PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI · mengandung enzim-enzim yang berperan sebagai...

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE DPPH

DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL

ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP (Erythrina

subumbrans (Hassk.) Merr.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Aldo Kristian

NIM : 098114038

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2013

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Skripsi ini kupersembahkan untuk :

Tuhanku Yesus Kristus atas segala berkat dan penyertaan-Nya

Bapak, Ibu dan Kakak-kakakku atas kasih sayang

dan segala hal yang diberikan

Sahabat-sahabatku dan almamaterku


v


vi


vii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis kepada Tuhan atas segala rahmat, berkat, anugrah

dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN

METODE DPPH DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL

FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP

(Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.)” ini dengan baik. Skripsi ini disusun

untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm) pada Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Penulis ingin berterima kasih kepada segala pihak yang telah memberikan

bantuan baik dukungan, bimbingan, sarana, materil maupun moril dalam

penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis

mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada:

1. Ipang Djunarko,M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

2. Prof.Dr.C.J. Soegihardjo,Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan perhatian, bimbingan dan arahan dari awal pengusulan skripsi

sampai penulisan skripsi ini selesai.

3. Lucia Wiwid Wijayanti,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya

untuk menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini.

4. Yohanes Dwiatmaka,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya untuk

menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini.


viii

5. Rini Dwiastuti S.Far.,Apt, M.Sc., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang

telah membimbing dan memberi nasihat kepada penulis.

6. Sahabat seperjuangan skripsi DPPH, Anthony Felix, Mikhael Gustandy,

Willigis Danu Patria yang selalu membantu dan bekerjasama dengan luar biasa.

7. Teman-teman FSM dan FST A 2009, atas kerjasama, dukungan dan bantuan

yang diberikan.

8. Segenap laboran Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.

9. Pemerintah Kabupaten Bengkayang, Kal-Bar, atas bantuan dana yang

diberikan.

10. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat

disebut satu per satu.

Penulis menyadari bahwa masih terdapat ketidaksempurnaan dalam

penulisan skripsi ini. Dengan segala kerendahan hati penulis akan menerima

segala kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga

skripsi ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan banyak pihak.

Yogyakarta, 10 Maret 2013

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL……………………………………………………. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………... ii

HALAMAN PENGESAHAN………………………………………….. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN………………………………………… iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..………………………………. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA…. vi

KATA PENGANTAR.…………………………………………………. vii

DAFTAR ISI…………………………………………………………….. ix

DAFTAR TABEL……………………………………………………….. xiii

DAFTAR GAMBAR…………………………………………………….. xv

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………... xvi

INTISARI………………………………………………………………... xvii

ABSTRACT……………………………………………………………... xviii

BAB I PENGANTAR……………………………………………………. 1

A. Latar Belakang…………………………………………………... 1

B. Permasalahan…………………………………………………….. 3

C. Keaslian Penelitian……………………………………………..… 3

D. Manfaat penelitian……………………………………………....... 4

E. Tujuan Penelitian…………………………………………………... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………..... 6

A. Dadap Serep……………….......................................................... 6

1. Keterangan botani………………………………………………… 6


x

2. Nama tumbuhan…………………………………………………. 6

3. Klasifikasi dadap serep…..……………………………………… 6

4. Gambaran umum………………………………………………… 7

5. Kandungan kimia dadap serep…………………………………… 7

B. Senyawa Fenolik……………………………………………………. 8

C. Radikal Bebas…………………………………………………… 9

D. Antioksidan……………………………………………………… 11

E. Penyarian………………………………………………………… 13

F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu…………………………….... 14

G. Validasi Metode……………………………………………...…… 16

H. Landasan Teori……………………………………………………. 18

I. Hipotesis………………………………………………………….. 19

BAB III METODOLOGI PENELITIAN………………………………… 20

A. Jenis dan Rancangan Penelitian………………………………….. 20

B. Variabel…………………………………………………………… 20

C. Definisi Operasional…………………..……………………….… 20

D. Bahan dan Alat Penelitian………………………………………… 21

1. Bahan penelitian……………………………………………….. 21

2. Alat penelitian…………………………………………….…… 21

E. Tatacara Penelitian………………………………………………… 22

1. Determinasi tumbuhan………………………………………… 22

2. Pengumpulan bahan……………………………………….…… 22

3. Preparasi sampel…………………………………………….… 22


xi

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji…………………….… 23

5. Uji pendahuluan……………………………………………..… 24

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan………………..…… 25

7. Uji aktivitas antioksidan………………………………….…… 26

8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total…………. 27

9. Penetapan kandungan fenolik total……………………………. 27

F. Analisis Hasil……………………………………………………… 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………….… 31

A. Determinasi……………………………………………………….. 31

B. Hasil Pengumpulan Bahan………………………………………… 31

C. Hasil Preparasi Sampel……………………………………….…… 34

1. Ekstraksi sampel……………………………………………..… 34

2. Fraksinasi ekstrak…………………………………………….… 35

D. Hasil Uji Pendahuluan……………………………………………....... 37

1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan……………………….… 37

2. Uji pendahuluan senyawa fenolik……………………………… 39

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan……………………. 40

1. Penentuan panjang gelombang maksimun (λ maks)…………… 40

2. Penentuan Operating Time (OT)………………………………... 41

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan………………………. 43

1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan ………………………… 45

2. Linearitas metode uji antioksidan……………………………….. 46

3. Spesifisitas metode uji antioksidan………………………………… 47


xii

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH……………… 48

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total……….. 55

1. Penentuan operating time (OT)……………………………………….. 55

2. Penentuan panjang gelombang maksimum…………………………… 56

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total………… 57

1. Presisi metode penetapan kadar kandungan fenolik total…………….. 57

2. Linieritas metode penetapan kandungan fenolik total………………… 58

3. Spesifisitas metode penetapan kandungan fenolik total………………. 59

J. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total……………………………. 59

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN…………………………………. 62

A. Kesimpulan……………………………………………………….……. 62

B. Saran………………………………………………………………....... 62

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………….. 63

LAMPIRAN…………………………………………………………….… 66

BIOGRAFI PENULIS…………………………………………………….. 95


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan

antioksidan sebagai penetral……………………………. 13

Tabel II. Kisaran recovery hasil analisis yang diterima………….. 17

Tabel III. Kriteria nilai presisi yang masih dapat diterima………... 17

Tabel IV. Hasil Scanning panjang gelombang maksimum DPPH… 40

Tabel V. Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin

yang direaksikan dengan radikal DPPH………………… 43

Tabel VI. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat

ekstrak etanol daun dadap serep yang direaksikan

dengan DPPH…………………………………………… 44

Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar kuersetin……. 45

Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat……… 45

Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode

DPPH……………………………………………………. 51

Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak

etanol daun dadap serep dengan metode DPPH…………. 52

Tabel XI. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan Fraksi etil asetat

ekstrak etanol daun dadap serep…………………………. 53

Tabel XII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin

dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep…… 54


xiv

Tabel XIII. Hasil scanning panjang gelombang maksimum………….. 57

Tabel XIV. Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter……… 58

Tabel XV. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang

direaksikan dengan Folin-Ciocalteu…………………… 58

Tabel XVI. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat

ekstrak etanol daun dadap serep……………………… 60


xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Beberapa struktur senyawa isoflavonoid………………… 8

Gambar 2. Klasifikasi flavonoid produk alam………………………. 9

Gambar 3. Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH……….. 12

Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan.. 15

Gambar 5. Skema jalannya penelitian……………………………….. 30

Gambar 6. Blanko DPPH , Fraksi etil asetat, Kuersetin…………..…. 38

Gambar 7. Blanko reagen Folin-ciocalteau , Fraksi+reagen

Folin-ciocalteau, Asam galat+ragen Folin-ciocalteatu…… 39

Gambar 8. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)…………….. 42

Gambar 9. Grafik Penetuan OT Fraksi Etil Asetat (Replikasi 1)……... 42

Gambar 10. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa…………….. 48

Gambar 11. Struktur senyawa kuersetin……………………………….. 49

Gambar 12. Usulan mekanisme reaksi kuersetin dan radikal DPPH…… 49

Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan

kuersetin………………………………………………….. 51

Gambar 14. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan

fraksi etil asetat…………………………………………… 52

Gambar 15. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)…………… 56

Gambar 16. Reaksi pembentukan kompleks molybdenum-blue……….. 60

Gambar 17. Kurva kalibrasi asam galat………………………………... 60


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat determinasi tanaman dadap serep………………. 66

Lampiran 2. Gambar tanaman dadap serep………………………… 67

Lampiran 3. Perhitungan rendemen……………………………... … 68

Lampiran 4. Data penimbangan untuk pengujian

aktivitas antioksidan……………………………….. ... 69

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi pengujian

aktivitas antioksidan…………………………………. 70

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi………………………………... 72

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan……………. 73

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH.. 74

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi air

ekstrak metanol daun dadap serep……………………... 84

Lampiran 10. Penimbangan bahan pengujian kandungan fenolik total... 85

Lampiran 11. Perhitungan konsentrasi pengujian fenolik total………… 85

Lampiran 12. Scanning kontrol asam galat……………………………. 88

Lampiran 13. Optimasi penentuan kandungan fenolik total…………… 88

Lampiran 14. Perhitungan kandungan fenolik total…………………… 93

Lampiran 15. Hasil pengujian statistik dengan software R 2.14.1…….. 94


xvii

INTISARI

Dalam pengobatan tradisional di Indonesia, daun dari tanaman dadap

serep berkhasiat untuk mengobati sakit kepala, batuk serta untuk minuman bagi

wanita sehabis melahirkan. Senyawa fenolik merupakan salah satu kandungan

bioaktif dari daun dadap serep. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui

aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep secara in

vitro yang didasarkan pada efek peredaman radikal bebas larutan 1,1-difenil-

pikrilhidrazil (DPPH) yang dinyatakan dengan inhibition concentration 50 (IC50).

Kandungan fenolik total juga ditentukan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu

dengan baku standar asam galat yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam

galat. Prinsip metode ini adalah senyawa fenolik teroksidasi dalam suasana basa

dan pereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi menjadi larutan berwarna biru yang dapat

diukur dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep

mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 245,15 ± 4,26 µg/mL

dan kandungan fenolik total sebesar 8,51 ± 0,18 ekivalen asam galat per g fraksi

etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep dan metode yang digunakan belum

tervalidasi.

Kata kunci: daun dadap serep (Erythrina subumbrans Hassk), fraksi etil asetat,

antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total


xviii

ABSTRACT

In Indonesian traditional medicine, the leaves of dadaps (Erythrina

subumbrans (Hassk.) Merr.) are efficacious to cure headaches, cough and can also

be used as a drink for women after childbirth. Phenolic compound is one of the

bioactive contents in dadaps leaves. This research was conducted to determine the

antioxidant activities of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves

in vitro based on the reducing effect of free radical of 1,1-diphenyl-pikrilhidrazil

(DPPH) solution expressed by inhibition concentration 50 (IC50). The total

phenolic contents was also determined by using the Folin-Ciocalteu reagent with

gallic acid standard expressed by the mass of gallic acid equivalents. The principle

of this method is oxidized phenolic compounds in alkaline medium and Folin-

Ciocalteu reagent is reduced to a blue solution that can be measured by the visible

spectrophotometer at a wavelength of 750 nm. The results showed that the ethyl

acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves had antioxidant activities with

IC50 valued in the amount of 245.15 ± 4.26 µg/mL and the total phenolic content

of 8.51 ± 0.18 gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of ethanol

extract of dadaps leaves and the method has not been validated.

Keywords : dadaps leaves (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.), ethyl acetate

fraction, antioxidant, DPPH, total phenolic content


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Paparan sistem biologis dari xenobiotik, polusi, radiasi pengion atau

cahaya UV dan perkembangan kondisi patologis tertentu menyebabkan tekanan

oksidatif, akibatnya meningkatkan produksi oksigen radikal. (Sapakal et al.,

2008). Pembentukan radikal bebas dan reaksi oksidasi pada biomolekul akan

berlangsung sepanjang hidup. Inilah penyebab utama dari proses penuaan dan

berbagai penyakit degeneratif (Silalahi, 2006). Radikal oksigen terus dibentuk

pada semua organisme hidup, dengan efek merusak yang menyebabkan cedera

dan kematian sel (Sapakal et al., 2008). Jenis Reaktif Oksigen Spesies (ROS)

termasuk radikal hidroksil, radikal anion superoksida, hidrogen peroksida, radikal

nitrat oksida, radikal hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida mampu bereaksi

dengan membran lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya,

yang mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al., 2008).

Antioksidan adalah zat yang berperan penting dalam menunda atau

mencegah penyakit degeneratif oleh kerusakan oksidatif dari komponen sel hidup

yang disebabkan oleh radikal bebas. Didalam tubuh secara alami telah

mengandung enzim-enzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti

enzim glutation reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT),

glutation peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif

dengan menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen

reaktif dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Namun karena


2

tekanan oksidatif berlebih didalam tubuh, menyebabkan produksi radikal bebas

menjadi meningkat didalam tubuh yang berakibat dibutuhkannya tambahan

antioksidan yang cukup untuk menanggulangi tekanan oksidatif yang tinggi

tersebut sehingga dapat mengurangi dampak kerusakan sel sebagai akibat dari

reaksi radikal bebas.

Antioksidan sintetik seperti butylated hidroksitoluen (BHT), butylated

hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ) dan propil gallate (PG)

telah digunakan selama bertahun-tahun, namun senyawa tersebut sedang diperiksa

untuk kemungkinannya dalam menimbulkan toksisitas. Oleh karena itu, sekarang

ini dilakukan penelitian intensif tentang antioksidan polifenol alami yang berasal

dari tumbuhan untuk menggantikan antioksidan sintetis (Qader et al., 2011).

Dadap serep (Erythrina subumbrans) adalah salah satu tanaman yang

secara tradisional digunakan untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan

untuk mengobati sakit kepala. Rebusan daunnya juga digunakan untuk mengobati

batuk (Anonim, 2007). Dalam tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa

bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Senyawa

fenolik tersebut memiliki peranan penting dalam kaitan penggunaan tanaman

terhadap manfaatnya bagi kesehatan. Salah satu manfaat dari kandungan senyawa

fenolik pada tanaman dadap serep telah dibuktikan dalam penelitian

Rukachaisirikul et al.,(2007) yang menunjukan tanaman dadap serep (Erythrina

subumbrans) mengandung senyawa fenolik yang beraktivitas antibakteri lebih

kuat dibanding standar antibiotik vancomycin dan oxacillin terhadap beberapa

strain bakteri streptococcus dan staphylococcus.


3

Senyawa fenolik merupakan senyawa bioaktif dari tumbuhan yang

merupakan sumber antioksidan alami yang aman. Untuk melihat potensi

antioksidan dari tanaman dadap serep, dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan

aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang

dilakukan dengan metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) secara

spektrofotometri. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat dan peka

serta hanya memerlukan sedikit sampel. Aktivitas diukur dengan menghitung

jumlah pengurangan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan

pengurangan konsentrasi larutan DPPH. Peredaman tersebut dihasilkan oleh

bereaksinya molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang

dilepaskan satu molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil

Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke

kuning (Zuhra, Tarigan dan Sihotang, 2008). Penentuan kandungan fenolik total

dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dilakukan menggunakan

metode Folin-Ciocalteu dimana merupakan salah satu metode yang cepat dan

sederhana dalam menentukan kandungan fenolik total (Fu et al., 2011).

B. Permasalahan

1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun

dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50

?

2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap

serep yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat ?


4

C. Keaslian Penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji aktivitas antioksidan

daun dadap pernah dilakukan oleh :

Estrada, E.I., 2010, dengan judul “Actividad Antioxidante De Alcaloides De

Erythrina Americana Miller”. Penelitian ini menggunakan daun dadap spesies

Erythrina Americana Miller yang diperoleh di universitas nacional autonoma

de Mexico (Mexico) dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazyl).

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah

bahwa dalam penelitian ini daun dadap serep spesies Erythrina subumbrans

(Hassk.) Merr. yang digunakan dipanen dari dari kebun tanaman obat Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas

antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan

menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

2. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas

antioksidan daun dadap serep sehingga bisa dimanfaatkan sebagai alternatif untuk

pemeliharaan kesehatan manusia.


5

E. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH fraksi etil asetat

ekstrak etanolik daun dadap serep.

2. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun

dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50

dan mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik

daun dadap serep yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Dadap Serep

1. Keterangan botani

Dadap serep termasuk tanaman legum pohon, berasal dari Asia Tenggara

dan tersebar di seluruh kepulauan nusantara. Varietas tanaman ini dibedakan

berdasarkan ada tidaknya duri pada kulitnya (Purwanto, 2007).

2. Nama tumbuhan

Nama latin : Erythrina subumbrans Hassk. (Anonim, 2007).

Nama sinonim : Erythrina hypaphorus Boerl., Erythrina lithosperma

Miquel (Anonim, 2007).

Nama daerah : dadap minyak, dadap limit (sunda); dadap lengan,

dadap lisah (jawa); dadap lenga, thetheuk oleng

(Madura) (Purwanto, 2007).

3. Klasifikasi dadap serep menurut USDA (2011)

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae

Genus : Erythrina

Spesies : Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.


http://www.plantamor.com/index.php?plantsearch=Fabaceae

http://www.plantamor.com/index.php?plantsearch=Erythrina

7

4. Gambaran umum

Dadap serep merupakan tanaman legum pohon, tumbuh tinggi agak

bengkok, ketinggian mencapai 15-22 m dengan diameter batang 40-100 cm,

sistem perakaran dalam. Kulit batang berwarna hijau, batang yang tua bercampur

garis-garis kecoklatan, cabang tumbuh lurus ke atas membentuk sudut 45o.

Daunnya beranak tiga helai, berbentuk delta atau gemuk bundar ujung agak

meruncing, bagian bawah daun membundar, bila diremas terasa lunak ditangan.

Ukuran panjang tangkai daun 10-20,5 cm; panjang daun 9-19 cm; dan lebar daun

6-17 cm. Daun atas berukuran lebih besar daripada kedua daun penumpu.

Bunganya tumbuh diantara ketiak daun, daun mahkota bunyanya berwarna merah

kekuningan, berbentuk terompet. Polongnya berukuran kecil, berbentuk sabit,

berisi 4-8 biji per polong (Purwanto, 2007).

Dalam penggunaannya, bagian kulit kayu dan daun dadap serep secara

empiris digunakan untuk pengobatan tradisional sebagai campuran dengan

tanaman obat lainnya. Di Indonesia ditemukan daun mudanya digunakan untuk

minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan untuk mengobati sakit kepala.

Rebusan daunnya digunakan untuk mengobati batuk (Anonim, 2007).

5. Kandungan kimia dadap serep

Tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti

alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Flavonoid dan isoflavonoid

yang terkandung dalam tanaman dadap merupakan senyawa bioaktif yang

menarik perhatian para peneliti karena selain memiliki struktur senyawa yang


8

baru, senyawa bioktif tersebut juga menunjukan potensi sebagai senyawa

antimikroba (Rasooli, 2011).

O O

IsoflavanIsoflavone

O

O

O

Isoflavanone

O

Isoflavan-3-ene

O

OH

Isoflavanol

O O

3-arylcoumarin

Gambar 1. Beberapa struktur senyawa isoflavonoid (Samanta, Das,

dan Das, 2011)

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder dari alam dengan jumlah

senyawa yang besar (lebih dari 8.000) yang tersebar luas diseluruh kingdom

tanaman dan dikarakterisasi dengan setidaknya memiliki satu cincin aromatis

dengan satu atau lebih terikat dengan gugus hidroksil. Senyawa fenolik dapat

diklasifikasikan berdasarkan susunan dari atom karbon dalam flavonoid (flavonol,

flavon, flavan-3-ol, antosianidin, flavanon, isoflavon dan lainnya) dan non-

flavonoid (asam fenolat, hidroksinamat, stilben dan lainnya) dan senyawa-

senyawa tersebut umumnya berada terkonjugasi dengan gula dan asam organik

(Cartea, Francisco, Soengas, dan Velasco, 2010).


9

Flavonoid merupakan salah satu kelompok metabolit sekunder terbesar

sebagai senyawa fenolik. Flavonoid melindungi tanaman terhadap berbagai

ancaman biotik dan abiotik yang menunjukkan spektrum dengan beragam fungsi

biologis dan memainkan peran penting dalam interaksi antara tanaman dan

lingkungannya (Samanta et al., 2011). Senyawa fenolik mayoritas yang ada di

alam berada sebagai glikosida. Adanya gula dan gugus hidroksil membuat

senyawa fenolik larut dalam air sedangkan adanya gugus metil dan unit isopentil

membuat flavonoid menjadi lipofilik (Samanta et al., 2011).

Sebagian besar koleksi metabolit dari produk alam disebut dengan istilah

flavonoid yang mencakup senyawa dengan karbon berstruktur C6-C3-C6.

Tergantung pada posisi keterkaitan dari cincin aromatik ke bagian benzopiren,

kelompok produk alam ini dibagi menjadi tiga kelas: Flavonoid (2 -

fenilbenzopiren), isoflavonoid (3-benzopiren) dan Neoflavonoid (Samata et al.,

2011).

O

O

Flavonoids Isoflavonoids(3-benzopyrans)

O

Neoflavonoids

Gambar 2. Klasifikasi flavonoid produk alam (Samata et al., 2011)

C. Radikal Bebas

Reaktif oksigen spesies (ROS) adalah istilah yang meliputi semua

molekul yang sangat reaktif yang mengandung atom oksigen yang merupakan


10

golongan radikal bebas. Jenis ROS termasuk radikal hidroksil, radikal anion

superoksida, hidrogen peroksida, singlet oksigen, radikal nitrat oksida, radikal

hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida. Semua mampu bereaksi dengan membran

lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya, yang

mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al, 2008).

Banyak bukti yang telah dikumpulkan untuk melihat kerusakan seluler

yang timbul akibat dari spesies oksigen reaktif (ROS), setidaknya sebagian, dalam

etiologi dan patofisiologi penyakit manusia seperti gangguan neurodegeneratif

(misalnya penyakit alzheimer, penyakit parkinson, multipel sklerosis, syndrom

down), peradangan, infeksi virus, autoimun patologi, dan gangguan sistem

pencernaan seperti peradangan pencernaan dan ulkus. Dalam sistem metabolisme

tubuh, radikal bebas dihasilkan sebagai bagian dari proses normal metabolisme

tubuh, dan reaksi berantai radikal bebas biasanya diproduksi di rantai pernapasan

mitokondria, campuran oksidase fungsi hati, dengan leukosit bakteri, melalui

aktivitas xantin oksidase, polusi atmosfer, dan dari transisi logam katalis, obat dan

xenobiotik. Selain itu, mobilisasi kimia dari cadangan lemak di bawah berbagai

kondisi seperti menyusui, olahraga, demam, infeksi dan bahkan puasa, dapat

menghasilkan peningkatan aktivitas radikal dan meningkatkan kerusakan,

khususnya yang berhubungan dengan kekebalan tubuh dan sistem saraf. Hormon

stres (adrenalin dan noradrenalin) yang disekresikan oleh kelenjar adrenal di

bawah kondisi stres emosional yang berkelanjutan dan berlebihan, yang

kemudian dimetabolisme menjadi lebih sederhana seperti molekul radikal bebas,

juga dapat meningkatkan produksi senyawa radikal dalam tubuh (Atawodi, 2005).


11

D. Antioksidan

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang mampu menunda,

memperlambat atau menghambat reaksi oksidasi didalam tubuh. Antioksidan

mampu menstabilkan, atau menonaktifkan radikal bebas sebelum menyerang sel

dalam tubuh. Antioksidan merupakan senyawa yang penting untuk menjaga

kesehatan seluler dan kesehatan sistemik tubuh (Sapakal et al., 2008).

Senyawa antioksidan dapat dibedakan berdasarkan komposisi, sifat fisik

dan kimia, mekanisme dan tempat aksi dari senyawa antioksidan tersebut. Enzim-

enzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti enzim glutation

reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), glutation

peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif dengan

menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen reaktif

dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Senyawa dengan bobot

molekul tinggi seperti protein : albumin, ceruplasmin, transferin, haptoglobin

mengikat logam aktif redoks dan membatasi produksi radikal bebas katalis logam.

Senyawa dengan berat molekul rendah dibagi menjadi antioksidan larut lemak

(tokoferol, karotenoid, kina dan beberapa polifenol) dan antioksidan yang larut air

(asam askorbat, asam urat dan beberapa polifenol). Senyawa antioksidan jenis

mineral: selenium, mangan, tembaga, dan seng diakui sebagai antioksidan yang

serbaguna. Senyawa antioksidan jenis vitamin: vitamin A, C, dan E ternyata

memiliki peran penting dalam mencegah atau meminimalkan kerusakan

peroksidasi dalam sistem biologis. Tanaman kaya antioksidan merupakan sumber

antioksidan alami yang dapat ditemukan dalam sayuran, kacang kedelai, kulit


12

jeruk, biji sesame, daun teh hijau, biji kakao, anggur, tomat, jeruk, apel, biji-

bijian, zaitun, wortel (Sapakal et al.,2008).

Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun

antioksidan alami. Tetapi saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi

karena ternyata dari hasil penelitian yang telah dilakukan bahwa antioksidan

sintetik seperti BHT (Butylated Hydroxy Toluena) ternyata dapat meracuni

binatang percobaan dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan

dan obat-obatan beralih mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumber-

sumber antioksidan alami baru (Zuhra et al., 2008).

Gambar 3. Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH ((a) donasi

kedua atom hidrogen, (b) dimerisasi, (c) kompleksasi) (Bondet, Brand-

Williams, dan Berset, 1997)


13

Tabel I. Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan antioksidan sebagai

penetral (Sapakal et al., 2008)

Reactive Oxygen Species

(ROS) Senyawa antioksidan

Radikal hidroksil vitamin C, glutation, flavonoid, asam

lipoid

Radikal superoksida vitamin C, glutation, flavonoid, SOD

Hidrogen peroksida vitamin C, glutation, betakaroten,

vitamin E, CoQ10, flavonoid, asam

lipoid

Lipid peroksida beta karoten, vitamin E, ubiquinon,

flavonoid, glutation peroksidase

E. Penyarian

Penyarian adalah kegiatan penarikan zat atau metabolit aktif yang semula

berada didalam sel yang kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif

tersebut larut dalam cairan penyari (Harborne, 1987). Secara umum, penyarian

dapat dibedakan menjadi infudasi, maserasi, perkolasi dan penyarian

berkesinambungan. Sebagai cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran

etanol air (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).

Maserasi merupakan metode yang melibatkan perendaman dan

penggojogan bahan tanaman didalam pelarut tertentu yang kemudian pelarutnya

diuapkan (Raaman, 2006). Remaserasi merupakan modifikasi cara penyarian

maserasi. Pada proses remaserasi cairan penyari dibagi menjadi dua bagian.

Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah


14

diendap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang

kedua (Depkes, 1986). Alkohol didalam banyak penelitian merupakan pelarut

yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut awal yang digunakan

dalam tahapan ekstraksi (Harborne, 1998).

Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakukan sampel

untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin

menganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Ekstraksi cair-cair

ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang menyatakan “pada

konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi

yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak campur”. Perbandingan

konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut dengan koefisien

distribusi atau koefisien partisi (Kd) dan digambarkan dengan rumus :

Kd = 𝑆 𝑜𝑟𝑔

𝑆 𝑎𝑞

Dimana [S]org dan [S]aq masing-masing merupakan konsentrasi analit

dalam fase organik dan dalam fase air; Kd merupakan koefisien partisi. Efiseiensi

proses ekstraksi tergantung pada nilai distribusinya dan juga tergantung pada

volume relative kedua fase. Adanya ekstaksi berulang (bertingkat) akan

meningkatkan efisiensi ekstraksi (Gandjar dan Rohman, 2007).

F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu

Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji

aktivitas antioksidan. Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter

konsentrasi yang ekivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal


15

ini dapat dicapai dengan cara mengintepretasikan data eksperimental dari metode

tersebut (Molyneux, 2004).

Uji kuantitatif daya antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1-

difenil-2-pikrilhidrazil) secara spektrofotometri sinar tampak. Metode ini

didasarkan pada perubahan warna radikal DPPH. Perubahan warna tersebut

disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH dengan satu atom hidrogen

yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk

senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning. Pada metode ini

absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak bereaksi

dengan senyawa antioksidan (Josephy, 1997).

NO2

O2N

O2N

NN + AH O2N

NO2

NO2

HN N

DPPH Free RadicalDPPH Reduced FormPhenolic Compounds

+ A

Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan

(Irshad, Zafaryab, Singh, dan Rizvi, 2012)

Dalam metode DPPH, dengan adanya elektron bebas yang tidak

berpasangan pada senyawa radikal DPPH, senyawa tersebut memberikan serapan

maksimum yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dan memberikan warna

ungu. Warnanya berubah dari ungu menjadi kuning sebagai bentuk berkurangnya


16

absorptivitas molar radikal DPPH pada 517 nm dari 9660 ke 1640 ketika elektron

bebas radikal DPPH dipasangkan dengan hidrogen dari senyawa antioksidan

radikal bebas untuk membentuk senyawa DPPH-H. Dengan demikian hasil

dekolorisasi yang terjadi memberikan nilai stoikiometri sehubungan dengan

jumlah elektron yang ditangkap (Prakash, 2001).

Metode Folin-Ciocalteu (F-C) merupakan metode kolorimetri yang

sering digunakan yang berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan

menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium karbonat, yang

akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk

mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat diukur secara

spektrofotometri ( Cicco dan Lattanzio, 2011).

G. Validasi Metode

Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis dapat

memberikan hasil seperti yang diharapakan dengan akurat, spesifik, reprodusibel,

dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2007).

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai

terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya atau nilai

rujukan. Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH (International Conference on

Harmanization) merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan

kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali

replikasi). Data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali (recovery)

(Gandjar dan Rohman, 2007). Rata-rata persen recovery yang dihasilkan

seharusnya berada dalam kisaran sebagai berikut :


17

Tabel II. Kisaran recovery hasil analisis yang diterima (APMVA, 2004)

% Senyawa

impuritis/aktif Rata-rata recovery yang diterima

≥ 10 98-102 %

≥ 1 90-110 %

0,1-1 80-120 %

< 1 75-125 %

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya

diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda

signifikan secara statistik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Tabel III. Kriteria nilai presisi yang masih dapat diterima (APVMA, 2004)

Kadar zat aktif

(%)

Nilai KV yang masih dapat diterima (%)

≥ 10 ≤ 2

1-10 ≤ 5

0,1-1 ≤ 10

<0,1 ≤ 20

Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara

tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sampel

seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks (Gandjar dan

Rohman, 2007). Jika respon yang dihasilkan dari suatu metode dapat

membedakan senyawa yang dituju dengan respon yang lainnya, maka metode


18

tersebut dapat dikatakan selektif. Selektifitas suatu metode analisis dapat

ditunjukan dengan menampilkan data yang menggambarkan tidak adanya

interferensi dari hasil produk degradasi dan senyawa yang dapat menyebabkan

interferensi lainnya dalam matriks (APVMA, 2004).

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh

hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada

kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik

kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x)

(Gandjar dan Rohman, 2007).

H. Landasan Teori

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat

reaktif yang merupakan salah satu faktor penyebab kerusakan sel dalam tubuh.

Untuk mengurangi dampak kerusakan yang diakibatkan dari radikal bebas,

dibutuhkan senyawa antioksidan yang merupakan suatu senyawa yang mampu

menunda, memperlambat atau menghambat reaksi oksidasi didalam tubuh yang

dapat berasal dari radikal bebas. Antioksidan mampu menstabilkan atau

menonaktifkan radikal bebas sebelum menyerang sel dalam tubuh. Sumber-

sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan alami

yang berasal dari tanaman.

Secara empiris tanaman dadap serep digunakan sebagai bahan obat

tradisional yang digunakan untuk mengobati batuk, sakit kepala, demam dan

minuman bagi wanita sehabis melahirkan. Tanaman dadap serep memiliki

kandungan senyawa bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan


19

lektin. Adanya berbagai kandungan senyawa fenolik disamping saponin dan lektin

dalam tanaman dadap serep tersebut memberikan kemungkinan besar bahwa

tanaman ini memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

Pengujian aktivitas antioksidan dari suatu sampel uji dapat dilakukan

dengan menggunakan metode DPPH. Metode ini didasarkan pada perubahan

warna radikal DPPH yang disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH

dengan senyawa antioksidan yang menyumbangkan satu atom hidrogen yang

dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk senyawa

1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning, sisa DPPH yang tidak bereaksi

diukur secara spektrofotometri sinar tampak.

Kandungan senyawa fenolik dari suatu sampel dapat diukur dengan

metode Folin-Ciocalteu (F-C). Metode ini berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat

dari fenol dengan menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium

karbonat, yang akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat

yang terbentuk mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat

diukur secara spektrofotometri.

I. Hipotesis

Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep mempunyai aktivitas

antioksidan yang dapat diukur dengan metode DPPH yang dinyatakan dengan

IC50. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep

dapat diukur dengan metode Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan massa

ekivalen asam galat.


20

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subjek uji

diberi perlakuan.

B. Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap

serep.

2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total

fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu

pemanenan dan cara panen.

4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari, cuaca, kelembaban,

curah hujan.

C. Definisi Operasional

1. Daun dadap serep adalah daun (folium) segar dari tanaman dadap serep yang

dipanen dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma (Yogyakarta) dengan bentuk daun belah ketupat, dengan lebar ± 10-17

cm, berwarna hijau.

2. Ekstrak etanolik daun dadap serep adalah sari hasil proses maserasi daun dadap

serep dengan penyari etanol.

3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanolik daun dadap serep

dengan menggunakan pelarut etil asetat.


21

4. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan

kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep untuk

menangkap radikal DPPH.

5. Nilai inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil

asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang menghasilkan penangkapan 50%

radikal DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: daun dadap serep

yang diambil dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta, akuades (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma); bahan kualitas p.a. E. Merck,

yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen

Folin-Ciocalteu, asam galat, dan kuersetin kualitas Sigma Chem. Co., USA; bahan

kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas

teknis CV. General Labora, yaitu: metanol; dan aluminium foil.

2. Alat penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scaltec

SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath

(labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Perkin

Elmer Lamda 20), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000μL; 1-10

mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim

digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).


22

E. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tumbuhan

Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimian, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Tanaman dadap serep diperoleh dari kebun tanaman obat Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma di Yogyakarta. Pengumpulan pada musim

kemarau bulan Agustus tahun 2012. Pemanenan dilakukan pada tanaman saat pagi

hari.

3. Preparasi sampel

Daun dadap serep segar dicuci dengan air mengalir, dikering-anginkan,

dan ditimbang sebanyak 1 kg, kemudian dihaluskan dengan grinder. Ketika

dihaluskan, daun tersebut ditambahkan sedikit cairan penyari (etanol 76%).

Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang 100 g dan dituang kedalam bejana

maserasi, ditambah etanol 76% sampai terendam sempurna, dan dicampur

homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat

diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan

diremaserasi dengan etanol 76% secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya

dicampurkan dengan filtrat terdahulu. Campuran filtrat kemudian disaring. Lalu

hasil penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator

hingga diperoleh ekstrak etanol daun dadap serep.


23

Ekstrak etanol daun dadap serep ditambah 300 mL air hangat dan

diekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan

ekstrak : wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna.

Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada

bagian atas.

Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi

air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan

perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air

dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan

vacuum rotary evaporator. Hasil fraksi tersebut kemudian ditutup dengan plastik

serta aluminium foil lalu disimpan dalam desikator. Lalu hasil fraksi tersebut

digunakan untuk dianalisis lebih lanjut.

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji

a. Pembuatan larutan DPPH

Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh

larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan

alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan stok kuersetin

Sebanyak 2,5 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0

mL.

c. Pembuatan larutan pembanding

Diambil sebanyak 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL larutan stok kuersetin,

kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh

konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 μg/mL.


24

d. Pembuatan larutan uji

1. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Sebanyak 12,5 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu di add

metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5 mL larutan

tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga

diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 75; 150; 225; 300; 375 μg/mL.

2. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total

Sebanyak 5,0 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan

metanol p.a sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 500,0 µg/mL.

e. Pembuatan larutan asam galat

Dibuat larutan asam galat dengan konsetrasi 500 µg/mL dalam

akuades : methanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL

larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai

10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50;

75; 100; 125; dan 150 µg/mL.

5. Uji pendahuluan

a. Uji fenolik

Sejumlah 0,5 mL larutan uji 500,0 µg/mL dan larutan pembanding

asam galat 150,0 µg/mL dimasukan ke dalam 3 tabung reaksi. Lalu

ditambahkan 5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan

dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan selama 10 menit.

Tambahkan 4 mL larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna

larutan tersebut.


25

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing

tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a,

larutan pembanding kuersetin 37,5 μg/mL , dan larutan uji 200,0 μg/mL.

Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan

tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna

pada larutan tersebut.

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL

larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda

batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080. Larutan

tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu

dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.

b. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing 3

labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan

pembanding kuersetin 5; 10 dan 15 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut

ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut

kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum selama 1

jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 75; 225; 375 μg/mL.


26

7. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode

spoktrofotometri sesuai dengan penelitian Rollando (2012).

a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH.

Ditambahan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian

larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang

maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan

sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.

b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi

bertutup kemudian ditambah dengan 1 mL larutan pembanding dan uji pada

berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah

dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex

selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.

c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, divalidasi presisi (%CV), spesifisitas

(spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).

% CV = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑆𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟

𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛 𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 x 100%


27

d. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk

kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan

menggunakan metode spektrofotometri.

a. Penentuan OT

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat

1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada

panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.

b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1

M. Diamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.

9. Penetapan kandungan fenolik total

a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL

ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air

(1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M.


28

Setelah OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum terhadap blanko yang terdiri

atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium

karbonat 1 M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.

b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total

Hasil dari prosedur 9 a , divalidasi presisi (%CV), spesifisitas (spektra

kontrol), dan linearitas (nilai r).

% CV = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑆𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑠 𝑒𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟

𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 x 100%

c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 500 μg/mL, lalu masing-masing dimasukan ke

dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada

pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai

gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat).

Lakukan 3 kali replikasi.

F. Analisis Hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus :

Absorbansi (larutan kontrol) – Absorbansi sampel (larutan pembanding/uji) X 100%

Absorbansi larutan control

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 mengunakan

persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun

pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik


29

untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC50 larutan

pembanding dan larutan uji.

Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat

dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier

dengan data kurva baku secara intrapolasi.


30

Gambar 5. Skema jalannya penelitian

Determinasi tanaman

Pengumpulan dan preparasi bahan

Pembuatan ekstrak etanol daun dadap serep

Ekstraksi cair-cair dengan wasbensin dan air

Fraksi wasbensin Fraksi air

Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat

Fraksi etil asetat Fraksi air II

Uji Pendahuluan

Optimasi uji antioksidan

Validasi metode uji

aktivitas antioksidan

Estimasi aktivitas

antioksidan

Analisis statistik

Optimasi metode

penetapan kandungan

fenolik total

Validasi metode

penetapan kandungan

fenolik total

Estimasi kandungan

fenolik total


31

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi

Dalam penelitian ini langkah pertama yang dilakukan adalah determinasi

tanaman yang akan digunakan sebagai sampel uji. Tujuan dilakukannya

determinasi adalah untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang

digunakan serta untuk menghindari kesalahan dalam penggunaan tanaman saat

dilakukan penelitian. Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma dengan acuan buku Flora of Java (Backer and Bakhuizen van den Brink,

1965). Dari hasil determinasi (lampiran 1) yang dilakukan terbukti bahwa

tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah dadap serep (Erythrina

subumbrans (Hassk.) Merr.).

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Daun dadap serep yang digunakan diperoleh dari kebun tanaman obat

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Daun dipanen tanggal

21 september 2012. Daun dadap serep dipilih yang tidak layu, tidak terdapat bekas

luka daun, masih berwarna hijau dan masih segar. Adanya luka daun pada

tanaman dapat menyebabkan timbulnya respon enzimatik terhadap luka pada daun

tanaman tersebut. Polifenol oksidase merupakan suatu enzim ekstraseluler yang

akan mengoksidasi senyawa fenolik menjadi bentuk radikal dan membentuk

polimer yang digunakan untuk menutup luka pada daun. Menurut Harborne


32

(1987), senyawa fenol pada tanaman sangat peka terhadap adanya proses oksidasi

enzim yang mungkin dapat berakibat hilangnya senyawa fenol. Berkurangnya

senyawa fenolik pada daun maka dapat mengakibatkan pada berkurangnya

aktivitas antioksidan. Seleksi ini dilakukan untuk menjaga kualitas daun yang

akan digunakan sehingga kemungkinan terjadinya pengurangan mutu sampel daun

akibat sudah terjadinya perubahan kandungan kimia daun dari proses perubahan

metabolisme tumbuhan dapat dihindari. Daun kemudian dicuci, dibersihkan

dengan air bersih yang mengalir untuk menghilangkan sisa-sisa partikel debu,

pengotor lain serta kontaminan yang masih tertinggal di daun.

Proses pemanenan dan preparasi simplisia merupakan proses yang dapat

menentukan mutu simplisia daun dadap serep yang akan digunakan sebagai

sampel uji, oleh karena itu diperlukan prosedur baku dalam proses tersebut.

Waktu terbaik untuk pemanenan daun (kualitas pada puncak musim atau waktu

pada hari pemanenan) harus ditentukan sesuai dengan kualitas dan kuantitas

konstituen aktif biologis dari hasil vegetatif total bagian tanaman obat yang

ditargetkan. Dalam pemanenan daun dadap serep dipilih pada saat pagi hari untuk

mendapatkan hasil metabolit sekunder dari tanaman secara maksimal dan tidak

dalam kondisi basah (hujan atau embun) atau dalam kondisi kelembaban tinggi

untuk mengurangi kemungkinan terjadinya kontaminasi oleh mikroba pada

tanaman. Kontaminasi mikroba pada tanaman dapat mengakibatkan berubahnya

metabolisme dari tanaman tersebut. Hal ini dikarenakan adanya senyawa

fitotoksin yang dihasilkan oleh mikroba yang merupakan hasil sintesis mikroba

pada tanaman saat mikroba tersebut menyerang tanaman. Fitotoksin dapat


33

menginduksi tanaman untuk memproduksi senyawa fitoaleksin yang merupakan

senyawa hasil metabolisme tanaman sebagai pertahanan atas serangan mikroba.

Menurut Harborne (1987), senyawa fitoaleksin pada tanaman dapat berupa

seskuiterpenoid, isoflavonoid, asetilena, atau senyawa fenol. Apabila senyawa

fitoaleksin diproduksi berlebih pada tanaman sebagai tanggapan atas serangan

mikroba, maka jumlah senyawa fenol yang dibutuhkan sebagai sumber fitoaleksin

akan bertambah. Hal ini dapat menimbulkan kandungan senyawa fenol yang

merupakan metabolit sekunder tanaman yang dapat berfungsi sebagai senyawa

antioksidan akan berkurang akibat digunakannya senyawa fenol sebagai sumber

fitoaleksin.

Daun dadap yang telah diperoleh dan dicuci kemudian dikeringkan

sebelum ekstraksi. Menurut World Health Organization (2003), dalam proses

pengeringan, kelembapan udara pada tempat pengeringan diperhatikan dan dijaga

untuk menghindari kelembapan udara berlebih yang dapat menimbulkan

tumbuhnya kontaminan jamur pada daun. Pengeringan dilakukan dalam keadaan

terawasi untuk mencegah terjadinya perubahan kimia yang mungkin terjadi. Daun

dadap serep yang diperoleh dikeringkan segera tanpa menggunakan suhu tinggi

dan dalam aliran udara yang baik. Setelah daun dadap serep benar-benar kering,

daun tersebut disimpan diwadah yang kering dan bersih.


34

C. Hasil Preparasi Sampel

1. Ekstraksi sampel

Serbuk simplisia yang digunakan kemudian diekstraksi dengan cairan

penyari etanol 76%. Menurut Harborne (1998), etanol didalam banyak penelitian

merupakan pelarut yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut

awal yang digunakan dalam tahapan ekstraksi. Metode penyarian yang digunakan

adalah dengan maserasi. Pemilihan metode ini karena dengan metode ini sampel

yang digunakan tidak mengalami perlakuan pemanasan sehingga senyawa yang

tidak cocok dengan pemanasan terjaga stabilitasnya. Maserasi dilakukan selama

dua hari dan dilanjutkan remaserasi selama dua hari. Selama proses maserasi

dilakukan, digunakan juga shaker sebagai alat untuk membantu penggojogan.

Penggojogan dilakukan untuk meningkatkan kontak antara cairan penyari yang

digunakan dengan sampel, sehingga proses ekstraksi metabolit yang terkandung

dalam sampel dapat berjalan lebih efektif dan mendapatkan hasil penyarian yang

maksimal. Remaserasi dalam penelitian ini dilakukan untuk memaksimalkan

hasil perolehan penyarian dari senyawa yang belum tersari akibat sudah jenuhnya

cairan penyari yang digunakan.

Hasil dari proses maserasi dan remaserasi dikumpulkan yang kemudian

disaring dengan corong Buchner yang dilapisi kertas saring dan diintegrasikan

dengan pompa vacuum sehingga proses penyaringan lebih cepat. Filtrat hasil

penyaringan tersebut kemudian diuapkan pelarutnya menggunakan alat vacuum

rotary evaporator. Alat tersebut dapat menguapkan pelarut yang digunakan

dengan titik didih yang lebih rendah dari titik didih pelarut dengan adanya pompa


35

vakum, sehingga dapat memperkecil kemungkinan rusaknya senyawa yang

terkandung didalamnya. Perolehan bobot ekstrak daun dadap serep adalah sebesar

14,235 g.

2. Fraksinasi ekstrak

Struktur senyawa aktif dalam tanaman sangat bervariasi. Perbedaaan ini

dipengaruhi golongan dan substituen dari senyawa tersebut. Hal ini dapat

menyebabkan perbedaan polaritas dari tiap-tiap senyawa tersebut sehingga untuk

mengekstraksi senyawa aktifnya diperlukan pelarut dengan polaritas yang

bertingkat. Menurut Snyder (1997), proses fraksinasi akan memisahkan

komponen aktif dari ekstrak daun kedalam fraksi polar, semi polar dan fraksi non

polar. Etanol merupakan salah satu pelarut universal yang dapat menyari banyak

senyawa kimia seperti klorofil, minyak, vitamin dan mineral. Oleh sebab itu

dalam penelitian ini dilakukan fraksinasi yang bertujuan untuk memisahkan

senyawa-senyawa didalam ekstrak sehingga yang didapat adalah senyawa-

senyawa yang dituju yaitu senyawa fenolik. Dalam melakukan fraksinasi dalam

penelitian ini menggunakan prinsip ektraksi cair-cair dimana merupakan teknik

ekstraksi yang menggunakan dua pelarut yang tidak tercampurkan yang

menimbulkan perpindahan senyawa terlarut dari satu pelarut ke pelarut kedua.

Ekstrak yang didapat kemudian dilarutkan dengan air hangat agar lebih

mudah untuk melarutkan ekstrak kental. Fraksinasi dilakukan dengan wasbensin

yang merupakan pelarut non polar. Penggunaan wasbensin yang merupakan

senyawa non polar dimaksudkan untuk mengekstraksi senyawa-senyawa non

polar seperi minyak, lemak, klorofil dan vitamin. Fraksinasi dilakukan


36

menggunakan corong pisah. Dalam corong pisah, fraksi air akan berada dibagian

bawah sedangkan fraksi wasbensin ada di bagian atas. Hal ini dikarenakan adanya

perbedaan bobot jenis antara wasbensin dan air. Fraksi air yang mengandung

senyawa polar seperti fenolik disimpan, sedangkan fraksi wasbensin yang

mengandung klorofil, minyak, lemak dan vitamin tidak digunakan dalam

penelitian ini.

Tahap selanjutnya melakukan fraksinasi kembali dari fraksi air yang

diperoleh menggunakan pelarut etil asetat. Menurut Robinson (1995),

pengekstraksian kembali fraksi air dengan pelarut organik yang tidak bercampur

dengan air tetapi agak polar sering kali bermanfaat untuk memisahkan golongan

fenolik seperti senyawa-senyawa flavonoid dari senyawa yang lebih polar seperti

karbohidrat. Etil asetat merupakan pelarut yang baik untuk ini. Fraksi air akan

berada dibagian bawah dan fraksi etil asetat yang berbobot jenis lebih kecil dari

bobot jenis air akan berada diatas. Fraksi etil asetat akan mengkestraksi senyawa

fenolik aglikon sedangkan senyawa seperti antosianin, glikosida flavonoid akan

berada dalam fraksi air.

Dalam melakukan fraksinasi, dilakukan dengan perbandingan yang sama

antara pelarut etil asetat, wasbensin dan air dengan masing-masing menggunakan

100 mL fraksi. Menurut Gandjar dan Rohman (2007), fraksinasi juga dilakukan

secara berulang sebanyak tiga kali karena ekstraksi berulang dengan volume yang

sama akan lebih efektif dibanding melakukan ekstraksi tunggal dengan volume

yang besar. Bentuk glikosida senyawa fenolik bersifat polar, sedangkan bentuk


37

aglikonnya bersifat cenderung non polar, sehingga tidak menutup kemungkinan

adanya senyawa tersebut larut dalam air maupun etil asetat.

Setelah didapat fraksi etil asetat, fraksi kemudian diuapkan menggunakan

vaccum rotary evaporator untuk meminimalkan pemaparan pemanasan supaya

stabilitas senyawa fenolik tetap terjaga. Sisa fraksi etil asetat kemudian

dimasukkan kedalam oven dengan suhu 40 oC untuk menguapakan sisa pelarut

sehingga didapatkan ekstrak kental. Fraksi kental etil asetat dalam cawan petri

kemudian dibungkus dengan plastik dan ditutup dengan alumunium foil supaya

tidak terkena udara dan tidak terpapar sinar UV yang dapat mendegradasi

senyawa fenolik yang ada didalam fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat yang sudah

dibungkus dimasukan didalam desikator agar tidak terpapar lembab dan

ditumbuhi jamur atau mikroba. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,424

g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,424 %.

D. Hasil Uji Pendahuluan

1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Tujuan uji pendahuluan aktivitas antioksidan adalah untuk mengetahui

secara kualitatif adanya senyawa yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan

di dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Uji ini menggunakan

radikal DPPH dengan kuersetin sebagai pembanding dan fraksi etil asetat ekstrak

etanolik sebagai sampel uji. Uji ini perlu dilakukan sebelum uji kuantitatif dimana

dapat menentukan langkah perlu dilakukannya uji kuantitatif aktivitas antioksidan

atau tidak.


38

Uji ini dilakukan menggunakan tabung reaksi dengan menambahkan

sejumlah larutan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep

ke larutan DPPH. Keberadaan senyawa antioksidan dapat menyebabkan terjadinya

peluruhan warna larutan dari ungu ke kuning.

Gambar 6. Blanko DPPH (B), Fraksi etil asetat (A), Kuersetin (C)

Dalam uji ini digunakan kontrol positif berupa larutan DPPH yang

ditambah kuersetin untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya positif (Gambar

5). Kontrol negatif dalam penelitian ini menggunakan larutan DPPH untuk

menunjukan warna larutan apabila hasil uji negatif (Gambar 5). Dari hasil uji yang

dilakukan terlihat adanya penurunan intensitas warna larutan uji fraksi etil asetat

ekstrak etanolik dari warna ungu menjadi kuning (Gambar 5). Ini menunjukan

bahwa hasil pengujian positif dan didalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun

dadap serep mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan.


39

1. Uji pendahuluan senyawa fenolik

Uji ini bertujuan untuk mengetahui adanya kandungan senyawa fenolik

dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Pengujian dilakukan

dengan metode Folin-Ciocalteau yang didasarkan pada reaksi oksidasi-reduksi

dalam suasana basa. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan fraksi etil asetat

ekstrak etanolik daun dadap serep dengan pereaksi Folin-Ciocalteau. Menurut

Cicco dan Lattanzio (2011), reaksi yang terjadi yaitu adanya oksidasi senyawa

fenol dalam suasana basa, yang pada umumnya menggunakan sodium karbonat,

yang mana biasanya akan menghasilkan ion fenolik yang cukup banyak. Ion

fenolat yang terbentuk akan mereduksi warna kuning dari reagen Folin-ciocalteau.

Reaksi positif dari metode ini membentuk kompleks warna biru. Semakin tinggi

kadar fenol pada sampel, semakin banyak produk molekul berwarna biru,

akibatnya intensitas warna biru semakin tinggi.

Gambar 7. Blanko reagen Folin-ciocalteau (A), Fraksi+reagen Folin-

ciocalteau (B), Asam galat+ragen Folin-ciocalteatu (C)


40

Uji ini menggunakan kontrol negatif, yaitu pereaksi Folin-Ciocalteu

untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya negatif (Gambar 6). Kontrol

positif dalam uji ini menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu yang ditambah asam

galat untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya positif (Gambar 6). Dari hasil

penelitian yang dilakukan, fraksi etil asetat yang diberi reagen Folin-Ciocalteu

menunjukan warna biru. Dapat disimpulkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun

dadap serep mengandung senyawa fenolik.

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)

Tujuan penentuan panjang gelombang maksimum adalah untuk

menentukan panjang gelombang dimana larutan DPPH yang digunakan

memberikan absorbansi yang paling optimum. Menurut Gandjar dan Rohman

(2007), pada panjang gelombang maksimum, perubahan yang sedikit dari

konsentrasi akan memberikan perubahan yang paling besar pada absorbansi yang

dihasilkan. Dengan demikian diperoleh sensitivitas yang maksimum.

Panjang gelombang maksimum dilakukan dengan scanning tiga

konsentrasi larutan DPPH. Scanning panjang gelombang dilakukan pada panjang

gelombang 400-600 nm.

Tabel IV. Hasil Scanning panjang gelombang maksimum DPPH

Konsentrasi larutan

DPPH λ maks hasil scanning λ maks rata-rata λ maks teoritis

0,02 mM 515,5 nm

515,5 nm 515-520 nm 0,04 mM 515,5 nm

0,08 mM 515,5 nm


41

Menurut Molyneux (2004), panjang gelombang teoritis untuk pengukuran

DPPH berkisar antara 515 nm-520 nm. Hasil scanning tiga konsentrasi larutan

DPPH didapatkan hasil panjang gelomabang maksimum rata-rata adalah 515,5 nm

(Tabel IV). Panjang gelombang ini masih masuk dalam kisaran panjang

gelombang teoritis DPPH, yaitu 515-520 nm.

2. Penentuan Operating Time (OT)

Operating time merupakan waktu dimana reaksi yang terjadi sudah

optimal. Menurut Mustariche (2012), pada rentang waktu tersebut senyawa uji

dan larutan pembanding berada dalam keadaan reaksi sempurna dengan DPPH

yang ditunjukan dengan diperolehnya absorbansi DPPH yang stabil. Pengukuran

pada waktu OT bertujuan untuk meminimalkan kesalahan dalam memperoleh

hasil pengukuran. Penetuan OT dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan

DPPH yang sudah direaksikan dengan larutan pembanding, yaitu kuersetin serta

larutan uji, yaitu fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Pengukurun

dilakukan pada konsentrasi rendah, tengah dan tinggi. Absorbansi diukur tiap 5

menit selama 60 menit.


42

Gambar 8. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)

Gambar 9. Grafik Penetuan OT Fraksi Etil Asetat (Replikasi 1)

Dari hasil pengukuran OT yang terlihat pada gambar 7 dan gambar 8

menunjukan bahwa absorbansi stabil pada menit ke-30 hingga menit ke-60.

Dengan demikian, secara teoritis dapat disimpulkan bahwa pada menit ke-30

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 20 40 60 80

Operating time kuersetin

Waktu (menit)

Ab

sorb

ansi

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 10 20 30 40 50 60 70

75 µg/mL

225 µg/mL

375 µg/mL

Penentuan OT Fraksi Etil Asetat

Waktu (menit)

Ab

sorb

ansi


43

seluruh senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan pada larutan pembanding

dan larutan uji sudah bereaksi dengan radikal DPPH, sehingga OT yang akan

digunakan untuk reaksi radikal DPPH dengan larutan pembanding dan larutan uji

adalah 30 menit.

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Validasi metode merupakan serangkaian prosedur yang digunakan untuk

menjamin bahwa metode analisis dapat memberikan hasil seperti yang

diharapakan dengan akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit

yang akan dianalisis. Hasil dari suatu analisis dengan metode yang valid akan

memberikan hasil yang dapat dipertanggung jawabkan. Parameter metode analisis

yang dinilai dalam pengujian ini yaitu presisi, linearitas dan spesifisitas.

Tabel V. Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin yang direaksikan

dengan radikal DPPH

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi

Kuersetin

(µg/mL)

Absorbansi

Konsentrasi

Kuersetin

(µg/mL)

Absorbansi

Konsentrasi

Kuersetin

(µg/mL)

Absorbansi

5,2 0,653 5 0,663 5 0,656

7,8 0,563 7,5 0,572 7,5 0,559

10,4 0,475 10 0,473 10 0,480

13 0,377 12,5 0,385 12,5 0,395

15,8 0,288 15 0,292 15 0,311

Persamaan regresi linear

y = -0,035x + 0,833

r = -0,9997


y = -0,037x + 0,849

r = -0,9998


y = -0,028x + 0,82

r = -0,9995


44

Dari tiga replikasi yang dilakukan memberikan persamaan regresi linear

yang berbeda tiap replikasinya. Berdasarkan nilai persamaan regresi linear seri

baku kuersetin yang dihasilkan, dipilih persamaan dari hasil replikasi dua yaitu y

= -0,037x + 0,849 yang akan digunakan untuk menghitung nilai presisi

(Coefficient of variation) dari kuersetin. Persamaan tersebut dipilih karena nilai r

dari replikasi dua menghasilkan nilai yang paling mendekati 1 atau -1, yaitu r = -

0,9998.

Tabel VI. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat ekstrak etanolik

daun dadap serep yang direaksikan dengan DPPH


Konsentrasi

Fraksi

(µg/mL)

Absorbansi

Konsentrasi

Fraksi

(µg/mL)

Absorbansi

Konsentrasi

Fraksi

(µg/mL)

Absorbansi

75,6 0,612 75 0,603 75 0,617

151,2 0,506 150 0,531 150 0,514

226,8 0,442 225 0,449 225 0,435

302,4 0,334 300 0,367 300 0,345

378 0,255 375 0,27 375 0,263


y = -0,088x + 0,695

r = -0,9975


y = -0,001x + 0,693

r = -0,9986


y = -0,001x + 0,697

r = -0,9991

Berdasarkan hasil (pada tabel VI) dari tiga replikasi fraksi etil asetat

ekstrak etanolik daun dadap serep yang dilakukan dipilih persamaan replikasi tiga

yaitu y = -0,001x + 0,697 dengan nilai r = 0,9991 sebagai persamaan yang akan

digunakan untuk menghitung coefficient of variation (CV) untuk fraksi etil asetat

ekstrak etanolik daun dadap serep.


45

1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan

Presisi merupakan keterulangan dan ketertiruan dari perolehan hasil

analisis beberapa kali terhadap sampel yang dianalisis dengan metode yang

digunakan. Presisi dari metode analisis dinyatakan dalam Coeffisien of Variant

(CV). Menurut Kingstone (2004), CV yang baik adalah CV ≤ 20% untuk

konsentrasi analit <0,1%b/v.

Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar kuersetin

Konsentrasi

Rerata

konsentrasi

Rerata

%IC SD % CV

Rendah 5,067 23,654 0,0051 0,781

Tengah 10,133 44,716 0,0037 0,757

Tinggi 15,267 65,506 0,0122 4,137

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukan pada tabel VII, didapat

nilai % CV 0,0781 %, 0,757 %, 4,137 % untuk tiga konsentrasi standar kuersetin

yang digunakan. Nilai ini masih masuk dalam persyaratan % CV menurut

Kingstone (2004), dimana CV yang baik adalah CV ≤ 20% dengan konsentrasi

analit <0,1%b/v.

Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat

Konsentrasi

Rerata

konsentrasi

Rerata

%IC SD % CV

Rendah 86 26,475 0,0070 1,162

Tengah 255 46,792 0,0070 1,584

Tinggi 434,4 68,380 0,0075 2,857

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukan pada tabel VIII, didapat

% CV fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dari tiga konsentrasi


46

yaitu 1,162 %, 1,584 %, 2,857 %. Nilai ini juga masih masuk dalam persyaratan

% CV menurut Kingstone (2004), dimana CV yang baik adalah CV ≤ 20% dengan

konsentrasi analit <0,1%b/v, sehingga dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan

metode analisis yang digunakan memiliki presisi yang baik.

2. Lineritas metode uji antioksidan

Linearitas merupakan suatu gambaran mengenai kemampuan suatu

prosedur analisis untuk menghasilkan hubungan yang proporsional antara

konsentrasi analit dalam sampel dengan hasil yang diberikan, baik secara

langsung atau dengan transformasi dari perhitungan matematik yang baik.

Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r). Dalam penentuan kurva

kalibrasi yang baik, konsentrasi minimal terdiri dari lima konsentrasi dengan jarak

antara 50-150%. Sedangkan menurut Chan et al., (2004), untuk koefisien korelasi

adalah 0,995 ataupun diharapkan lebih dari nilai tersebut.

Berdasarkan hasil tiga repikasi yang ditunjukan pada tabel V untuk

validasi metode analisis kuersetin, didapatkan persamaan regresi linear untuk

replikasi satu, replikasi dua dan replikasi tiga berturut-turut adalah 0,9997, 0,9998,

dan 0,9995. Dari tiga hasil tersebut nilai r yang dihasilkan masih memenuhi

persyaratan linearitas menurut Chan et al (2005), dimana minimal koefisien

korelasi linearitas yang baik minimal r = 0,995. Hal ini menunjukkan bahwa

metode yang digunakan dalam analisis kuersetin mempunyai linearitas yang baik.

Dari persamaan regresi linier fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun

dadap serep yang ditunjukan pada tabel VI, hasil dari tiga replikasi yang

dilakukan didapatkan nilai koefisien korelasi berturut-turut adalah replikasi satu r


47

= 0,9975, r = 0,9986, dan r = 0,9991. Tiga hasil ini masih diatas nilai koefisien

korelasi linearitas minimal menurut Chan et al (2005), yaitu r = 0,995. Dari hasil

tersebut dapat disimpulkan metode ini memiliki linieritas yang baik untuk

menganalisis fraksi etil asetat ekstrak daun dadap serep.

3. Spesifisitas metode uji antioksidan

Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode analisis dalam

mengukur dengan akurat respon analit dalam suatu matriks diantara komponen

potensial lainnya didalam sampel. Dalam metode analisis ini yang menggunakan

spektrofotometri visibel pada pengukuran kuersetin dan fraksi etil asetat sampel

uji, spesifikasi metode dapat dilihat dengan tidak adanya serapan dari sampel

sebelum ditambah DPPH pada panjang gelombang pengukuran yang digunakan

yaitu 515,5 nm.

Berdasarkan hasil scanning pada larutan pembanding kuersetin

(Lampiran 6c ) dan larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6e ) pada panjang

gelombang 515,5 nm tidak terdapat serapan, sehingga ketika kuersetin maupun

larutan uji fraksi etil asetat direaksikan dengan radikal DPPH maka yang terbaca

hanya absorbansi DPPH hasil reaksi. Dari hasil tersebut maka dapat disimpulkan

metode uji aktivitas antioksidan untuk kuersetin dan fraksi etil asetat memiliki

spesifitas yang baik.

Dari hasil validasi metode analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa

metode penangkapan radikal bebas DPPH oleh kuersetin dan fraksi etil asetat

ekstrak etanolik daun dadap serep sebagai antioksidan terbukti sudah baik dalam

linearitas, presisi dan spesifisitas sehingga hasil yang diperoleh dapat dipercaya.


48

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Radikal DPPH

Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji

aktivitas antioksidan. Aktivitas diukur secara spektrofotometri dengan

menghitung jumlah pengurangan intensitas warna ungu larutan DPPH yang

sebanding dengan jumlah DPPH yang beraksi dengan senyawa antioksidan.

Menurut Zuhra et al., (2008), peredaman tersebut dihasilkan oleh bereaksinya

molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang dilepaskan satu

molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil Pikril Hidrazin

dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke kuning.

Dengan adanya penangkapan radikal DPPH menyebabkan terjadinya penurunan

nilai absorbansi DPPH. Reaksi radikal DPPH terhadap senyawa fenolik adalah

sebagai berikut :

NO2

O2N

O2N

NN + AH O2N

NO2

NO2

HN N

DPPH Free RadicalDPPH Reduced Form

Phenolic Compounds

+ A

Gambar 10. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan

(Irshad et al., 2012)

Mengenai pelarut yang digunakan, dalam penelitian ini menggunakan

perlarut metanol karena menurut Molyneux (2004), telah diketahui metanol tidak

memberikan interferensi pada reaksi yang terjadi. Pada penelitian ini digunakan

kuersetin sebagai pembanding dalam uji aktivitas antioksidan. Digunakan


49

kuersetin sebagai pembanding karena kuersetin termasuk flavonoid yang telah

diketahui memiliki aktivitas antioksidan.

Gambar 11. Struktur senyawa kuersetin (Cartea, 2010)

O

OOH

HO O

OH

OH

DPPH-

O

OOH

HO O

OH

OH

DPPHH

O

OOH

HO O

OH

OH

H

O

OOH

HO O

OH

OH

O

OOH

HO O

OH

OH

DPPH-

O

OOH

HO O

OH

OH

DPPH

O

OOH

HO O

OH

OH

O

O OH

OHO

OH

HO

Kuersetin-

O

OOH

HO O

OH

OH

O

OOH

HO O

OH

OH

Gambar 12. Usulan mekanisme reaksi antara kuersetin dan radikal DPPH


50

Pada gambar 12 menunjukan reaksi kuersetin dalam peredaman radikal

DPPH yang dihasilkan oleh bereaksinya molekul DPPH dengan atom hidrogen

yang dilepaskan molekul kuersetin sebagai standar sehingga terbentuk senyawa

Difenil Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari

ungu ke kuning. Pengurangan radikal DPPH juga disebabkan reaksi terminasi

antara radikal DPPH dengan radikal kuersetin yang terbentuk.

Metode DPPH dalam analisis ini bertujuan untuk mengetahui parameter

konsentrasi yang ekivalen memberikan 50 % efek aktivitas antioksidan (IC50).

IC50 didefinisikan sebagai konsentrasi efektif larutan uji yang dapat menurunkan

50% intensitas serapan blanko dan dapat dihitung dari persamaan regresi linear

pada kurva konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak daun dadap serep terhadap persen

peredaman. Semakin kecil harga IC50 yang dihasilkan menunjukan kemampuan

menangkap radikal bebas yang semakin kuat. Persamaan regresi linier dan hasil

perhitungan % IC untuk standar kuersetin ditunjukan pada tabel IX dan gambar 13

persamaan regresi linier dan hasil perhitungan % IC untuk fraksi etil asetat

ditunjukkan pada tabel X dan gambar 14, sedangkan hasil IC50 untuk kuersetin

dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep di tunjukan pada tabel XI.


51

Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH

Replikasi

Konsentrasi

(µg/mL) % IC Persamaan regresi linier 5,2 24,246

7,8 34,687

I 10,4 44,896 y = 4,024x + 3,323

13 56,265 r=0,9997

15,8 66,589

5 22,817

7,5 33,411

II 10 44,936 y = 4,326x + 1,210

12,5 55,180 r=0,9999

15 66,007

5 23,898

7,5 35,151

III 10 44,315 y = 3,949x + 4,994

12,5 54,176 r=0,9995

15 63,921

Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin

y = 4.326x + 1.210R² = 0.9999

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5

%IC

Ku

erse

tin

Konsentrasi kuersetin (µg/mL)

Kurva konsentrasi kuersetin vs %IC Kuersetin


52

Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun

dadap serep dengan metode DPPH

Replikasi Konsentrasi (µg/mL) % IC Persamaan regresi linier

75,6 26,176

151,2 38,963

I 226,8 46,683 y = 0,141x + 16,09

302,4 59,710 r = 0,9975

378 69,240

75 28,129

150 36,710 y = 0,131x + 17,40

II 225 46,484 r = 0,9986

300 56,257

375 67,819

75 25,121

150 37,621 y = 0,141x + 15,30

III 225 47,209 r = 0,9991

300 58,131

375 68,083

Gambar 14. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil

asetat

y = 0.141x + 15.30r = 0.9991

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250 300 350 400

%IC

fra

ksi e

til a

seta

t

Konsentrasi fraksi etil asetat (µg/mL)

Kurva konsentrasi fraksi etil asetat vs %IC fraksi etil asetat


53

Tabel XI. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan Fraksi etil asetat

ekstrak etanolik daun dadap serep

Bahan Uji

IC50 (µg/mL)

Rata-rata

(µg/mL) SD % CV

Replikasi

1

Replikasi

2

Replikasi

3

Kuersetin 11,593 11,278 11,443 11,438 0,157 1,377

Fraksi etil

asetat 240,496 248,855 246,099 245,150 4,425 1,736

Dari tabel XI, nilai % CV yang dihasilkan untuk sampel kuersetin dan

fraksi etil asetat berturut-turut sebesar 1,377 % dan 1,736 %. Dari hasil tersebut

dapat dikatakan bahwa CV yang dihasilkan menurut Kingstone (2004) memenuhi

persyaratan analisis, yaitu ≤ 20%, hal ini berarti bahwa uji aktivitas antioksidan

yang dilakukan mempunyai presisi yang baik.

Berdasarkan hasil perhitungan yang ditunjukan pada tabel XI, rata-rata

IC50 kuersetin adalah 11,438 ± 0,157 µg/mL dan rata-rata IC50 fraksi etil asetat

ekstrak etanolik daun dadap serep adalah 245,150 ± 4,425 µg/mL. Dari hasil nilai

IC50 tersebut diketahui bahwa kuersetin memiliki aktivitas antioksidan lebih besar

dibandingkan dengan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

Berdasarkan tingkat kekuatan aktivitas antioksidan menurut Aryanto (2006),

kuersetin berada pada tingkat antioksidan sangat kuat (< 50 µg/mL), sedangkan

fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep pada tingkat lemah (> 150

µg/mL).


54

Tabel XII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan fraksi

etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep (Aryanto, 2006)

Intensitas Nilai IC50 Kuersetin

Fraksi etil asetat

ekstrak etanolik

Sangat kuat <50 µg/mL √

Kuat 50-100 µg/mL - -

Sedang 101-150 µg/mL - -

Lemah >150 µg/mL - √

Data hasil IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat kemudian dianalisa secara

statistik untuk melihat signifikansi data dari kuersetin dan fraksi etil asetat. Dalam

penelitian ini analisa data secara statistik menggunakan software R 2.14.1. Hal

pertama yang dilakukan adalah melakukan pengujian distribusi normal data IC50

kuersetin dan fraksi etil asetat . Hal ini dilakukan untuk mengetahui langkah

selanjutnya apakah akan menggunakan uji parametrik atau non-parametrik.

Pengujian distribusi normal data dilakukan menggunakan uji normalitas Shapiro-

wilk. Pemilihan uji normalitas Shapiro-Wilk karena menurut Dahlan (2012), jika

data yang digunakan berjumlah kurang dari lima puluh maka uji normalitas data

menggunakan uji normalitas Shapiro-wilk. Hipotesis null (Hnull) adalah data IC50

terdistribusi normal sedangkan hipotesis alternatif adalah data IC50 terdistribusi

tidak normal. Berdasarkan hasil yang diperoleh nilai P untuk IC50 kuersetin dan

fraksi etil asetat berturut-turut sebesar 0,9488 dan 0,6291. Nilai signifikansi yang

diperoleh untuk kuersetin dan fraksi etil asetat lebih besar dari nilai signifikansi

0,05 (taraf kepercayaan 95%), oleh karena itu Hnull diterima. Dari hasil tersebut

dapat disimpulkan data IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat terdistribusi normal.

Dari hasil analisis data yang secara statistik diketahui terdistribusi

normal, maka langkah selanjutnya melakukan uji parametrik, yaitu uji T tidak


55

berpasangan. Hipotesis null (Hnull) adalah nilai IC50 kuersetin tidak lebih kecil

daripada fraksi etil asetat dan hipotesis alternatif yang digunakan adalah nilai IC50

kuersetin lebih kecil daripada fraksi etil asetat. Hasil pengujian statistik diperoleh

nilai signifikansi sebesar 0,000 antara kuersetin dan fraksi etil asetat. Dari hasil

yang diperoleh jika dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan, yaitu

0,05 maka Hnull ditolak karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih kecil

daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Dari hasil tersebut, dapat disimpulkan

bahwa nilai IC50 kuersetin lebih kecil daripada fraksi etil asetat.

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan operating time (OT) dilakukan dengan mengukur absorbansi

tiap 5 menit dalam rentang waktu 30 menit. OT merupakan waktu dimana reaksi

yang terjadi antara asam galat dan reagen Folin-Ciocalteu sudah optimal yang

ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil.


56

Gambar 15. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukkan pada grafik

penentuan OT asam galat menunjukan dari menit ke-10 sampai ke-30 absorbansi

senyawa hasil reaksi asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu terbentuk secara

stabil. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa OT penetapan kandungan

fenolik total adalah 10 menit.

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Panjang gelombang maksimum ditentukan untuk mendapatkan serapan

maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu.

Menurut Gansch, Weber, dan Lee (2009), panjang gelombang maksimum untuk

hasil reaksi Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenolik adalah 750-765. Penentuan

panjang gelombang maksimum dilakukan dengan melakukan scanning pada

panjang gelombang 600-800 nm pada tiga konsentrasi larutan asam galat

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 10 20 30 40

50 ppm

100 ppm

150 ppm

Operating Time Asam Galat

Waktu (menit)

Ab

sorb

ansi


57

Tabel XIII. Hasil scanning panjang gelombang maksimum

Konsentrasi larutan

Asam galat

λ maks

hasil scanning

λ maks

rata-rata

λ maks

teoritis

150 µg/mL 754 750,3

750 100 µg/mL 744

50 µg/mL 753

Hasil Scanning tiga konsentrasi asam galat yang sudah direaksikan

dengan pereaksi Folin-Ciocalteu didapatkan hasil panjang gelombang maksimum

rata-rata adalah 750 nm. Oleh karena itu dalam menentukan kandungan fenolik

total menggunakan panjang gelombang 750 nm.

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total

Validasi metode penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan

analisis presisi, linearitas dan spesifisitas dari tiga replikasi larutan baku asam

galat yang digunakan.

1. Presisi metode penetapan kadar kandungan fenolik total

Presisi metode analisis dinyatakan dengan koefisien variasi atau CV.

Menurut Harmita (2004), kadar analir sekitar 100 ppm CV kurang dari 5 % dapat

dikatakan metode tersebut memberikan presisi yang baik. Dari ketiga tingkat

konsentrasi yang dibuat, nilai % CV yang dibuat masuk dalam % CV yang

dipersyaratkan sehingga metode ini dapat dikatakan memilki presisi yang baik.


58

Tabel XIV. Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter

Sampel rata-rata

absorbansi SD %CV

Seri 1 0,328 0,01 2,940

Seri 2 0,446 0,006 1,400

Seri 3 0,554 0,01 1,854

Seri 4 0,660 0,013 1,97

Seri 5 0,773 0,015 1,992

2. Linieritas metode penetapan kandungan fenolik total

Linieritas merupakan kemampuan dari suatu metode untuk mendapatkan

hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran

yang ditentukan. Pada persamaan regresi linear yang didapat dari tiga replikasi

asam galat adalah replikasi satu sebesar 0,9993, replikasi dua sebesar 0,9995 dan

replikasi tiga sebesar 0,9999. Menurut Harmita (2004), persyaratan linearitas yang

baik jika nilai r lebih besar atau mendekati 0,999, maka dapat dikatakan bahwa

kurva baku memenuhi persyaratan linearitas.

Tabel XV. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang direaksikan dengan

pereaksi Folin-Ciocalteu

Asam galat


Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

terukur

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

terukur

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

terukur

50 0,321 49,8 0,324 51 0,339

75 0,444 74,7 0,453 76,5 0,441

100 0,545 99,6 0,565 102 0,551

125 0,652 124,5 0,675 127,5 0,653

150 0,777 149,4 0,786 153 0,756

y = 0,004x + 0,0998

r= -0,9993

y = 0,004x + 0,1022

r = 0,9995

y = 0,004x + 0,1296

r = 0,9999


59

3. Spesifisitas metode penetapan kandungan fenolik total

Berdasarkan hasil scanning pada larutan asam galat (Lampiran 12) dan

fraksi etil asetat pada panjang gelombang 750 nm tidak terdapat serapan. Hal ini

berarti bahwa hanya hasil reaksi asam galat atau fraksi etil asetat dengan pereaksi

Folin-Ciocalteau saja yang terbaca pada panjang gelombang 750 nm tanpa adanya

respon pembacaan absorbansi dari senyawa lain. Oleh karena itu, metode

penetapan kandungan fenolik total untuk asam galat dan fraksi etil asetat ekstrak

etanolik daun dadap serep memiliki spesifisitas yang baik.

J. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total

Penetapan kandungan fenolik total dalam penelitian ini dilakukan secara

spektrofotometri dengan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu menggunakan

asam galat sebagai pembanding. Menurut Cicco dan Lattanzio (2011), metode

Folin-Ciocalteu (F-C) merupakan metode kolorimetri yang sering digunakan yang

berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan senyawa

alkali, umumnya menggunakan natrium karbonat, yang akan menghasilkan ion

fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk mereduksi kompleks

fosfotungstat-fosfomolibdat warna kuning F-C menjadi berwarna kompleks

berwarna biru, yang dapat diukur secara spektrofotometri. Semakin besar

konsentrasi senyawa fenol maka semakin banyak ion fenolat yang akan mereduksi

kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat sehingga warna biru yang dihasilkan

semakin pekat.


60

H3PO4(MoO3)12+

OH

+ H2O

O

O

kuinon

H2(PMo12O12)

atau

H7(PMo12O10)

+

Kompleks molybdenum-blue

Senyawa fenolreagen Folin-Ciocalteu

Gambar 16. Reaksi pembentukan kompleks molybdenum-blue (Singleton dan

Rossi, 1965)

Gambar 17. Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total

Tabel XVI. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak

etanolik daun dadap serep

Sampel Kandungan fenolik

total rata-rata SD CV

Replikasi 1 8,30

8,507 0,183 2,156 Replikasi 2 8,57

Replikasi 3 8,65

y = 0.004x + 0.129r = 0.9999

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 50 100 150 200

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi asam galat (µg/mL)

Kurva persamaan regresi linear

regresi linear asam galat

Linear (regresi linear asam galat)


61

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukan pada gambar 17,

didapat persamaan regresi linear replikasi tiga yaitu y = 0,004x + 0,129 dengan r =

0,9999. Persamaan ini dipilih karena merupakaan persamaan regresi linear yang

memiliki nilai r paling mendekati 1. Dari hasil perhitungan didapatkan hasil

kandungan fenolik total rata-rata pada sampel sebesar 8,507 ± 0,183 mg ekivalen

asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.


62

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep

dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan sebagai IC50 rata-rata

sebesar 245,15 ± 4,425 µg/mL dan metode yang digunakan belum tervalidasi.

2. Kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap

serep yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat rata-rata sebesar

8,51 ± 0,18 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanolik

daun dadap serep dan metode yang digunakan belum tervalidasi.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian aktivitas antioksidan dari fraksi air ekstrak etanolik

daun dadap serep untuk melihat potensi aktivitas antioksidan dari fraksi air

tersebut.

2. Perlu dilakukan penelitian untuk melihat potensi aktivitas lainnya (seperti

aktivitas antibakteri) dari daun tanaman dadap serep.


63

Daftar Pustaka

Anonim, 2007, PROSEA Plant Resources of South-East Asia 11 Auxiliary plants,

LIPI Press, Jakarta, pp.127-130

APVMA, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical Methods for Active

Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products , Kingston

Ariyanto,R., 2006, Uji Aktivitas antioksidan, Penentuan Kandungan Fenolik dan

Flavonoid Total Fraksi Kloroform dan Fraksi Air Ekstrak Metanolik

Pegagan (Centella asiatica L. Urban), Skripsi, Universitas Gadjah Mada

Atawodi, S.E., 2005, Antioxidant potential of African medicinal plants, Afr. J.

Biotechnol, Vol. 4 (2), 128

Backer CA, dan Bakhuizen van den Brink RC, 1965. Flora of Java, Vol. 2.

Noordhoff, Groningen, The Netherland, pp. 626–628

Bondet, V., Brand-Williams, W. and Berset, C., 1996, Kinetics and Mechanisms

of Antioxidant Activity using the DPPH• Free Radical Method, Lebensm.-

Wiss. U.-Technol., vol. 30, 609–615

Cartea, M.E., Francisco, M., Soengas, P., and Velasco, P., 2010, Phenolic

Compounds in Brassica Vegetables, Molecules, 16, 251-280

Chan, Chung Chow, Lam, Herman, Lee, and Y.C., Zhang, Xue-Ming, 2004,

Analtytical Method Validation and Instrument Performance Verification,

Jhon Wiley and Sons, Inc., New Jersey

Cicco, N., and Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate

Concentration on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination

of Phenolics with Low Concentration in the Presence of Methanol: A

Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, American Journal

of Analytical Chemistry,840-844

Dahlan, M.S., 2012, Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika,

Jakarta, pp. 37, 42-49

Depkes RI, 1986, Sediaan Galenik, Departemen kesehatan Republik Indonesia,

Jakarta, pp. 2, 10-13

Desmiaty, Y., Julia, R., Ika, R., 2008, Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas

Daun Cerme (Phyllanthus acidus (L.) Skeels), Jurnal Farmasi Indonesia,

70 – 74

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986, Sediaan Galenik,

Jilid 2, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 11-12

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope

Indonesia, edisi 4, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.

1036, 1061

Estrada, E.I., 2010, Actividad Antioxidante De Alcaloides De Erythrina

Americana Miller, Tesis, Campus Montecillo, Mexico


64

Fu, L., Xu, B.T., Gan, R.Y., Zhang, Y., Xu, X.R., Xia, E.Q., and Li, H.B., 2011,

Total Phenolic Contents and Antioxidant Capacities of Herbal and Tea

Infusions, Int. J. Mol. Sci., 12, 2112-2124

Gandjar, I. G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, PP: 46-48, 465-472

Gansch, H., Weber, C.A., and Lee, C.Y., 2009, Antioxidant Capacity and

Phenolic Phytochemicals in Black Raspberries, New York Fruit Quarterly,

17(1), 19-21

Harborne, J.B., 1998, Phytochemical Methods : a guide to modern techniques of

plant analysis, Third edition, Chapman & Hall, London, pp 4-6

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan,

Ed. 2, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, 47-

109

Harmita, 2004, Majalah Ilmu Kefarmasian Vol.I, No.3: Petunjuk Pelaksanaan

Validasi Metode dan Cara, Departemen Farmasi FMIPA UI, Jakarta, pp.

117-135

Irshad, Md., Zafaryab, Md., Singh, M., and Rizvi, M.M.A., 2012, Comparative

Analysis of the Antioxidant Activity of Cassia fistula Extracts,

Int.J.Med.Chem., Volume 2012, 1-6

Josephy, P.D., 1997, Molecular Toxicology, Oxford University Press, New York,

pp. 44-103

Kingston, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical methods for Active

Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products, Australian

Pesticides and Veterinary Medicines Authority

Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl

(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J.

Sci.Technol., 26(2), 211-219

Mustarichie, R., Moektiwardoyo, M., Levita, J., Supriyatna, Muhtadi, A.,

Subarnas, A., and Udin, L.Z., 2012, The Research Evidence of Antioxidant

and Anti-Cancer Activity of Genistein Content In The Indonesia

Traditional Food (Oncom) Ethanol Extract, Int. Res J Pharm. App Sci.,

2(5), 65-73

Prakash, Aruna Ph. D., 2001, Antioxidant Activity, takes you into the Heart of a

Giant Resource Volume 19 Number 2, 1,2

Purwanto, I., 2007, Mengenal Lebih Dekat Leguminosae, Kanisius, Yogyakarta,

pp. 77-78

Qader, S.W., Abdulla M.A., Chua L.S., Najim N., Zain M.M., and Hamdan S., 2011,

Antioxidant, Total Phenolic Content and Cytotoxicity Evaluation of

Selected Malaysian Plants, Molecules, 3434


65

Raaman, N., 2006, Phytochemical Techniques, New India Publishing Agency,

New Delhi, pp. 10-11

Rasooli, I., 2011, Bioactive Compounds in Phytomedicine, InTech, Croatia, pp.

163-179

Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, edisi keenam,

penerbit ITB, Bandung, pp. 191-209

Rollando, 2012, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-

Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Air

Ekstrak Metanol Daun Sirih (Piper Betle L.), Skripsi, 27-34, Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Rukachaisirikul, T., Innok, P., Aroonrerk, N., Boonamnuaylap, W., Limrangsun,

S., Boonanyon, C., Woonjina, U., Suksamrarn, A., 2007, Antibacterial

Pterocarpans From Erythrina subumbrans, J.Ethnopharmacol., 110, 171-

175

Samanta, A., Das, G., Das, S.K., 2011, Roles of Flavonoids in Plants, Int J Pharm

Sci Tech, Vol-6, 12-28

Sapakal V. D., Shikalgar T. S., Ghadge R. V., Adnaik R.S., Naikwade N. S.,

Magdum C. S. 2008, In Vivo Screening of Antioxidant Profile : a review,

Journal of Herbal Medicine and Toxicology, 1-2

Silalahi, J., 2006, Makanan Fungsional, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, p. 41

Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolic with

Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16,

147

Snyder L.R., and Kirkland J.J,1997, Practical HPLC Method Development, 2nd

Ed, John Wiley and sons

United States Department of Agriculture (USDA), 2011, Natural Resources

Conservation Service,http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=ERSU15,

diakses tanggal 3 Februari 2013

Wangcharoen, W. dan Morasuk, W., 2007a, Antioxidant Capacity and Phenolic

content of Some Thai Culinary Plants, Mj. Int. J.Sci.Tech., 01(02), 100-

106

World Health Organization, 2003, WHO guidelines on good agricultural and

collection practices (GACP) for medicinal plants, World Health

Organization, Geneva, pp. 13-16, 55-60

Zuhra, C.F., Tarigan, J., dan Sihotang, H., 2008, Aktivitas Antioksidan Senyawa

Flavonoid dari Daun Katuk (Sauropus androgunus (L) Merr.), Jurnal

Biologi Sumatera, pp. 7 – 10


http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=ERSU15

66

LAMPIRAN

Lampiran 1.Surat determinasi tanaman dadap serep


67

Lampiran 2. Gambar tanaman dadap serep dari kebun tanaman obat

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma


68

Lampiran 3. Perhitungan rendemen

Cawan1

(g)

Cawan 2

(g)

Cawan 3

(g)

Bobot cawan 59,1322 59,4312 59,2913

Bobot

cawan+ekstrak

64,3125 63,7355 64,0414

Bobot ekstrak 5,1803 4,3043 4,7501

Total bobot ekstrak 14,2347

Bobot serbuk daun dadap yang digunakan = 100 g

Bobot total ekstrak etanol = 14,2347 g

Rendemen ekstrak etanol = 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙

𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑒𝑟𝑏𝑢𝑘 𝑑𝑎𝑢𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛 x 100%

= 14,2347 𝑔

100 𝑔 x 100%

= 14,2347 %

Bobot fraksi etil asetat = 0,4238 g

Rendemen fraksi etil asetat = 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖

𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑒𝑟𝑏𝑢𝑘 𝑑𝑎𝑢𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛 x 100%

= 0,4238

100 x 100%

= 0,4238 %


69

Lampiran 4. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan

a. Penimbangan DPPH

Replikasi 1 (g) Repilkasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Bobot kertas 0,2123 0,2129 0,2130

Bobot kertas + DPPH 0,2279 0,2286 0,2289

Bobot kertas + sisa 0,2123 0,2129 0,2130

Bobot DPPH 0,0156 0,0157 0,0159

b. Penimbangan Kuersetin

Replikasi 1

(g)

Repilkasi 2

(g)

Replikasi 3

(g)

Bobot kertas 0,2347 0,2326 0,2439

Bobot kertas + kuersetin 0,2373 0,2352 0,2465

Bobot kertas + sisa 0,2348 0,2327 0,2439

Bobot zat 0,0025 0,0025 0,0026

c. Penimbangan sampel uji

Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Bobot cawan 14,5897 14,114 14,1086

Bobot cawan + fraksi 14,6025 14,1266 14,1211

Bobot cawan + sisa 14,5899 14,1141 14,1086

Bobot zat 0,0126 0,0125 0,0125


70

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi pengujian aktivitas antioksidan

a. Konsentrasi DPPH

Replikasi 1

BM = 394,33

Mol = massa

BM =

15,6 mg

394,33 = 0,0395 mmol

M = mol

volume =

0,0395 mmol

0,1 L = 0,395 mM

Replikasi 2

BM = 394,33

Mol = massa

BM =

15,7 mg

394,33 = 0,0398 mmol

M = mol

volume =

0,0398 mmol

0,1 L = 0,398 mM

Replikasi 3

BM = 394,33

Mol = massa

BM =

15,9 mg

394,33 = 0,0403 mmol

M = mol

volume =

0,0403 mmol

0,1 L = 0,403 mM

b. Konsentrasi Kuersetin

Kosentrasi larutan induk


2,5 mg

10 mL = 250 µg/mL

2,5 mg

10 mL = 250 µg/mL

2,6 mg

10 mL = 260 µg/mL

Konsentrasi seri larutan pembanding kuersetin

Seri larutan pembanding Konsentrasi larutan pembanding


Seri 1 5 µg/ml 5 µg/ml 5,2 µg/ml

Seri 2 7,5 µg/ml 7,5 µg/ml 7,8 µg/ml


Seri 4 12,5 µg/ml 12,5 µg/ml 13 µg/ml



71

Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding (Replikasi 1)

Larutan induk = 250 µg/mL

Konsentrasi larutan pembanding (seri 1) =

C1 x V1 = C2 x V2

250 µg/mL x 0,2 mL = C2 x 10 mL

C2 = 5 µg/mL

b. Konsentrasi sampel uji fraksi etil asetat

Konsentrasi larutan induk


12,6 mg

25 mL = 504 µg/mL

12,5 mg

25 mL = 500 µg/mL

12,5 mg

25 mL = 500 µg/mL

Konsentrasi seri larutan uji fraksti etil asetat

Seri larutan uji

Konsentrasi larutan sampel (µg/mL)

Replikasi

1

Replikasi 2 Replikasi 3

Seri 1 75,6 75 75

Seri 2 151,2 150 150

Seri 3 226,8 225 225

Seri 4 302,4 300 300

Seri 5 378 375 375

Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding (Replikasi 2)

Larutan induk = 500 µg/mL

Konsentrasi larutan sampel uji (seri 1) =

C1 x V1 = C2 x V2

500 µg/mL x 1,5 mL = C2 x 10 mL

C2 = 75 µg/mL


72

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi

a. Scanning metanol

b. Scanning metanol : air (1:1 v/v)


73

c. Scanning Kuersetin

d. Scanning asam galat


74

e. Scanning fraksi etil asetat (400-600 nm)

f. Scanning fraksi etil asetat (600-800 nm)


75

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan Operating Time

1. Penetuan OT kuersetin

OT yang didapat 30 menit

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 517 nm

5 µg/mL 10 µg/mL 15 µg/mL

5 0,665 0,551 0,371

10 0,653 0,536 0,35

15 0,645 0,523 0,333

20 0,638 O,51 0,317

25 0,634 0,499 0,308

30 0,633 0,494 0,303

35 0,632 0,494 0,303

40 0,632 0,494 0,303

45 0,632 0,494 0,303

50 0,631 0,494 0,302

55 0,631 0,494 0,302

60 0,631 0,494 0,302

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 517 nm


5 0,623 0,492 0,306

10 0,612 0,476 0,284

15 0,602 0,465 0,272

20 0,597 0,455 0,26

25 0,594 0,448 0,251

30 0,592 0,441 0,243

35 0,592 0,441 0,243

40 0,592 0,441 0,243

45 0,592 0,441 0,243


76


2. Penetuan OT fraksi etil asetat daun dadap serep

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 517,0 nm


5 0,662 0,380 0,264

10 0,645 0,361 0,248

15 0,627 0,354 0,234

20 0,618 0,348 0,225

25 0,613 0,343 0,219

30 0,609 0,338 0,215

35 0,609 0,338 0,215

40 0,609 0,338 0,215

45 0,609 0,338 0,215

50 0,609 0,338 0,215

55 0,609 0,338 0,214

60 0,609 0,338 0,214


50 0,592 0,440 0,243

55 0,592 0,440 0,242

60 0,592 0,440 0,242

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 517 nm


5 0,650 0,483 0,335

10 0,629 0,462 0,312

15 0,621 0,446 0,291

20 0,616 0,435 0,274

25 0,613 0,426 0,261

30 0,61 0,42 0,252

35 0,61 0,42 0,252

40 0,61 0,42 0,252

45 0,61 0,42 0,251

50 0,61 0,419 0,251

55 0,609 0,419 0,251

60 0,609 0,419 0,251


77

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 517 nm


5 0,616 0,398 0,335

10 0,604 0,370 0,311

15 0,595 0,352 0,293

20 0,588 0,341 0,279

25 0,585 0,333 0,272

30 0,582 0,327 0,267

35 0,582 0,327 0,267

40 0,582 0,327 0,267

45 0,582 0,327 0,267

50 0,582 0,327 0,266

55 0,582 0,327 0,266

60 0,582 0,326 0,266


Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 517 nm


5 0,659 0,455 0,330

10 0,637 0,438 0,301

15 0,626 0,424 0,277

20 0,619 0,413 0,258

25 0,615 0,409 0,247

30 0,613 0,406 0,243

35 0,613 0,406 0,243

40 0,613 0,406 0,243

45 0,613 0,406 0,243

50 0,613 0,406 0,242

55 0,613 0,405 0,242

60 0,613 0,405 0,242



78

b. Penentuan λ maksimum

1. Scanning DPPH 0,020 mM


79

2. Spektra DPPH 0,04 mM


80

3. Spektra DPPH 0,08 mM


81

4. Plot scanning λ maksimum

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH

% IC = Absorbansi (larutan kontrol) – Absorbansi sampel (larutan pembanding/uji) X 100%

Absorbansi larutan control

a. Kuersetin

Replikasi

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

Absorbansi

larutan

pembanding % IC

Persamaan regresi

linier

5,2

0,653 24,2459

7,8

0,563 34,6868

I 10,4 0,862 0,475 44,8956 y = 4,024x + 3,323

13

0,377 56,2645 r=0,9997

15,8

0,288 66,5893


82

Konsentrasi 5 ,2 µg/mL

% IC = 0,862−0.653

0,862 𝑥 100 % = 24,2459%

Konsentrasi 7,8 µg/mL

% IC = 0,862−0.563

0,862 𝑥 100 % = 34,6868%


% IC = 0,862−0.475

0,862 𝑥 100 % = 44,8956%

Konsentrasi 13µg/mL

% IC = 0,862−0.377

0,862 𝑥 100 % = 56,2645%


% IC = 0,862−0.288

0,862 𝑥 100 % = 66,5893%

Replikasi

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

Absorbansi

larutan

pembanding % IC

Persamaan regresi

linier

5

0,663 22,8172

7,5 0,859 0,572 33,4109

II 10

0,473 44,9360 y = 4,326x + 1,210

12,5

0,385 55,1804 r=0,9999

15

0,292 66,0070

Replikasi

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

Absorbansi

larutan

pembanding % IC

Persamaan regresi

linier

5

0,656 23,8979

7,5 0,862 0,559 35,1508

III 10

0,480 44,3155 y = 3,962x + 4,663

12,5

0,395 54,1763 r=0,9995

15

0,311 63,9211


83

b. fraksi etil asetat daun dadap serep

Replikasi Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

Absorbansi

larutan sampel

uji

% IC Persamaan

regresi linier

75,6

0,829

0,612 26,1761

y = 0,141x +

16,09

r = 0,9975

151,2 0,506 38,9626

I 226,8 0,442 46,6828

302,4 0,334 59,7105

378 0,255 69,24


% IC = 0,829−0.612

0,829 𝑥 100 % = 26,1761 %


% IC = 0,829−0.506

0,829 𝑥 100 % = 38,9626 %


% IC = 0,829−0.442

0,829 𝑥 100 % = 46,6828 %


% IC = 0,829−0.334

0,829 𝑥 100 % = 59,7105 %

Konsentrasi 378 µg/mL

% IC = 0,829−0.255

0,829 𝑥 100 % = 69,24 %


(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

Absorbansi

larutan

sampel uji

% IC Persamaan

regresi linier

75

0,839

0,603 28,1287

y = 0,131x +

17,40

r = 0,9986

150 0,531 36,7104

II 225 0,449 46,4839

300 0,367 56,2574

375 0,27 67,8188


84


(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

Absorbansi

larutan

sampel uji

% IC Persamaan

regresi linier

75

0,824

0,617 25,1214

y = 0,141x +

15,30

r = 0,9991

150 0,514 37,6214

III 225 0,435 47,2087

300 0,345 58,1311

375 0,263 68,0825

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi air ekstrak metanol

daun dadap serep

a. Kuersetin

Replikasi I

Persamaan regresi linier : y = 4,024x + 3,323

( y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL)

IC50 adalah nilai x saat y = 50

50 = 4,024x + 3,323

x = 50−3,323

4,024= 11,5929µg/mL

Replikasi Persamaan IC50 (µg/mL)

II y = 4,326x + 1,210 11,2783

III y = 3,949x + 4,994 11,4429

b. Fraksi etil asetat daun dadap serep

Replikasi I

Persamaan regresi linier : y = 0,141x + 16,09

( y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL)

IC50 adalah nilai x saat y = 50

50 = 0,141x + 16,09

x = 50−16,09

0,141= 240,4965 µg/mL


85

Replikasi Persamaan IC50

(µg/mL)

II y = 0,131x + 17,40 248,855

III y = 0,141x + 15,30 246,0993

Lampiran 10. Penimbangan bahan pengujian kandungan fenolik total

a. Data penimbangan asam galat


Bobot Kertas 0,2246 0,2268 0,2431

Bobot Kertas + zat 0,2496 0,2519 0,2689

Bobot sisa 0,2246 0,227 0,2434

Bobot zat 0,0250 0,0249 0,0255

b. Data penimbangan fraksi etil asetat


Bobot cawan 14,5925 14,1172 14,2864

Bobot cawan + fraksi 14,5975 14,1224 14,2915

Bobot cawan + sisa 14,5925 14,1174 14,2865

Bobot zat 0,005 0,005 0,005

Lampiran 11. Perhitungan konsentrasi pengujian fenolik total

a. Konsentrasi asam galat

Kosentrasi larutan induk


25,2 mg

10 mL = 2500 µg/mL

24,9 mg

10 mL = 2490 µg/mL

25,5 mg

10 mL = 2550 µg/mL

Kosentrasi larutan intermediet

Replikasi 1 Replikasi 2

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

2500 µg/mL x 5 mL = C2 x 25 ml 2490 µg/mL x 5 mL = C2 x 25 mL

C2 = 500 µg/mL C2 = 498 µg/mL

Replikasi 3

C1.V1 = C2.V2


86

2550 µg/mL x 5 mL = C2 x 25 mL

C2 = 510 µg/mL

Konsentrasi seri larutan asam galat

Replikasi 1 (500 µg/mL)

Seri 1 Seri 2 Seri 3

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

500 µg/mL.1 = C2. 10 500 µg/mL.1,5 = C2. 10 500 µg/mL.2 = C2. 10

C2 = 50 µg/mL C2 = 75 µg/mL C2 =100 µg/mL

Seri 4 Seri 5

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

500 µg/mL.2,5 = C2. 10 500 µg/mL.3 = C2. 10

C2 =125 µg/mL C2 =150 µg/mL



C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2


C2 = 49,8 µg/mL C2 = 74,7 µg/mL C2 = 99,6 µg/mL

Seri 4 Seri 5

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

498 µg/mL.2,5 = C2. 10 498 µg/mL.3 = C2. 10

C2 = 124,5 µg/mL C2 = 149,4 µg/mL


87



C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2


C2 = 51 µg/mL C2 = 76,5 µg/mL C2 = 102 µg/mL

Seri 4 Seri 5

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

510 µg/mL.2,5 = C2. 10 510 µg/mL.3 = C2. 10

C2 = 127,5 µg/mL C2 = 153 µg/mL

Konsentrasi Larutan Asam Galat (µg/mL) Absorbansi

Seri larutan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 R1 R2 R3

Seri 1 50 49,8 51 0,321 0,324 0,339

Seri 2 75 74,7 76,5 0,444 0,453 0,441

Seri 3 100 99,6 102 0,545 0,565 0,551

Seri 4 125 124,5 127,5 0,652 0,675 0,653

Seri 5 150 149,4 153 0,777 0,786 0,756


88

Lampiran 12. Scanning kontrol asam galat

Lampiran 13. Optimasi penentuan kandungan fenolik total

a. Penentuan Operating Time

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 750,0 nm


5 0,314 0,504 0,764

10 0,325 0,524 0,796

15 0,325 0,525 0,796

20 0,325 0,525 0,796

25 0,325 0,525 0,796

30 0,325 0,526 0,797



89

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 750,0 nm


5 0,296 0,522 0,727

10 0,303 0,548 0,758

15 0,306 0,548 0,759

20 0,306 0,548 0,759

25 0,306 0,548 0,76

30 0,306 0,548 0,76


Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 750,0 nm


5 0,309 0,547 0,759

10 0,327 0,584 0,791

15 0,328 0,584 0,791

20 0,328 0,584 0,792

25 0,328 0,584 0,792

30 0,328 0,584 0,792



90

b. Penentuan λ maksimum

1. Spektra asam galat 50 μg/mL


91



92



93

Lampiran 14. Perhitungan kandungan fenolik total

Sampel replikasi 1

Absorbansi sampel = 0,461

y = 0,004x + 0,129

0,461 = 0,004x + 0,129

x = 0,461− 0,129

0,004 = 83 µg/mL

Kandungan fenolik total = x . v

m = 0,083 mg/mL.

0,5 mL

0,005 g

= 8,3 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

Sampel replikasi 2


y = 0,004x + 0,129

0,472 = 0,004x + 0,129

x = 0,472− 0,129

0,004 = 85,75 µg/mL


m = 0,0857 mg/mL.

0,5 mL

0,005 g


Sampel replikasi 3


y = 0.004x + 0.129

0,475 = 0.004x + 0.129

x = 0,475− 0,129

0,004 = 86,5 µg/mL


m = 0,0865 mg/mL.

0,5 mL

0,005 g



94

Lampiran 15. Hasil pengujian statistik dengan software R 2.14.1

a. Uji normalitas

b. Uji T tidak berpasangan


95

BIOGRAFI PENULIS

Aldo Kristian, penulis skripsi dengan judul UJI

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN

METODE DPPH DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL

ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP

SEREP (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.),

dilahirkan di kota Pontianak 20 Desember 1991 dari

pasangan Bapak Yosep Puna S,Pd dan Ibu Magdalena.

Penulis telah menyelesaikan pendidikan di SD N 17 Pontianak pada tahun 1997

hingga 2003 lalu melanjutkan pendidikan menengah di SMP Santo Fransiskus

Asisi Pontianak pada tahun 2003 hingga 2006. Penulis kemudian melanjutkan

pendidikan di SMA N 5 Pontianak pada tahun 2006 hingga 2009 dan melanjutkan

pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada

tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis aktif mengikuti berbagai

kepanitian acara seperti acara Pharmacy Performance and Event Cup (2010) dan

Temu alumni akbar (2012). Selain kegiatan dalam lingkungan kampus, penulis

juga pernah menjadi relawan dalam pendataan demografis wilayah rawan bencana

merapi yang diselenggarakan oleh United Nations Development Programme

(UNDP) pada tahun 2012.


PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI · mengandung enzim-enzim yang berperan sebagai...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI · mengandung enzim-enzim yang berperan sebagai...