PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIv Roma 11:33 O, Alangkah dalamnya kekayaan, hikmat dan...

PENETAPAN KADAR FLOROTANIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT

ALGA MERAH (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) DENGAN

METODE KOLORIMETRI FOLIN CIOCALTEAU

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Hendry Kurniawan

NIM: 048114086

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Hendry Kurniawan

NIM: 048114086

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2008


iii

Penelitian untuk Skripsi




yang diajukan oleh :

Hendry Kurniawan

NIM: 048114086

telah disetujui oleh :

Pembimbing Ign. Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si. Tanggal : 12 November 2007


iv


v

Roma 11:33

O, Alangkah dalamnya kekayaan, hikmat dan pengetahuan Allah! Sungguh tak terselidiki keputusan-keputusan-Nya dan sungguh tak terselami jalan-jalan-Nya!

�

�

�

�

��

��

��

Karya ini kupersembahkan untuk :

Tuhan Yesus Kristus Sahabat,

Penghibur yang tak pernah membiarkan aku ‘down’...

Papa-Mama tercinta Sebagai ungkapan rasa

hormat dan baktiku Meimeiku tercinta Sahabat-sahabatku

serta almamaterku Segenap dosen dan

karyawan USD Semua yang sedang

membaca skripsi ini... �


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Hendry Kurniawan Nomor Mahasiswa : 048114086

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “Penetapan Kadar Florotanin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) dengan Metode Kolorimetri Folin Ciocalteau” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 25 Februari 2008 Yang menyatakan ( Hendry Kurniawan )


vii

PRAKATA

Alleluia!! Terpujilah Tuhan Yang Maha Esa atas berkat kasih dan karunia-

Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi

yang berjudul “Penetapan Kadar Florotanin dalam Fraksi Etil Asetat Alga

Merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) dengan Metode Kolorimetri

Folin Ciocalteau”. Penelitian ini barulah langkah awal perjalanan panjang

penelitian tentang alga di bidang kosmetik dan farmasi. Skripsi ini disusun guna

memenuhi salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Dalam penulisan skripsi ini, penulis telah banyak mendapatkan bantuan

baik materiil, moral maupun spiritual dan dukungan yang berupa bimbingan,

dorongan, sarana maupun fasilitas dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini,

penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada:

1. Rita Suhadi, M. Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ign.Y. Kristio Budiasmoro,M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah

meluangkan waktu dan tenaga untuk memberikan bimbingan dan saran

mulai dari penyusunan proposal hingga diselesaikannya skripsi ini.

3. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. dan Erna Tri Wulandari, M.Si.,

Apt. selaku dosen penguji yang telah meluangkan waktu untuk

memberikan masukan, saran selama penelitian.


viii

4. Dra. A. Nora Iska H., M.Si., Apt. selaku dosen penanggungjawab proyek

penelitian payung dan ikut menemani selama penelitian, Abdul Rohman,

S.F., Apt. (UGM) dan Christine Patramurti, M.Si., Apt. atas segala

masukan, kepedulian saat penelitian mengalami permasalahan.

5. Dr. Sabikis, Apt. yang telah membantu menerjemahkan reaksi Folin yang

terbenam lama dalam sebuah buku tua Harry Auterhoff & Knabe.

6. Prof. Roman Przybylski (University Drive Lethbridge), Dr. ��

�� Jéssica de Matos Nunes�(Universidade Federal do Rio Grande

do Sul) yang mau berbagi pengalaman riset polifenol yang luar biasa.

7. Rekan tim peneliti, “Algae crew” (Elsa, Angel, Dewi, Andri, Fani, Dipta)

yang mendukung, menyemangati selama penelitian dan penyusunan

skripsi ini.

8. Teman-teman tim peneliti Teh, Wortel, Jagung, Pulveres yang menambah

keceriaan selama di laboratorium.

9. Teman-teman FST’04, kelas B, terutama kelompok D4 (Ratna-Rizky,

Widya), “The Dream Team” (Boriz, Yusak, Peter, Rike, Fani) yang

kompak habis, dan selalu mengalami hal aneh selama praktikum.

10. Segenap staf laboran terutama di lantai IV dan kepala gudang (mas Otok)

atas masukan, bantuan, kebersamaan, dan kerjasamanya selama penelitian.

11. Teman Reef’ers, bapak gembalaku pdt. Drs. Yos Hartono, S.Th., teman

pastori: Om Edwin, Tony, Marihot, Pa Ce, mbak Yuni, kak Yetty. Serta

pdt. Samuel Sakru (Boyolali) atas dukungan doa yang luar biasa.


ix

12. Semua pihak yang tak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Akhir kata, penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan skripsi

ini masih memiliki kekurangan mengingat keterbatasan penulis dalam penyusunan

skripsi ini. Oleh sebab itu, penulis mengharapkan kritik dan saran atau mungkin

ada pertanyaan dari pembaca sekalian, kirimkan ke alamat email

[email protected]. Semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan di lingkungan akademis Universitas Sanata

Dharma, syukur-syukur di tanah air. Selamat membaca...

Yogyakarta, Februari 2008

Penulis


x

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis

ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah

disebutkan kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 4 Februari 2008

Penulis

Hendry Kurniawan


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL……………………………………………………….......... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………............... iii

HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………….......…. iv

HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………………...........v

PRAKATA............................................................................................................ vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. x

DAFTAR ISI.......................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xv

DAFTAR TABEL................................................................................................ xvi

DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xvii

INTISARI............................................................................................................. xix

ABSTRACT ............................................................................................................ xx

BAB I. PENGANTAR............................................................................................ 1

A. Latar Belakang ............................................................................................ 1

B. Perumusan Masalah .................................................................................... 3

C. Keaslian Karya ............................................................................................ 3

D. Manfaat Penelitian ...................................................................................... 3

1. Manfaat teoritis ........................................................................................... 3

2. Manfaat metodologis................................................................................... 4

3. Manfaat praktis ........................................................................................... 4

E. Tujuan Penelitian ........................................................................................ 4


xii

1. Tujuan umum: ............................................................................................. 4

2. Tujuan khusus: ............................................................................................ 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA..................................................................... 5

A. Alga atau Rumput Laut ............................................................................... 5

B. Alga Merah ................................................................................................. 6

C. Kandungan kimia Laurencia sp. ................................................................. 6

D. Florotanin .................................................................................................... 7

E. Ekstraksi...................................................................................................... 8

F. Spektrofotometri Visibel dan Kolorimetri ................................................ 10

G. Metode Folin Ciocalteau........................................................................... 14

H. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 16

1. Akurasi ...................................................................................................... 16

2. Presisi ........................................................................................................ 16

3. Sensitivitas ................................................................................................ 17

4. Linearitas................................................................................................... 17

5. Range ........................................................................................................ 17

6. Spesifisitas ................................................................................................ 18

7. Detection Limit.......................................................................................... 18

8. Quantitation Limit ..................................................................................... 18

I. Kesalahan Dalam Metode Analisis ........................................................... 19

1. Kesalahan Sistematik (determinate errors) .............................................. 19

2. Kesalahan Tidak Sistematik (indeterminate errors) ................................. 20

J. Keterangan Empiris................................................................................... 20


xiii

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 22

A. Jenis Rancangan Penelitian ....................................................................... 22

B. Variabel dan Definisi Operasional ............................................................ 22

1. Variabel Penelitian .................................................................................... 22

2. Definisi operasional .................................................................................. 22

C. Bahan atau Materi Penelitian .................................................................... 23

D. Alat Penelitian........................................................................................... 23

E. Tata Cara Penelitian .................................................................................. 24

1. Preparasi Sampel Alga Merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville.... 24

2. Penetapan Kadar Air Serbuk Alga ............................................................ 24

3. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik................................................................. 25

4. Isolasi Florotanin Kasar ............................................................................ 25

5. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau........................... 26

a. Pembuatan larutan uji dan larutan standar ........................................ 26

b. Penetapan Operating Time (OT)....................................................... 26

c. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (� maks) ......................... 27

6. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 27

7. Pengukuran Kadar Polifenol Total............................................................ 28

a. Perlakuan pada larutan standar floroglusinol.................................... 28

b. Perlakuan fraksi etil asetat alga merah.............................................. 29

F. Analisis Hasil ............................................................................................ 30

1. Akurasi ...................................................................................................... 30

2. Presisi ........................................................................................................ 30


xiv

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 31

A. Pengambilan Sampel..................................................................................... 31

B. Preparasi Sampel Alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville ........... 31

B. Hasil Uji Kualitatif........................................................................................ 36

1. Uji pendahuluan ........................................................................................ 36

2. Uji polifenol .............................................................................................. 37

3. Uji tanin (zat samak) ................................................................................. 38

C. Isolasi Florotanin Kasar ................................................................................ 38

D. Dasar Reaksi Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau ..................................... 40

E. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau............................... 44

1. Penetapan Operating Time (OT)............................................................... 44

2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (�maks) .................................. 45

F. Hasil Validasi Metode Analisis..................................................................... 48

G. Penetapan Kadar Florotanin Fraksi Etil Asetat Laurencia papillosa

(Forskal) Graville .......................................................................................... 52

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN............................................................... 54

A. Kesimpulan ............................................................................................... 54

B. Saran.......................................................................................................... 54

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 55

LAMPIRAN.......................................................................................................... 59

BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 73


xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur kimia beberapa polifenol alga .............................................. 8

Gambar 2. Rangkaian alat sokhletasi................................................................. 10

Gambar 3. Instrumentasi spektrofotometer visisbel .......................................... 11

Gambar 4. Diagram radiasi elektromagnetik ..................................................... 12

Gambar 5. Ionisasi senyawa fenol ..................................................................... 13

Gambar 6. Proses oksidasi fenol oleh enzim polifenol oksidase (PPO) ............ 34

Gambar 7. Reaksi saat penetapan kadar air dengan Karl Fischer...................... 35

Gambar 8. Reaksi uji pendahuluan senyawa floroglusinol dan KOH ............... 36

Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks gugus fenolik dan FeCl3 ................ 37

Gambar 10. Reaksi redoks dalam reaksi Folin-Ciocalteau.................................. 42

Gambar 11. Hasil pembacaan OT floroglusinol kadar 3,0 ppm dengan

pereaksi Folin Ciocalteau................................................................. 45

Gambar 12. Hasil pembacaan �maks floroglusinol 3 macam kadar

floroglusinol: 1,0; 3,0 dan 6,0 ppm setelah direaksikan

dengan Folin Ciocalteau................................................................... 47

Gambar 13. Kurva baku hubungan kadar dan absorbansi floroglusinol

setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteau .................................. 51


xvi

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I. Hasil uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik Laurencia

papillosa (Forskal) Graville ................................................................ 37

Tabel II. Hasil uji kandungan senyawa polifenol Laurencia papillosa

(Forskal) Graville ................................................................................ 38

Tabel III. Data replikasi seri baku floroglusinol ................................................. 48

Tabel IV. Hasil validasi metode Folin-Ciocalteau .............................................. 49

Tabel V. Hasil penetapan kadar sampel florotanin kasar Laurencia

papillosa (Forskal) Graville ................................................................ 52


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Surat Keterangan hasil identifikasi spesies alga merah ............. 59

Lampiran 2. Data perhitungan kadar air dengan Karl Fischer........................ 61

Lampiran 3. Data penimbangan replikasi seri baku floroglusinol.................. 62

Lampiran 4. Contoh perhitungan seri kadar baku floroglusinol..................... 63

Lampiran 5. Hasil scanning �maks kadar floroglusinol 1,0 ppm setelah

direaksikan dengan Folin-Ciocalteau......................................... 63





Lampiran 8. Hasil pembacaan absorbansi seri baku floroglusinol

pada ketiga �maks ......................................................................... 65

Lampiran 9. Data recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak dengan

metode Folin-Ciocalteau ............................................................ 65

Lampiran 10. Hasil analisis statistik regresi linear seri baku floroglusinol

replikasi I.................................................................................... 66


replikasi II .................................................................................. 67


replikasi III ................................................................................. 67

Lampiran 13. Parameter mean recovery ........................................................... 68


xviii

Lampiran 14. Parameter CV ............................................................................. 69

Lampiran 15. Data penimbangan sampel fraksi etil asetat

Laurencia papillosa (Forskal) Graville...................................... 69

Lampiran 16. Data absorbansi sampel fraksi etil asetat Laurencia papillosa

(Forskal) Graville ....................................................................... 70

Lampiran 17. Contoh perhitungan kadar sampel.............................................. 70

Lampiran 18. Foto hasil uji kualitatif kandungan florotanin serbuk

alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville ................... 71

Lampiran 19. Foto florotanin kasar dari fraksi etil asetat alga merah

Laurencia papillosa (Forskal) Graville...................................... 72

Lampiran 20. Foto instrumen spektrofotometer UV - VIS Perkin Elmer

Lambda- 20 ................................................................................ 72


xix

INTISARI

Tanaman laut alga merupakan salah satu kekayaan laut Indonesia yang sangat potensial, namun belum dimanfaatkan secara maksimal baik sebagai nutrisi makanan maupun agen biomedis. Salah satunya, alga merah Laurencia yang cukup melimpah di perairan Indonesia. Alga merah mengandung mikronutrien polifenol alga yang dikenal sebagai florotanin. Senyawa ini berupa unit-unit floroglusinol (1,3,5-trihidoksibenzena) yang berbeda dari tumbuhan terestrial.

Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan florotanin kasar dari alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville serta menetapkan kadar florotanin dalam fraksi etil asetat alga tersebut. Isolasi dilakukan menggunakan metode sokhletasi dengan pelarut metanol. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian difraksinasi dengan kloroform, akuades, dan etil asetat untuk mendapatkan florotanin kasar.

Konsentrasi polifenol total dalam florotanin kasar ditetapkan secara spektrofotometri dengan metode Folin-Ciocalteau, menggunakan standar floroglusinol yang dibuat seri konsentrasi baku 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ; 5,0 ; dan 6,0 ppm dalam pelarut aseton 75 %. Standar floroglusinol dan sampel dibaca pada panjang gelombang maksimum 750,1 nm. Konsentrasi polifenol total dalam fraksi etil asetat alga merah yang didapat adalah 10,55-11,21 mg PGE (Phloroglucinol Equivalent)/g sampel.

Kata kunci : florotanin, polifenol, alga merah Laurencia papillosa, metode

Folin-Ciocalteau


xx

ABSTRACT

Seaweed algae is one of Indonesian’s sea treasures that really potential, but still haven’t been used maximally as well yet, either as food nutrition or biomedical agents. One of them is red algae Laurencia that abundant enough in Indonesian waters. The Red algae contains algae polyphenols micronutrient called phlorotannins. This compound is derived from phloroglucinol units (1,3,5-trihydoxybenzene), that is differ from terrestrial plant polyphenols.

The goals of this study is for getting crude phlorotannin from red algae Laurencia papillosa (Forskal) Graville and determining phlorotannin concentration in ethyl acetate fractional of alga that mentioned. Isolation have been done by soxhletation method with methanol solvent. The viscous extract that was gained, than was fractionated with chloroform, aquadest and ethyl acetate to gain crude phlorotannin.

Concentration of total polyphenols in crude phlorotannin was determined by spectrophotometric with Folin-Ciocalteau method. Using phloroglucinol standard that was made in calibration series 0.5 ; 1.0 ; 2.0 ; 3.0 ; 4.0 ; 5.0 and 6.0 ppm with acetone 75 % solvent. The phloroglucinol standard and sample was scanned at 750.1 nm the maxima wavelength. Concentration of total polyphenols in ethyl acetate fractional of red algae has been investigated was 10.55-11.21 mg PGE (Phloroglucinol Equivalent)/g sample.

Key words : phlorotannin, polyphenols, red algae Laurencia papillosa, Folin-

Ciocalteau method


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Saat ini telah dikenal 8000 senyawa fenolik alam dengan struktur yang

digambarkan sebagai suatu fenol (cincin aromatik yang berikatan sedikitnya

dengan 1 gugus hidroksil) seperti asam kafeat, asam ferulat, kuersetin, apigenin,

genistein, resveratrol, asam norhidroguaiaretat, asam karnosat, silimarin, polifenol

teh, dan tanin (Svobodova et al., 2003).

Salah satu mikronutrien dari tumbuhan alga adalah polifenol yang dikenal

sebagai florotanin, merupakan senyawa polifenol yang tidak ditemukan pada

tumbuhan terestrial (Burtin, 2003). Beberapa aktivitas biologik florotanin yang

telah diteliti adalah antiproliferasi dan antioksidan (Nakamura et al., 1996; Kang

et al., 2005a; Athukorala et al., 2006; Yuan & Walsh, 2006), antiinflamasi (Shin

et al., 2006), inhibitor matriks metalloproteinase (Kim et al., 2006), sitoprotektif

terhadap stres oksidatif (Kang et al., 2005b), dan inhibitor HIV-1 reverse

transcriptase dan protease (Ahn et al., 2004).

Sebagai negara yang dikelilingi oleh lautan, Indonesia memiliki potensi

yang baik untuk mengembangkan dan memanfaatkan kekayaan lautnya terutama

alga atau rumput laut (Sulistiyowati, 1992). Alga merah cukup melimpah di

perairan Indonesia yang belum dimanfaatkan secara maksimal baik sebagai

makanan ataupun agen biomedis. Selain itu, senyawa bioaktif dari lautan yang


2

telah dieksplorasi belumlah sebanyak dari daratan yang memiliki keterbatasan

lahan tanah yang semakin sempit untuk pemukiman dan fasilitas lainnya.

Diketahui pula, tanaman alga merah telah dikembangkan jadi beberapa

produk kosmetika antioksidan karena merupakan agen pereduksi sebagaimana

halnya dengan vitamin C, sehingga perlu dilakukan investigasi tentang kandungan

aktif senyawa polifenolnya. Maka sebagai langkah awal untuk meneliti

kandungan polifenol alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville dilakukan

penelitian secara kualitatif dan kuantitatif polifenol totalnya agar dapat diketahui

kandungan senyawa florotanin Laurencia papillosa (Forskal) Graville sebenarnya

dan jika dilakukan uji penelitian lanjutan dapat diketahui besarnya potensi

aktivitasnya sebagai bioaktif yang berguna menjaga kesehatan manusia.

Penelitian mengenai estimasi kandungan polifenol total pada rumput laut

dan ekstraknya yang terhitung sebagai ekivalen floroglusinol pernah dilakukan

oleh Zhang et al. (2006) dengan metode sederhana berdasarkan reaksi kolorimetri

Folin-Ciocalteau. Metode ini memiliki keunggulan dalam hal sensitivitasnya

mengukur senyawa-senyawa yang memiliki gugus fenolik hingga tingkat part per

million (ppm), memiliki reprodusibilitas dan linearitas yang baik, sederhana,

hanya membutuhkan reagen Folin Ciocalteau sehingga metode ini masih

digunakan hingga saat ini.


3

B. Perumusan Masalah

Dari uraian di atas, maka permasalahan dalam penelitian ini difokuskan

pada florotanin dalam fraksi etil asetat yang diisolasi dari alga merah Laurencia

papillosa (Forskal) Graville yang tersebar di pantai selatan Yogyakarta. Rumusan

masalah yang ada sebagai berikut :

1. Apakah florotanin berupa florotanin kasar pada fraksi etil asetat dapat diisolasi

dari alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville untuk diukur dengan

metode Folin Ciocalteau?

2. Berapakah kadar florotanin dalam alga merah Laurencia papillosa (Forskal)

Graville yang diukur dengan metode Folin Ciocalteau?

C. Keaslian Karya

Sepengetahuan peneliti, penelitian tentang penetapan kadar florotanin

dalam fraksi etil asetat alga merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville)

dengan metode Folin-Ciocalteau belum pernah dilakukan.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi kandungan florotanin hasil

isolasi dari alga merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville).


4

2. Manfaat metodologis

Penelitian ini dapat menjadi acuan tentang penggunaan metode Folin

Ciocalteau dalam penetapan kadar florotanin.

3. Manfaat praktis

Memberi informasi kepada masyarakat kandungan polifenol alga merah

(Laurencia papillosa (Forskal) Graville) yang bermanfaat bagi kesehatan

sebagai antioksidan, antikanker, sediaan kosmetik tabir surya dan manfaat lain

yang belum diteliti.

E. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum:

Tujuan umum penelitian ini adalah menetapkan kadar florotanin alga merah

Laurencia papillosa (Forskal) Graville.

2. Tujuan khusus:

a. Dapat mengisolasi florotanin berupa florotanin kasar pada fraksi etil asetat

alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville untuk diukur dengan

metode Folin Ciocalteau.

b. Mengetahui kadar florotanin dalam alga merah Laurencia papillosa

(Forskal) Graville yang diukur dengan metode Folin Ciocalteau.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Alga atau Rumput Laut

Rumput laut adalah tumbuhan yang tidak dapat dibedakan antara bagian

akar, batang dan daun. Semua bagian tumbuhannya disebut thallus. Berdasarkan

ukurannya dibedakan dua golongan yaitu mikro-algae dan makro-algae (Anonim,

1979). Makroalga (alga coklat, alga hijau, dan alga merah) merupakan tumbuhan

laut yang dikonsumsi sehari-hari sebagai sayuran secara turun–menurun di Asia.

Banyak penelitian epidemiologi mengaitkan antara konsumsi alga dan manfaatnya

bagi kesehatan. Selain itu, makroalga telah banyak dieksplorasi di negara barat

sebagai sumber phycocolloid seperti alginat, karagenan, dan agar. Di sisi lain,

makroalga masih mengandung senyawa lain (makronutrien dan mikronutrien)

yang mempunyai efek protektif terhadap kesehatan yang menarik untuk diteliti

lebih lanjut. Makroalga merupakan sumber polisakarida yang tinggi (alginat dan

fucoidan dari alga coklat, karagenan dan agar dari alga merah), selain itu juga

makronutrien seperti mineral yang tinggi (yodium dari alga coklat dan kalsium),

protein dan asam amino (pikobiliprotein dari alga merah dan biru), lipid dan asam

lemak (asam linolenat dari alga hijau, asam eikosapentoat dan asam arakidonat),

dan mikronutrien (vitamin C, vitamin E, polifenol, dan karotenoid) (Burtin, 2003).

Jenis-jenis alga ini umumnya tumbuh dengan baik di daerah pasang surut atau di

daerah yang selalu terendam air (subtidal) sampai batas kedalaman 200 m yang

intensitas cahaya masih dapat ditembus (Kadi, 2007).


6

B. Alga Merah

Red algae (Rhodophyta, Yunani : �� (rhodon) = mawar + ��

(phyton) = tanaman, jadi tanaman merah) adalah kelompok besar sekitar 5000-

6000 spesies dari kebanyakan marine algae adalah multiselular termasuk banyak

dikenal sebagai ganggang laut (Thomas, 2002). Laurencia termasuk dalam ordo

Ceramiales dan famili Rhodomelaceae (Al Amin & Razali, 1997).

Kebanyakan coralline algae, mensekresikan kalsium karbonat dan

memainkan peran membangun batu karang (Woelkerling, 1990). Alga merah

seperti dulse (Palmaria palmata) dan nori sebagai masakan tradisional Eropa dan

Asia dan digunakan untuk produk agar, karagenan dan bahan tambahan makanan

lain (Thomas, 2002).

C. Kandungan kimia Laurencia sp.

Laurencia papillosa (Forskal) Graville mengandung polisakarida

carrageenan dan agar, dinding sel alga merah mengandung minor polisakarida

xylan (Burtin, 2003). Laurencia obtusa mengandung seskuiterpen teroksidasi

chamigrenelactone, asetogenin steroisomer neoisoprelaurefucin. Dua diterpen

terhalogenasi 15-bromoparguer-9(11)-ene-16-ol dan 15-bromoparguer-7-ene-16-

ol dielusidasi dari L. nipponica. L. intricata memiliki diterpen laurenditerpenol.

Rhodomela confervoides telah dikenal sebagai sumber derivat bromofenol (Blunt

et al., 2006). Kandungan kalsium bisa setinggi 7 % dari bobot kering pada

makroalga dan bisa mencapai 34 % pada alga berkapur lithotamne. Protein alga

merah disebut dengan pikobiliprotein. Kandungan protein dan senyawa fenolik


7

bertolakbelakang, pada alga merah dan hijau memiliki kandungan fenol yang

rendah dan protein yang tinggi. Lipid didapati hanya 1-5 % dari bobot kering alga

menunjukkan suatu poli-asam lemak tak jenuh. Selain itu terdapat pula polifenol

alga disebut florotanin (Burtin, 2003).

D. Florotanin

Polifenol alga disebut juga florotanin, berbeda dengan polifenol dari

tanaman teresterial yang berasal dari turunan asam galat dan asam ellagat,

sementara polifenol algal berasal dari unit-unit floroglusinol (1,3,5-

trihydroxybenzene) (Burtin, 2003).

Kandungan tertinggi florotanin ditemukan dalam ganggang coklat,

berkisar 5-15 % dari berat kering (Nagayama et al., 2002). Florotanin terdiri dari

molekul dengan struktur dan tingkat polimerisasi yang heterogen yaitu

phloroglucinol (2 %) dan oligomernya seperti eckol (trimer, 3 %),

phlorofucofuroeckol A (pentamer, 28 %), dieckol (heksamer, 7 %), 8,8’–bieckol

(hexamer, 7 %) dan lainnya (30 %). Florotanin dengan struktur dan tingkat

polimerisasi yang heterogen memungkinkan senyawa ini mempunyai aktivitas

biologik yang luas (Athukorala et al., 2006; Yuan & Walsh, 2006; Kang et al.,

2005a). Floroglusinol berupa kristal putih pada suhu kamar, titik lebur 218 0C,

rasa manis, tak berwarna dalam cahaya. Larut dalam 100 bagian air, 10 bagian

alkohol, 0,5 bagian piridin. Praktis larut eter, protektif terhadap cahaya (Anonim,

1989).


8

Glombitza et al. menemukan floroglusinol bebas dalam Fucus vesiculosus

dan mendeskripsikan isolasi beberapa polifloroglusinol dan dinamakan difucol,

trifucol, serta campuran dua isomerik tetrafucol. Senyawa-senyawa ini diisolasi

dan dikaraktersisasikan sebagai paracetates, yang strukturnya didapat dari data

spektrum. Dari ganggang coklat yang lain, Bifurcaria bifurcata, diisolasi sebuah

difenil eter dan dikarakterisasikan sebagai paracetate. Data spektrum

menunjukkan senyawa ini, bernama bifuhalol yang lebih lanjut diduga sebagai

prekursor tanin phaeophyta. Contoh struktur kimia senyawa-senyawa polifenol

alga seperti pada gambar 1 (Anonim, 1978).

OH

OH

HO

OH

OH

HO

HO

HO

OH

OH

OH

HO

HO

HO

OH

OH

OH

HO

OH

OH

HO

HO

HO

OHO

OH

OH

HO

HO

HO

OH

OH

OH

HO

OH

OH

HOOH

OH

HO

HO

HO

OH

OH

OH

HO

HO

HO

OH

( 1 ) ( 2 ) ( 3 )

( 4 ) ( 5 ) ( 6 )

Gambar 1. Struktur kimia beberapa polifenol alga : (1) Floroglusinol, (2) Difucol, (3) Bifuhalol, (4) Trifucol, (5) Isomer I Tetrafucol, (6) Isomer II Tetrafucol

E. Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang

tidak dapat larut dengan pelarut cair. Faktor yang mempengaruhi kecepatan


9

penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan batas antara

cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut. Pada waktu

pembuatan simplisia (serbuk), beberapa sel ada yang dindingnya pecah dan ada

yang masih utuh. Proses penyarian pada sel yang dindingnya masih utuh, zat aktif

yang terlarut pada cairan penyari untuk keluar dari sel harus melewati dinding sel

(Anonim, 1986). Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan

menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, diluar pengaruh

cahaya matahari langsung (Anonim, 1979).

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana dan digunakan untuk

simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari.

Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari.

Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang

mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung

zat mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak,

dan lain-lain. Keuntungan penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan

peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian maserasi

adalah pengerjaan lama, penyariannya kurang sempurna (Anonim, 1986).

Sokhletasi merupakan salah satu penyarian berkesinambungan

menghasilkan ekstrak cair yang dilanjutkan dengan proses penguapan. Serbuk

diisikan pada filter kertas berpori. Cairan penyari dalam labu dipanaskan hingga

mendidih. Uap penyari mengembun karena didinginkan oleh pendingin balik.

Embun turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali


10

ke labu. Cairan akan menguap kembali berulang seperti proses sebelumnya

(Anonim, 1986). Rangkaian alat sokhletasi seperti gambar 2 (Evans, 2002).

Gambar 2. Rangkaian alat sokhletasi : A) tempat ekstraksi sampel, B) tempat solven

Metode sokhletasi mempunyai beberapa keuntungan antara lain, cairan

penyari yang dibutuhkan lebih sedikit dan secara langsung hasil yang diperoleh

lebih pekat. Serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni maka dapat

menyari zat aktif lebih banyak dan penyarian dapat diteruskan tanpa menambah

volume cairan penyari (Anonim, 1986).

F. Spektrofotometri Visibel dan Kolorimetri

Spektrofotometer adalah suatu instrumen yang akan memecah radiasi

polikromatis menjadi panjang gelombang berbeda. Instrumentasi seluruh

spektrofotometer yang ada: 1) sumber radiasi kontinyu pada � tertentu, 2)

monokromator untuk memilih berkas sempit dari sumber spektrum, 3) sel sampel,

4) detektor, 5) pembaca respon detektor atau recorder (Christian, 2004).

Instrumentasi spektrofotometer seperti pada gambar 3 (Cairns, 2005).


11

Gambar 3. Instrumentasi spektrofotometer visisbel

Sumber (source) untuk daerah tampak, adalah tungsten filament

incandescent lamp. Sel sampel untuk visibel dari gelas atau kuarsa (Christian,

2004). Analisis spektroskopi adalah sains untuk menetapkan berapa banyak

substansi yang ada di sampel secara akurat mengukur berapa besar cahaya yang

diabsorpsi atau diemisikan oleh atom atau molekul di dalamnya (Cairns, 2005).

Senyawa yang dapat menyerap radiasi cahaya tampak adalah senyawa

berwarna yang memiliki elektron lebih mudah dipromosikan. Spektrum serapan

elektronik ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif karena jumlah radiasi

elektromagnetik yang diserap ada hubungannya dengan jumlah molekul penyerap

(Silverstein & Murrill, 1991; Skoog et al., 1998), digambarkan sebagai berikut:

T = = 10 -abcItIo (1)

A = log = abc1T (2)

Keterangan:

T = persen transmittan

Io = intensitas radiasi yang

datang

It = intensitas radiasi yang

diteruskan

A = absorban (serapan)

a = absorbansi molar

b = tebal kuvet

c = konsentrasi analit

(Mulja & Suharman, 1995)


12

Cahaya adalah bentukan radiasi elektromagnetik, disebut demikian karena

terdiri atas komponen elektrik dan komponen magnetis yang bergelombang

bersamaan dengan arah tegak lurus dan tegak lurus terhadap arah perjalanan

radiasi melewati ruang seperti gambar 4 berikut (Cairns, 2005).

Gambar 4. Diagram radiasi elektromagnetik

Panjang gelombang saat mencapai absorbans (A) tertinggi disebut �maks

dan karakteristik dari bagian kromofor (Christian, 2004). Pergeseran �maks menjadi

panjang gelombang lebih panjang dikenal sebagai batokromik atau red shift

karena warna merah berada pada panjang gelombang yang panjang di akhir

spektrum visibel. Pada kasus fenol yang merupakan asam lemah, ionisasi

meningkatkan intensitas absorpsi cahaya dan posisi �maks berpindah ke panjang

gelombang lebih panjang. Ini karena ionisasi dan kehilangan atom H sehingga

menghasilkan ion H+ dengan muatan negatif penuh pada oksigen (ion fenoksida),

yang dapat berinteraksi dengan cincin lebih efektif dari pasangan elektron bebas

yang ada pada molekul tak terionkan. Gambar 5 menggambarkan proses ionisasi

senyawa fenol (Cairns, 2005).


13

Gambar 5. Ionisasi senyawa fenol

Kolorimetri adalah suatu teknik pengukuran cahaya yang diabsorpsi oleh

zat berwarna baik warna yang terbentuk dari asalnya maupun akibat reaksi dengan

zat lain (Khopkar, 1990). Pemilihan prosedur kolorimetri untuk menentukan

substansi tergantung pada pertimbangan sebagai berikut :

1. metode kolorimetri akan memberikan hasil yang lebih akurat pada

konsentrasi rendah daripada titrimetri atau gravimetri.

2. metode kolorimetri sering digunakan pada kondisi di mana tidak ada

titrimetri atau gravimetri.

3. metode kolorimetri memiliki beberapa keuntungan dalam hal spesifisitas

(Vogel, 1978).

Kriteria untuk analisis kolorimetri yang baik adalah :

1. Menghasilkan reaksi warna yang khusus

Reaksi-reaksi yang ada sangat sedikit sekali untuk beberapa substansi

tertentu, tetapi justru memberikan warna-warna yang banyak membentuk

kelompok warna tersendiri yang hanya berhubungan dengan substansi

khusus.

2. Adanya proporsi yang sesuai antara warna dan konsentrasi


14

Untuk kolorimeter visual sangat penting bahwa intensitas warna harus

meningkat secara linier dengan konsentrasi substansi yang ditentukan.

3. Stabilitas warna

Warna yang dihasilkan harus sama untuk mendapatkan hasil yang akurat.

Hal ini menerapkan reaksi-reaksi warna yang akan dicapai secara maksimal.

Waktu untuk mencapai warna yang maksimal harus cukup lama untuk

mendapatkan pengukuran yang kurat.

4. Reprodusibel

Prosedur kolorimetri harus memberikan hasil yang reprodusibel dalam

kondisi yang spesifik.

5. Kejernihan larutan

Larutan harus bebas dari pengotor jika pembanding yang dipakai dibuat

dengan standar. Kekeruhan akan menyerap cahaya dengan baik (Vogel,

1978).

G. Metode Folin Ciocalteau

Reagen Folin-Ciocalteau tersusun atas: 100 g natrium tungstat, 25 g

natrium molibdat P, 50 mL asam fosfat P, 100 mL HCl P, 150 g lithium sulfat P,

dan beberapa tetes brom P (Anonim, 1995).

Metode Folin-Ciocalteau (Singleton & Rossi, 1965) sebagaimana

dideskripsikan oleh Waterman dan Mole (1994) telah digunakan untuk

mendeterminasikan fenol total. Metode Folin-Ciocalteau digunakan untuk

menetapkan konsentrasi gugus-gugus hidroksil fenolik dalam sampel. Metode ini


15

tidak menyediakan data senyawa fenolik tertentu dalam ekstrak. Metode Folin-

Ciocalteau berdasar atas kemampuan mereduksi gugus hidroksil fenolik dan

sangat tidak spesifik namun dapat mendeteksi semua fenol dengan sensitivitas

berbeda. Reaksi redoks dari fenolat terjadi di bawah kondisi basa mereduksi

kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat dalam reagen menjadi suatu warna biru

(Box, 1983).

Pengujian dengan kolorimetri oksidasi/reduksi ini mengukur semua

molekul fenol tanpa ada diferensiasi antara asam gallat, monomer, dimer dan

senyawa fenolik yang lebih besar (Anonim, 2001). Paper pertama tentang metode

ini dipublikasikan pertama kali pada 1927. Singleton dan Rossi (1965)

membuktikan reprodusibilitas uji ini. Ini adalah suatu metode kuantitatif dan

sensitif, tergantung pada derajat polimerisasi: Fenolik + basa + reagen Folin-

Ciocalteau (F-C) + panas = produk berwarna biru. Absorpsi hasil reaksi polifenol

anggur dan reagen F-C pada 755 nm (Anonim, 2001).

Reagen Folin-Ciocalteau suatu agen pengoksidasi tersusun dari

heteropolifosfotungstat–molibdat (Anonim, 2001). Reagen Folin-Ciocalteau

merupakan larutan kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam

fosfomolibdat dan asam heteropolifosfotungstat. Reagen ini mengoksidasi fenolat

(garam alkali), sehingga mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks

Mo-W. Fenolat hanya ada pada larutan basa tetapi reagen dan produknya tidak

stabil pada kondisi basa. Reaksi tersebut menghasilkan warna biru ungu yang

dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (Jansoon, 2005).


16

H. Validasi Metode Analisis

Validasi suatu metode analisis adalah proses yang dibuat, dengan

penelitian laboratorium agar karakteristik pelaksanaan metode memenuhi

persyaratan aplikasi analisis yang diinginkan. Parameter-parameter validitas

metode analisis antara lain akurasi, presisi, linearitas, spesifisitas, range, detection

limit, dan quantitation limit (Anonim, 2005).

1. Akurasi

Akurasi adalah derajat kepercayaan antara nilai yang terukur dan nilai

sebenarnya. Nilai sebenarnya yang mutlak sangat sukar diketahui. Definisi

yang lebih mungkin mengenai akurasi adalah kesesuaian antara nilai terukur

dan nilai sebenarnya yang dapat diterima (Christian, 2004).

Akurasi dihitung sebagai persentase recovery pengujian sejumlah

analit yang diketahui jumlahnya atau sebagai perbedaan antara rata-rata dan

nilai sebenarnya yang dapat diterima (Anonim, 2005). Menurut Mulja dan

Hanwar (2003) akurasi untuk bahan baku 98-102 %, sedangkan untuk

bioanalisis rentang akurasi 80-120 % masih bisa diterima.

2. Presisi

Presisi suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian antar hasil

percobaan individual ketika metode itu diaplikasikan secara berulang pada

sampel yang homogen (Anonim, 2005). Presisi bisa diekspresikan sebagai

standar deviasi, koefisien variasi, sebagai rentang kepercayaan nilai rata-rata

(Christian, 2004). Menurut Mulja dan Hanwar (2003), presisi yang baik


17

dinyatakan dengan nilai koefisien variasi (CV) yang < 2 % untuk kadar analit

98-102 %.

3. Sensitivitas

Sensitivitas suatu metode analisis merupakan kemampuan metode

analisis untuk memisahkan perbedaan kecil konsentrasi analit. Faktor yang

mempengaruhi sensitivitas adalah kemiringan (slope) kurva baku dan presisi.

Jika ada 2 metode analisis memiliki presisi yang sama namun salah satunya

memiliki kemiringan kurva baku yang lebih curam maka metode yang disebut

terakhir lebih sensitif, dan sebaliknya (Skoog et al., 1998).

4. Linearitas

Linearitas suatu metode analisis merupakan kemampuan (pada

rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung

proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel sehingga

memberikan nilai koefisien korelasi yang lebih besar daripada nilai koefisien

korelasi pada tabel statistik (Mulja & Suharman, 1995).

5. Range

Range suatu metode analisis adalah interval antara konsentrasi

terendah sampai konsentrasi tertinggi analit yang dapat diukur secara

kuantitatif menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan akurasi,

presisi, linearitas yang memadai (Anonim, 2005).


18

6. Spesifisitas

Spesifisitas didefinisikan sebagai kemampuan untuk mengukur

dengan baik komponen lain dalam analit yang mungkin ada seperti pengotor,

produk degradasi, dan komponen matriks (Anonim, 2005). Spesifisitas

merupakan karakterisitik terpenting dari suatu metode sebagai salah satu

parameter validasi yang utama (Mulja & Hanwar, 2003)

7. Detection Limit

Detection limit adalah kadar terkecil analit yang masih dapat

memberikan tanggap detektor yang tingginya 2-3 kali simpangan maksimum

dari noise (derau) garis dasar (Mulja & Hanwar, 2003). Pada kasus prosedur

analisis instrumental yang menghasilkan background noise. Menurut ICH

(International Conference on Harmonization), rasio signal-to-noise yang

dapat diterima adalah 2:1 atau 3:1 (Anonim, 2005).

8. Quantitation Limit

Quantitation limit adalah kadar terkecil analit dalam sampel yang

dapat ditetapkan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi

percobaan yang dinyatakan. Menurut ICH, rasio signal-to-noise yang dapat

diterima adalah 10:1 (Anonim, 2005).


19

I. Kesalahan Dalam Metode Analisis

Kesalahan dalam metode analisis sangat sukar untuk dihilangkan namun

sumber kesalahan tetap harus dibuat seminimal mungkin. Kesalahan dalam

analisis kimia dapat dikategorikan menjadi 2 kelas utama, yaitu:

1. Kesalahan Sistematik (determinate errors)

Kesalahan sistematik adalah hasil analisis yang menyimpang secara

tetap dari nilai kadar yang sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur

analisis, sehingga kesalahan ini disebut juga kesalahan prosedur (Mulja &

Suharman, 1995). Kesalahan sistematik dapat disebabkan oleh beberapa

faktor, antara lain:

a. Kesalahan personil dan operasi

Kesalahan ini disebabkan oleh cara pelaksanaan analisis, bukan

karena metode. Kesalahan operasi umumnya bersifat fisis (bukan khemis),

misalnya kesalahan pengamatan visual pada titik akhir titrasi, kekeliruan

cara pencucian endapan, dan sebagainya. Jadi kesalahan ini bersifat

individual dan sangat dipengaruhi oleh keterampilan analis dalam

melakukan pekerjaan analisis.

b. Kesalahan alat dan pereaksi

Kesalahan ini disebabkan oleh pereaksi yang kurang murni, alat

yang kurang valid atau pemakaian alat yang kurang tepat walaupun

alatnya sendiri baik, contohnya pengambilan volume tepat dengan pipet

ukur atau gelas ukur, penggunaan buret 50 mL (buret makro) untuk

analisis mikro, dan sebagainya.


20

c. Kesalahan metode

Kesalahan ini dapat disebabkan oleh kesalahan pengambilan

sampel, kesalahan akibat reaksi kimia yang tidak sempurna, atau ikut

mengendapnya zat-zat yang tidak diinginkan (Day & Underwood, 1986).

Kesalahan sistematik dapat dihindari atau diperkecil dengan:

1). Mengkalibrasi instrumen dan melakukan koreksi secara berkala (biasanya

tiap 3 bulan atau disesuaikan dengan frekuensi pemakaian alat).

2). Memilih metode dan prosedur standar dari badan resmi.

3). Memakai bahan kimia dengan derajat untuk analisis.

4). Meningkatkan pengetahuan dan keterampilan analis.

5). Melakukan penetapan blangko atau kontrol dengan zat baku.

6). Melakukan penetapan paralel (in duplo atau in triplo).

2. Kesalahan Tidak Sistematik (indeterminate errors)

Kesalahan tidak sistematik adalah penyimpangan yang tidak tetap

dari hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan fluktuasi dari

instrumen yang dipakai (derau). Penyebab kesalahan ini tidak dapat ditentukan

dan tidak dapat dikontrol maka kesalahan ini disebut juga kesalahan acak

(random error) (Mulja & Suharman, 1995).

J. Keterangan Empiris

Penyarian florotanin alga merah dilakukan dengan cara sokhletasi karena

hasil dengan cara maserasi didapat ekstrak yang kurang memadai. Selain itu,

florotanin cukup stabil oleh pemanasan dilihat dari sifat fisika-kimia monomernya


21

floroglusinol. Florotanin yang ditetapkan kadarnya adalah fraksi etil asetat yang

diuapkan pelarutnya dan dianggap sebagai florotanin kasar.

Metode Folin-Ciocalteau dapat digunakan untuk menetapkan konsentrasi

gugus-gugus hidroksil fenolik dalam sampel. Metode ini tidak menyediakan data

senyawa fenolik tertentu dalam ekstrak. Metode Folin-Ciocalteau berdasar atas

kemampuan mereduksi gugus hidroksil pada fenol sehingga tidak spesifik namun

sangat sensitif untuk mendeteksi semua kandungan senyawa polifenol dalam

fraksi etil asetat alga merah yang ingin ditetapkan kadarnya, sehingga yang diukur

adalah kadar total polifenol alga yang ekivalen dengan standar floroglusinol.

Dipilih standar floroglusinol karena merupakan unit monomer florotanin.


22

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam penelitian deskriptif non-eksperimental

karena tidak ada intervensi atau perlakuan terhadap fenomena yang diamati.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah volume cairan

penyari untuk mengisolasi florotanin alga merah Laurencia papillosa

(Forskal) Graville, tempat panen alga di pantai Drini, masa panen pada

bulan Mei, komposisi reagen saat analisis.

b. Varibel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah umur alga

yang dipanen (bukan tanaman budidaya), suhu dan kelembaban ruangan

saat percobaan.

2. Definisi operasional

a. Laurencia papillosa (Forskal) Graville adalah spesies alga merah yang

diambil dari pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta pada bulan Mei.

b. Ekstrak metanol adalah hasil ekstraksi serbuk alga dengan sokhlet

menggunakan pelarut metanol sampai jernih.


23

c. Florotanin kasar adalah ekstrak kasar florotanin dari fraksi etil asetat yang

diuapkan pelarut (etil asetat) seluruhnya.

d. Kadar florotanin adalah konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen

dengan floroglusinol (mg PGE/g sampel) yang diukur pada panjang

gelombang maksimum 750,1 nm mendekati teoritis hasil penelitian Zhang

et al. dengan metode Folin Ciocalteau.

C. Bahan atau Materi Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut: Alga

merah (Laurencia sp.) dari pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta diambil

tanggal 21 Mei 2007. Metanol, kloroform, etil asetat, natrium karbonat (p.a. E.

Merck, Germany), reagen Folin Ciocalteau (Sigma Chem, Co., USA.), akuades

(Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma).

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut:

Seperangkat spektrofotometer UV-VIS Perkin Elmer Lambda 20, timbangan

elektrik BP 160 dan scaltec SBC 22 readability 0,01 mg, mesin blender, vaccum

rotary evaporator (Buchi), waterbath (Abo-tech), autoklaf, mikropipet 100-1000

�l. (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup (Scott-Germany), alat-alat untuk

sokhletasi, yaitu sokhlet, labu alas bulat (Schott Duran, Germany), alat sentrifus,

corong pisah 500 mL, alat-alat gelas yang lazim digunakan untuk penelitian di

laboratorium analisis (PYREX-GERMANY)


24

E. Tata Cara Penelitian

1. Preparasi Sampel Alga Merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Alga merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) dikumpulkan,

dicuci dengan air mengalir dan dimasukkan dalam autoklaf selama 30 menit pada

suhu 100 0C. Selanjutnya dikeringkan dalam oven dengan suhu 80-100 0C selama

6 hari sampai dapat dihancurkan dengan kekuatan tangan, diserbuk dengan

blender, diayak dan dipilih serbuk yang lolos dengan derajat halus 20/30.

2. Penetapan Kadar Air Serbuk Alga

Penetapan kadar air serbuk alga dilakukan dengan menggunakan metode Karl

Fischer. Serbuk alga ditimbang dengan seksama 0,2 gram, kemudian ditambah 10

mL metanol, didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Dilakukan pre-titrasi

pada alat, lalu dilakukan uji kebocoran sesuai prosedur perintah pada alat, hingga

didapat angka drift 10-50 pada alat. Standardisasi dilakukan dengan cara timbang

spuit berisi air, kemudian dimasukkan 1 tetes air ke dalam alat. Lalu ditimbang

kembali untuk ditentukan berat air yang dimasukkan. Kemudian dihitung

kesetaraan air. Sebanyak 1 mL metanol dimasukkan dan titrasi dengan alat

(blangko). Kemudian 1 mL sampel dimasukkan, titrasi dengan alat, hitung kadar

air dalam sampel. Kadar air dalam sampel dihitung dengan rumus:

x - blanko (10)berat yang ditimbang

x 100 %Kadar air =

x = angka yang muncul pada alat (%), berat yang ditimbang = mg.


25

3. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik

a. Uji pendahuluan

Sebanyak 1 mL filtrat alga ditambah 10 mL air, dipanaskan selama 30

menit. Larutan disaring dengan kapas. Larutan berwarna kuning sampai

merah menunjukkan adanya senyawa yang mengandung kromofor dengan

gugus hidrofilik. Jika ditambah KOH, warna larutan kuning sampai merah

menjadi lebih pekat.

b. Uji polifenol

Sebanyak 1 mL filtrat alga ditambah 3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Jika

terjadi warna hijau-biru menunjukkan adanya polifenol.

c. Uji tanin (zat samak)

Sebanyak 1 mL filtrat alga ditambah 1 mL NaCl 2 %. Bila terjadi

suspensi (endapan) disaring melalui kertas saring. Filtrat alga ditambah 5

mL larutan gelatin 1 %. Terbentuknya endapan warna putih menunjukkan

adanya tanin.

4. Isolasi Florotanin Kasar

Serbuk alga ditimbang sebanyak 40 g. Kemudian serbuk dimasukan

ke dalam kantong khusus untuk sokhlet dan dimasukan dalam labu sokhlet.

Setelah itu diberi pelarut metanol sebanyak 2 kali sirkulasi (1 sirkulasi = 70

mL) dalam tabung sokhlet. Proses sokhletasi dilakukan sampai tetesan pelarut

jernih dengan suhu 100-120 0C. Setelah selesai, hasil sokhletasi diuapkan

pelarutnya dengan menggunakan vacuum rotary evaporator sampai volume


26

yang kecil (1/10 dari volume mula-mula) dan ditambahkan kembali pelarut

metanol hingga diperoleh 60 mL ekstrak metanol, kemudian ditambahkan 120

mL kloroform, dan 45 mL air dalam corong pisah. Corong pisah digojog

perlahan dan didiamkan hingga memisah dan membentuk 2 lapisan. Lapisan

atas dan lapisan bawah yang terbentuk dipisahkan, selanjutnya lapisan atas

diekstraksi dalam corong pisah dengan etil asetat masing-masing sebanyak

75mL. Kumpulkan fraksi etil asetat, selanjutnya diuapkan, dan diperoleh

ekstrak yang merupakan florotanin kasar.

5. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau

a. Pembuatan larutan uji dan larutan standar

i. Pembuatan larutan intermediet floroglusinol

Ditimbang dengan cara seksama 0,05 g standar floroglusinol,

kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75 % sampai volume 50,0 mL.

Buat seri konsentrasi (0,005; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; dan 0,06)

ppm sebanyak 10,0 mL dengan pelarut aseton 75 %.

ii. Perlakuan fraksi etil asetat alga merah

Ditimbang dengan cara seksama 0,05 g fraksi polifenol, kemudian

dilarutkan ke dalam aseton 75 % hingga volumenya 50,0 mL.

b. Penetapan Operating Time (OT)

Pipet 0,5 mL larutan intermediet 0,03 ppm dan dimasukkan ke dalam labu

takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau


27

yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit,

kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai

volume 50,0 mL dengan akuades. Operating time diukur dengan

spektrofotometer visibel. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang

teoritis hasil reaksi floroglusinol dengan Folin Ciocalteau (750 nm).

c. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (� maks)

Pipet 0,5 mL larutan intermediet (0,01; 0,03; dan 0,06) ppm dan masukkan

ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol

Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan

selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M,

dicampurkan sampai volume 50,0 mL dengan akuades. Campuran tersebut

diinkubasi pada suhu kamar selama OT (pada 15 menit pertama dan 15

menit kedua, campuran tersebut divortex selama 30 detik). Kemudian

campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit.

Kemudian ketiga larutan tersebut di-scanning pada rentang panjang

gelombang 400-900 nm dengan spektrofotometer visibel untuk melihat

panjang gelombang maksimumnya.

6. Validasi Metode Analisis

Pipet 0,5 mL untuk masing-masing larutan intermediet dan masukkan ke

dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-

Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit,


28

kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai volume 50,0

mL dengan akuades. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama OT

untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk warna biru (pada 15 menit

pertama dan 15 menit kedua, campuran tersebut divortex selama 30 detik).

Kemudian campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5

menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil

scanning (�maks) menggunakan spektrofotometer visibel. Ditentukan persamaan

kurva baku plot antara kadar baku floroglusinol dan absorbansi. Replikasi

dilakukan sebanyak 3 kali untuk dihitung recovery, kesalahan sistematik,

kesalahan acak dengan rumus sebagai berikut:

Recovery = sebenarnyakadar

kurkadar teru× 100 %

Kesalahan sistematik = 100 % – recovery

Kesalahan acak = kurkadar teru rata-rata

(SD) deviasistandar × 100 %

7. Pengukuran Kadar Polifenol Total

a. Perlakuan pada larutan standar floroglusinol

Pipet 0,5 mL untuk masing-masing larutan intermediet dan masukkan ke

dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-

Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama

2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan

sampai volume 50,0 mL dengan akuades. Campuran tersebut diinkubasi


29

pada suhu kamar selama OT untuk menyempurnakan reaksi sampai

terbentuk warna biru (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua,

campuran tersebut divortex selama 30 detik). Kemudian campuran reaksi

disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diukur

absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil scanning (�maks)

menggunakan spektrofotometer visibel.

b. Perlakuan fraksi etil asetat alga merah

Pipet 10,0 mL larutan sampel alga merah dan dimasukkan ke dalam labu

takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau

yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit,

kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai

volume 50,0 mL dengan akuades. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu

kamar selama OT jam untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk

warna biru (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran tersebut

divortex selama 30 detik). Kemudian, campuran reaksi disentrifus dengan

kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada

panjang gelombang maksimum hasil scanning (�maks) menggunakan

spektrofotometer visibel. Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen

dengan floroglusinol (mg PGE/g sampel). Prosedur ini dilakukan sebanyak

3 kali replikasi dengan masing-masing replikasi ditetapkan sebanyak 2 kali

dengan cara 2 kali pemipetan (duplo).


30

F. Analisis Hasil

Analisis hasil dilakukan untuk mengetahui validitas metode yang

digunakan dalam penelitian. Validitas metode dilihat dari beberapa parameter

dengan mengacu rentang nilai yang dipersyaratkan Harmita (2004), sebagai

berikut:

1. Akurasi

Akurasi dinilai berdasarkan hasil perolehan kembali (recovery) dan

kesalahan sistematik. Akurasi dikatakan baik jika nilai perolehan kembali rata-rata

(mean recovery) berada dalam rentang 80-110 % jika konsentrasi analit yang

diperiksa adalah 1 ppm (0,0001 %) dengan nilai kesalahan sistematik yang

diterima <20 % (Harmita, 2004). Recovery dan kesalahan sistematik dihitung

dengan rumus sebagai berikut:

Recovery = sebenarnyakadar

kurkadar teru× 100 %

Kesalahan sistematik = 100 % – recovery

2. Presisi

Penilaian presisi berdasarkan nilai kesalahan acak atau coefficient of

variation (CV). Presisi dikatakan baik jika nilai CV lebih kecil dari 4,1 % untuk

rentang recovery yang dapat diterima 85-115 % (Harmita, 2004). Kesalahan acak

diperoleh dengan rumus :

Kesalahan acak = kurkadar teru rata-rata

(SD) deviasistandar × 100 %


31

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengambilan Sampel

Sampel alga merah didapat dari hasil panen petani setempat pada tanggal

21 Mei 2007 dari perairan dangkal pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta.

Secara geografis berada di wilayah samudera Indonesia, pantai selatan pulau

Jawa. Suhu perairan habitat laut alga sekitar 27-30 0C. Umur alga merah yang

dipanen tidak diketahui pasti karena bukan merupakan hasil budidaya melainkan

merupakan hasil panen langsung dari alam, meski informasi tentang perbedaan

umur, masa panen, kondisi geografis habitat alga tumbuh dan spesies alga ini

penting untuk diperhatikan karena dapat memberikan variasi kandungan polifenol

alga.

Selanjutnya jenis spesies alga merah yang didapat diidentifikasi dengan

bantuan dari pihak laboratorium Sistematika Tumbuhan (Fakultas Biologi UGM,

Yogyakarta). Hasil identifikasi, sampel alga merah termasuk dalam ordo

Ceramiales, familia Rhodomelacaeae, genus Laurencia, spesies Laurencia

papillosa (Forskal) Graville (lihat lampiran 1).

B. Preparasi Sampel Alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville dikumpulkan, dicuci

dengan air tawar mengalir sebanyak dua kali untuk menghilangkan kotoran

berupa debu, pasir (silikat), material laut bukan berasal dari alga merah yang ikut


32

terbawa dan mengotori sampel alga merah. Langkah pencucian ini perlu dilakukan

dengan cermat agar pengotor tidak mengotori sampel yang ingin diteliti.

Senyawa silikat juga dapat membentuk kompleks molibdat dari reagen

Folin dalam suasana asam. Bentuk kompleks asam molibdat yang terbentuk

H6[SiMo12O40].n H2O (Auterhoff & Knabe, 1978). Setelah itu, dilakukan langkah

sortasi atau penyortiran terhadap alga yang dipanen agar materi dari jenis alga

spesies lain atau bahan organik asing tidak tercampur dengan sampel alga merah

karena alga tumbuh bersama-sama dalam satu habitat dengan alga atau rumput

laut yang berbeda spesies juga, tidak hanya dalam bentukan populasi. Sampel

yang didapat benar-benar merupakan alga merah Laurencia papillosa (Forskal)

Graville dilihat dari ciri morfologisnya. Bagian akar alga dibuang dengan pisau

atau gunting karena alga umumnya berakar pada suatu karang sehingga bagian

akarnya dibuang agar materi asing dari batu karang tidak ikut dan mengganggu

hasil analisis. Secara umum tujuan sortasi untuk meminimalkan keberadaan

materi organik asing karena materi organik maupun organic dust ini dapat

menggangu hasil analisis.

Organic dust ini dapat turut mereduksi kompleks asam dalam reagen

membentuk warna kehijauan sesuai laporan penelitian Otto Folin. Namun hal ini

tidak banyak memberi pengaruh pada hasil analisis, mengingat reagen Folin-

Ciocalteau sendiri mengandung banyak stabilizer untuk mengatasi berbagai

ketidakstabilan dari reagen termasuk karena organic dust ini, kandungan bromin

dari reagen dapat menghilangkan hasil reduksi ini, sehingga tidak lagi membentuk

warna menyerupai tinta kehijauan (Wu, 1920).


33

Selain itu, pada pengamatan saat dilakukan sortasi terdapat senyawa

berupa kalsium seperti butiran kapur berwana putih yang melingkupi daerah

sekitar thallus alga, kalsium ini merupakan produk alamiah alga yakni hasil

kalsifikasi. Kalsium yang masih ada setelah dilakukan sortasi tidak akan

mengganggu analisis. Senyawa Ca ini bukanlah reduktor sehingga praktis tidak

mampu memiliki kemampuan mereduksi kompleks asam molibdat-fosfat pada

reagen Folin-Ciocalteau yang digunakan.

Setelah lolos proses sortasi maka ganggang merah diproses dalam autoklaf

selama 30 menit pada suhu 100 0C untuk mendenaturasi protein yang ada dalam

ganggang termasuk enzim polifenol oksidase atau Polyphenol Oxydase (PPO).

Efek perlakuan panas terhadap aktivitas PPO menunjukkan pemberian suhu

menyebabkan meningkatnya kecepatan reaksi antara enzim dan senyawa fenolik

sebagai substratnya. Perlakuan pada 55 0C, membuat enzim inaktif secara parsial.

PPO telah dilaporkan menjadi inaktif dengan direbus dalam air panas pada 100 0C

selama 1,5 menit (Mustapha & Ghalem, 2007).

Enzim PPO ini mengkatalisis hidroksilasi dari monofenol menjadi o-

difenol. Lebih lanjut, dapat mengkatalisis oksidasi o-difenol untuk membentuk o-

kuinon. Proses polimerisasi o-kuinon ini cepat berlangsung menghasilkan pigmen

berupa senyawa polifenol. Jika enzim PPO inaktif maka proses polimerisasi fenol

tidak lagi berlangsung, membentuk polimer polifenol yang lebih panjang. Secara

sederhana digambarkan pada gambar 6 (Sullivan et al., 2003).


34

O

O

o-kuinon

OH OH

O O

Enzim PPO Enzim PPO

OH

Gambar 6. Proses oksidasi fenol oleh enzim polifenol oksidase (PPO)

Hasil autoklaf dijadikan simplisia dengan cara dikeringkan dalam oven

selama beberapa hari pada suhu 90 0C, agar menjadi simplisia alga merah kering

dengan tingkat kekeringan tertentu sehingga mudah untuk dihancurkan dengan

tangan kemudian diserbuk dengan alat blender bermotor. Alga harus benar-benar

kering agar didapat partikel yang serbuk yang cukup halus. Kadar air atau lembab

yang semakin rendah maka sel-sel tanaman alga menjadi lebih rapuh terhadap

kekuatan mekanis mesin blender sehingga lebih mudah untuk dihaluskan menjadi

serbuk. Derajat kehalusan serbuk yang diambil 20/30 dengan cara pengayakan

agar diperoleh ukuran partikel serbuk yang lebih homogen dan partikel yang tidak

terlalu besar atau kecil.

Ekstraksi akan bertambah baik bila luas permukaan area spesifik serbuk

simplisia yang kontak dengan cairan penyari semakin luas sehingga

meningkatkan efisiensi ekstraksi serbuk simplisia alga. Sementara partikel

serbuk yang terlalu halus juga tidak menguntungkan karena dapat menyebabkan

flogging (partikel-partikel kecil menyumbat pori-pori yang ada) pada filter saat

sokhletasi sehingga proses ekstraksi serbuk alga menjadi terhambat. Selanjutnya

dilakukan penetapan kadar air serbuk alga dilakukan dengan metode Karl

Fischer karena metode ini spesifik mengukur kadar air dalam analit


35

dan sensitif untuk mengukur sampel dalam jumlah yang sedikit serta akurat.

Kadar air dari serbuk alga merah yang terukur dengan metode ini:

• Replikasi I : 8,53%

• Replikasi II : 6,00 %

• Replikasi III : 5,97 %

Hasil penetapan kadar air adalah 6,83 ± 1,469 %, masih memenuhi syarat

atau masih di bawah 10 % sehingga dapat diterima sebagai simplisia kering untuk

selanjutnya diekstraksi dengan cara sokhletasi. Hasil penetapan kadar air pada

replikasi I berbeda jauh dari kadar yang didapat pada replikasi II dan III

dimungkinkan oleh sampel yang menyerap lembab sebelum dilakukan analisis

dengan Karl Fischer. Penetapan kadar air dengan metode Karl Fischer berdasar

atas reaksi redoks antara SO2 dan I2 menghasilkan garam asam hidroiodat dan

garam alkil sulfat. Reaksi redoks ini hanya berlangsung dengan adanya air seperti

gambar 7, reaksi di bawah ini (Evans, 2002).

Gambar 7. Reaksi saat penetapan kadar air dengan Karl Fischer

Tujuan pengontrolan kandungan lembab di bawah 10 % ini untuk

menekan pertumbuhan mikroba yang mampu menguraikan kandungan organik


36

ganggang sebagaimana yang disyaratkan dalam MMI (Materia Medika Indonesia)

untuk simplisia tanaman umumnya.

B. Hasil Uji Kualitatif

1. Uji pendahuluan

Pada prosedur pengujian ini filtrat alga ditambah air, dipanaskan selama

30 menit untuk menarik semua senyawa yang cukup polar termasuk polifenol

yang larut air. Larutan disaring dengan kapas agar bagian yang tak larut air tidak

mengotori analit. Hasil berwarna kuning sampai merah menunjukkan adanya

senyawa yang mengandung kromofor (flavonoida, antrakuinon, senyawa fenolik

lainnya) dengan gugus hidrofilik (gula, asam, fenolat, dan sebagainya).

Hasil diperkuat dengan penambahan KOH, warna larutan menjadi lebih

intensif. Karena senyawa fenolik mudah sekali teroksidasi dalam basa yang

membuat warna lebih intensif seperti reaksi pada gambar 8 di bawah (Krumholz

& Bryant, 1988).

OH

OH

HOKOH

OH

OH

HO

HO

Gambar 8. Reaksi uji pendahuluan senyawa floroglusinol dan KOH

Uji pendahuluan ini dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa

fenolik dalam alga merah termasuk kandungan senyawa polifenol alga yang


37

memiliki banyak gugus-gugus fenolik dengan floroglusinol sebagai monomer.

Hasil pengamatan sampel serbuk Laurencia papillosa (Forskal) Graville

menunjukkan hasil positif mengandung senyawa fenolik, seperti tabel I berikut.

Tabel I. Hasil uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik

Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Perlakuan Warna hasil reaksi

Pemanasan 30 menit

+ KOH

kuning pucat (+)

kuning lebih gelap (+)

2. Uji polifenol

Sebanyak 1 mL filtrat alga ditambah 3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Jika

terjadi warna hijau-biru menunjukkan adanya polifenol. Hal ini disebabkan oleh

terbentuknya kompleks ion Fe3+ dan gugus-gugus fenol yang membentuk

kompleks warna hijau-biru seperti pada gambar 9 (Krumholz & Bryant, 1988).

O

Fe3+

O O

OH

6 FeCl3 + 3 HCl+

OH

OH

OH

Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks gugus fenolik dan FeCl3

Uji polifenol ini memperkuat bukti adanya kandungan polifenol alga atau

florotanin dalam Laurencia papillosa (Forskal) Graville. Hasil pengamatan


38

sampel serbuk Laurencia papillosa (Forskal) Graville menunjukkan hasil positif

mengandung senyawa polifenol, seperti tabel II berikut.

Tabel II. Hasil uji kandungan senyawa polifenol Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Warna sebelum reaksi

Warna sesudah reaksi

Kuning pucat Biru gelap di bagian tengah (+)

3. Uji tanin (zat samak)

Penambahan NaCl 2 % dimaksudkan untuk menghilangkan protein agar

tidak terjadi reaksi positif palsu sehingga jika terjadi endapan protein maka

disaring. Kemudian filtrat alga diberi gelatin jika hasil positif akan membentuk

endapan karena tanin mampu menyamak kulit.

Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin yang inkompatibel

dengan gelatin dalam HCl atau NaCl. Tanin memiliki afinitas yang kuat terhadap

gelatin sehingga gelatin mengalami presipitasi (Thomas & Frieden, 1923). Alasan

dilakukan uji tanin karena secara kimia tanin dan florotanin mirip sehingga

florotanin dapat memberikan hasil positif juga terhadap uji tanin. Hasil

pengamatan sampel serbuk Laurencia papillosa (Forskal) Graville menunjukkan

hasil positif mengandung senyawa tanin, ada sedikit endapan putih di dasar.

C. Isolasi Florotanin Kasar

Serbuk alga yang ditimbang sebesar 40,004 g untuk selanjutnya

diekstraksi dengan cara sokhletasi. Proses sokhletasi dilakukan sampai pelarut

metanol pengekstraksi jernih untuk memastikan semua senyawa yang relatif polar


39

dapat ditarik dalam ekstrak metanol. Total lama proses sokhletasi selesai

dilakukan selama 34 jam dan 5 menit ditandai dengan jernihnya metanol yang

menyari serbuk alga di tabung sokhlet. Setelah selesai, hasil sokhletasi diuapkan

pelarutnya dengan menggunakan vacuum rotary evaporator sampai volume yang

kecil (1/10 dari volume mula-mula) agar diperoleh ekstrak yang lebih pekat

konsentrasinya. Ekstrak metanol pekat ditambahkan metanol hasil kondensasi

vacuum rotary evaporator hingga diperoleh 60 mL ekstrak metanol agar diperoleh

proses fraksinasi dengan komposisi pelarut yang konstan.

Selanjutnya ekstrak metanol ditambah 120 mL kloroform, dan 45 mL air.

Terjadi pemisahan 2 lapisan antara lapisan atas dengan berat molekul (BM) lebih

ringan yakni fraksi metanol-air yang membentuk ikatan hidrogen dan lapisan

bawah adalah kloroform. Metanol-air lebih mudah menarik fraksi relatif polar

seperti florotanin sehingga yang diambil adalah lapisan atas.

Alasan pemilihan pelarut metanol karena metanol memiliki gugus

hidroksil yang memungkinkan membentuk ikatan hidrogen intramolekuar dengan

gugus hidroksil yang ada pada senyawa fenolik dan meningkatkan kelarutan

polifenol dalam pelarut metanol. Sementara pelarut non polar seperti kloroform,

digunakan untuk membuang lipid pada ekstrak metanol (Padda, 2006).

Selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat sebanyak dua kali

agar semua fraksi florotanin dapat ditarik dengan lebih sempurna mengingat

proses penarikan secara berulang jauh lebih efektif dibandingkan dengan sekali

penarikan dengan volume penyari lebih besar sekaligus. Florotanin yang dapat

ditarik dalam fraksi etil asetat dikumpulkan dan diuapkan etil asetatnya sehingga


40

diperoleh florotanin kasar yang akan menjadi analit untuk ditetapkan kadar

polifenol totalnya dengan menggunakan reagen fenolik Folin-Ciocalteau.

D. Dasar Reaksi Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau

Reagen yang digunakan adalah Folin-Ciocalteau (F-C) yang dalam kondisi

stabil sebelum reaksi berwarna kuning dalam suasana asam. Reaksi F-C ini

melibatkan reaksi antara ion fenolat dengan kompleks ion polimerik dari asam-

asam fosfomolibdat dan fosfotungstat (Anonim, 2006).

Warna biru produk berasal dari oksidasi fenolat, dan asam heteropoli

tereduksi secara parsial dari +6 menjadi campuran kondisi valensi +6 dan +5

menghasilkan produksi kompleks molibdenum-tungsten biru (Singleton & Rossi,

1965). Bagian reagen yang paling aktif dari reagen ini adalah molibdat sehingga

kompleks warna yang terbentuk disebut molybdenum blue.

Dalam bentuk tunggal, molibdat akan menjadi sukar larut dan

membentuk koloidal (Auterhoff & Knabe, 1978). Oleh karena itu, molibdat

dicampur dalam bentuk garam NaMolibdat dan diberikan asam fosfat (H3PO4)

membentuk kompleks asam fosfomolibdat. Selain kompleks dengan fosfat,

diketahui bahwa senyawa seperti arsenat, wolframat, silikat juga mampu

membentuk kompleks asam dengan molibdat. Misalnya, jika membentuk

kompleks dengan arsen maka kompleks asam yang terbentuk disebut

arsenomolibdat.

Reagen aktif F-C tersusun atas larutan asam berwarna kuning yang

mengandung kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam heteropoli


41

(Singleton & Rossi, 1965). Asam heteropoli yang ada pada reagen F-C adalah

asam tungstat dan asam molibdat.

Kenyataanya reagen ini mengandung seri atau rangkaian polimerik yang

memiliki bentukan umum dengan pusat atau sentral unit tetrahedral fosfat (PO43-)

dikelilingi oleh beberapa unit oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur

tungsten dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum (Singleton &

Rossi, 1965).

Florotanin berupa polimer dengan unit monomernya floroglusinol

memiliki 3 gugus hidroksil. Gugus hidroksil ini cukup reaktif dan merupakan

pengarah orto, para dalam proses sintesis. Ketiga gugus hidroksil floroglusinol

berada pada posisi meta, sehingga posisi orto dan para masih kosong dan akan

mudah dioksidasi sehingga posisi posisi para, orto terisi oleh gugus hidroksil

juga. Florotanin dan polifenol lainnya sangat tidak stabil dalam kondisi basa

karena akan teroksidasi membentuk ion fenolat (C6H6O-) dan berlanjut akan

membentuk senyawa kuinoid yang dapat membuat warna pigmen semakin intens

biasanya berwarna kecoklatan.

Susana basa saat reaksi diberikan oleh natrium karbonat, sehingga semua

senyawa fenolik akan teroksidasi menjadi ion fenolat. Dan ion fenolat inilah yang

akan mereduksi kompleks asam heteropoli dari fosfotungstat dan fosfomolibdat

membentuk produk berwarna biru.

Reduksi yang sempurna dari reagen ke status valensi yang lebih rendah

merusak warna asalnya. Sifat alamiah sesungguhnya dari complex blue pigments

hingga saat ini masih belum dapat dipastikan. Prinsip pembentukan pigmen biru


42

ini digunakan dalam analisis sebagai metode kolorimetri yang sudah lama

diketahui (Singleton & Rossi, 1965). Warna biru yang dihasilkan setara dengan

konsentrasi fenolat yang terbentuk artinya semakin besar konsentrasi senyawa

fenolik maka semakin banyak pula ion fenolat yang terbentuk dan reagen F-C

semakin rusak oleh reduktor dan warna biru yang dihasilkan semakin pekat setara

dengan konsentrasi ion fenolat sehingga dapat dianalisis dengan spektrofotometer.

Kompleks asam dari reagen F-C ini akan tereduksi membentuk produk

yang berwarna dengan adanya suatu reduktor. Reagen F-C sendiri dapat bertindak

sebagai agen pengoksidasi (oksidator).

Reaksi Reduksi asam fosfomolibdat:

H3PMo12O40 + 4e + 4 H+ H7[PMo12O40] (Auterhoff & Knabe, 1978)

Reaksi Oksidasi fenol:

OHO

O

+ H2O + 4 H + + 4e

(C6H5OH) (C6H4O2)

oksidator

(McMurry, 2004)

Saat analisis terjadilah kesetimbangan reaksi redoks dari reagen F-C dan

senyawa fenolik (gambar 10).

OHO

O

+ H2O

(C6H5OH) (C6H4O2)

+ H3PMo12O40 H7[PMo12O40]+

(senyawa biru) Gambar 10. Reaksi redoks dalam reaksi Folin-Ciocalteau


43

Gugus fenol teroksidasi dengan cepat dalam larutan cukup basa dan

menghasilkan ion-ion fenolat dalam konsentrasi cukup. Reagen F-C dan pigmen

biru yang terbentuk tidak stabil dalam larutan basa. Reaksi melibatkan

pengrusakkan reagen kuning yang aktif. Kebanyakan senyawa fenolik terionisasi

sekitar 50 % pada pH 9-10. Karena porsi yang terionisasi bereaksi dengan reagen

folin kesetimbangan akan bergeser dan akan lebih banyak lagi fenolat yang

dihasilkan. Dibutuhkan waktu untuk reaksi ini untuk dapat mendekati sempurna.

Reagen F-C harus tetap bertahan dalam kondisi basa, agar dapat bereaksi dengan

semua fenolat. Untuk pertimbangan ini dibutuhkan kondisi optimum untuk alasan

produksi reaksi yang cepat dan retensi waktu yang panjang untuk warna

maksimum akan mencakup pertimbangan reagen fosfo-molibdo-tungstat kadar

tinggi dan alkalinitas yang sedang (Singleton & Rossi, 1965).

Terdapat banyak variasi dalam penggunaan metode Folin-Ciocalteau ini

sendiri. Variasi yang ada mencakup perbedaan dalam pemilihan referensi standar,

lama pemanasan reaksi, suhu, dan perbedaan hasil pengukuran panjang

gelombang (Anonim, 2006). Referensi standar yang umum digunakan untuk

analisis kandungan polifenol adalah asam galat, asam tanat, keursetin yang umum

digunakan untuk sampel flavonoid dan floroglusinol.

Alasan pemilihan standar floroglusinol adalah karena secara teoritis

floroglusinol merupakan unit monomer florotanin alga. Diperkuat oleh hasil

penelitian Zhang et al. (2006), didapat hasil pembacaan panjang gelombang

maksimum produk berwarna kebiruan dari metode Folin-Ciocalteau, pada sampel

alga A. nodosum dan baku floroglusinol sama-sama berada pada panjang


44

gelombang 750 nm atau adanya kesamaan karakteristik antara florotanin dengan

baku floroglusinol saat direaksikan dengan reagen F-C.

E. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau

1. Penetapan Operating Time (OT)

Penentuan Operating Time (OT) sangat penting dalam pengukuran dengan

metode analisis menggunakan prinsip kolorimetri karena warna hasil reaksi yang

dihasilkan tidak selamanya stabil. Maka dari itu, perlu dicari rentang waktu

setelah reaksi berlangsung agar hasil yang didapat memberikan absorbansi yang

tetap stabil tidak menaik atau menurun nilainya agar data yang dihasil tetap

reprodusibel dan valid.

Jika telah diketahui rentang Operating Time (OT) maka pembacaan

absorbansi hasil reaksi pada baku dan sampel harus dilakukan pada rentang OT

yang telah diketahui. Dari hasil pembacaan OT, maka disimpulkan bahwa pada

menit ke 50 hingga menit ke 90, reaksi menunjukkan nilai absorbansi yang stabil.

Hal ini sesuai dengan yang diutarakan Singleton & Rossi (1965) pada

pembahasan sebelumnya, dibutuhkan waktu bereaksi yang relatif panjang namun

stabil sehingga untuk prosedur pembacaan absorbansi standar dan sampel

selanjutnya dilakukan pada rentang OT yaitu menit ke 50-90. Hasil pembacaan

OT standar floroglusinol sebagai berikut (gambar 11).


45

ABSORBANCE ��

0,1000,2000,3000,4000,5000,600

Gambar 11. Hasil pembacaan OT floroglusinol kadar 3,0 ppm dengan pereaksi Folin Ciocalteau

2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (�maks)

Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang suatu senyawa

mempunyai nilai absorbansi yang maksimum. Pembacaan absorbansi pada


46

panjang gelombang maksimum akan memberikan sensitivitas dan presisi analisis

yang maksimal (Mulja & Suharman, 1995).

Zhang et al. (2006) telah melakukan penelitian tentang estimasi

kandungan polifenol total pada sampel rumput laut dan ekstraknya berdasarkan

reaksi Folin-Ciocalteau. Mereka mendapatkan panjang gelombang maksimum

untuk standar floroglusinol dan sampel A. nodosum adalah 750 nm. Karena itu,

penentuan �maks dilakukan pembacaan absorbansinya pada rentang 400-900 nm

agar dapat melihat puncak spektrum yang lebih jelas di sekitar 750 nm sebagai

panjang gelombang teoritis.

Digunakan 3 macam kadar baku floroglusinol untuk mengetahui panjang

gelombang maksimum yakni dengan membaca spektrum plot panjang gelombang

dan absorbansi senyawa hasil reaksi antara reagen Folin-Ciocalteau dengan baku

floroglusinol kadar kecil 0,1 ppm, kadar tengah 0,3 ppm, kadar terbesar 0,6 ppm.

Hasil yang didapat menunjukkan 3 puncak absorbansi maksimum pada panjang

gelombang yang berbeda, yakni pada 0,1 ppm didapat �maks 758,7 nm; 0,3 ppm

didapat �maks 750,1 nm; dan 0,6 ppm didapat �maks 743,4 nm.

Ada kecendrungan semakin besar konsentrasi baku floroglusinol maka

panjang gelombang cendrung bergeser ke panjang gelombang yang lebih kecil.

Artinya pada konsentrasi semakin kecil maka panjang gelombang semakin

bergeser ke arah yang lebih besar. Ini dimungkinkan oleh ionisasi fenolik menjadi

ion fenolat sehingga mampu mengabsorpsi cahaya pada tingkat energi lebih kecil

atau panjang gelombang lebih besar.


47

Pada konsentrasi kecil, dengan suasana basa tetap dari Na2CO3 1,9 M

maka lebih mudah mengoksidasi floroglusinol menghasilkan ion fenolat yang

memiliki muatan negatif penuh pada oksigen (ion fenolat), yang dapat berinteraksi

dengan cincin lebih efektif dari pasangan elektron bebas yang ada pada molekul

tak terionkan sehingga meningkatkan intensitas absorpsi cahaya dan posisi �maks

berpindah ke panjang gelombang lebih panjang (Cairns, 2005).

λ (wavelength)

a b s o r b a n c e u n i t ( a u )

��

��

��

��

��

��

��

��

Gambar 12. Hasil pembacaan �maks floroglusinol 3 macam kadar floroglusinol: 1,0; 3,0 dan 6,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteau

Dengan didapat 3 panjang gelombang maka seri baku telah dicobakan

untuk dibaca pada ketiga panjang gelombang ini dan hasilnya absorbansi yang

terbaca tidak berbeda jauh. Namun dipilih panjang gelombang tengah 750,1 nm


48

karena paling mendekati �maks teoritis 750 nm, hasil reaksi floroglusinol dengan

reagen Folin-Ciocalteau (Zhang et al., 2006). Sesungguhnya tidak ada panjang

gelombang maksimal teoritis yang pasti untuk mengukur sampel florotanin karena

bukan merupakan senyawa tunggal tetapi merupakan campuran heterogen polimer

polifenol dengan unit monomer berupa floroglusinol.

F. Hasil Validasi Metode Analisis

Untuk mengetahui validitas metode Folin-Ciocalteau, maka dilakukan

penetapan terhadap baku floroglusinol dengan replikasi sebanyak 3 kali pada

panjang gelombang yang dipilih 750,1 nm dan didapat 3 persamaan kurva baku

yang berbeda sebagai berikut:

Tabel III. Data replikasi seri baku floroglusinol

Replikasi I Replikasi II Replikasi III Kadar

floroglusinol (mg/100mL)

Absorbansi Kadar


Absorbansi Kadar


Absorbansi

0,0512 0,075 0,0553 0,070 0,0504 0,074 0,1024 0,138 0,1046 0,132 0,1008 0,134 0,2048 0,269 0,2091 0,257 0,2016 0,255 0,3071 0,405 0,3137 0,407 0,3025 0,410 0,4095 0,516 0,4182 0,514 0,4033 0,506 0,5119 0,648 0,5228 0,643 0,5041 0,636 0,6143 0,796 0,6274 0,712 0,6049 0,724

Keterangan: Replikasi I : A = 0,0091; B = 1,265; r = 0,9996 Replikasi II : A = 0,0169; B = 1,182; r = 0,9968 Replikasi III : A = 0,0202; B = 1,198; r = 0,9980

Berdasarkan hasil perhitungan tabel di atas dapat dilihat bahwa nilai

koefisien korelasi (r) untuk replikasi I (0,9996), replikasi II (0,9980) dan replikasi

III (0,9966) lebih besar daripada r tabel dengan taraf kepercayaan 95 % dan df


49

(degrees of freedom) 5, yaitu 0,811 dan memenuhi persyaratan yaitu r hitung =

0,9996 (lebih besar dari 0,999). Hal ini berarti semua persamaan kurva baku

tersebut mempunyai parameter linearitas yang baik dan dapat digunakan untuk

menetapkan kadar florotanin dalam fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal)

Graville.

Parameter yang digunakan untuk menentukan validitas metode dalam

penelitian ini adalah recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak baku

floroglusinol. Recovery dan kesalahan sistematik adalah parameter akurasi

sedangkan kesalahan acak adalah parameter presisi. Berikut hasil mean recovery

atau rata-rata recovery, rata-rata kesalahan sistematik, dan kesalahan acak atau

CV yang didapat:

Tabel IV. Hasil validasi metode Folin-Ciocalteau

Kadar teoritis floroglusinol

(ppm)

Rata-rata recovery (%) n = 3

Rata-rata kesalahan

sistematik (%) n = 3

Kesalahan acak (CV) (%)

0,5 90,67 10,60 11,69 1,0 95,90 3,22 3,35 2,0 98,72 1,63 1,65 3,0 105,51 3,07 2,91 4,0 100,26 2,22 2,21 5,0 101,29 2,29 2,26 6,0 97,97 3,03 3,09

Hasil perhitungan recovery dari tabel IV menunjukkan bahwa rata-rata

recovery untuk semua seri kadar berada di dalam rentang recovery yang baik

untuk bahan baku sebagai analit dengan kadar sekitar 1 ppm saat dianalisis, yaitu


50

80 – 110% (Harmita, 2004). Berdasarkan hasil ini berarti semua seri kadar

memenuhi kriteria recovery yang baik.

Kesalahan sistematik merupakan parameter lain untuk akurasi selain

recovery. Nilai kesalahan sistematik yang baik dapat ditentukan dari rentang

recovery dengan rumus: |P – 100%|, dengan P adalah nilai recovery. Rentang

recovery yang baik adalah 80 – 110% dan berdasarkan rumus di atas didapatkan

nilai kesalahan sistematik yang baik adalah � 20%. Perhitungannya adalah sebagai

berikut : |80 % - 100 %| = 20 % dan |110 % - 100%| = 10 %.

Hasil perhitungan kesalahan sistematik pada tabel IV menunjukkan nilai

rata-rata kesalahan sistematik untuk semua seri kadar < 20 % atau memenuhi

kriteria kesalahan sistematik yang baik.

Hasil perhitungan kesalahan acak pada tabel IV menunjukkan bahwa seri

kadar 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm memiliki nilai CV < 4,1 % yang

disyaratkan untuk analisis yang baik dengan rentang recovery 85-115 % menurut

sistem RSD (Relative Standard Deviation) (Harmita, 2004). Hanya kadar 0,5 ppm

yang tidak memenuhi syarat karena CV-nya cukup besar yakni 11,69 %.

Sementara menurut Mulja dan Hanwar (2003) presisi yang baik dinyatakan

dengan nilai CV < 2 %, sehingga hanya 1 seri kadar yang memenuhi kriteria

presisi yang baik, yaitu seri kadar 0,2 ppm yang memenuhi syarat ini.

Hasil validitas dari recovery, kesalahan sistematik, kesalahan acak yang

paling tidak memenuhi syarat pada pembacaan kadar 0,5 ppm. Hal ini

dimungkinkan oleh sulitnya membuat konsentrasi baku terendah dalam seri baku


51

ini karena harus memipet volume yang cukup kecil 0,5 mL dari larutan stok baku

sehingga risiko faktor kesalahannya paling besar.

Persamaan kurva baku yang dipilih berdasar hasil recovery, kesalahan

sistematik, kesalahan acak terbaik untuk penetapan kadar sampel adalah

persamaan kurva baku replikasi I, yang paling baik dibandingkan replikasi II dan

III. Persamaan ini dipilih karena nilai r-nya paling mendekati 1 dan intersep yang

paling kecil. Nilai r yang mendekati 1 berarti ada korelasi antara peningkatan

konsentrasi hasil reaksi floroglusinol dengan Folin-Ciocalteau dan kenaikan nilai

respon absorbansi.

Hubungan antara kadar floroglusinol dan nilai absorbansi dari persamaan

baku yang dipilih (replikasi I) disajikan pada gambar 13 di bawah ini:

y = 1,265x + 0,0091r = 0,9996

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

Kadar floroglusinol (mg/100mL)

abso

rban

si

Gambar 13. Kurva baku hubungan kadar dan absorbansi floroglusinol setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteau


52

G. Penetapan Kadar Florotanin Fraksi Etil Asetat Laurencia papillosa

(Forskal) Graville

Florotanin dalam crude phlorotannin dari fraksi etil asetat dilarutkan

dalam aseton 75 % secara bertahap, karena selain dapat diekstraksi dengan

alkohol, senyawa polifenol juga efektif ditarik dengan campuran aseton dan air

yang juga relatif polar (Padda, 2006). Selain itu, kepentingan mengganti pelarut

metanol dengan aseton saat penetapan kadar dengan Folin-Ciocalteau adalah agar

tidak ada intervensi absorbansi warna dari pelarut karena alkohol masih memiliki

gugus hidroksil (OH) yang cukup sensitif untuk mereduksi kompleks asam dalam

reagen sehingga blangko juga nantinya akan dapat berwarna kebiruan, hal ini

meningkatkan risiko kesalahan terhadap pembacaan nilai absorbansi analit yang

didapat.

Dengan menggunakan persamaan baku Y = 1,265 X + 0,0091 maka

diperoleh data hasil pengukuran kadar florotanin fraksi etil asetat Laurencia

papillosa (Forskal) Graville menggunakan metode Folin-Ciocalteau, dengan

replikasi 3 kali dan masing-masing replikasi dianalisis dengan duplo untuk

mengurangi nilai kesalahan sistematik seperti yang disajikan pada tabel V:

Tabel V. Hasil penetapan kadar sampel florotanin kasar Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Replikasi (duplo) Kadar (mg PGE/g) Χ (mg PGE/g)

1a 10,60 1b 10,45

10,53

2a 11,10 2b 11,25

11,18

3a 10,90 3b 10,95

10,93


53

Kadar florotanin dalam fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal)

Graville yang terukur dengan metode Folin-Ciocalteau ini adalah 10,55-11,21 mg

PGE/g. Kadar florotanin yang didapat ini diestimasikan sebagai kadar polifenol

total yang ekivalen dengan standar floroglusinol karena metode Folin-Ciocalteau

ini tidak spesifik mengukur jenis polimer polifenol tertentu namun sangat sensitif

terhadap seluruh senyawa yang memiliki gugus fenolik termasuk florotanin yang

berupa campuran heterogen polifenol dengan tingkat polimer berlainan.

Metode ini memiliki keunggulan dalam hal sensitivitasnya mengukur

senyawa-senyawa yang memiliki gugus fenolik hingga tingkat part per million

(ppm), memiliki reprodusibilitas dan linearitas yang baik, sederhana, hanya

membutuhkan reagen Folin Ciocalteau dan kondisi basa, serta menghasilkan

reaksi warna yang relatif cepat dan stabil dalam rentang waktu relatif panjang.


54

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Florotanin dapat diisolasi dari alga merah Laurencia papillosa (Forskal)

Graville untuk diukur dengan metode Folin Ciocalteau.

2. Kadar florotanin dalam fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal)

Graville yang terukur dengan metode Folin-Ciocalteau adalah 10,55-11,21 mg

PGE/g.

B. Saran

1. Perlu dilakukan analisis terhadap struktur kimia florotanin apa saja yang

terkandung dalam fraksi etil asetat dengan spektrofotometer IR dan GC-MS.

2. Perlu dilakukan langkah optimasi kondisi prosedur metode Folin-Ciocalteau

dalam skripsi ini seperti pH dan suhu saat reaksi agar diperoleh hasil scan

panjang gelombang maksimum yang sama untuk tiap konsentrasi baku.

3. Perlu dibandingkan validitas metode penetapan kadar dengan metode Folin-

Ciocalteau ini dengan metode analisis senyawa fenolik lainnya seperti dengan

AlCl3, FAS (Ferri Amonium Sitrat).


55

DAFTAR PUSTAKA

Ahn, M. J., Yoon, K. D., Min, S.Y., Lee, J. K., Kim, J.H., Kim, T. G., Kim, S.H., Kim, N.G., Huh, H., and Kim, J., 2004, Inhibition of HIV-1 reverse transcriptase and protease by Phlorotannins from the brown alga Ecklonia cava, Biol. Pharm. Bull., 27(4), 544-547.

Amin, Al, Razali, 1997, Kajian Kepelbagaian dan Taburan Rumpai Laut di

Sekitar Desaru, Johor, Fakulti Sains Hayatuniversiti Kebangsaan Malaysia Bangi, pkukmweb.ukm.my/~ahmad/botani/amin.html, diakses tanggal 1 November 2007.

Anonim , 1978, Marine Natural Products : Chemical and Biological Perspectives

Vol. I, diedit oleh Paul J. Scheuer, 118-119, Academic press, New York. Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, 4, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 11-25, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 1989, The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals Drugs and

Biological, 1169, 11th Ed., Merck Inc., New York. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 1157, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 2001, Product Development, Dry Creek Nutrition, www.activin.com/

DCNI Template.htm, diakses tanggal 27 Agustus 2007. Anonim, 2005, United State Pharmacopeia 28, 2749-2751, United State

Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville. Anonim, 2006, Dietary Supplements Methods Executive Summary July 2006,

AOAC International, www.aoac.org/dietsupp6/Dietary-Supplement-web-site/Jul2006.htm, diakses tanggal 13 November 2007.

Athukorala, Y., Kim, K.N., and Jeon,Y.J., 2006, Antiproliferative and

Antioxidant Properties of An Enzymatic Hydrolysate from Brown Alga Ecklonia cava, J.Fd.Chem.Toxicol., 44(7), 1065-1074.

Auterhoff, H. and Knabe, J., 1978, Lehrbuch der Pharmazeutischen Chemie, 103,

Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Mbh., Stuttgart. Blunt, J.W., Copp, B.R., Munro, M.H.G., Northcotec, P.T. and Prinsep, M.R.,

2006, Marine natural products, Nat. Prod. Rep., 22, 15. Burtin, P., 2003, Nutrional Value of Algas , Electron. J. Environ. Agric. Food

Chem., France, 2 (4) , 498-500.


56

Box, J.D., 1983, Investigation of the Folin-Ciocalteu Phenol Reagent for the Determination of Polyphenolic Substances in Natural Waters, Water Res., 17, 511–525.

Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, Sixth Edition, 65, 66, 483, 484, John

Wiley & Sons, Inc., United States of America. Cairns, D., 2005, Essentials of Pharmaceutical Chemistry, Second Edition, 151-

159, Pharmaceutical Press, London. Dahuri, R., 2003, The role of Marine Biotechnology in the Development of

Marine Biomedical Product, Proceedings of International Symposium on Biomedicine, 18-19 September, 2003, 1-5, IPB, Bogor.

Day, R. A. dan Underwood, A. L., 1986, Analisis Kuantitatif, Edisi V, 389-392,

diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Evans, W.C., 2002, Trease and Evans: Pharmacognosy, 15th Ed., 98, W.B.

Saunders, London. Glombitza, K. W. and Keusgen , M., 1995, Fuhalols and deshydroxyfuhalols from

the brown alga Sargassum spinuligerum, Phytochemistry, 38, 987-990. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian, I (3), 117 – 135. Jansoon, N., 2005, The Determination of Total Phenolic Compounds in Green Tea,

209.85.165.104/search?q=cache:Nj311vjKCdcJ:chemw.sc.mahidol.ac.th/scess/scch108/2005_06_SCCH108Lab02.pdf+Folin-Ciocalteau+ method +colori metric&hl=en&ct=clnk&cd=9&gl=id, diakses tanggal 24 Oktober 2007

Kadi, A., 2007, Beberapa Catatan Kehadiran Marga Sargassum di Perairan

Indonesia, www.oseanografi.lipi.go.id/volxxxno.42.pdf, diakses tanggal 20 Februari 2007

Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Koh,Y.S., Yoo, B.S., Kim, J.H., Ham, Y.M.,

Baik, J.S., Lee, N.H., and Hyun, J.W., 2005a, Triphlorethol-A from Ecklonia cava protects V-79-4 lung fibroblast against hydrogen peroxide induced cell damaged, Free Radic. Res., 39 (8), 883-892.

Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Zhang, R., Jung, M.S., Ham, Y.M., Baik, J.S.,

and Hyun, J.W., 2005b, Cytoprotective effect of phloroglucinol on oxidative stress induced cell damaged via catalase activation, J.Cell Biochem., 97(3), 609-620.


57

Kim, M.M., Ta, Q.V., Mendis, E., Rajapakse, N., Jung, W.K., Byun, H.G., Jeon, Y.J. and Kim, S.K., 2006, Phlorotannins in Ecklonia cava extract inhibit matrix metalloproteinase activity, Life Sci., 79(15), 1436-1443.

Khopkar, S.M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, alih bahasa oleh

Saptoraharjo, A., 193, 204, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Krumholz, L.R. And Bryant, M.P., 1988, Characterization of the Pyrogallol-

Phloroglucinol Isomerase of Eubacterium oxidoreducens, J. Bacteriol., Illinois, 170(6), 2478.

McMurry, J., 2004, Organic Chemistry, 6th Ed., 618, Thomson Brooks/Cole, U.S. Mulja, M. dan Hanwar, D.,2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium Yang

Baik, Majalah Farmasi Airlangga, III, 71 – 72. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 26-28, Airlangga

University Press, Surabaya. Mustapha, K. and Ghalem, S., 2007, Effect of Heat Treatment on Polyphenol

Oxidase and Peroxidase Activities in Algerian Stored Dates, AJB, 6(6), 790-794.

Nagayama, K., Iwamura, Y., Shibata, I., Hirayama, I., and Nakamura, T., 2002,

Bactericidal Activity of Phlorotannins from The Brown Alga Ecklonia kurome, JAC, 50, 889-893.

Nakamura, T., Nagayama, K., Uchida, K., and Tanaka, R., 1996 , Antioxidant

activity of phlorotannin isolated from the brown alga Eisenia bicyclis , Fisheries Sci., 62(6), 923-926.

Padda, M.S., 2006, Phenolic Composition And Antioxidant Activity of

Sweetpotatoes [Ipomoea batatas (L.) Lam], Dissertation, Punjab Agricultural University, 15.

Shin, H.C., Hwang, H.J., Kang, K.J., and Lee, B.H., 2006, An oxidative and

antiinflammatory agent for potential treatment of osteoarthritis from Ecklonia cava, Arch. Pharm. Res., 29(2), 165-171.

Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolics with

Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147.

Sulistiyowati, H., 1992, Komposisi dan Distribusi Alga di Pantai Pasir Putih,

Kabupaten Situbondo (Laporan Penelitian), FKIP-UNEJ, Jember.


58

Sullivan, M., Thoma, S., Samac, D. and Hatfield, R., 2003, Cloning of Red Clover and Alfafa Polyphenol Oxydase Genes and Expression of Active Enzymes in Transgenic Alfafa, Molecular Breeding of Forage and Turf, 190.

Susanto, A., 2006, Apa yang Terdapat dalam Rumput Laut?, Fak. Perikanan dan

Ilmu Kelautan UNDIP, 129.70.123.66/~jlitheng/rumput/kandungan.html, diakses tanggal 1 November 2007.

Svobodova, A., Psotova, J., and Walterova, D., 2003, Natural phenolics in

prevention of UV-Induced Skin Damage (A Review), Biomed. Papers, 147(2), 137-145.

Silverstein, B. and Murrill, 1986, Spectrometric Identification of Organic

Compounds, Ed. V, diterjemahkan oleh A.J.Hartono, Amy Victro Purba, 306-308, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental

Analysis, 5th Ed., 11-14, 140, H. Brace College, Philadelphia.

Thomas, D.,2002, Algas, Life Series, Natural History Museum, London. Thomas, A.W. and Frieden, A., 1923, The Gelatin-Tannin Reaction, 839,

Industrial & Engineering Chemistry, Columbia University, NY.

Vogel, A.I., 1978, A Text Book of Quantitative Inorganic Analysis, Fourth edition, 728, The English Language Book Society, Richard Clay Ltd., Bungay.

Waterman, P.G. and Mole, S., 1994, Analysis of Phenolic Plant Metabolites:

Extraction and Chemical Quantification, Blackwell Scientific Pub., 66-69.

Woelkerling, W. J., 1990, "An Introduction", in K. M. Cole & R. G. Sheath: Biology of The Red Algae, 1–6, Cambridge University Press, Cambridge.

Wu, H., 1920, Contribution to The Chemistry of Phosphomolybdic Acids,

Phosphotungstic Acids, and Allied Substances, JBC, Boston, 189-220. Yuan, Y.V., and Walsh, N.A., 2006, Antioxidant and Antiproliferative Activities

of Extract from a Variety of Edible Algas, J.Fd.Chem.Toxicol., 44, 1144-1150.

Zhang, Q., Zhang, J., Shen, J., Silva, A., Dennis, D.A., and Barrow, C.J., 2006, A

Simple 96-well Microplate Method for Estimation of Total Polyphenol Content in Algas, J. App. Phycol., 18, 445-450.


59

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan hasil identifikasi spesies alga merah


60


61

Lampiran 2. Data perhitungan kadar air dengan Karl Fischer

Blangko:

Berat air + spuit = 8,6898 g

Berat spuit + sisa air = 8,6694 g

Berat air yang dimasukkan = 0,0204 g

Kadar air blangko = 0,0349 %

Berat air blangko = x 0,0349 = 3,49 mg100

1

Replikasi I:

Berat sampel = 2000,1 mg

Berat air sampel = x 0,2056 = 20,56 mg100

1

Kadar air sampel =(20,56-3,49)

x 10 x 100 % = 8,5346 %2000,1

Replikasi II:



1

Kadar air sampel = (15,5-3,49)

x 10 x 100 % = 6,0002 %2001,6


62

Replikasi III:



1

Kadar air sampel = (15,43-3,49)

x 10 x 100 % = 5,9685 %2000,5

Lampiran 3. Data penimbangan replikasi seri baku floroglusinol

Replikasi I:

Berat kertas + zat = 0,45148 g Berat kertas + sisa = 0,40029 g ( - ) Berat zat = 0,05119 g � ad 50,0 mL aseton 75 % Replikasi II:

Berat kertas + zat = 0,44613 g Berat kertas + sisa = 0,39553 g ( - ) Berat zat = 0,05060 g � ad 50,0 mL aseton 75 %

Replikasi III:

Berat kertas + zat = 0,49880 g Berat kertas + sisa = 0,39798 g ( - ) Berat zat = 0,10082 g � ad 100,0 mL aseton 75 %


63

Lampiran 4. Contoh perhitungan seri kadar baku floroglusinol

Replikasi I:

Konsentrasi stok baku floroglusinol = 51,19mg/50mL = 1,0238 mg/mL

C1 = 0,5 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,0512 mg/100mL

C2 = 1,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,1024 mg/100mL

C3 = 2,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,2048 mg/100mL

C4 = 3,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,3071 mg/100mL

C5 = 4,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,4095 mg/100mL

C6 = 5,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,5119 mg/100mL

C7 = 6,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,6143 mg/100mL


direaksikan dengan Folin-Ciocalteau


64






65

Lampiran 8. Hasil pembacaan absorbansi seri baku floroglusinol pada ketiga

�maks

C flroglusinol (ppm)

Absorbansi pada λ maks

758,7 nm 750,1 nm 743,4 nm 0,477 0,049 0,070 0,050 0,953 0,131 0,126 0,123 1,905 0,286 0,306 0,281 2,859 0,418 0,423 0,420 3,812 0,544 0,549 0,543 4,765 0,656 0,653 0,659 5,718 0,727 0,732 0,732

A 0,01598 0,02917 0,01084 B 0,131738 0,129576 0,133349 r 0,99425 0,99387 0,99477

Lampiran 9. Data recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak dengan

metode Folin-Ciocalteau

Replikasi I Kadar

floroglusinol sebenarnya (ppm)

Absorbansi Kadar hitung floroglusinol

(ppm)

Recovery (%)

Kesalahan sistematik (%)

0,512 0,075 0,521 101,848 1,848 1,024 0,138 1,020 99,607 0,393 2,048 0,269 2,056 100,419 0,419 3,071 0,405 3,132 101,977 1,977 4,095 0,516 4,010 97,926 2,074 5,119 0,648 5,055 98,742 1,258 6,143 0,796 6,225 101,346 1,346

Replikasi II Kadar

floroglusinol sebenarnya (ppm)

Absorbansi Kadar hitung floroglusinol

(ppm)

Recovery (%)


0,553 0,070 0,446 80,756 19,244 1,046 0,132 0,982 93,896 6,104 2,091 0,257 2,061 98,562 1,438 3,137 0,407 3,325 106,999 6,999 4,182 0,514 4,280 102,340 2,340 5,228 0,643 5,394 103,179 3,179 6,274 0,712 5,990 95,479 4,521


66

Replikasi III

Kadar floroglusinol

sebenarnya (ppm) Absorbansi

Kadar hitung floroglusinol

(ppm)

Recovery (%)


0,504 0,074 0,045 89,417 10,583 1,008 0,134 0,095 94,191 5,809 2,016 0,255 0,196 97,170 2,830 3,025 0,410 0,325 107,544 7,544 4,033 0,506 0,405 100,523 0,523 5,041 0,636 0,514 101,938 1,938 6,049 0,724 0,587 97,088 2,912


replikasi I

Correlations

1,000 1,0001,000 1,000

, ,000,000 ,

7 77 7

ABSORBANKADARABSORBANKADARABSORBANKADAR

Pearson Correlation

Sig. (1-tailed)

N

ABSORBAN KADAR

Model Summary

1,000a ,999 ,999 ,008389Model1

R R SquareAdjustedR Square

Std. Error ofthe Estimate

Predictors: (Constant), KADARa.

Coefficientsa

9,083E-03 ,006 1,506 ,192,126 ,002 1,000 77,491 ,000

(Constant)KADAR

Model1

B Std. Error

UnstandardizedCoefficients

Beta

StandardizedCoefficients

t Sig.

Dependent Variable: ABSORBANa.


67


replikasi II

Correlations

1,000 ,997,997 1,000

, ,000,000 ,

7 77 7


Pearson Correlation

Sig. (1-tailed)

N

ABSORBAN KADAR

Model Summary

,997a ,993 ,992 ,022573Model1




Coefficientsa

1,698E-02 ,016 1,043 ,345,117 ,004 ,997 27,054 ,000

(Constant)KADAR

Model1

B Std. Error


Beta


t Sig.



replikasi III

Correlations

1,000 ,998,998 1,000

, ,000,000 ,

7 77 7


Pearson Correlation

Sig. (1-tailed)

N

ABSORBAN KADAR


68

Model Summary

,998a ,996 ,995 ,017156Model1




Coefficientsa

2,021E-02 ,012 1,639 ,162,120 ,003 ,998 35,363 ,000

(Constant)KADAR

Model1

B Std. Error


Beta


t Sig.


Lampiran 13. Parameter mean recovery menurut Harmita (2004)


69

Lampiran 14. Parameter CV menurut Harmita (2004)

Rentang yang RSD (simpangan dapat diterima baku relatif) (% klaim) (%)

98,5-101,5 0,41 97-103 0,82 95-105 1,4 90-110 2,8 90-125 4,8 85-115 4,1 75-125 6,9 50-150 13,7

(Berdasar taraf kepercayaan 99 %)

Lampiran 15. Data penimbangan sampel fraksi etil asetat Laurencia papillosa

(Forskal) Graville

Replikasi I:

Berat kaca arloji + zat = 15,28600 g Berat kaca arloji + sisa = 15,23494 g ( - ) Berat zat = 0,05106 g � ad 50,0 mL aseton 75 %

Replikasi II:


Replikasi III:



70

Lampiran 16. Data absorbansi sampel fraksi etil asetat Laurencia papillosa

(Forskal) Graville

Scan pada � = 750,1 nm Keterangan Absorbansi

Rep1.1 0,283

Rep1.2 0,279

Rep2.1 0,268

Rep2.2 0,271

Rep3.1 0,272

Rep3.2 0,274

Lampiran 17. Contoh perhitungan kadar sampel

Persamaan kurva baku: y = 1,2645 x + 0,0091

Replikasi I: Duplo 1 � y = 0,283 � x = 0,2167 mg/100mL

C1= x 50 mL = 10,60 mg/g2,167 . 10-3 mg/mL

0,05106 gx

50

1

Duplo 2 � y = 0,279 � x = 0,2135 mg/100mL

C2= x 50 mL = 10,45 mg/g2,135 . 10-3 mg/mL

0,05106 gx

50

1


71

Lampiran 18. Foto hasil uji kualitatif kandungan florotanin serbuk alga merah

Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Uji polifenol Uji Tanin

Baku Floroglusinol

Alga Merah

Baku Floroglusinol

Alga Merah

Uji pendahuluan alga merah

sebelum sesudah + KOH +KOH


72

Lampiran 19. Foto florotanin kasar dari fraksi etil asetat alga merah Laurencia

papillosa (Forskal) Graville

Lampiran 20. Foto instrumen spektrofotometer UV - VIS Perkin Elmer

Lambda- 20


73

BIOGRAFI PENULIS

Hendry Kurniawan , penulis skripsi yang berjudul

Penetapan Kadar Florotanin dalam Fraksi Etil

Asetat Alga Merah (Laurencia papillosa (Forskal)

Graville) dengan Metode Kolorimetri Folin

Ciocalteau, lahir di kota Samarinda, Kalimantan

Timur pada tanggal 14 September 1986 dari pasangan

Bapak Handojo Poerwanto dan Ibu Kong Phei Tjin.

Penulis menyelesaikan pendidikan Taman Kanak-

Kanak di TK Kristen Kalam Kudus, Pekanbaru pada

tahun 1991 hingga 1992 dan menyelesaikan pendidikan dasar di SD Kristen

Kalam Kudus, Pekanbaru, tahun 1992 hingga tahun 1998. Pendidikan SLTP

ditempuh pada tahun 1998 hingga 2001, di SLTP Santa Maria, Pekanbaru,

dilanjutkan dengan menempuh pendidikan di SMU Negeri 1, Pekanbaru, pada

tahun 2001 hingga 2002 dan diselesaikan di SMU BOPKRI 1, Yogyakarta tahun

2002 hingga 2004. Penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Univesitas

Sanata Dharma, Yogyakarta pada 2004 hingga 2008. Selama kuliah, penulis

pernah mengirimkan tulisian ilmiah bejudul “Uji Daya Analgetik Conotoxin pada

Lendir Siput Laut Cypraea tigris Linn.” pada PKM penulisan ilmiah yang

diselenggarakan Dirjen Pendidikan Tinggi Depdiknas (2007) dan pernah menjadi

asisten dosen pada mata kuliah praktikum Kromatografi (2007), praktikum F.T.S.

Steril (2008) dan praktikum F.T.S. Solid A/B (2008).


PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIv Roma 11:33 O, Alangkah dalamnya kekayaan, hikmat dan...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIv Roma 11:33 O, Alangkah dalamnya kekayaan, hikmat dan...