkan tanaman yang sudah sakit. Fungisida sitemik bekerja

bersama dengan proses metabolisme tanaman. Fungisida sistemik hanya bekerja

pada satu tempat dari bagian sel jamur, sehingga disebut mempunyai cara kerja

single site action atau spesifik. Jenis-jenis fungisida sistemik diantaranya

golongan oksatin, metalaksil, benzimidazol, fosfat organik, pirimidin, triazol dan

strobilurin (Sumardiyono, 2013).


13

B. Azoxystrobin

1. Mekanisme Aksi Azoxystrobin

Azoxystrobin (Methyl (E) – 2 - { 2[ 6 - ( 2 – cyanophenoxy ) pyrimidin –

4 –yloxy ]phenyl } – 3 - methoxyacrylate) merupakan fungisida turunan strobulin

yang bekerja secara sistemik dan termasuk dalam golongan methoxyacrylates.

Mekanisme aksi azoxystrobin adalah menginhibisi respirasi mitokondria jamur.

Azoxystrobin memiliki stuktur seperti Gambar 1.

Gambar 1. Stuktur Azoxystrobin (Mastovska, 2008)


14

2. Sifat Fisika Kimia Azoxystrobin

Sifat fisika kimia senyawa azoxystrobin dapat dilihat dalam tabel berikut:

Tabel 1. Sifat Fisika Kimia Azoxystrobin

Nama umum Azoxystrobin Nama kimia (IUPAC) Methyl (E)-2-{2 [6-(2-

cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3- Methoxyacrylate

Nama kimia (CA) Methyl (E)-2-[[6-(2-cyanophenoxy)-4-pyrimidinyl]oxy]-α- (methoxymethylene)benzeneacetate

Rumus molekul C22H17N3O5 Bobot molekul 403,4 g/mol Pemerian Serbuk putih, tidak berbau Tekanan uap pada 20°C 1,1 x 10-10 Pa Titik lebur 116°C Koefisien partisi Log Pow = 2,5 ( 20°C, pH 7) Kelarutan dalam air 20°C 6 mg/L pada purified water Berat jenis 1,34 g/cm3

Volatilitas Henry’s Law constant = 7,3 x 10-9 Pa m3/mol

Kelarutan di air 20°C 6,7 mg/L pada buffer pH 5,2 6,7 mg/L pada buffer pH 7 5,9 mg/L pada buffer pH 9,2

Kelarutan pada pelarut organic 20°C

Hexane = 0,057 g/L Octanol = 1,4 g/L Metanol = 20 g/L Toluene = 55 g/L Acetone = 86 g/L Ethyl acetate = 130 g/L Asetonitril = 340 g/L Dicholomethane = 400 g/L

(Mastovska, 2008)


15

C. Buah Melon

1. Pengertian Melon

Melon merupakan tanaman semusim yang tumbuh menjalar, berbatang

lunak, dari setiap pangkal tangkai daun pada batang utama tumbuh tunas lateral.

Pada tunas lateral inilah muncul bunga betina (bakal buah) yang rata-rata mampu

menghasilkan satu sampai dua calon buah. Namun, tidak semuanya menjadi buah.

Calon buah yang tidak sempat diserbuki akan gugur. Oleh karena itu, perempelan

tunas lateral harus dilakukan, kecuali tunas lateral yang bakal buahnya dipilih

untuk dijadikan buah. Budi daya tanaman melon dapat pula dirambatkan pada

turus bamboo (ajir). Buah melon umumnya berbentuk bulat dengan jarring-jaring

(net) yang tampak jelas pada permukaan kulit buahnya. Akan tetapi ada beberapa

varietas melon yang tidak memiliki net pada permukaan kulitnya, misalnya Silver

Light, Sun Lady, Snow Charm dan beberapa yang lainnya (Samadi, 2007).

2. Taksonomi Tanaman Melon

Tanaman melon (Cucumis melo L.) termasuk famili Cucurbitaceae.

Klasifikasi tanaman melon dalam ilmu tumbuha-tumbuhan atau taksonomi

disebutkan dengan urutan sebagai berikut:

Kingdom : Platae / Tumbuh-tumbuhan

Divisio : Spematophyta / Tumbuhan berbiji

Sub-divisio : Angiospremae / Tumbuhan Berbiji tertutup

Kelas : Dicotyledonae / Biji berkeping dua

Ordo : Cucurbitaceae (Compositae)

Famili : Cucurbitaceae


16

Genus : Cucumis

Spesies : Cucumis melo L. ( Nuryanto, 2000).

3. Kandungan Buah Melon

Tabel II. Kandungan Buah Melon (Samadi, 2007).

No Unsur Gizi Jumlah 1 Energi (kalori) 23 2 Protein (g) 0,6 3 Kalsium (mg) 17 4 Vitamin A (IU) 2,400 5 Vitamin C (mg) 30 6 Thiamin (mg) 0,045 7 Riboflavin (mg) 0,065 8 Niacin (mg) 1,0 9 Karbohidrat (g) 6,0 10 Besi (mg) 0,5 11 Nicotinamida (mg) 0,5 12 Air (mL) 93,0 13 Serat (g) 0,4

D. Ekstraksi

1. Pengertian dan Prinsip Ekstraksi

Liquid-liquid Extraction (LLE) merupakan salah satu ekstraksi yang

sering digunakan untuk memisahkan suatu analit dari komponen lain yang tidak

diharapkan. LLE adalah suatu metode pemisahan dengan menggunakan dua fase

pelarut yang saling tidak bercampur dengan memperhatikan nilai P-nya. Metode

ini digunakan dengan menggunakan tabung sentrifuge dimana hanya memerlukan

sampel yang lebih sedikit (Cairns, 2004).

Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel

atau clean-up sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen


17

matriks yang mungkin mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Di

samping itu, ekstraksi pelarut juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada

dalam sampel dengan jumlah kecil sehingga tidak memungkinkan atau

menyulitkan untuk deteksi atau kuantifikasinya (Gandjar dan Rohman, 2007).

Dalam bentuk paling sederhana, suatu alikuot larutan air digojog dengan

pelarut organik yang tidak campur dengan air. Kebanyakan prosedur ekstraksi

cair-cair melibatkan ekstraksi analit dari fase air ke dalam pelarut organik yang

bersifat non polar atau agak polar seperti heksana, metilbenzen, atau

diklorometan. Meskipun demikian, proses sebaliknya (ekstraksi analit dari pelarut

organik non polar ke dalam air) juga mungkin terjadi (Gandjar dan Rohman,

2007).

Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah

molekul-molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang

bersifat non polar atau agak polar. Sementara itu, senyawa-senyawa polar dan

senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi

yang menyatakan bahwa “pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan

terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling

tidak campur”. Perbandingan konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam dua

fase disebut dengan koefisien distribusi atau koefisien partisi (KD) dan

dirumuskan sebagai berikut:


18

KD = (S)org (S)aq

Keterangan:

KD = koefisien partisi

[S]org = konsentrasi analit dalam fase organik

[S]aq = konsentrasi analit dalam fase air

Dalam prakteknya, analit seringkali berada dalam bentuk kimia yang

berbeda karena adanya disosiasi (ionisasi), protonasi, dan juga kompleksasi atau

polimerasi karenanya ekspresi yang lebih berguna adalah rasio distribusi atau

rasio partisi (D). Persamaannya adalah sebagai berikut:

D = (Cs)org (Cs)aq

Keterangan:

D = rasio partisi

(Cs)org = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase organik

(Cs)aq = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase air

Analit yang mempunyai rasio distribusi besar (104 atau lebih) akan

mudah terekstraksi ke dalam pelarut organik meskipun proses kesetimbangan

(yang berarti 100% solut terekstraksi atau tertahan) tidak pernah terjadi.

Kebanyakan ekstraksi dilakukan dengan menggunakan corong pisah dalam waktu

beberapa menit. Akan tetapi untuk efektivitas ekstraksi analit dengan rasio

distribusi yang kecil (<1), ekstraksi hanya dapat dicapai dengan mengenakan

pelarut baru pada larutan sampel secara terus menerus (Gandjar dan Rohman,

2007).


19

2. Pemilihan Pelarut

Pelarut organik yang dipilih untuk ekstraksi pelarut adalah pelarut yang

mempunyai kelarutan yang rendah dalam air (< 10%), dapat menguap sehingga

memudahkan penghilangan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi, dan

mempunyai kemurnian yang tinggi untuk meminimalkan adanya kontaminasi

sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).

Beberapa masalah yang sering dijumpai ketika melakukan ekstraksi

pelarut yaitu: terbentuknya emulsi, analit terikat kuat pada partikulat, analit

terserap oleh partikulat yang mungkin ada, analit terikat pada senyawa yang

mempunyai berat molekul tinggi, dan adanya kelarutan analit secara bersama-

sama dalam kedua fase. Terjadinya emulsi merupakan hal yang paling sering

dijumpai. Oleh karena itu, jika emulsi antara kedua fase ini tidak dirusak maka

recovery yang diperoleh kurang baik. Emulsi dapat dipecah dengan cara:

a. Penambahan garam ke dalam fase air

b. Pemanasan atau pendinginan corong pisah yang digunakan

c. Penyaringan melalui glass-wool

d. Penyaringan dengan menggunakan kertas saring

e. Penambahan sedikit pelarut organik yang berbeda

f. Sentrifugasi (Gandjar dan Rohman, 2007).


20

E. Sentrifugasi

Sentrifugasi merupakan suatu tekhnik pemisahan suatu partikel saat

diberikan gaya terapan sentrifugal. Metode ini didasarkan pada perbedaan tingkat

sedimentasi partikel ukuran yang berbeda dan berat jenis (Wilson, 2001).

Sentrifugasi adalah nama umum yang diberikan untuk metode pemisahan

yang melibatkan rotasi sumbu tetap untuk menghasilkan gaya sentrifugal (g).

Kekuatan gaya sentrifugal ini mengakibatkan zat turun melalui media cair dan

jatuh atau mengalami sedimentasi yang bervariasi terutama sesuai dengan densitas

zat dan ukuran. Kepadatan zat yang berbeda atau ukuran sedimen pada tingkat

yang berbeda dan di beberapa titik tertentu secara fisik akan terpisah satu sama

lain. Sedimentasi zat dapat di gambarkan dengan persamaan Stokes untuk

penyelesaian partikel di medan gravitasi.

dimana v = laju sedimentasi atau kecepatan partikel; d = diameter partikel; ℮p =

kepadatan partikel; ℮L = densitas zat cair; n = viskositas medium cair; g = gaya

gravitasi. dari persamaan stoke dapat dilihat bahwa:

a. Laju sedimentasi partikel sebanding dengan ukuran partikel

b. Tingkat sedimentasi sebanding dengan perbedaan kepadatan antara partikel

dan cairan

c. Tingkat sedimentasi adalah nol ketika kepadatan partikel adalah sama dengan

densitas cairan


21

d. Penurunan tingkat sedimentasi sebagai viskositas meningkat cair

e. Peningkatan laju sedimentasi sebagai kekuatan peningkatan gravitasi (Sharpe,

1998).

F. Solid Phase Extraction (SPE)

Solid Phase Extaction (SPE) merupakan salah satu kemungkinan dalam

persiapan sampel dengan berdasarkan metode penjebakan analit. Menggunakan

metode ini analit terjebak dalam adsorben, dan kemudian dicuci dengan volume

minimal pelarut (Nollet, 2005).

Tahapan pertama menggunakan SPE adalah dengan mengkondisikan

penjerap menggunakan pelarut yang sesuai. Penjerap nonpolar seperti C18 dan

penjerap penukar ion dikondisikan dengan mengalirinya menggunakan metanol

lalu aquadest. Pencucian yang berlebih menggunakan air akan mengurangi

recovery analit. Penjerap-penjerap polar seperti diol, sianol, amino, dan silika

harus dibilas dengan menggunakan pelarut nonpolar seperti metilen klorida

(Rohman, 2009).

Solid Phase Exraction (SPE) merupakan teknik yang relatif baru dan

cepat berkembang sebagai alat utama yang digunakan untuk pra perlakuan sampel

atau clean-up sampel yang kotor. Keunggulan SPE dibandingkan dengan ekstraksi

cair-cair adalah:

a. Proses ekstraksi lebih sempurna

b. Pemisahan analit dari pengganggu yang mungkin ada menjadi lebih efisien

c. Mengurangi pelarut organik yang digunakan


22

d. Fraksi analit yang diperoleh lebih mudah dikumpulkan

e. Mampu menghilangkan partikulat

f. Lebih mudah diotomatisasi (Rohman, 2009).

Empat tahapan dalam prosedur SPE, yaitu:

a. Pengkondisian. Catridge (penjerap) dialiri dengan menggunakan

pelarut sampel untuk membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan

nilai pH yang sama, sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak diharapkan

ketika sampel dimasukan dapat dihindari.

b. Retensi (tertahannya) sampel. Larutan sampel dilewatkan ke catridge

baik untuk menahan analit yang dituju, sementara komponen lain terelusi atau

untuk menahan komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang dituju

terelusi.

c. Pembilasan. Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh

komponen yang tidak tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.

d. Elusi. Tahap ini merupakan tahap akhir untuk mengambil analit yang

dituju, jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).

Strategi pertama adalah dengan memilih pelarut yang mampu menahan

semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara itu senyawa-

senyawa yang lain akan terelusi. Analit yang dituju selanjutnya dielusi dengan

menggunakan sejumlah kecil pelarut organik yang akan mengambil analit yang

tertahan pada penjerap. Strategi ini bermanfaat jika analit yang dituju berkadar

rendah. Strategi yang lainnya adalah dengan mengusahakan supaya analit yang


23

dituju keluar (terelusi), sementara senyawa pengganggu tertahan pada penjerap

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 3. Tahapan SPE (Nollet, 2005).

G. Kromatografi Gas

1. Pengertian

Kromaografi adalah suatu metode pemisahan campuran yang didasarkan

pada perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara

dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase gerak yang digunakan,

kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu kromatografi gas dan

kromatografi cair (McNair & Miller, 1998).

Kromatografi gas adalah teknik pemisahan yang mana solut-solut yang

mudah menguap dan stabil dengan pemanasan bermigrasi melalui kolom yang

mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio

distribusinya (Gandjar dan Rohman, 2007).


24

Kromatografi gas pada dasarnya merupakan metode pemisahan yang

tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa tanpa menggunakan baku

pembanding. Optimasi kromatografi gas antara lain sensitivitas dan

selekstivitas/spesifitas instrument terhadap analit yang dianalisis. Polaritas dan

volatilitas dari komponen yang akan dipisahkan menjadi pertimbangan untuk

memilih fase diam yang cocok (Grob, 1995).

Kromatografi Gas merupakan teknik analisis yang cepat, memiliki hasil

yang baik untuk analisis pestisida multikomponen, memiliki sensitifitas tinggi

dengan detektor yang spesifik (Nollet, 2004). Kromatografi gas dapat digunakan

untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan cara

membandingkan waktu retensi dari komponen yang kita analisis dengan waktu

retensi zat baku pembanding (standar) pada kondisi analisis yang sama. Analisis

kuantitatif diakukan dengan cara perhitungan relatif dari tinggi atau luas puncak

kromatogram komponen yang dianalisis terhadap zat baku pembanding (standar)

yang dianalisis (Johnson & Stevenson, 1991).

Komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan di antara

fase diam dan fase gerak. Suatu kromatografi gas yang baik terdiri dari

komponen-komponen penting yaitu gas pembawa dan regulator tekanan, injektor,

kolom, oven, detektor, dan pencatat signal (Rouessac dan Annick, 2007).

2. Prinsip Pemisahan

Pemisahan pada kromatografi gas di dasarkan pada titik didih suatu

senyawa dikurangi dengan interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan fase

diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu


25

menghantarkannya ke detektor. Fase gerak dalam kromatografi gas juga biasa

disebut sebagai gas pembawa. Syarat gas pembawa adalah tidak reaktif, dan

murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor (Gandjar

dan Rohman, 2007).

Pada kromatografi gas, fase diam selalu di tempatkan di dalam sebuah

kolom. Fase diam ini dapat berupa suatu padatan (Kromatografi Gas-Padat/Gas

Solid Chromatography). Cara penyerapan komponen pada kromatografi gas padat

(GSC) merupakan proses adsorpsi pada permukaan, sedangkan Kromatografi Gas

Cair (GLC) dinamakan kromatografi partisi (Soeryadi, 1997).

Pemisahan pada kromatografi gas dapat di lakukan pada suhu tetap yang

biasanya disebut dengan pemisahan isotermal dan dapat dilakukan dengan

menggunakan suhu yang berubah secara terkendali yang disebut dengan

pemisahan suhu terprogram. Pemisahan isotermal paling baik dipakai pada

analisis rutin atau jika kita mengetahui agak banyak sifat sampel yang akan

dipisahkan. Pilihan awal pada pemisahan isotermal ini adalah suhu yang

digunakan beberapa derajat di bawah titik didih komponen campuran utama. Ada

dua hal yang perlu diperhatikan terkait dengan penggunaan pemisahan isotemal

ini, yaitu: (1) terkait dengan pemilihan suhu. Jika suhu yang digunakan terlalu

tinggi maka komponen akan terelusi tanpa terpisah, sementara jika suhu terlalu

rendah maka komponen yang bertitik didih tinggi akan keluar sangat lambat atau

bahkan tetap dalam kolom sehingga akan mengacaukan proses kromatografi

selanjutnya, dan (2) terkait dengan proses kromatografi, karena makin lama suatu

sampel dalam kolom maka semakin lebar alas puncaknya. Kedua hal ini dapat


26

diatasi jika digunakan pemisahan dengan suhu terprogram (Gandjar & Rohman,

2007).

Pemisahan dengan suhu terprogram mempunyai keuntungan, yakni

mampu meningkatkan resolusi komponen-komponen dalam suatu campuran yang

mempunyai titik didih pada kisaran yang luas. Disamping itu, pada suhu

terprogram juga mampu mempercepat keseluruhan waktu analisis, karena

senyawa-senyawa dengan titik didih tinggi akan terelusi lebih cepat (Gandjar &

Rohman, 2007).

3. Performance GC

Pemisahan yang terjadi pada analisis dengan kromatografi gas

dipengaruhi oleh efisiensi kolom dan efisiensi pelarut. Efisiensi kolom

menentukan pelebaran puncak kromatogram. Efisiensi kolom dapat diukur dengan

menghitung jumlah lempeng teoritis (N) dan panjang kolom yang sesuai dengan

plat teoritis (Height Equivalent to a Theoritical Plate, HETP). HETP adalah

panjang kolom yang diperlukan untuk mencapai kesetimbangan komponen

cuplikan diantara fase gerak yang bergerak dan fase diam yang diam. Semakin

banyak jumlah lempeng teoritis, semakin kecil HETP, maka efisiensi kolom

meningkat dan pemisahan yang terjadi akan semakin baik (Jennings, et all., 1987).

Faktor ikutan didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak tepi muka

sampai tepi belakang puncak dibagi dua kali jarak dari maksimum puncak sampai

tepi muka puncak, jarak-jarak tersebut diukur pada titik yang ketinggiannya 5%

dari tinggi puncak di atas garis dasar. Untuk suatu puncak yang simetris, factor


27

ikutan (Tf) besarnya satu, dan besarnya harga Tf ini akan bertambah jika

kromatogram semakin tambah berekor (Jennings, et all., 1987).

Pemisahan yang sebenarnya dari dua puncak yang berurutan diukur

dengan resolusi atau daya pisah. Resolusi merupakan suatu ukuran keefisienan

kolom dan pelarut yang dapat menerangkan sempitnya puncak dan juga

pemisahan antara dua maksimum puncak. Resolusi didefinisikan sebagai jarak

antara dua puncak dibagi dengan jumlah lebar masing-masing puncak dengan

diukur dari alas puncak. Bila nilai resolusi adalah satu maka kesempurnaan

pemisahan dua puncak adalah 99,7%. Umumnya dalam praktek, nilai resolusi satu

tidak cukup baik karena derajat overlap. Pemisahan yang baik dicapai pada

resolusi sekitar 1,5 atau lebih (Wittkowski & Matissek, 1990).

4. Instrumentasi

Gambar 4. Diagram Skematik Kromatografi Gas (Nagel, 2004)

a. Gas pembawa. Fase gerak dalam kromatografi gas disebut gas

pembawa dan harus murni dan inert secara kimia. Gas pembawa yang umumnya

digunakan adalah helium, nitrogen, argon, dan hidrogen (Skoog, West, Holler,and

Crouch, 2004).

Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan jenis

detektor yang digunakan. Gas pembawa untuk detektor ECD biasanya adalah N2


28

dengan kecepatan alir 30-60 ml/menit. Untuk setiap pemisahan dengan

kromatografi gas terdapat kecepatan optimum gas pembawa yang tergantung pada

diameter kolom. Kolom kapiler menggunakan kecepatan alir gas yang rendah,

yakni antara 0,2 – 2 mL/menit. Karena kecepatan alir gas pembawa pada kolom

kapiler sangat rendah, maka pada kebanyakan detektor ditambah gas tambahan

yang ditambahkan ke dalam efluen setelah keluar dari kolom tetapi belum

mencapai detektor. Gas tambahan umumnya sama dengan gas pembawa,

meskipun kadangkala digunakan helium. Gas pembawa bekerja paling efisien

pada kecepatan alir tertentu. Gas nitrogen akan efisien jika digunakan dengan

kecepatan alir ± 10 ml/menit, sementara helium akan efisien pada kecepatan alir

40 ml/menit (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 5. Gas yang Digunakan dalam Kromatografi Gas (Grob, 1995)

b. Sample Injector. Ruang injektor atau inlet berfungsi untuk

menghantarkan sampel ke dalam aliran gas pembawa. Sampel yang akan

dikromatografi di masukkan ke dalam ruang suntik melalui gerbang suntik yang

biasanya berupa lubang yang ditutupi dengan septum atau pemisah karet. Ruang

suntik harus dipanaskan tersendiri (terpisah dari kolom) dan umumnya 10 – 15ºC


29

lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum. Jadi seluruh sampel akan menguap

segera setelah sampel disuntikkan (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pada kolom kapiler, sampel yang diperlukan sangat sedikit bahkan

sampai 0,01 μL, berbeda dengan kolom kemas yang memerlukan 1 – 100 μL

sampel. Karena pengukuran secara akurat sulit dilakukan jika sampel yang

disuntikkan terlalu kecil (pada kolom kapiler), maka ditempuh suatu cara untuk

mengecilkan ukuran sampel setelah penyuntikan. Salah satu cara yang dilakukan

adalah dengan menggunakan teknik pemecah suntikan (split injection). Dengan

menggunakan pemecah suntikan ini, sampel yang banyaknya diketahui,

disuntikkan ke dalam aliran gas pembawa dan sebelum masuk ke kolom, gas

pembawa ini dibagi menjadi dua aliran. Satu aliran masuk ke dalam kolom dan

satunya lagi akan dibuang. Aliran relatif dalam kedua aliran ini dikendalikan

dengan sejenis penghambat seperti katup jarum pada aliran yang dibuang. Laju

alir di dalam kedua aliran diukur dan ditentukan nisbah (rasio) pemecahannya.

Jika 1 μL sampel dimasukkan ke dalam pemecah aliran yang mempunyai nisbah

pemecahan 1:100, maka sebanyak 0,01 μL sampel masuk ke dalam kolom dan

sisanya akan dibuang (Gandjar dan Rohman, 2007).

c. Kolom. Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena

di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen

sentral pada kromatografi gas. Terdapat dua jenis tipe kolom yang digunakan

dalam gas kromatografi, yaitu kolom kemas dan kolom kapiler atau sering disebut

open tubular columns. Pada masa lalu, lebih banyak digunakan kolom kemas

untuk melakukan analisis menggunakan gas kromatografi. Untuk aplikasi masa


30

kini, kolom kemas digantikan dengan kolom kapiler karena lebih efisien dan lebih

cepat (Skoog, West, Holler, and Crouch, 2004). Semakin sempit diameter kolom,

maka efisiensi pemisahan kolom semakin besar atau puncak kromatogram yang

dihasilkan semakin tajam. Pada umumnya, seorang analis akan memilih kolom

dengan diameter 0,2 mm atau yang lebih kecil ketika menganalisis sampel dengan

konsentrasi sekelumit atau ketika seorang analis akan memisahkan komponen

yang sangat kompleks (Gandjar dan Rohman, 2007).

Kolom kapiler terbuat dari silica (SiO2) dan dilapisi dengan polymide

(plastik yang mampu menahan suhu 350ºC). Pada bagian dalam terdapat rongga

yang menyerupai pipa, oleh karena itu kolom kapiler juga disebut Open Tubular

Columns. Fase diam melekat mengelilingi dinding dalam kolom. Terdapat 4

macam jenis lapisan pada kolom kapiler ini, yaitu: WCOT (Wall Coated Open

Tubular Column), SCOT (Support Coated Open Tubular Column), PLOT (Porous

Layer Open Tubular Column), dan FSOT (Fused Silica Open Tubular Column).

WCOT (Wall Coated Open Tubular Column) memiliki 0,1 – 5 μm lapisan tipis

fase diam cair yang terdapat pada dinding bagian dalam kolom. SCOT (Support

Coated Open Tubular Column) memiliki partikel solid yang dilapisi dengan fase

diam cair yang terdapat pada bagian dalam dinding. Pada PLOT (Porous Layer

Open Tubular Column) partikel padat sebagai fase diam aktif. Dengan besarnya

luas area yang dimiliki, SCOT dapat menampung sampel lebih besar daripada

WCOT. Performa SCOT berada diantara WCOT dan kolom kemas. Diameter

dalam kolom kapiler memiliki ukuran 0,10 – 0,53 mm dengan panjang 15 sampai

100 m, umumnya adalah 30 m. Menurut Moffat, Osselton, and Widdop (2011)


31

kolom kapiler menghasilkan resolusi, sensitivitas, daya tahan yang lebih baik

daripada kolom kemas (Harris, 2010).

Kolom kapiler sangat banyak dipakai atau lebih disukai oleh para

ilmuwan. Salah satu penyebabnya adalah kemampuan kolom kapiler memberikan

harga jumlah plat teori yang sangat besar (> 300.000 plat). Fase diam yang

dipakai pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase

diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1;

DB-1; SE- 30; CPSIL-5) dan fenil 5% - metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-

52; CPSIL- 8). Fase diam semi polar adalah seperti fenil 50% - metilpolisiloksan

50% (HP-17; DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang polar adalah

seperti polietilenglikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax-20M). Jenis

fase diam akan menentukan urutan elusi komponen-komponen dalam campuran.

Seorang analis harus memilih fase diam yang mampu memisahkan komponen-

komponen dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).

Efisiensi kolom akan meningkat dengan semakin bertambah halusnya

partikel fase diam ini. Semakin kecil diameter partikel fase diam, maka

efisiensinya akan meningkat. Ukuran partikel fase diam biasanya berkisar antara

60 – 80 mesh (250 – 170 μm) (Gandjar dan Rohman, 2007).

d. Detektor penangkap electron (Electron capture detector/ECD).

Detektor penangkap elektron (ECD) merupakan detektor yang dilengkapi dengan

sumber radioaktif yaitu tritium (3H) atau nikel (63Ni) yang menghasilkan partikel-

β. Partikel radioaktif ini bertubrukan dan mengioniasi gas pembawa (make up) gas

(Grob, 1995). Tegangan listrik yang dipasang antara katoda dan anoda tidak


32

terlalu tinggi, antara 2-100 volt. Dasar kerja detektor ini adalah: penangkapan

elektron oleh senyawa yang memiliki afinitas terhadap elektron bebas, yaitu

senyawa yang mempunyai unsur-unsur elektronegatif. Bila fase gerak (gas

pembawa N2) masuk ke dalam detektor maka sinar β akan mengionisasi molekul

N2 menjadi ion-ion N2+ dan menghasilkan elektron bebas yang akan bergerak ke

anoda dengan lambat. Dengan demikian, di dalam ruangan detektor terdapat

semacam awan elektron bebas yang dengan lambat menuju anoda. Elektron-

elektron yang terkumpul pada anoda akan menghasilkan arus garis dasar (baseline

curent) yang steady dan memberikan garis dasar pada kromatogram. Bila

komponen sampel (senyawa dengan unsur elektronegatif) dibawa fase gerak

masuk ke ruang detektor yang dipenuhi awan elektron, maka senyawa ini akan

menangkap elektron sehingga membentuk ion molekul negatif. Ion molekul ini

akan dibawa oleh fase gerak (carrier gas). Akibatnya setiap partikel negatif

dibawa keluar detektor, berarti menyingkirkan satu elektron dari sistem sehingga

arus listrik yang steady tadi akan berkurang. Pengurangan arus ini akan dicatat

oleh rekorder sebagai puncak pada kromatogram (Gandjar & Rohman, 2007).

Detektor merupakan perangkat yang di letakkan pada ujung kolom

tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil

pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang

berfungsi mengubah sinyal gas pembawa gan komponen-komponen di dalamnya

menjadi sinyal elektronik (Gandjar dan Rohman, 2007).


33

e. Oven. Pemilihan temperatur pada kromatografi gas tergantung pada

beberapa faktor. Temperatur injeksi harus relatif tinggi yang memberikan

kecepatan penguapan yang paling tinggi sehingga memberikan resolusi yang baik.

Temperatur injeksi terlalu tinggi dapat menyebabkan karet septum menjadi rusak

dan menyebabkan tempat injeksi menjadi kotor. Temperatur kolom berhubungan

dengan kecepatan, sensitivitas, dan resolusi. Pada temperatur kolom yang tinggi,

komponen sampel lebih banyak berada pada fase gas sehingga akan cepat terelusi

tetapi resolusi nya menjadi buruk. Pada temperatur rendah, komponen sampel

akan memiliki lebih banyak waktu untuk berada pada fase diam dan terelusi

secara perlahan, resolusi menjadi meningkat tetapi sensitivitas menurun karena

puncak yang dihasilkan akan melebar. Temperatur detektor harus cukup tinggi

untuk mencegah kondensasi sampel (Christian, 2004).

H. Metode Kuantifikasi

Metode kuantifikasi dan proses kalibrasi adalah sama digunakan pada

suatu teknik instrumental untuk analisis senyawa organic seperti contohnya pada

insteumen kromatografi gas. Determinasi kuantitatif suatu komponen organic

didasarkan pada perbandingan respons instrumental dari suatu senyawa yang tidak

diketahui dengan kalibran. Kalibran disiapkan dengan referensi standar yang

diketahui memiliki kemurnian yang tinggi. Beberapa pendekatan untuk

kuantifikasi yaitu dengan menggunakan metode standar eksternal, metode standar

internal dan metode standar adisi (Czichos, 2006).


34

1. Metode Standar Eksternal

Metode standar eksternal merupakan metode yang digunakan untuk

menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu

sampel dengan menggunakan plot kalibrasi kurva baku eksternal. Larutan-larutan

kurva baku eksternal disiapkan dan dianalisis secara terpisah dari kromatogram

senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa

tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan, selanjutnya

diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa tersebut

ditentukan dengan metode grafik dari plot kalibrasi atau secara numerik (Rohman,

2009).

2. Metode Standar Internal

Metode standar internal berdasarkan pada perbandingan respon relatif

dari analit terhadap respon satu atau lebih suatu senyawa. Standar internal di

tambahkan ke dalam sampel dan kalibran. Baku standar internal merupakan

senyawa yang berbeda dengan analit, meskipun demikian senyawa ini harus

terpisah dengan baik selama proses pemisahan. Baku internal dapat

menghilangkan pengaruh karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran

sampel atau konsentrasi karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel

atau konsentrasi karena variasi instrument. Suatu baku internal digunakan jika

suatu sampel memerlukan perlakuan sampel yang sangat signifikan. Perlakuan

yang dimaksud adalah tahapan-tahapan yang meliputi derivatisasi, ekstraksi,

filtrasi, dan sebagainya yang mengakibatkan sampel berkurang. Jika baku internal


35

ditambahkan pada sampel sebelum dilakukan preparasi sampel, maka baku

internal dapat menjadi faktor koreksi hilangnya sampel.

3. Metode Standar Adisi

Metode standar adisi didasarkan pada adisi suatu senyawa kalibran yang

diketahui kuantitas atau konsentrasinya kemudian ditambahkan pada sampel yang

tidak diketahui jumlah/konsentrasinya (dengan atau tanpa penambahan standar

internal). Dengan menambahkan paling sedikit dua atau lebih alikuot standar,

suatu kurva dapat disiapkan. Konsentrasi analit dalam sampel dapat ditentukan

dengan ekstrapolasi kurva kalibrasi. Respon analit harus linier pada kisaran

konsentrasi yang digunakan dalam kurva baku kalibrasi. Suatu pendekatan dalam

standar adisi adalah dengan membagi sampel ke dalam beberapa bagian yang

sama kemudian diadisi dengan konsentrasi standar adisi yang meningkat.

Selanjutnya dianalisis antara respon analit dengan konsentrasi yang dinjeksikan

(Rohman, 2009).

I. Validasi Metode Analisis

Metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang dapat diterima

dalam mendapatkan hasil analisis suatu sampel. Validasi merupakan proses

verifikasi metode yang sesuai dengan tujuan analisis. Metode dapat berupa hasil

pengembangan metode lain, di dapat dari suatu literatur atau bahkan dari pihak

ketiga lainnya. Suatu metode mungkin diadaptasikan atau dimodifikasi untuk

dapat memenuhi persyaratan dan kemampuan dari sebuah laboratorium dan atau

untuk tujuan metode yang akan digunakan. Beberapa garis besar kriteria validasi


36

metode residu fungisida meliputi akurasi, presisi, kisaran linearitas, linearitas, dan

LOQ (CCPR, 2003).

1. Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan nilai antara hasil uji dan hasil referensi

yang diketahui. Akurasi dapat ditetapkan dari hasil perolehan kembali (%

recovery). Recovery merupakan fraksi atau persentase dari perolehan kembali

suatu analit setelah ekstraksi dan analisis sampel kosong yang telah ditambahkan

analit dengan konsentrasi yang diketahui (adisi menggunakan reference material).

Suatu % recovery yang dikatakan memenuhi parameter validasi metode residu

fungisida jika berada pada rentang 70 % - 125% untuk konsentrasi 10 µg/kg

(ppb) (AOAC, 2002).

2. Presisi

Presisi adalah Kedekatan antara hasil uji yang diperoleh di bawah kondisi

yang ditetapkan. Presisi dapat ditentukan dengan ≥ 3 replikasi pada ≥ 5 level.

Presisi dapat ditetapkan dengan melihat % RSD. Suatu metode dikatakan

memiliki repeatability yang baik jika % RSD ≤ 20 % (CCPR, 2014) atau kurang

dari 32% pada konsentrasi 10 µg/kg (ppb) (AOAC, 2002). .

3. Linearitas dan Rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon

yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik,

proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita, 2004). Suatu

linearitas metode analisis reidu fungisida dapat dikatakan baik jika ≥ 0,990

(CCPR, 2003).


37

4. Limit of Quantitation (LOQ)

LOQ merupakan konsentrasi terkecil analit yang dapat diukur. Umumnya

didefinisikan sebagai konsentrasi minimum analit dalam sampel uji yang dapat

ditentukan dengan presisi yang dapat diterima (pengulangan) dan akurasi di

bawah kondisi yang dinyatakan dalam hasil uji. LOQ dapat diterima jika kurang

dari ½ MRL dan positive list sebesar 0,01 µg/g (CCPR, 2003).

J. Landasan Teori

Azoxystrobin merupakan fungisida turunan strobulin yang bekerja secara

sistemik dan termasuk dalam golongan methoxyacrylates. Mekanisme aksi

azoxystrobin adalah menginhibisi respirasi mitokondria jamur. Intrumen GC-ECD

dapat dikatakan sudah dalam kondisi yang optimum jika mendapatkan N, Rs dan

Tf yang memenuhi persyaratan. Setelah didapatkan konsidi yang dapat

memisahkan analit dengan berbagai impurities maka dilakukan pengujian

keajegan dari sistem GC-ECD dengan menginjeksikan enam kali konsentrasi yang

sama pada kondisi yang sama. Kemudian dilanjutkan dengan menentukan analisis

kuantitatif dari GC-ECD yang meliputi % RSD RF, % D, linearitas, kisaran

linearitas, IDL dan IQL. Ekstraksi azoxystrobin dilakukan dengan metode

QuEChERS dan pengendapan menggunakan sentrifugasi. Clean-up dilakukan

dengan menggunakan kolom SPE C18 dimana bagian nonpolar dari azoxystrobin

akan terjerab dalam fase diam. Determinasi menggunakan GC-ECD. Hasil

validasi metode analisis dikatakan baik jika memenuhi persyaratan akurasi,

presisi, kisaran linearitas, linearitas dan LOQ.


38

K. Hipotesis

1. Pelarut dengan polaritas yang mendekati azoxystrobin dapat digunakan

sebagai pelarut ekstraksi azoxystrobin pada kulit dan daging buah melon

secara kuantitatif

2. SPE C18 dapat digunakan sebagai sarana clean-up untuk memisahkan matriks

dengan azoxystrobin dengan fase gerak yang sesuai

3. Azoxystrobin dapat dipisahkan dengan matriks dengan GC dan ditetapkan

dengan detector ECD


BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni karena terdapat perlakuan

terhadap subjek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi standar

azoxystobin yang ditambahkan, volume fase gerak saat clean-up, lama

sentrifugasi, kecepatan sentrifugasi.

2. Variabel Tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah hasil fraksi elusi metanol

saat clean-up, jumlah supernatan yang diperoleh, lama sentrifugasi, kecepatan

sentrifugasi, resolusi (Rs), jumlah lempeng (N), tailing factor (Tf), waktu retensi

(tR), koefisien korelasi, limit of detection (LOD) atau IDL, IQL, limit of

quantification (LOQ), LLMV, presisi, dan hasil % recovery validasi metode

analisis.

3. Variabel Pengacau Terkendali

Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian

pelarut yang digunakan. Hal tersebut diatasi dengan menggunakan pelarut pro

39


40

analysis (p.a.) yang memiliki kemurnian tinggi, berat sampel melon, jumlah

garam, conditioning SPE, volume pencucian SPE dan waktu alir SPE.

C. Definisi Operasional

a. Azoxystrobin adalah fungisida golongan strobulin yang dianalisis dalam

penelitian ini

b. QuEChERS adalah cara cepat dan mudah dalam penentuan multiresidu

pestisida dengan menggunakan ekstraksi asetonitril dan garam MgSO4, NaCl,

Natrium sitrat, disodium sitrat sesquihidrat dilanjut dengan partisi dispersive-

SPE.

c. Conditioning SPE adalah proses mengaliri SPE dengan menggunakan 3 mL

metanol dan 3 mL aquabidest secara berurutan hingga catrid SPE C18 benar-

benar terbuka sempurna

d. GC-ECD adalah seperangkat sistem Gas Chromatography yang dilengkapi

dengan Electron Capture Detector (ECD)

e. Parameter validasi metode analisis adalah semua parameter yang

dipersyaratkan agar diperoleh metode analisis yang valid diantaranya akurasi,

presisi, koefisien korelasi, LOD dan LOQ

f. Standar internal adalah standar dekachlorobifenil (DCB) yang ditambahkan

untuk mengoreksi kesalahan saat proses berlangsung

g. Homogenisasi sampel adalah proses menghomogenisasi melon tanpa adanya

penambahan air


41

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku azoxystrobin

99,7% (Syngenta), standar dekachlorobifenil (DCB) (Sigma Aldrich) , asetonitril,

metanol, MgSO4, NaCl, Natrium sitrat, disodium sitrat hydrogenate sesquihydrate

dengan kualitas pro analysis (E. Merck), aquadest (Laboratorium Kimia Analisis

Instrumental Farmasi USD), aquabidest (Laboratorium Kimia Analisis

Instrumental Farmasi USD), dan sampel melon dari pedagang buah di beberapa

Pasar Yogyakarta.

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kromatografi gas HP

5890 series II dengan dilengkapi detektor ECD 63Ni dan kolom kapiler non polar

(5%-phenyl)-methylpolysiloxane, 12–50 m, i.d 0,20–0,32 mm, d.f. 0,11–0,52 µm,

neraca analitik (OHAUS Carat Series PAJ 1003, max 60/120 g, min 0,001 g, d =

0,01/0,1 mg, e = 1 mg), kolom SPE C18 400 mg, homogeniser sample, vortex, hot

plate, termometer, sentrifuse, botol plastik sentrifugasi 15 ml, ultrasonifikasi,

syringe, mikropipet, pisau, sarung tangan, seperangkat komputer dengan CBM-

102 (Shimadzu), perangkat lunak Shimadzu Labsolutions: GC Solution versi

2.30.00SU4, perangkat lunak Powerfit v.6.05 dan alat-alat gelas yang lazim

digunakan di laboratorium analisis.


42

F. Tata Cara Penelitian

Garis besar dari penelitian ini dibagi menjadi uji kesesuaian sistem GC-

ECD, preparasi sampel melon, optimasi clean-up, validasi metode analisis residu

azoxystrobin dalam buah melon. Metode dikatakan valid jika dapat memenuhi

parameter validitas yang meliputi akurasi, presisi, koefisien korelasi, LOD dan

LOQ.

1. Prosedur Pencucian Alat-Alat Gelas

Cuci alat dengan menggunakan aquadest sebanyak tiga kali dan ditunggu

hingga kering. Cuci kembali alat menggunakan aceton tiga kali kemudian

keringkan. Terakhir cuci alat menggunakan metanol dengan tiga kali pengulangan

dan keringkan.

2. Pembuatan Larutan Stok Azoxystrobin dan DCB

a. Pembuatan stok azoxystrobin. Ditimbang sejumlah lebih kurang 11,4

mg baku azoxystrobin dan larutkan dalam 1mL toluen sehingga didapatkan

konsentrasi stok induk sebesar 11,4 mg/mL.

b. Pembuatan stok DCB. Timbang 10mg DCB dan larutkan dalam 100

mL pelarut. Ambil 10 uL dan add hingga volume 1000 uL.

3. Pembuatan Larutan Intermediet Azoxystrobin

a. Pembuatan larutan intermediet A. Ambil 40 µL dari stok induk dan

larutkan dalam 1000 µL heksan sehingga didapatkan larutan intermediet A

dengan konsentrasi 0,456 µg/µL.


43

b. Pembuatan larutan intermediet B. Ambil 10 µL larutan intermediet A

diencerkan hingga volume 1000 µL heksan, sehingga didapatkan konsentrasi

0,456 x 10-2 µg/ µL.

4. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD

Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum metode analisis terpilih

dilaksanakan. Secara normal terdapat variasi dalam peralatan dan teknik analisis,

maka uji kesesuaian system perlu dilakukan untuk memastikan sistem operasional

akhir adalah efektif dan memberikan hasil yang sesuai dengan tujuan analisis.

Kelayakan sistem dilihat dari beberapa parameter yaitu presisi, linearitas dan

sensitivitas sistem GC-ECD.

a. Optimasi sistem GC-ECD. Optimasi terhadap sistem GC-ECD

dilakukan dalam uji kesesuaian sistem. Optimasi instrumen GC-ECD dilakukan

sesuai dengan prosedur yang ditetapkan dalam petunjuk operasional alat yang

dilakukan oleh Sanjayadi (2014).

b. Kinerja kualitatif GC-ECD. Kinerja GC-ECD meliputi pemisahan

standar azoxystrobin pada sistem atau performa GC-ECD, dan keajegan sistem.

Dilakukan dengan menginjeksikan larutan intermediet B dengan kadar 0,137 ng

pada GC-ECD yang sudah dioptimasi sebanyak enam kali dibawah kondisi sistem

yang sama.

c. Kinerja kuantitatif GC-ECD. Dalam analisis kuantitatif GC-ECD

meliputi parameter-parameter presisi, linearitas, rentang linearitas, sensitivitas

LOD/ IDL dan IQL, akurasi.


44

1) Presisi sistem GC-ECD. Repeatability sistem dilihat dari nilai % RSD. Nilai

% RSD ditetapkan dengan cara menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan

intermediet B dengan jumlah volume pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5

µL; ; 4 µL, 3 µL, 2 µL yang mana masing-masing ditambahkan 2 µL standar

internal dan diencerkan menggunakan heksan hingga volume 200 µL.

Injeksikan pada GC-ECD dengan menggunakan volume injeksi 2 µL

sehingga didapatkan massa berturut-turut sebesar 0,912 ng; 0,456 ng; 0,319

ng; 0,228 ng; 0,182 ng, 0,137 ng dan 0,091 ng. Diperoleh respon sistem yang

berupa luas puncak azoxystrobin pada tiap kadar, sehingga dapat dihitung

nilai rata-rata respon factor (RF) , standar deviasi RF dan % RSD RF.

2) Linearitas hubungan kadar baku azoxystrobin dengan respon sistem GC-

ECD. Koefisien korelasi (r) digunakan sebagai penentu linearitas hubungan

kadar baku azoxystrobin dengan respon yang berupa luas puncak

azoxystrobin/standar internal. Nilai parameter (r) dapat ditetapkan dengan

menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan intermediet B dengan volume

pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL dan 2 µL yang masing-

masing ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan menggunakan

heksan hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD dengan

menggunakan volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa berturut-turut

sebesar 0,912 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182 ng; 0,137 ng; dan

0,091 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan program statistik

powerfit hingga didapatkan hubungan antara kadar azoxystrobin dengan rasio


45

puncak azoxystrobin/luas puncak DCB serta nilai statistik lain seperti

intersep (a) dan slope (b).

3) Sensitivitas sistem GC-ECD. Beberapa parameter sensitivitas adalah nilai

LOD/ IDL, IQL dan slope. Parameter ini dapat ditetapkan dengan cara

menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan intermediet B dengan volume

pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL; 2 µL; 1 µL yang

masing-masing ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan

menggunakan heksan hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD

dengan menggunakan volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa

berturut-turut sebesar 0,912 ng; 0,684 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182

ng; 0,137 ng; 0,091 ng; 0,046 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan

program statistik powerfit hingga didapatkan hubungan antara kadar

azoxystrobin dengan rasio puncak azoxystrobin/luas puncak DCB serta nilai

statistik lain seperti LOD/IDL, IQL dan slope (b).

4) Akurasi. Pengukuran kedekatan antara nilai yang sebenarnya dengan nilai

yang terukur dapat ditetapkan dengan menggunakan % D. Semakin kecil % D

maka kedekatan semakin baik. Parameter ini dapat ditetapkan dengan cara

menginjeksikan larutan intermediet B dengan volume pengambilan 20 µL; 15

µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL; 2 µL; 1 µL yang masing-masing

ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan menggunakan heksan

hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD dengan menggunakan

volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa berturut-turut sebesar 0,912

ng; 0,684 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182 ng; 0,137 ng; 0,091 ng;


46

0,046 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan program statistik

powerfit hingga didapatkan persamaan y=bx+a untuk dapat menghitung % D.

5. Preparasi Sampel Melon

a. Penetapan kadar air dalam buah melon. Homogenisasi kulit, daging

dan whole melon secara terpisah tanpa penambahan air. Timbang masing-masing

sampel 10 gram. Letakan dalam cawan petri kemudian oven hingga bobot tetap

dalam suhu 65°C.

b. Optimasi lama sentrifugasi. Homogenisasi sampel. Timbang sebanyak

kurang lebih 5 gram sampel yang telah homogen dan masukan dalam tabung

sentrifugasi 15mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ;

0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 mL asetonitril. Gojog dengan kuat selama 1

menit kemudian vortex selama 2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000rpm

selama 5 menit ; 10 menit dan 15 menit. Bandingkan hasil supernatan yang

diperoleh.

6. Optimasi Clean-Up Menggunakan SPE C18

a. Penentuan kapasitas berat SPE. Homogenisasi melon hingga

homogen. Timbang 10 gram sampel dan masukan dalam tabung sentrifugasi 50

mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H

citrate 1.5H2O dan 10 ml asetonitril dan kemudian gojok dengan kuat selama 1

menit. Vortex selama 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan

5000 rpm. Ambil 1 mL supernatan dan masukan dalam flakon. Kemudian oven

hingga beratnya tetap. Timbang berat sampel yang telah kering, kemudian hitung

kapasitas berat SPE dengan rumus:


47

Berat sampel = Kapasitas SPE x 5%

b. Optimasi tahap washing saat clean up SPE. Timbang 5 gram sampel

yang telah dihomogenkan, tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate

2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog dengan kuat

selama 1 menit, vortex selama 2 menit dan sentrifugasi 5 menit dengan kecepatan

5000rpm. Ambil 3 mL supernatan kemudian adisi dengan 2 µL standart

intermediet A. Keringkan lalu tambahkan 1 mL aquabidest dan ultrasonifikasi

selama 5 menit. Loading sampel ke SPE dengan kecepatan alir maksimal 1

ml/menit. Washing dengan berbagai macam komposisi pelarut, antara lain: 5 mL

aquabidest dan 5 mL metanol 5%. Elusikan 3 ml metanol dan tampung dalam

flakon. Keringkan hasil elusi dan hasil washing kemudian larutkan dalam 100 µL

heksan. Masing-masing hasil eluat metanol setelah diwashing menggunakan 5 %

metanol dan 100% aquabidest, diinjeksikan dalam GC-ECD dengan volume

injeksi 2 µL.

c. Optimasi tahap elusi untuk dapat menarik analit. Penarikan analit

dilakukan dengan memfraksinasi jumlah elusi metanol. Timbang 2 sampel yang

telah dihomogenkan dengan berat masing-masing 5 gram dan masukan dalam

tabung sentrifugasi 15 mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate

2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 mL asetonitril. Gojog dengan kuat

selama satu menit dan vortex selama dua menit. Lakukan sentrifugasi dengan

kecepatan 5000rpm selama 5 menit. Ambil 3 mL supernatan dan masukan dalam

flakon. Adisi menggunakan larutan intermediet A dengan volume 50 µL.

Kemudian keringkan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath. Larutkan hasil


48

pengeringan dalam 1 mL aquabidest dan lakukan ultrasonifikasi selama 5 menit.

Loading sampel pada SPE yang telah di conditioning. Washing dengan 5 mL

aquabidest dan tunggu hingga kering dengan bantuan gas nitrogen. Lakukan 5

kali fraksinasi metanol secara kuantitatif, dimana penggunaan metanol pada tiap

fraksi sebanyak 1 mL. Tampung hasil fraksinasi dalam flakon yang berbeda-beda.

Kemudian keringkan dengan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath.

Larutkan dengan menggunakan heksan 100 µL dan injekan pada GC-ECD yang

telah teroptimasi.

d. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali.

Homogenisasi melon hingga homogen, timbang tiga sampel masing-masing

sebanyak 5 gram dan masukan dalam tiga tabung sentrifugasi 15mL. Adisi

menggunakan 15 µL larutan intermediet B. Tambahkan pada masing-masing

tabung 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate

1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog dengan kuat selama 1 menit dan vortex selama

2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Ambil 3 ml

supernatan dan masukan dalam flakon. Uapkan dengan menggunakan gas nitogen

hingga kering. Larutkan hasil pengeringan dalam 500 µL aquabidest dan

ultrasonifikasi selama 5 menit. Elusikan ketiga sampel yang diadisi menggunakan

15 µL larutan intermediet B kedalam satu SPE yang sama (SPE A), dengan tiap

kali pencucian menggunakan 30 ml metanol dan 10 ml aquabidest. Atur

kecepatan alir SPE maksimal adalah 1 ml/menit. Washing dengan menggunakan 5

ml aquabidest. Elusi dengan 3 ml metanol kemudian tampung hasil elusi

menggunakan flakon. Uapkan tiga eluat yang dihasilkan hingga kering dalam


49

flakon yang berbeda-beda, kemudian larutkan dalam 100 µL heksan untuk siap

diinjek ke GC.

7. Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah Melon

Parameter validasi yang akan dievaluasi dalam metode ini adalah akurasi,

presisi, linearitas, kisaran linearitas dan limit of quantification (LOQ) dengan

menggunakan metode adisi.

Proses validasi ini menggunakan 81 sampel dibagi menjadi tiga

perlakuan adisi. Adisi standar azoxystrobin yang dilakukan pada awal sebelum

ekstraksi (Jalur A), sebelum clean up (Jalur B), dan sebelum determinasi GC

(Jalur C). Tiap jalur diadisi dengan 9 tingkat konsentrasi azoxystrobin yang dibuat

dari 1 µL, 2 µL, 3 µL, 5 µL, 7 µL, 10 µL, 13 µL, 16 µL,20 µL larutan intermediet

B. Tiap konsentrasi pada masing-masing jalur direplikasi 3 kali. dan satu sampel

blanko untuk semua keseluruhan proses. Adapun yang dimaksud proses ekstraksi,

clean up dan determinasi adalah sebagai berikut:

a. Ekstraksi QuEChERS. Timbang sampel sebanyak 81 sampel melon

yang telah dihomogenkan dengan berat masing masing sampel 5 gram, masukan

dalam tabung sentrifugasi 15mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3

citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog selama

satu menit dengan kuat lalu vortex selama 2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan

5000 rpm selama 5 menit. Ambil semua supernatan dan lakukan kembali

reekstraksi dengan menambahkan 5 ml asetonitril. Campurkan kedua hasil


50

supernatan yang diperoleh ±10 ml kemudian masukan dalam flakon dan

keringkan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath.

b. Clean-up menggunakan SPE. Conditioning SPE dengan mengaliri

5ml metanol dan 5 ml aquabidest secara berurutan. Larutkan supernatan hasil

ekstraksi yang telah dikeringkan ke dalam 500 µL aquabidest dan ultrasonifikasi

selama 5 menit. Masukan hasil ultrasonifikasi ke dalam SPE yang telah

diconditioning. Washing dengan mengaliri 5 ml aquabidest dan tunggu hingga

kering. Elusi dengan 3 ml metanol dan tampung hasil menggunakan flakon

kemudian keringkan. Tambahkan 2 µL DCB dan larutkan dalam 200 µL hexan

kemudian injek ke GC dengan volume 2 µL.

c. Determinasi GC-ECD. Tambahkan 2 µL DCB pada hasil pengeringan

clean-up dan larutkan dalam 200 µL hexan kemudian injek ke GC dengan volume

2 µL.Akurasi dapat didapatkan dari hasil perolehan kembali pada tiap seri kadar

kurva baku adisi. Presisi ditentukan dari hasil perhitungan simpangan baku

(standard deviation). Linearitas dan limit of detection (LOD) diperoleh melalui

kurva baku solven. Limit of quantification (LOQ) didapatkan dengan

menggunakan kurva baku adisi.

G. Analisis Hasil Penulisan

1. Analisis Kualitatif GC-ECD

Optimasi kromatografi gas dilihat melalui kecepatan alir gas pembawa,

initial temperature, suhu injektor, suhu kolom, suhu oven, dan suhu detektor yang


51

menghasilkan pemisahan optimum. Parameter pemisahan telah optimum antara

lain resolusi (Rs), tailing factor (Tf), dan jumlah plate (N).

a. Resolusi (Rs). Pemisahan peak dapat dikatakan baik jika terjadi

pemisahan 6σ atau Rs ≥ 1,5 (Grob,1995).

(Grob, 1995).

Keterangan :

tR = waktu retensi

w1 dan w2 = lebar area

b. Jumlah plate (N). Nilai N yang dipersyaratkan secara umum > 7000

(Grob,1995).

(Grob, 1995).

Keterangan :

tR = waktu retensi

w = lebar dasar puncak


52

c. Tailing factor (Tf). Nilai Tf yang masih dapat diterima adalah ≤ 1,2.

Jika Tf lebih besar dari 1,2 maka kromatrogram tersebut mengalami pengekoran

(tailing) (Dolan et al, 2002).

d. Keajegan. Ratio tR standar/standar internal dan rasio luas area

standar/DCB dari penginjekan 6 kali. Keajegkannya dihitung dengan melihat nilai

% RSD yang tidak boleh lebih dari 20% (Sanco, 2013). Dengan rumus

% RSD = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎

𝑥 100%

(Harmita, 2004).

2. Analisis Kuantitatif GC-ECD

a. Presisi. Presisi diperoleh dengan cara melihat kedekatan antara

penginjekan rasio luas area azoxystrobin/standar internal. Presisi diperoleh dari

perhitungan secara matematis terhadap besarnya simpangan baku data.

% RSD = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎

𝑥 100%

Tabel III. Kriteria % RSD Validasi Metode Analisis

(AOAC, 2012).


53

b. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang

diperoleh dari mengeplotkan kadar azoxystrobin dengan rasio luas puncak

azoxystrobin/standar internal dari data kurva baku dalam regresi linear yang dapat

diolah secara statistik menggunakan program Powerfit (Utrech University

FacµLteit Scheikunde). Nilai R2 ≥0,99 (AOAC, 2002).

c. Sensitivitas. Sensitivitas GC-ECD dapat ditentukan dengan

menghitung LOD dengan rumus:

LOD = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏

(USDA/AMS PDP, 2015).

d. Respon Faktor (RF) adalah rasio antara sinyal yang dihasilkan oleh

suatu analit, dan kuantitas analit yang menghasilkan sinyal.

RF = 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 𝑠𝑖𝑛𝑦𝑎𝑙 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑎𝑚𝑏𝑎ℎ𝑘𝑎𝑛


e. Percent difference (% D). %D diterima jika ≤ 20 % dengan rumus:


Keterangan :

c1 = konsentrasi standar yang diketahui yang dapat dikuantifikasi

c2 = konsentrasi yang dihitung dari kurva kalibrasi

3. Pengukuran Kadar Air dalam Sampel Melon


54

Dilakukan dengan menghitung kadar air konstan pada tiap sampel kulit,

daging dan whole melalui rumus

Kadar air = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑒𝑡𝑎𝑝 𝑠𝑒𝑡𝑒𝑙𝑎ℎ 𝑑𝑖𝑜𝑣𝑒𝑛𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑑𝑖𝑜𝑣𝑒𝑛

𝑥 100%

4. Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah Melon

a. Akurasi. Akurasi diperoleh dengan menghitung perolehan kembali

(percent recovery) dari azoxystrobin. Akurasi dihitung dengan rumus:

Perolehan kembali (recovery) = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑖𝑘𝑒𝑡𝑎ℎ𝑢𝑖

𝑥 100%

b. Presisi. Presisi diperoleh dari perhitungan secara matematis terhadap

besarnya simpangan baku (standard deviation) data.

Kesalahan Acak (% KV) = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎

𝑥 100%

c. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang

diperoleh dari mengeplotkan kadar azoxystrobin dengan rasio luas puncak

azoxystrobin/standar internal DCB dari data kurva baku dalam regresi linear yang

dapat diolah secara statistik menggunakan program Powerfit (Utrech University

Faculteit Scheikunde). Didapatkan persamaan y =bx + a.

d. Limit of Quantification (LOQ). LOQ diperoleh dengan menghitung

simpangan baku dari intercept kurva baku adisi dan diolah menggunakan

persamaan matematis secara statistik menggunakan program Powerfit (Utrech

University Faculteit Scheikunde). LOQ dihitung dengan menggunakan rumus:

LOQ = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏


55

H. Rancangan Penelitian

1. Optimasi Washing SPE

Homogenisasi melon

Timbang 5 gram

Tambahkan :

2 gram MgSO4

0,5 gram NaCl

0,5 gram Na3CitR

0,25 gram Na2HCitR

Tambahkan 5 mL asetonitril

Gojog 1 menit dan vortex 2 menit

Sentrifuge dengan kec. 5000rpm selama 5 menit

Ambil 3 mL supernatant dan adisi dg 2uL intermediet A

Ultrasonifikasi selama 5 menit

Loading sampel dalam SPE


56

Keringkan dan larutkan dalam 200 uL

Tampung hasil eluat

Washing dengan 5%MeOH Washing dengan 100%

Elusikan dengan 3 mL MeOH Tampung hasil

Elusikan dengan 3 mL MeOH

A B

Injeksikan tampungan eluat & tampungan

PEMBUKTIAN HIPOTESIS 1


57

2. Fraksinasi Metanol untuk Menarik Analit

Homogenisasi melon

Timbang 5 gram

Tambahkan :

2 gram MgSO4

0,5 gram NaCl

0,5 gram Na3CitR

0,25 gram Na2HCitR



Sentrifugasi dengan kec. 5000 rpm selama 5 menit

Ambil 3 mL supernatant

Tambahkan 1 ml aquabidest

Tambahkan 50 µL standar larutan A

Uapkan dengan gas N2


58


Loading pada SPE yang telah di conditioning

Washing dengan 5 mL aquabidest

Fraksinasi MeOH masing-masing 1mL sebanyak 5x

1 2 3 4 5

Keringkan

Larutkan dengan 100 µL metanol

Injeksikan pada GC-ECD

Pembuktian Hipotesis 2


59

3. Validasi Metode Analisis

Ekstraksi

Clean up

Determinasi

*Dilakukan melalui tiga jalur adisi standart (A; B; C).

PEMBUKTIAN HIPOTESIS 1-2-3

Sampel + standart

Sampel + standart

Sampel + standart

Kesalahan ekstraksi + clean up + determinasi

Kesalahan clean up + determinasi

Kesalahan determinasi

Sampel blanko

Sampel sesungguhnya

A

B

C


60

4. Preparasi Sampel Buah Melon Step 1 – Extraction Processes

Tambahkan campuran garam :

• 2 g MgSO4 • 0,5 g NaCl • 0,5 g Na3 citrate 2H2O • 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O

Homogenisasi melon hingga homogen

Masukan 5 gram sampel yang telah dihomogenkan dalam tabung sentrifugasi 15 mL


Gojog dengan kuat selama 1 menit & vortex selama 2 menit

Sentrifugasiselama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Tampung semua hasil supernatan dalam flakon

Reekstrasi dengan menambahkan kembali 5 mL asetonitril dalam tabung sentrifugasi

Tampung kembali hasil supernatan dalam flakon yang sama

Uapkan diatas waterbath dengan bantuan gas nitrogen


61

Step 2 – Clean up Processes

Coditioning :

• 5 ml metanol • 5 ml aquabidest

Larutkan dalam 500 µL aquabidest dan ultrasonifikasi selama 5 menit

Loading ekstrak kedalam SPE C18 yang telah diconditioning

Washing menggunakan 5 mL aquabidest

Tampung hasil clean-up dan keringkan

Elusi sampel menggunakan 3 mL metanol

Larutkan dalam 200 µL heksan dan injekkan ke GC dengan volume 2 µL

Pembuktian Hipotesis 2


62

5. Uji Kelayakan SPE Apabila digunakan Lebih dari satu kali

Homogenisasi melon

Timbang 3 sampel masing-masing 5 gram

Adisi dengan 15 uL intermediet B



Sentrifuge dengan kec. 5000rpm selama 5 menit

Ambil 3 mL supernatant

Tambahkan 1 mL aquabidest


Masukan dalam SPE yang telah di conditioning

Tambahkan :

2 gram MgSO4

0,5 gram NaCl

0,5 gram Na3CitR

0,25 gram Na2HCitR


63

Washing menggunakan 3 mL aquabidest

Elusikan dengan 3 mL metanol

Tampung dan keringkan

Cuci SPE dengan 30 mL metanol dan 10 mL aquabidest

Loading sampel ke-2 dengan langkah seperti diatas

Tamping dan keringkan semua hasil ekstrak bersih

Larutkan dalam 200 uL heksan

Injeksikan pada GC-ECD


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penetapan kadar residu azoxystrobin dilakukan menggunakan GC-ECD

karena GC-ECD memiliki sensitivitas yang cukup tinggi dan waktu analisis yang

relatif cepat (Day and Underwood, 2002).

Detector ECD dipilih dalam penelitian ini berdasarkan struktur dari

azoxystrobin yang mengandung atom elektronegatif seperti N dan O yang

mempunyai afinitas terhadap elektron bebas yang berasal dari sumber radio aktif

nikel (63Ni) pada detektor. Gugus elektronegatif tersebut akan menangkap

elektron bebas untuk dibawa keluar ke detektor, sehingga terjadilah pengurangan

jumlah elektron dari sistem. Pengurangan arus akan direkam dan diangggap

sebagai respon kromatogram. Semakin banyak jumlah atom elektronegatif dalam

suatu senyawa maka akan semakin tinggi respon pada GC-ECD (Grob, 1995).

Sensitivitas ECD biasanya ditunjukan melalui deteksi lindan yang dapat mencapai

10 fg per injeksi dikarenakan struktur lindan yang terdiri dari benzene yang

dikelilingi empat Cl yang bersifat elektronegatif (Kenndler, 2004).

Dalam gas liquid chromatography analit akan terdistribusi antara fase

diam cair dan fase gerak gas ideal. Volatilitas suatu senyawa dapat dinyatakan

dalam Henry’s Law constant, dimana semakin besar nilai konstanta henry maka

semakin cepat senyawa tersebut menguap dan menghasilkan tR yang cepat

(Kenndler,2004). Azoxystrobin memiliki konstanta henry yaitu sebesar 7,3 x 10-9

64


65

Pa m3/mol sehingga dapat dianalisis menggunakan GC dengan tR sekitar 30-32

menit.

Melon memiliki kandungan vitamin C yang cukup tinggi, adanya gugus

COOH ini dapat mempengaruhi respon detektor ECD yang digunakan dalam GC.

Mengingat bahwa GC-ECD kurang selektif jika dibandingkan dengan LC-

MS/MS, maka diperlukan modifikasi untuk mendapatkan ekstrak bersih yaitu

dengan adanya proses clean-up menggunakan SPE C18. Diharapkan dengan

adanya clean-up senyawa pengganggu respon detektor tersebut dapat berkurang

sehingga meningkatkan selektifitas dan sensitifitas metode analisis GC-ECD.

Pada metode QuEChERS yang menggunakan sistem dispersive SPE,

kesetimbangan yang terjadi dalam sistem clean-up hanya satu kali, sedangkan

pada kolom SPE kesetimbangan dalam sistem dapat terjadi berulang-ulang

sehingga efisiensi pemisahan semakin meningkat. Hal ini perlu dilakukan karena

detektor ECD sangat sensitif tetapi kurang selektif.

Beberapa optimasi yang penulis lakukan diantaranya adalah uji

kesesuaian sistem GC-ECD, preparasi sampel melon, optimasi clean-up dan

validasi metode analisis residu azoxystrobin dalam buah melon.


66

A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD untuk Menganalisis Azoxystrobin

Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum metode analisis terpilih

dilaksanakan. Secara normal terdapat variasi dalam peralatan dan teknik analisis,

maka uji kesesuaian sistem perlu dilakukan untuk memastikan sistem operasional

akhir adalah efektif dan memberikan hasil yang sesuai dengan tujuan analisis.

1. Optimasi Sistem GC-ECD

Dari hasil optimasi, didapatkan kondisi GC-ECD yang optimum, dengan

spesifikasi sebagai berikut pada Tabel IV

Tabel IV. Hasil Optimasi GC-ECD

Parameter Kondisi optimum 1. Injektor (split) Suhu Injektor 230°C Volume injeksi 2 µL 2. Oven Panjang kolom 25 m Fase diam 5%-phenyl-methylpolysiloxane Temperatur Terprogram: 100°C (3 menit),

30°C/menit, 245°C (30 menit), 30°C/menit, 260°C ( 15 menit)

3. Detektor Detektor ECD 63Ni Suhu detector 295°C 4. Gas Gas N2 UHP flow rate gas 1 ml/menit


67

2. Kinerja Kualitatif GC-ECD

a. Pemisahan standar azoxystrobin pada sistem GC-ECD. Sistem GC-

ECD harus dipastikan performanya dalam memisahkan analit sebelum dilakukan

analisa kualitatif sistem. Azoxystrobin muncul pada tR ±30,024 menit sedangkan

standar internal muncul pada tR ±20,724 menit. Gambar 6 merupakan hasil dari

pemisahan GC-ECD dalam kondisi yang telah optimum.

Gambar 6. Pemisahan Standar Internal, Difenoconazole dan Azoxystrobin

Pemisahan azoxystrobin menggunakan sistem GC-ECD yang telah

dioptimasi dengan kondisi seperti diatas menghasilkan hasil yang cukup baik.

Rata-rata nilai jumlah plate teoritis (N) yang diperoleh kurang lebih 53138,561.

Nilai N ini menyatakan jumlah plate yang terbentuk di dalam kolom (fase diam).

Semakin banyak jumlah N, semakin banyak jumlah kesetimbangan yang berjalan

dalam kolom dan hasil pemisahan akan semakin baik. Rata-rata nilai resolusi (Rs)

dari hasil uji kesesuain sistem GC-ECD diatas sebesar 8,638 dan tailing factor (tf)

sebesar 0,711. Kondisi tersebut telah memenuhi persyaratan bahwa pemisahan

yang baik karena Rs yang dihasilkan telah lebih dari 1,5 dan tailing factor kurang

DCB

Difenoconazole

Azoxystrobin


68

dari satu (Snyder et al., 2010). Tabel dibawah ini menunjukan performace dari

GC-ECD setelah dilakukan penginjekan enam kali pada satu konsentrasi yang

sama.

Tabel V. Hasil Performance GC-ECD

Massa (ng)

No Injek Rs N Tf

0,137

1 8,082 38853,338 0,600 2 9,393 68522,486 1,000 3 10,246 68363,772 0,500 4 4,422 29227,458 0,667 5 10,639 78610,328 1,000 6 9,044 35253,984 0,500

Rata-rata 8,638 53138,561 0,711

b. Keajegan sistem GC-ECD. Pengamatan keajegan sistem dilihat dari

hasil penginjekan enam kali standar dengan kadar 0,137 ng pada kondisi sistem

yang sama. Parameter yang ditetapkan adalah nilai % RSD dari ratio tR dan luas

area standar azoxistobin/standar internal.

Tabel VI. Keajegan Sistem GC-ECD

Massa (ng) Ratio tR azox/DCB Ratio AUC azox/DCB

0,137

1,450 0,533 1,451 0,526 1,452 0,536 1,425 0,526 1,426 0,442 1,426 0,759

Rata-rata 1,438 0,553 SD 0,014 0,107 % RSD 0,959 19,271

Baik CCPR (2014) maupun Sanco (2013) menyatakan bahwa %RSD

masih dapat diterima jika kurang dari 20%. Sehingga dapat disimpulkan bahwa


69

kinerja GC-ECD dalam kondisi yang telah ditetapkan, dapat digunakan untuk

analisis residu azoxystrobin.

3. Kinerja Kuantitatif GC-ECD.

Uji ini dilakukan dengan membuat kurva baku standar azoxystrobin

sembilan konsentrasi dengan masing-masing tiga replikasi. Tujuan penggunaan

kurva baku adalah untuk mengetahui presisi, nilai linearitas, kisaran linearitas,

slope, sensitivitas yang berupa LOD, dan akurasi.

a. Presisi. Kriteria presisi yang harus dipenuhi adalah % RSD RF yang

merupakan perbandingan antara respon GC-ECD yang dihasilkan dibagi

konsentrasi yang ditambahkan. Hasil dari analisis dapat dilihat di Tabel VII.

Tabel VII . Hasil %RSD RF Analisis Kuantitatif GC-ECD

Kadar (ng)

RF Kurva Baku

1 Kurva Baku

2 Kurva baku

3 0,091 3,127 7,217 6,879 0,137 3,228 7,647 6,943 0,182 3,389 8,018 6,193 0,228 2,909 8,327 5,662 0,319 2,846 8,958 5,673 0,456 2,628 8,963 5,196 0,912 2,265 9,076 4,624

Rata-rata 2,913 8,315 5,881 SD 0,382 0,725 0,853

% RSD 13,127 8,716 14,496

Dari data diatas dapat dinyatakan bahwa kinerja GC-ECD sudah

memenuhi kriteria repeatability, karena % RSD yang diperoleh < 20 % yaitu

berkisar antara 8,7%-14,5% (CCPR, 2014).


70

b. Linearitas. Linearitas atau koefisien korelasi diperoleh dari kurva

baku solven. Kurva ini menghubungkan antara kadar azoxystrobin dengan tingkat

respon yang berupa ratio luas puncak azoxystrobin/standar internal. Standar

internal yang digunakan dalam penelitian ini adalah dekaklorobifenil (DCB).

DCB dengan konsentrasi 0,0001 mg/mL dimasukan pada sampel sebelum

diinjeksikan ke GC-ECD dengan jumlah yang konstan yaitu 1 µL dalam setiap

100 µL pelarut. Tujuan dari standar internal ini adalah untuk mengoreksi

kesalahan yang terjadi dalam sistem GC-ECD dan mengoreksi efek matrik jika

dilakukan pada kurva baku adisi. DCB dipilih sebagai standar internal karena

dapat dideteksi menggunakan GC-ECD. Kurva baku yang dihasilkan dalam

penelitian ini ditunjukan pada Gambar 7 berikut:

Gambar 7 Kurva Hubungan Kadar Azoxystrobin Vs Rasio AUC

Azoxystrobin/DCB

Linearitas merupakan kemampuan (dalam rentang tertentu) untuk

mendapatkan hasil penelitian yang proporsional terhadap konsentrasi analit

dalam sampel. Pada kurva baku diatas menunjukan hubungan yang linier pada

y = 9.3251x - 0.1996 R² = 0.9997

02468

10

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Rat

io A

UC

Azo

x/D

CB

Kadar (ng)

Kurva hubungan kadar azoxystrobin vs rasio AUC azoxystrobin/DCB


71

rentang kadar azoxystrobin 0,0456 ng - 0,091 ng dengan nilai koefisien korelasi

(R2) sebesar 0,9913-0,9997. Persyaratan nilai koefiien korelasi (R2) untuk uji

kategori impurity, yaitu R2 ≥0.990 (AOAC,2002). Sehingga metode ini

dinyatakan memiliki linearitas yang baik.

c. Sensitivitas. Limit of detection (LOD) atau Instrumental Detection

Limit (IDL) merupakan salah satu parameter sensitivitas sistem. LOD adalah

konsentrasi yang menghasilkan sinyal instrumen yang berbeda signifikan

dengan sinyal blanko (Miller and Miller, 2010). Sinyal yang berbeda signifikan

dari blanko adalah intersep + 3 S intersep, oleh karena itu LOD adalah

konsentrasi azoxystrobin yang memberikan sinyal sebesar intersep+ 3 S

intersep. Semakin kecil nilai LOD maka semakin sensitif suatu instrumen. LOD

dalam penelitian ini ditentukan dari penggabungan tiga kurva baku dengan

tujuh konsentrasi terkecil yang memiliki linearitas cukup baik. Kisaran

linearitas yang dipakai antara 0,046 ng – 0,137 ng. LOD yang didapatkan

seperti dalam tabel dibawah ini

Tabel VIII. Hasil Uji Sensitivitas GC-ECD

Kurva Baku Linearitas Persamaan a0 B LOD

(ng/ul) 1 0,99966 F(x) = -0,05730 + 3,69561 x 0,008 3,696 0,003

2 0,99977 F(x) = -0,17440 + 8,98156 x 0,017 8,982 0,003

3 0,99174 F(x) = 0,21263 + 5,09538 x 0,058 5,095 0,017

Berdasarkan data diatas didapatkan nilai LOD antara 0,003 ng/µL –

0,017 ng/µL. Sensitivitas dari suatu prosedur analisis merupakan perubahan


72

besaran respon sebagai akibat perubahan besaran konsentrasi. Dalam sebuah

fungsi kalibrasi sensitivitas dinyatakan sebagai kemiringan kurva (slope).

Semakin besar nilai kemiringan kurva maka dikatakan metode semakin sensitif.

Hal ini dikarenakan dengan adanya sedikit saja perubahan konsentrasi analit

maka akan menimbulkan respon yang signifikan pada sistem. Nilai slope dari

persamaan regresi linier sebesar 3,696 – 8,982.

Instrumental Quantitation Limit (IQL) merupakan kadar terkecil dari

seri kurva baku yang masih dapat diterima keterulangannya dengan maksimal

% RSD, % D < 20%. IQL merupakan salah satu parameter bahwa pada kadar

tersebut dapat dikuantifikasikan sistem dengan kondisi yang digunakan. Nilai

IQL yang didapat dalam penelitian ini sebesar 2 µL larutan standar intermediet

B yang dilarutkan dalam 200 µL heksan atau sama dengan kadar sebesar 0,091

ng.

d. Akurasi. Percent difference (%D) digunakan untuk mengetahui

kedekatan hasil injeksi larutan standar kurva baku pada GC-ECD dengan kadar

sesungguhnya larutan tersebut. Menurut USDA (2015) % D dapat diterima jika

nilainya ≤ 20%. Adapun hasil % D untuk tiga replikasi kurva baku adalah

sebagai berikut:


73

Tabel IX. Hasil % D Analisis Kuantitatif GC-ECD

Kadar (ng) C1 C1' % D 0,046 0,046 0,046 1,066 0,091 0,091 0,092 0,708 0,137 0,137 0,133 2,442 0,182 0,182 0,178 2,348 0,228 0,228 0,225 1,362 0,319 0,319 0,328 2,750 0,456 0,456 0,460 0,798 0,912 0,912 0,909 0,313

Rata-rata 1,473

Disimpulkan berdasarkan presisi, akurasi, kisaran dan linearitas kurva

baku serta LOD yang dicapai GC-ECD dapat digunakan untuk menetapkan

residu azoxystrobin.

B. Preparasi Sampel Melon

1. Homogenisasi

Metode homogenisasi yang tepat sangat diperlukan untuk mendapatkan

sampel yang homogen. Sampling analytical portion untuk melon dilakukan

dengan metode kuartering agar diperoleh sampel yang representatif. Dalam

preparasi sampel, dilakukan penetapan kadar air di dalam buah melon, untuk

mengetahui perlu tidaknya penambahan air saat preparasi sampel. Hasil penelitian

yang dilakukan menyatakan bahwa kandungan kadar air di dalam buah melon

adalah berkisar 92,224% untuk bagian daging 93,782% untuk bagian whole, dan

93,050% untuk bagian kulit, sehingga untuk preparasi sampel dengan metode


74

QuEChERS yang mempersyaratkan kadar air lebih dari 80% (Anastasiades, 2006)

tidak diperlukan penambahan air.

Tabel X. Kadar Air Dalam Buah Melon

2. Ekstraksi dengan Metode QuEChERS

Prinsip dari QuEChERS dalam penelitian ini adalah melakukan ekstraksi

analit menggunakan pelarut (asetonitril) dan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3

citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O untuk mengurangi kadar air yang

berlebih dalam sampel dengan tetap mengatur kondisi pH agar sampel dalam

kondisi stabil dalam bentuk molekul dan diperoleh recovery yang baik dan di

lanjutkan dengan sentrifugasi untuk dapat memisahkan senyawa berdasarkan

ukuran partikel dan berat jenis. Kemudian dilakukan clean-up dan di determinasi

menggunakan GC-ECD. Peneliti memilih menggunakan metode Buffer

QuEChERS karena dengan menjaga pH sampel antara 4-5 diharapkan

azoxystrobin dalam keadaan stabil dalam bentuk molekul dan co-ekstraktan

minimal. Sesuai dengan literatur dibawah ini:

Kategori

Replikasi I Replikasi II Kadar air Rata-rata

Kadar air

Berat Awal Zat

Berat Akhir

Zat Selisih

Berat Awal Zat

Berat Akhir Zat

Selisih Replikasi I

Replikasi II

Kulit 10,052 0,559 9,493 10,001 0,834 9,167 94,439 91,661 93,050 Whole 10,068 0,402 9,666 10,007 0,845 9,162 96,007 91,556 93,782 Daging 10,030 0,690 9,340 10,009 0,868 9,141 93,121 91,328 92,224


75

Gambar 8. Pengaruh pH terhadap Jumlah Co-Extractant (Anastassiades, 2006)

Citrate buffer pada pH 4-5 memberikan jumlah co-ektraktan dalam hasil

ekstraksi yang lebih sedikit jika dibangingkan dengan jumlah co ektraktan pada

raw material original QuEChERS maupun acetate buffer. Pemilihan metode

QuEChERS ini dilakukan dengan melihat jumlah co-ektraktan yang paling sedikit

didalam pelarut yang memiliki kelarutan paling baik. Asetonitril merupakan

pelarut yang umum digunakan dalam metode QuEChERS. Buffer QuEChERS

menggunakan empat jenis garam antara lain: Magnesium sulfate anhidrate,

natrium klorida, natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate sesquihydrate.

Magnesium sulfate anhidrate digunakan untuk menginduksi pemisahan antara

asetonitril dengan air dalam sistem LLE dan meningkatkan recovery analit polar.

Natrium klorida berfungsi sebagai garam penyangga dan mengurangi interfensi

senyawa polar, natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate sesquihydrate

ditambahkan untuk mengontrol pH, mempertahankan tingkat pH antara 4 dan 6,


76

dan untuk stabilitas dasar pestisida yang sensitif. Setelah dilakukan ekstraksi,

larutan organik asetonitril yang mengandung azoxystrobin akan berada dilapisan

atas (Leung, 2012).

Keunggulannya dari citrat buffer QuEChERS ini adalah nilai recovery

yang bagus bahkan untuk pestisida paling asam, recovery dapat diterima pada

pestisida yang sensitif terhadap asam maupun basa, mampu meningkatkan

selektifitas, dan tidak memberikan efek negatif jika menggunakan clean-up PSA,

tidak seperti asetat buffer (Anastassiades, 2006).

Penggojokan dilakukan dengan kuat selama satu menit untuk memecah

gumpalan matriks sampel. Semakin kecil gumpalan matriks, maka luas

permukaan akan semakin meningkat sehingga kesetimbangan yang optimum akan

lebih cepat dicapai. Optimasi lama sentrifugasi dilakukan dengan berbagai macam

waktu yaitu 5, 10, 15 menit dengan kecepatan tetap yaitu 5000 rpm. Dengan

waktu 5 menit didapatkan hasil yang efektif, yaitu dengan waktu yang relatif

pendek sudah mampu mendapatkan supernatan dengan jumlah yang cukup.

Penambahan waktu dalam variabel diatas tidak terlalu mempengaruhi jumlah

supernatan yang dihasilkan, yaitu hanya berkisar 4 mL.


77

Gambar 9. Hasil Optimasi Lama Waktu Sentrifugasi

Hasil sentrifugasi menunjukan bahwa asetonitril berada di bagian atas

dan air berada dibagian bawah karena massa jenis air lebih besar dari asetonitril.

Tingkat kelarutan azoxystrobin didalam asetonitril sebesar 340 g/L, sedangkan

kelarutannya di dalam air hanya 6,7 mg/L. Oleh sebab inilah diperlukan

penambahan garam NaCl untuk salting out effect mengurangi kelarutan

azoxystrobin dalam air, dan memaksa masuk kedalam lapisan asetonitril.

Reekstraksi dilakukan dalam penelitian ini agar diperoleh % recovery

yang lebih baik, dan meminimalisir analit yang masih tertinggal didalam matriks.

Kesetimbangan akan lebih banyak tercapai saat dilakukan reekstraksi. Hasil

supernatan diambil semua agar dapat merepresentasikan jumlah azoxystrobin

yang terekstrak dalam tiap 5 gram sampel melon.

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

5

5 menit 10 menit 15 menit

jum

lah

supe

rnat

an

waktu

Optimasi Lama Sentrifugasi


78

3. Optimasi clean-up

Clean-up merupakan salah satu proses yang penting untuk mendapatkan

ekstrak bersih saat akan dideterminasi meggunakan GC-ECD. Azoxystrobin

memiliki log POW sebesar 2,71 at 20 °C sehingga pada pH 5,03 tidak mengalami

disosiasi dan dapat terjerab pada fasa diam C18. Sistem yang digunakan dalam

clean-up pada penelitian ini adalah sistem reverse-phase SPE. Peneliti memilih

pelarut yang mampu menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang

digunakan (C18), dengan ikatan lemah agar dapat terelusi. Senyawa yang lebih

polar akan terelusi dengan fasa gerak air . Sehingga terpilihlah aquabidest sebagai

pelarut pertama karena hanya memiliki kelarutan sebesar 6,7 mg/L. Analit yang

dituju selanjutnya dielusi dengan menggunakan metanol yang akan mengambil

analit yang tertahan pada penjerap karena kelarutan analit didalam metanol kurang

lebih 20 g/L. Strategi ini bermanfaat jika analit yang dituju berkadar rendah

(Gandjar dan Rohman, 2007). Beberapa optimasi clean-up yang dilakukan dalam

penelitian ini adalah kapasitas berat SPE, washing dan fraksinasi elusi metanol

untuk mengelusi analit

Tabel XI. Hasil Optimasi Clean-up

Optimasi Hasil

Kapasitas SPE ≥ 50 mg, yang digunakan 400 mg

Pencucian SPE 30 mL metanol dilanjut 10 mL aquabidest

Kelayakan SPE Dapat digunakan 3x

Washing SPE 5 mL aquabidest

Elusi SPE 3 mL metanol


79

a. Kapasitas berat SPE. Jenis berat SPE ada banyak sekali antara lain 30

mg, 50 mg, 60 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 500 mg, 1 g, 2 g, 5 g, 20 g dll.

Berat sorben SPE menentukan jumlah maksimum analit untuk dapat tetap tertahan

(Anonim2).

Gambar 10. Jenis-jenis SPE dan Kapasitasnya (Sigma aldrich)

Kapasitas SPE ditentukan dengan menimbang berat 1 mL ekstrak. Berat

1 mL sampel per gramnya tidak boleh melebihi 5% dari berat catride SPE. Hasil

perhitungan tiap 1 mL sampel kering sebesar 2,5 mg, oleh karena itu SPE yang

boleh digunakan harus lebih dai 50 mg. Peneliti menggunakan SPE C18 dengan

berat 400 mg.

b. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Dalam

penelitian ini SPE C18 digunakan lebih dari satu kali dan tidak lebih dari tiga kali.

Optimasi ini dilakukan dengan menginjekan 15uL standar intermediet B

menggunakan SPE yang sama. Pencucian SPE dilakukan dengan menggunakan

30 mL metanol dan 10 mL aquabidest . SPE masih dapat dikatakan layak

digunakan apabila % RSD kurang dari 20% (CCPR,2014) yang artinya masih

memiliki keterulangan yang baik dan hasil % recovery yang diharapkan masih


80

dalam kisaran 80-120%. Adapun data presisi dan % recovery dari penggunaan

SPE secara berulang sebagai berikut:

Tabel XII. Hasil Preisi dan Akurasi Kelayakan SPE

Massa (ng) AUC DCB

AUC azox Ratio

% Recovery

% Kesalahan

0,684 25368,2 51682,4 2,037 110.666 10.666 0,684 16110,5 33144,7 2,057 105.428 5.428 0,684 20158,1 40942,2 2,031 86.878 13.122

Rata-Rata 2,042 100,991 9,739 SD 0,014

% RSD 0,672

Dari data diatas menyatakan bahwa SPE masih layak digunakan

sebanyak tiga kali pemakaian dengan tiap kali pencucian menggunakan 30 mL

metanol dan dilanjutkan dengan 10 mL aquabidest.

c. Optimasi washing. Hasil injeksi eluat metanol setelah washing

menggunakan 5% MeOH dan 100% aquabidest dipresentasikan pada gambar

berikut:

Gambar 11. Hasil Eluat Metanol Setelah Washing 5% MeOH dan 100% Aquabidest

Eluat metanol setelah washing menggunakan 100% aquabidest

menghasilkan luas puncak standar yang lebih besar jika dibandingkan dengan

0

1000000

2000000

washing 5% Metanol washing 100% UPW

AUC

Azox

ystr

obin

AUC Azoxystrobin


81

eluat metanol setelah washing menggunakan 5% metanol. Terbukti pada

kromatogram aquabidest hasil wahing yang ditampung, tidak menunjukan

terdeteksinya azoxystrobin yang terikut pada cairan washing.

Gambar 12. Hasil Tampungan Washing Menggunakan 100% Aquabidest

d. Fraksinasi jumlah metanol untuk menarik analit. Fraksinasi penarikan

analit menggunakan metanol dengan konsentrasi adisi 50uL stok A didapatkan

lima fraksi dengan grafik seperti dibawah ini:

Gambar 13. Fraksinasi Elusi Metanol untuk Menarik Analit

0

500000

1000000

1500000

2000000

Fraksi I Fraksi II Fraksi III Fraksi IV Fraksi VAUC

Azox

ystr

obin

Jumlah Fraksi

Fraksinasi Elusi Metanol


82

Hasil fraksinasi ke-3 menyatakan bahwa dengan mengelusikan 3 mL

metanol sudah cukup untuk menarik analit yang diharapkan yaitu sebesar

99,830%.

C. Validasi Metode Analisis

Kriteria validasi metode analisis residu pestisida meliputi recovery

ekstraksi, recovery clean-up, pengukuran determinasi, calibration range dari

determinasi analit, LOD dan LOQ (CCPR, 2014).

Untuk menguji kinerja clean-up dengan kolom SPE C18, adisi dilakukan

pada ekstrak blanko melon sebelum dilakukan SPE. Sedangkan untuk menguji

kinerja GC-ECD saat menetapkan kadar azoxystrobin dalam matriks ekstrak

melon bersih (setelah melalui clean-up SPE C18) dilakukan adisi standar pada

ekstrak bersih. Apabila kedua uji ini memenuhi persyaratan revovery mencapai

70% - 120% (CCPR, 2014), maka dilakukan penetapan akurasi metode analisis

yang baru dikembangkan ini. LOQ/LCL/LLMV metode teroptimasi ini ditetapkan

pada konsentrasi terendah yang telah memenuhi kriteria akurasi dan presisi.


83

1. Kinerja GC-ECD dalam Mendeteksi Azoxystrobin pada Matriks Ekstrak

Melon Bersih (Jalur C)

a.

b.

Gambar 14. Blangko Matriks Melon (a) dan Blanko yang Diadisi Standar

Azoxystobin (b)

Selektifitas merupakan kemampuan untuk mengukur analit yang dituju

secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks

sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi dan komponen matriks. Dapat

dilihat pada gambar 14a. bahwa tidak adanya peak pengganggu dalam waktu tR

Azoxystrobin

Blank

DCB


84

azoxystrobin (32,294 menit). Hal ini membuktikan bahwa berbagai impurities dari

matriks tidak mempengaruhi selektifitas metode. Hal ini juga ditunjukan dengan

nilai resolusi yang ≥ 1,2 seperti tabel dibawah ini:

Tabel XIII. Kinerja GC ECD dalam Mendeteksi Azoxystrobin dalam Buah Melon

No Rs awal

Rs Akhir N Tf Keajegan

Tr 1 2,975 3,584 112472,232 0,667 1,423 2 2,994 5,444 186626,592 0,333 1,428 3 2,541 3,009 57551,187 0,750 1,424 4 2,534 4,254 82830,375 0,500 1,429 5 2,123 3,564 82207,976 0,500 1,483 6 2,884 3,240 77907,230 0,500 1,423

Penelitian ini memiliki tiga kurva baku adisi yaitu penambahan standar

sebelum ekstraksi (Jalur A); penambahan standar sebelum clean-up (Jalur B);

dan penambahan standar sebelum diinjeksikan ke GC-ECD (Jalur C). Peneliti

memulai dengan Jalur C untuk memastikan bahwa penambahan standar pada

matriks tetap dapat memberikan % recovery yang baik yaitu berkisar antara 80-

120%.

Parameter-parameter yang telah dipenuhi saat penambahan standar

sebelum diinjeksikan ke GC-ECD (Jalur C) meliputi akurasi dan presisi yang

ditunjukan dalam tabel dibawah ini:


85

Tabel XIV. Hasil Presisi Jalur C

Massa (ng) Respon factor

R1 R2 0,137 0,151 0,064 0,228 0,119 0,075 0,319 0,158 0,078 0,456 0,207 0,089 0,593 0,215 0,086 0,730 0,207 0,093 0,912 0,187 0,093

Rata-rata 0,178 0,082 SD 0,036 0,011 %RSD 20 13

Tabel XV. Hasil Akurasi Jalur C

Massa (ng)

Recovery 1

Recovery 2

Recovery 3 Rata-rata Recovery

0,137 61,691 98,174 134,010 97,958 0,228 77,110 156,359 120,064 117,844 0,319 80,826 114,100 119,695 104,874 0,456 81,079 91,776 107,902 93,585 0,593 83,640 90,992 113,767 96,133 0,730 88,984 97,238 105,450 97,224

Repeatability Jalur C dapat dikatakan optimum karena nilai %RSD 13-20%.

Rentang kadar 0,137 ng- 0,730 ng memiliki recovery berkisar antara 93-117%.

Nilai recovery didapatkan dengan memasukan hasil respon GC-ECD pada

persamaan kurva baku dengan kriteria kurva baku yang mendekati tanggal

penginjekan sampel validasi. Peneliti menggunakan kurva baku karena

berdasarkan hasil uji signifikansi antara kurva baku dengan kurva adisi tidak

berbeda signifikan secara statistik. Dimana didapatkan hasil nilai t thitung sebesar

1,513771 dan t tabel sebesar 2,14 , yang mana jika t hitung lebih kecil dari t tabel

maka nilai yang diujikan tidak berbeda signifikan.


86

Gambar 15. Kurva Baku vs Kurva Adisi C

Dalam penelitian ini didapatkan nilai % D atas kedekatan nilai yang

didapat dengan yang ditambahkan berkisar antara 1,7-14,8%, maka prosedur

analisis Jalur C dapat disimpulkan telah optimum dilihat dari kriteria presisi dan

akurasi baik dari nilai recovery yang dapat berkisar antara 70-125% atau nilai %

D yang mampu ≤ 20 %.

Tabel XVI. Hasil %D Jalur C

Massa (ng) % D 0,137 14,896 0,228 6,329 0,319 7,945 0,456 1,701 0,593 4,622 0,730 2,724

y = 4.4245x + 0.5503 R² = 0.9942

y = 4.5508x + 0.2963 R² = 0.989

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

5

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Ratio

AU

C Az

ox/D

CB

Massa (ng)

Kurva Baku vs Kurva Adisi C

Kurva Adisi C

Kurva Baku

Linear (Kurva Adisi C)

Linear (Kurva Baku)


87

2. Kinerja Clean-up dengan Kolom SPE C18 (Jalur B)

Jalur B digunakan untuk mengetahui kelayakan dari prosedur analisis

proses clean-up menggunakan SPE C18 dengan melihat akurasi dan presisi seperti

pada tabel dibawah ini:

Tabel XVII. Hasil Presisi Jalur B

Massa (ng) Respon factor

R1 R2 R3 0,137 8,340 3,190 8,367 0,228 8,141

9,170

0,319 7,018 2,855 8,156 0,456 6,664 2,745 8,129 0,593 7,102 2,887 7,972 0,730 7,198 2,706 8,176 0,912 5,271 2,770 8,807

rata-rata 7,105 2,859 8,397 SD 1,014 0,176 0,433

%RSD 14,276 6,158 5,160

Tabel XVIII. Hasil Akurasi Jalur B

Massa (ng)

Recovery 1

Recovery 2

Recovery 3 Rata-rata Recovery

0,091 116,342 84,359 85,575 95,425 0,137 93,119 65,722 95,425 84,755 0,228 101,652

117,819 109,735

0,319 90,159 96,201 107,596 97,985 0,456 88,675 101,462 110,633 100,257 0,593 97,044 113,507 110,190 106,914 0,730 99,680 108,699 114,317 107,565

Repeatability Jalur B dapat dikatakan optimum karena nilai %RSD yang

didapatkan kurang dari 20% (CCPR, 2014) yaitu sebesar 5-14%. Recovery pada

rentang kadar 0,091 ng- 0,912 ng berkisar antara 84-109%. Seperti halnya jalur

C, recovery didapatkan dengan menggunkan kurva baku yang memiliki kedekatan


88

waktu dalam penginjekan dengan sampel validasi, hal ini dikarenakan kedua

kurva baku dan kurva adisi tidak berbeda signifikan seperti Gambar 16 dibawah

ini:

Gambar 16. Kurva Baku vs Kurva Adisi B

Dalam penelitian ini akurasi juga ditentukan dengan nilai % D, jika % D

≤20% maka metode dikatakan akurat, karena nilai yang didapatkan dengan nilai

yang ditambahkan memiliki kedekatan seperti yang ada pada Tabel XIX:

Tabel XIX. Hasil %D Jalur C

Massa (ng) % D 0,137 0,633 0,228 9,521 0,319 2,752 0,456 3,271 0,593 5,238 0,730 2,893

y = 6.567x + 0.2915 R² = 0.9927

y = 6.852x + 0.2681 R² = 0.9963

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Ratio

AU

C Az

ox/D

CB

Massa (ng)

Kurva Baku vs Kurva Adisi B

Kurva Adisi B

Kurva Baku

Linear (Kurva Adisi B)

Linear (Kurva Baku)


89

Berdasarkan hasil diatas, dapat dinyatakan bahwa proses clean-up sudah

optimum dengan telah memenuhi persyaratan yang dipersyaratkan. Sehingga

dapat dilakukan validasi metode analisis secara penuh.

3. Akurasi dan Presisi Metode Analisis Teroptimasi (Jalur A)

Tujuan dilakukannya Jalur A adalah untuk mendapatkan hasil validasi

metode secara keseluruhan. Jalur A inilah yang dinamakan kurva baku adisi yang

akan dibuat dalam kesimpulan, untuk menentukan apakah metode ini dapat

diguanakn untuk analisis residu fungisida azoxystrobin atau tidak.

a. Linearitas. Linearitas merupakan suatu parameter analisis yang

menggambarkan kemampuan suatu alat untuk memperoleh hasil pengujian yang

sebanding dengan kadar analit dalam zat uji pada rentang kadar tertentu yang

dinyatakan dalam koefisien korelasi (R2).

Persamaan linear yang diperoleh dari hasil penelitian yaitu y = 2,485x +

0,3382 dengan koefisien korelasi R² = 0,9832. Persamaan tersebut memiliki slope

sebesar 2,485 pada kisaran linearitas 0,0912 ng – 0,684 ng.

Gambar 17. Linearitas Kurva Baku Adisi

y = 2.485x + 0.3382 R² = 0.9832

0

1

2

3

0 0.2 0.4 0.6 0.8

Ratio

AU

C Az

o/DC

B

Kadar (ng)

Kurva Baku Adisi


90

Menurut Association of Official Analytical Chemist (AOAC, 2005) suatu

metode akan dikatakan linear apabila menghasilkan nilai koefisien korelaasi (R2)

≥0,990. Hal ini menunjukan bahwa metode ini dengan rentang 0,0912 ng - 0,684

ng kurang linear. Namun untuk kategori impurity menurut Ahuja and Dong

(2005) suatu metode dikatakan linear jika nilai r ≥ 0,98, sehingga metode

penentapan kadar residu pestisida azoxystrobin dalam buah melon telah

memenuhi persyartan yang ditentukan.

b. Presisi. Presisi dilakukan untuk melihat kedekatan antara hasil uji

yang diperoleh pada sampel yang homogen pada kondisi tertentu. Presisi dapat

ditentukan dengan keterulangan. Keterulangan metode analisis residu fungisida

azoxytrobin dapat ditetapkan dengan melihat nilai %RSD Rf. Respon factor

merupakan perbandingan antara respon GC-ECD dengan konsentrasi analit.

Menurut USDA (2015), jika %RSD RF ≤ 20 % maka keterulangan metode

tersebut dikatakan baik. Berikut merupakan hasil keterulangan kurva adisi validasi

metode analisis secara keseluruhan:

Tabel XX. Hasil Presisi Kurva Adisi

Massa (ng)

Respon factor Replikasi 1 Replikasi 2

0,137 3,448 4,045 0,228 4,186 4,319 0,319 4,040 3,790 0,456 3,319 3,160 0,593 2,583 2,573 0,684 2,969 3,008

Rata-rata 3,424 3,483 SD 0,614 0,673

%RSD 17,930 19,338


91

Nilai % RSD Rf dalam validasi penelitian secara keseluruhan (Jalur A)

sebesar 17-19% yang mana telah memenuhi kriteria keterulangan yang baik.

c. Akurasi, dilakukan untuk melihat ketepatan atau kecermatan metode

analisis. Kecermatan dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery)

yang didapatkan dari memasukan respon yang berupa ratio AUC

azoxystrobin/DCB pada kurva baku yang terdekat.

Gambar 18. Kurva Baku vs Kurva Adisi A

Hasil uji akurasi yang meliputi % recovery dan % D dalam penelitian ini

dapat dilihat pada tabel:

Tabel XXI. Hasil Akurasi Kurva Adisi

Massa (ng)

Recovery 1

Recovery 2

Recovery 3

Rata-rata Recovery

0,091 115,266 103,078 81,392 99,912 0,137 89,536 102,471 124,696 105,568 0,319 134,078 120,708 104,903 119,896 0,456 112,211 103,424 94,530 103,389 0,593 87,441 84,897 79,751 84,030 0,684 103,062 102,619 97,009 100,897

y = 2.6852x + 0.2555 R² = 0.9802

y = 2.6773x - 0.0774 R² = 0.985

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.2 0.4 0.6 0.8

Ratio

AU

C Az

ox/D

CB

Massa (ng)

Kurva Baku vs Kurva Adisi A

Kurva Adisi A

Kurva Baku

Linear (Kurva Adisi A)

Linear (Kurva Baku )


92

Berdasarkan Tabel XXI. terlihat bahwa nilai persen perolehan kembali

(% Recovery) yang diperoleh pada penelitian ini telah memenuhi persyaratan

karena berada pada rentang 70-120% (CCPR 2014) yaitu sebesar 84-119%,

dengan nilai % RSD kurang dari 20 % dan % D berkisar antara 0,038-19,332%

sebagai berikut:

Tabel XXII. Hasil % D Validasi Metode Analisis

Massa (ng) % D 0,137 11,578 0,228 17,146 0,319 3,263 0,456 4,985 0,593 19,332 0,684 0,038

Dari penelitian ini akurasi dan presisi metode analisis dinyatakan

memenuhi parameter yang dipersyaratkan.

d. Sensitivitas (LOQ). Batas kuantisasi merupakan parameter yang

diartikan sebagai konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang masih dapat

memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004). Berdasarkan hasil

pengukuran LOQ untuk azoxystrobin diperoleh nilai batas kuantitasi sebesar

0,0008 µg/g. nilai ini telah mencapai yang dipersyaratkan yaitu lebih kecil dari

positif list sebesar 0,01 µg/g.

e. LLMV. Tingkat konsentrasi terendah di mana metode analisis

sebenarnya telah mampu divalidasi di laboratorium (CCPR, 2014). Dari hasil

perhitungan didapatkan LLMV sebesar 0,005 µg/g. Berdasarkan metode ini


93

diketahui bahwa % kesalahan dalam ekstraksi, clean-up dan determinasi secara

berturut-turut adalah 3,87%, 3,05%, 9,1%.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Asetonitril mampu menjadi pelarut organik dalam proses ekstraksi

azoxystrobin dalam buah melon, dengan kesalahan ekstraksi 9,1%.

2. SPE C18 merupakan metode clean-up yang baik dalam memisahkan

azoxystrobin pada matriks buah melon. Recovery fortifikasi sebelum clean-up

dengan kolom SPE C18 sebesar 84-107%, % RSD 5-14%, % D sebesar

0,633-9,521% dengan kesalahan clean-up sebesar 3,05%.

3. Validasi metode analisis dilakukan pada sampel blanko dan sampel yang di

fortifikasi dilakukan pada instrument yang teroptimasi.

a. Kinerja kuantitatif GC teroptimasi adalah rata-rata %D <20%, linearitas

0,9913-0,9997 pada kisaran linearitas 0,0456 ng- 0,912 ng, dengan IDL

0,003 µg/mL - 0,01 µg/mL dan IQL 0,047 µg/mL.

b. Kinerja GC pada ekstrak sampel blanko yang di fortifikasi 0,137 ng-

0,730 ng sebelum di injeksikan memberoleh recovery 93%-117% dan %

RSD sebesar 13-20%, % D 1,7-14,8% dengan kesalahan determinasi

sebesar 3,87%.

c. Kinerja metode analisis melalui fortifikasi 0,091 ng – 0,684 ng pada buah

melon memberikan recovery berkisar antara 84 % - 119% dengan %

RSD 17-19%, %D sebesar 0,03-17,1%. Linearity range 0,002 µg/g –

0,014 µg/g dengan LOQ 0,0008 µg/g dan LLMV 0,005 µg/g. Dengan

94


95

demikian validasi metode ini memenuhi persyaratan untuk memantau

kadar Azoxystrobin dalam buah melon dibawah positif list sebesar 0,01

µg/g.

B. Saran

Perlu adanya pembandingan lebih lanjut suatu hasil proses ekstraksi jika

menggunakan PSA.


96

DAFTAR PUSTAKA

Ahuja, S., and Dong, M.W., 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, volume 6, Elsevier, Inc., USA, p. 192.

Anastassiades, Michelangelo, 2006, The QuEChERS Method –Background Informationand Recent Developments, Community Reference LaboratoryPesticide Residuesusing Single Residue Methods, Stuttgart, p.50,66.

Anonim1, Pesticide Residue Analysis: QuEChERS Informational Booklet, Enviro, USA, diunduh pada tanggal 03 Oktober 2014.

Anonim2,Strata, Extraction Method Development, phenomenex, https://www.brechbuehler.ch/fileadmin/redacteur/pdf/columns-sampleprep/sample-prep/z007.pdf, diakses tanggal 10 Oktober 2015.

AOAC, 2002. AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for dietary Supplements and Botanicals. Diakses dari www.aoac.org/Official_Methods/slv_guidelines.pdf, pada tanggal 16 Januari 2014.

AOAC, 2007, Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and Partitioning with Magnesium Sulfate Gas Chromatography/Mass Spectrometry and Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry, AOAC International, diakses pada tanggal 03 Oktober 2014.

AOAC, 2012, Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements, AOAC Official Methods Of Analysis, Pp 1-17.

Burton, L. DeVere., 2010, Agriscience Fundamentals and Applications, Edisi kelima, Delmar Cengage Learning, USA, p.286.

Cairns, Donald., 2004, Intisari Kimia Farmasi, EGC, Jakarta, hal 31.

CCPR, 2003, Joint Fao/Who Food Standards Programme, Codex Alimentarius Commission, Twenty-Fifth Session, Fao-Who, Italy, P 1-106

CCPR, 2014, Joint Fao/Who Food Standards Programme Codex Alimentarius Commission: Report Of The 46th Session Of The Codex Committee On Pesticide Residues, Switzerland

Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, 6th edition, John Wiley & Sons, Inc., USA, p. 128, 585-588.

Codexalimentarius,http://www.codexalimentarius.org/standards/pestres/commodities-detail/en/?c_id=285 , diakses tanggal 10 Oktober 2015.


https://www.brechbuehler.ch/fileadmin/redacteur/pdf/columns-sampleprep/sample-prep/z007.pdf

https://www.brechbuehler.ch/fileadmin/redacteur/pdf/columns-sampleprep/sample-prep/z007.pdf

http://www.codexalimentarius.org/standards/pestres/commodities-detail/en/?c_id=285

http://www.codexalimentarius.org/standards/pestres/commodities-detail/en/?c_id=285

97

CRI, 2010, Menjual Potensi dan Kendala Agrobisnis Indonesia, Beijing, http://indonesian.cri.cn/201/2010/10/04/1s113232.htm, diakses tanggal 11/2/2015

Czichos Horst,Tetsuy Saito, and Leslie Smith, 2006, Handbook of Material Measurement Methods,CRC Press, New York.pp.160-163.

Day RA dan Al Underwood. 2006. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi Keenam. Sopyan Iis, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Quantitative Analysis.

DEPTAN. 2006. Penggunaan Pestisida secara Bijaksana. Jakarta: Direktorat Jenderal Tanaman Pangan dan Holtikultura.

Djojosumarto, Panut, 2008, Panduan Lengkap Pestisida & Aplikasinya, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal 1-11.

Dolan, John W., LC Resources Inc., Walnut Creek, 2002, Peak Tailing and Resolution California, USA, LC•GC Europe

Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan kedua, Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 378, 389-390, 429,430, 437-438.

Grob, L.R., 1995, Modern Practice of Gas Chromatography, John Wiley and Sons Inc., New York. p. 291-295

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Farmasi FMIPA-UI, hal 117 – 135.

Harris, D.C., 2010, Quantitative Chemical Analysis, 8th edition, W. H. Freeman and Company, New York, pp. 566-567.

Horwitz, W., 1984, Official Methods of Analysis of AOAC Interational, 13rd Edition, AOAC International, USA, p.16

Jules., Janick, 2012, Horticultural Reviews, Volume 39, John Willey & Sons, New Jersey.

Jennings, E. L., Mittlehldt, E., & Stremple, P., 1987, Analytical Gas Chromatography, 2nd Edition, California, Academic Press, pp 37-61.

Johnson, E. L., & Stevenson, R., 1991, Dasar Kromatografi Cair (Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung.

Kenndler, Ernst, 2004, Gas Chromatography, Institute for Analytical Chemistry, University of Vienna, pp. 1-33.

Leung, Sueki H, Monika M. Kansal, Carl Sanchez, Art Dixon, and Erica Pike, 2012, Phenomenex, Inc., 411 Madrid Ave., Torrance, CA 90501 USA,


http://indonesian.cri.cn/201/2010/10/04/1s113232.htm

98

Analyzing Pesticide Residues in Lettuce by the EN 15662 Method using Phenomenex roQ™ QuEChERS Kits Followed by LC/MS/MS and GC/MS Analysis, TN-0052, APPLICATIONS, p. 1

McNair, H. M. & Miller, J. M., 1998, Basic Gas Chromatography, New York, John Willey & Sons.

Mastovska, Katerina., 2008, Azoxystrobin (229): Agricultural Research Service, United State Departement of Agriculture, Wyndmoor, PA, USA, p. 4.

Martha, Hincapie., 2012, Baseline Sensitivity Of Guignardia citricarpa, The Causal Agent Of Citrus Black Spot To Azoxystrobin, Pyraclostrobin And Fenbuconazole,Ufdcimages.uflib.ufl.edu/UF/E0/04/50/72/00001/HINCAPIE_CAPUTO_M.pdf hal 33, diakses tanggal 14 Mei 2015

Nagel, Macherey, 2004, Gas Chromatography Application Guide / Technical Handbook, MN, German, pp. 2-3.

Nuryanto, Hery., 2000, Budi Daya Melon, Jakarta, Ganeca Exact, hal 1-5.

Nollet, Leo., et all., 2005,Chromatographic Analysis of the Environment, Third Edition, Volume 93, CRC Press (Taylor & Francis Group), New York, p. 46-49.

RAM 305/03, 2004, Standard Operating Procedure Residue Analytical Method for the Determination of Residue of Azoxystrobin (ICI5504) and R230310 in Crop Samples Final Determination by LC-MS/MS, Syngenta, p.6.

Rohman,A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Penerbit Graha Ilmu, Yogyakarta, pp. 217-230.

Rouessac F & R Annick, 2007. Chemical Analysis. Paris: John Wiley & Sons, Ltd

Samadi, Budi., 2007, Melon Usaha Tani Dan Penanganan Pasca Panen, kanisius, Yogyakarta, hal. 12, 18, 85.

Sanco, 2013, Guidance Document on Analytical Quality Control and Validation Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed, European, pp 3-36.

Sharpe. P.T., 1998, Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology: Methods of cell Separation, Elsevier Science Publishers, New York, p 18-19.

Sigma, Aldrich,http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-preparation/spe/tube-configuration-guide.html, diakses tanggal 10 Oktober 2015.


http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-preparation/spe/tube-configuration-guide.html

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-preparation/spe/tube-configuration-guide.html

99

Skoog, D.A., West, D.M., Holler F.J., and Crouch S.R., 2004, Fundamental of Analytical Chemistry, 8th edition, Thomson learning, Inc., USA, pp. 948-950, 959.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Dolan, J.W., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, pp. 20,813.

Sudarmo, Subiyakto., 1991, Pestisida, Kanisius, Yogyakarta, hal 5-10.

Sumardjo, Damin, 2009, Pengantar Kimia: Buku Panduan kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata I Fakultas bioeksakta, Buku Kedokteran EGC, Jakarta, hal. 472, 482

Sumardiyono, C., 2013, Pengantar Toksikologi Fungisida, Gajah Mada University Press, Yogyakarta, pp. 6-9, 29, 32, 54-60, 88-91, 94-96.

Soeryadi, I., 1997, Kromatografi, Warta Insinyur Kimia, 17-19.

USDA/AMS PDP, 2015, United States Department of Agriculture Agricultural Marketing Service, Science & Technology, Pesticide Data Program, US, pp 2-29.

Wilson, Keith and John Walker, 2001, Principles and Techniques of Practical Biochemistry, fifth edition, United Kingdom, Cambridge, p 262-264.

Wittkowski, R., & Matissek, R..,1990, Cappilary Gas Chromatography in Food Control and Research, Pennsylvania: Technomic Publishing.

Wudianto, R., 1992, Petunjuk Penggunaan Pestisida, Penebar Swadaya, Jakarta.


100

LAMPIRAN


101

Lampiran 1. Perhitungan Sensitivitas Alat

Sensitivitas alat ditentukan dengan menghitung LOD dari:

a. Kurva baku 1

Kadar azoxystrobin

(ng)

Rasio AUC azoxystrobin/DCB

0,046 0,111 0,091 0,285 0,137 0,442

F(x) = -0,05730 + 3,69561 x R2 = 0,99966

Setelah data tersebut diatas diolah menggunakan program powerfit didapatkan: POLYNOMIAL : F(x) = -0.05730 + 3.69561 x

Dihitung menggunakan rumus :

𝐿𝑂𝐷 = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏

= 3 𝑥 0,00843,695

= 0,003 ng/µL

b. Kurva baku 2

Kadar azoxystrobin

(ng)


0,046 0,232 0,091 0,658 0,137 1,046

F(x) = -0,17440 + 8,98156 x R2 = 0,99977

Coefficient Std Dev. Min. Limit Max. Limit a0 -5,73E-02 8,48E-03 -9,38E-02 -2,08E-02 a1 3,70E+00 6,79E-02 3,40E+00 3,99E+00


102

Setelah data tersebut diatas diolah menggunakan program powerfit didapatkan: POLYNOMIAL : F(x) = -0,17440 + 8,98156 x

Coefficient Std Dev. Min. Limit Max. Limit a0 -1,74E-01 1,69E-02 -2,47E-01 -1,02E-01 a1 8,98E+00 1,35E-01 8,40E+00 9,56E+00



= 3 𝑥 0,0168,981

= 0,003 ng/µL

c. Kurva baku 3

Kadar azoxystrobin

(ng)


0,046 0,467 0,091 0,627 0,137 0,950

F(x) = 0,21263 + 5,09538 x R2 = 0,99174

Setelah data tersebut diatas diolah menggunakan program powerfit didapatkan: POLYNOMIAL : F(x) = 0.21263 + 5.09538 x



Coefficient Std Dev. Min. Limit

Max. Limit

a0 2,13E-01 5,81E-02 -3.75E-02 4.63E-01 a1 5,10E+00 4,66E-01 3.09E+00 7.10E+00


103

= 3𝑥 0,0585,095

= 0,018 ng/µL

Lampiran 2. Kurva Adisi Azoxystrobin pada sampel buah melon

Setelah data tersebut diatas diolah menggunakan program powerfit didapatkan: POLYNOMIAL : F(x) = 0,29934 + 2,60032x

Coefficient Std Dev. Min. Limit

Max. Limit

a0 2,99E-01 3,71E-02 2,21E-01 3,78E-01 a1 2,60E+00 9,82E-02 2,39E+00 2,81E+00


𝐿𝑂𝑄 = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏

= 3𝑥 0,0372,600

= 0,042 ng

= 0,021 ng/µL

= 0,856 ng/g

= 0,0008 µg/g


104

Lampiran 3. Perhitungan Resolusi (Rs) dan Resolusi DCB

Rs = 2∆𝑡𝑅𝑊1+𝑤2

Rs Awal = 2(33,914−32,294)0,538 𝑐𝑚+1.384 𝑐𝑚

= 2,540

Rs Akhir = 2(33,914−32,294)0,538 𝑐𝑚+0,538𝑚

= 3,07

Besar Resolusi (Rs) DCB:

No Rs awal Rs Akhir N Tf Keajegan

Ratio azo/DCB

1 1.274 2.015 91472.978 1.667 1.428 2 2.198 5.858 55581.646 1.000 1.423 3 1.002 5.808 55175.379 0.667 1.422 4 1.097 4.631 38482.669 1.000 1.423 5 1.097 1.142 28290.471 1.333 1.423

x 1.424

SD 0.003

RSD 0.189


105

Lampiran 4. Certificate of Analysis DCB


106

Lampiran 5. Certificate of Analysis NaCl


107

Lampiran 6. Certificate of Analysis MgSO4


108

Lampiran 7. Certificate of Analysis Na2HCitr


109

Lampiran 8. Certificate of Analysis Na3Citr


110

Lampiran 9. Certificate of Analysis Acetonitrile


111

Lampiran 10. Certificate of Analysis Hexane


112

Lampiran 11. Certificate of Analysis Methanol


113

Lampiran 12. Certificate of Analysis Azoxystrobin Donasi dari PT Syngenta


114

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah Melon (Cucumis melo L.)” memiliki nama lengkap Rizki Seviana Puspitasari. Penulis dilahirkan di Kulon Progo pada tanggal 07 September 1993 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Suhadi dan Warningsih. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulisyaitu TK Seruni IV Glagah Kulon Progo (1997 – 1999), SD Negeri Glagah I Kulon Progo (1999 – 2005), SMP Negeri 1 Temon Kulon Progo (2005 – 2008),

SMA Negeri 1 Wates Kulon Progo(2008 – 2011) dan pada tahun 2011 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi antara lain Wakil Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi (DPMF) periode (2014-2015); peserta Program Kreativitas Mahasiswa yang lolos seleksi dan didanai Hibah Direktorat Pendidikan Tinggi (Dikti) tahun (2014) dengan judul “Crackers Mentri Mbah Kusang (Mengkudu Bernutrisi Limbah Kulit Pisang)”; Sekertaris Event Donor Darah Unit Kegiatan Fakultas Farmasi Islam Sanata Dharma (Fistara) pada tanggal (2013); anggota Divisi Quality Control Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi periode (2012-2013); Koordinator Sie Acara Komisi Pemilihan Umum Gubernur Badan Eksekutif Mahasiswa dan Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi periode (2012-2013); Panitia Pharmacy Performance dan Pharmacy Road to School (2013) sebagai anggota divisi dana dan usaha; peserta perkuliahan “Guest Lecture on Medical Chemistry by Prof. Dr. Rob Leurs (Vrije Universiteit, The Netherlands) (2013) di Universitas Gadjah Mada; peserta Seminar Nasional “Pemberdayaan Pasien Dalam Self Management Diabetes Melitus untuk Meningkatkan Kualitas Hidup” (2011); peserta makrab Jaringan Makasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) (2012); peserta Seminar “Motivasi dan Inspirasi utuk Meningkatkan Leadership Competencies” (2014); volunteer kegiatan Desa Mitra “Penyuluhan Sikat Gigi dan Cuci Tangan yang Baik di SD N Sumberadi 1 Sleman” (2012); anggota dalam memperingati Hari HIV Aids Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) Fakultas Farmasi USD (2012).


PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI · VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU AZOXYSTROBIN DALAM BUAH...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI · VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU AZOXYSTROBIN DALAM BUAH...