EKSPLORASI, ISOLASI DAN IDENTIFIKASI AGEN HAYATIEXPLORATION, ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BIOLOGICAL AGENTSElvina Sari, 4442120791LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIANUNIVERSITAS SULTAN AGENG TIRTAYASAABSTRAK Isolasi agen hayati berupa mikroorganisme dapat didefinisikan sebagai proses pengambilan mikroorganisme dari lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu media biakan di laboratorium. Media biakan merupakan suatu media yang digunakan untuk menumbuhkan jasad renik di laboratorium. Potato Dextrose Agar ( PDA ) merupakan media yang baik digunakan untuk membiakkan suatu mikroorganisme khususnya cendawan, sedangkan Nutrient Agar (NA) adalah media yang baik digunakan untuk membiakkan suatu mikroorganisme khususnya bakteri. Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa dapat melakukan ekplorasi, isolasi serta identifikasi agen hayati. Pada praktikum ini dilakukan tiga isolasi yaitu, isolasi pada serangga (belalang) yang terserang penyakit , sampel tanah perakaran bambu dan daun jambu biji yang terserang penyakit. Hasil praktikum menunjukkan bahwa isolasi sampel tanah perakaran bambu dan daun jambu biji yang terserang penyakit dalam media PDA (Potato Dextrose Agar) setelah satu minggu diidentifikasi mengalami kontaminasi berupa media menjadi berlendir, baunya menyengat dan terdapat koloni cendawan yang diduga merupakan koloni cendawan Penicillium sp. dan Colletotrichum gloeosporioides. Isolasi pada serangga (belalang) yang terserang penyakit dalam media NA (Nutrient Agar) setelah satu minggu diidentifikasi mengalami kontaminasi berupa media menjadi berlendir, baunya menyengat dan terdapat koloni bakteri yang diduga merupakan koloni bakteri Bacillus cereus.Kata Kunci : Eksplorasi, isolasi, identifikasi, Bacillus cereus , Colletotrichum gloeosporioides, Penicillium sp.

2

PENDAHULUAN Agen hayati atau sering disebut agen pengendali hayati ( Biological Control Agens ) adalah setiap organisme yang dalam semua tahap perkembangannya dapat dipergunakan untuk keperluan pengendalian hama dan penyakit ataupun organisme pengganggu tumbuhan dalam proses produksi , pengolahan hasil pertanian dan juga berbagai keperluannya. Jenis organisme yang termasuk agen hayati yaitu spesies, subspecies, varietas, semua jenis serangga (insect), nematode , protozoa, mikroorganisme seperti, bakteri, virus, mikoplasma, cendawan atau jamur. Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan bantuan manusia yaitu melalui teknik isolasi. Menurut Dwidjoseputro (2003), isolasi agen hayati berupa mikroorganisme seperti bakteri atau cendawan mengandung definisi sebagai proses pengambilan mikroorganisme dari lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu medium di laboratorium. Prinsip kerja isolasi mikroorganisme cukup sederhana yaitu dengan cara menginokulasikan sejumlah (kecil atau sedikit) mikroorganisme pada suatu medium tertentu yang dapat menyusun kehidupan mikroorganisme. Sejumlah mikroorganisme tersebut didapat dari bermacam-macam tempat tergantung dari tujuan inokulasi. Proses isolasi ini menjadi penting dalam mempelajari identifikasi mikroorganisme seperti bakteri ataupun jamur yang termasuk dalam agen hayati. Identifikasi agen hayati (mikroorganisme) yaitu untuk mengetahui sifat-sifat morfologi mikroorganisme tersebut. Pemeriksaan morfologi mikroorganisme ini perlu, untuk mengenal jenis mikroorganisme. Disamping itu juga perlu pengenalan sifat-sifat fisiologisnya bahkan sifat-sifat fisiologis ini kebanyakan merupakan faktor penentu dalam mengenal atau mengetahui nama spesies mikroorganisme. Sedangkan yang dimaksud dengan konfirmasi jenis mikroorganisme yaitu merupakan tindakan untuk mengetahui suatu mikroorganisme tertentu apakah benar-benar tumbuh pada media spesifik (biakan) yang digunakan (Waluyo, 2005). Media spesifik (biakan) yaitu media yang digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba atau mikroorganisme khusus. Media spesifik (biakan) ini beraneka ragam komposisinya tergantung nutrisi apa yang diperlukan atau dibutuhkan oleh mikroorganisme tersebut. Untuk menelaah mikroorganisme di dalam laboratorium ,pertama- tama kita harus dapat menumbuhkan mikroorganisme tersebut di dalam suatu biakan murni. Pada umumnya media biakan yang digunakan untuk mengembangbiakkan mikroorganisme mengandung air, sumber energy seperti protein dan karbohidrat, zat hara (sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan hidrogen), serta faktor penunjang pertumbuhan seperti asam amino dan vitamin. Suatu media biakan yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan melakukan aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroba tertentu (Djafaruddin, 2008). Contoh media biakan yang digunakan untuk mengembangbiakkan mikroba atau mikroorganisme adalah media PDA dan media NA. Potato Dextrose Agar atau disingkat PDA merupakan media yang sangat umum diperrgunakan sebagai tempat untuk membiakan dan menumbuhkan jamur dan khamir. Selain itu media PDA dapat dimamfaatkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme menggunakan metode Total Plate Count. Komposisi Potato Dextrose Agar ini terdiri dari bubuk kentang, dextrose dan juga agar. Bubuk kentang dan juga dextrose merupakan sumber makanan untuk jamur dan khamir. Penggunaaan media Potato Dextrose Agar dalam konsep perlindungan tanaman, umumnya digunakan untuk mengisolasi jamur atau cendawan yang terdapat pada sampel tanaman yang terserang penyakit sehingga jamur atau cendawan tersebut dapat identifikasi (Suharni, 1999). Menurut Pelczar (2005), Nutrient Agar (NA) merupakan media berbentuk padat untuk pertumbuhan mikroorganisme yang umumnya dipergunakan dalam berbagai kultur mikroorganisme. Media NA biasa digunakan untuk mengamati koloni bakteri tumbuh dan menyebar.TUJUANPraktikan dapat melakukan ekplorasi, isolasi serta identifikasi agen hayati.BAHAN DAN METODE

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jum'at 10 April 2015 pukul 07.30 selesai. Bertempat di Laboratorium Bioteknologi Tanaman Universitas Sultan Ageng Tirtayasa. Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi (6 buah) dan rak tabung reaksi, alu dan mortar, jarum ose, bunsen, cawan petri, timbangan analitik, dan incubator atau laminar airflow. Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah media PDA (Potato Dextrose Agar), media NA, alcohol, air, plastik wrap , alumunium foil, tanah yang diduga memiliki agen antagonis, daun tanaman jambu biji yang terserang penyakit atau diduga terkena cendawan, serta belalang yang diduga mati akibat terkena bakteri.Cara Kerja Isolasi Tanah1.Diukur air sebanyak 10 ml dengan menggunakan Erlenmeyer.2.Dipersiapkan tabung reaksi sebanyak 6 tabung. Lalu masing-masing tabung diisi air sebanyak 10 ml.3.Ditimbang tanah sebanyak 10 gram (gr) dengan menggunakan timbangan analitik.4.Tanah yang sudah ditimbang dimasukkan ke dalam tabungan yang pertama.5.Campuran tanah dan air dikocok dalam tabung reaksi tersebut dikocok sampai homogen.6.Campuran tersebut diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet tetes kemudian dipindahkan ke dalam tabung yang kedua. Kemudian dikocok sampai homogen.7.Hal yang sama dilakukan sampai tabung ke 6.8.Hasil dari campuran pada tabung keenam dituangkan pada cawan petri.9.Disiapkan media PDA pada laminar airflow.10.Diambil campuran tanah pada cawan petri dengan menggunakan pipet tetes lalu diteteskan campuran tanah tersebut pada media PDA sebanyak tiga titik.Cara Kerja Isolasi Tanaman1.Disiapkan bagian tanaman yang terkena penyakit.2.Tanaman pada bagian yang terkena penyakit dipotong membentuk segiempat.3.Potongan tanaman tersebut diletakan pada cawan petri dan direndam dengan alkohol 70% pada seluruh bagian potongan.4.Lalu didiamkan selama 5 menit. Tumbuk pada mortar sampai halus.5.Disiapkan media PDA pada laminar airflow. Media PDA yang digunakan adalah media PDA yang sebelumnya sudah diteteskan sampel tanah yang sudah diproses ( campuran tanah dan air ).

6.Jarum ose di panaskan dengan bunsen sebelum digunakan.7.Setelah potongan tanaman sudah halus di pindahkan ke media PDA dengan menggunakan jarum ose.8.Cawan petri ditutup dengan penutup cawan petri lalu dibungkus dengan alumunium foil dan plastik wrap dan diberi label.9.Lalu diamati selama 1 minggu dan dilihat pertumbuhan cendawan atau jamur pada media tersebut.10.Setelah 1 minggu melakukan pengamatan selanjutnya dilakukan identifikasi cendawan pada media tersebut.Cara Kerja Isolasi Serangga1.Disiapkan serangga yang diduga mati terkena penyakit atau bakteri.2.Disiapkan mortar dan alu yang direndam dengan alcohol 70%, kemudian serangga dimasukkan ke dalam mortar dan kemudian ditumbuk sampai halus.3.Jika sudah halus, pada mortar tersebut dimasukkan air sebanyak 5 ml dan di homogenkan.4.Disiapkan media NA pada laminar airflow.5.Jarum ose dipanaskan dengan bunsen sebelum digunakan.6.Diambil serangga yang sudah dihaluskan pada mortar dengan menggunakan jarum ose lalu digoreskan secara zigzag pada media NA.7.Cawan petri ditutup dengan penutup cawan petri lalu dibungkus dengan alumunium foil dan plastik wrap dan diberi label.8.Lalu diamati selama 1 minggu dan dilihat pertumbuhan koloni bakteri pada media tersebut.9.Setelah 1 minggu diidentifikasi jenis bakteri pada media tersebut.

HASIL DAN PEMBAHASAN

HasilTabel 1. Identifikasi Cendawan dan Bakteri

NoGambarIdentifikasiKeterangan

1.Cendawan Colletotrichum gloeosporioides dan Penicillium sp.Kontaminasi

2.Bakteri Bacillus cereusKontaminasi

Pembahasan

Bakteri merupakan domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri dulu terbagi menjadi Bacteria dan Archaebacteria, namun sekarang Archaebakteria mempunyai domain sendiri yang disebut dengan Archaea. Bakteri memiliki ciri-ciri antara lain tidak memiliki membran inti, tidak memiliki organel dengan membran, memiliki dinding sel peptidoglikan, dan materi asam nukleatnya berupa plasmid. Cendawan adalah suatu kelompok jasad hidup (agen hayati) yang menyerupai tumbuhan tingkat tinggi, karena mempunyai dinding sel, tidak bergerak, berkembang biak dengan menggunakan spora, tetapi tidak mempunyai klorofil. Cendawan yang menjadi patogen pada tanaman, dapat mengganggu proses-proses fisiologis pada tanaman yang sedang menjadi inangnya. Cendawan yang dapat merugikan tanaman dalam hal pengangkutan zat cair dan garam mineral, dapat pula mengganggu proses fotosintesis serta mengganggu pengangkutan hasil dari fotosintesis. Cendawan dapat merusak akar, batang, daun, buah dan bunga, serta hasil dari tanaman yang terdapat di tempat penyimpanan. Gangguan terus-menerus dan dapat merugikan aktivitas tanaman yang menimbulkan gejala dan tanda disebut sebagai penyakit pada tanaman. Salah satu tahapan penting dalam mendiagnosa gejala serangan penyakit tanaman adalah identifikasi terhadap patogen tanaman yang biasanya berupa cendawan. Mikroorganisme atau patogen yang diidentifikasi berasal dari pengambilan sampel tanaman yang terserang penyakit. Sampel tanaman yang terserang penyakit kemudian diisolasi dan ditumbuhkan pada media aseptik buatan. Hal yang sama berlaku pada serangga. Kita bisa melakukan pengambilan sampel serangga yang terserang penyakit, kemudian diisolasi dan ditumbuhkan pada media aseptik buatan. Sehingga dapat diidentifikasi jenis bakteri yang menyerang pada serangga tersebut. Menurut Kusnadi (2003), identifikasi menjadi sangat penting karena pada tahapan tersebut ditekankan beberapa hal pokok seperti untuk pengendalian khususnya untuk uji antagonis ataupun hanya sekedar untuk mengetahui jenis cendawan yang menyerang tanaman atau bakteri yang menyerang serangga. Media spesifik (biakan) yang digunakan untuk mengembangbiakkan mikroba atau mikroorganisme contohnya adalah media PDA dan media NA. Potato Dextrose Agar atau disingkat PDA merupakan media yang sangat umum dan sering digunakan untuk mengembangbiakkan, menumbuhkan jamur dan khamir. Selain itu media PDA dapat dimamfaatkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme menggunakan metode Total Plate Count. Komposisi Potato Dextrose Agar ini terdiri dari bubuk kentang, dextrose dan juga agar. Bubuk kentang dan dextrose merupakan sumber makanan untuk jamur dan khamir. Penggunaaan media Potato Dextrose Agar (PDA) dalam konsep perlindungan tanaman, umumnya digunakan untuk mengisolasi jamur atau cendawan yang terdapat pada sampel tanaman yang terserang penyakit sehingga jamur atau cendawan tersebut dapat identifikasi. Nutrient Agar (NA) adalah media berbentuk padat untuk pertumbuhan mikroorganisme yang sangat umum digunakan dalam berbagai kultur mikroorganisme. Media Nutrient Agar merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Media NA biasa digunakan untuk mengamati koloni bakteri tumbuh dan menyebar.

Pada praktikum ini dilakukan tiga isolasi yaitu, isolasi pada serangga yang terserang penyakit , sampel tanah perakaran dan daun tanaman yang terserang penyakit. Pada praktikum ini digunakan beberapa teknik melakukan isolasi dan media pertumbuhan. Teknik isolasi yang digunakan ada dua yaitu teknik isolasi tunggal dan teknik isolasi gores. Isolasi tunggal merupakan teknik melakukan isolasi dengan cara meneteskan bahan yang diduga mengandung mikroorganisme pada media dengan menggunakan pipet, sedangkan isolasi gores merupakan teknik melakukan isolasi dengan cara menggeser atau menggoreskan ujung jarum ose yang telah mengandung mikroorganisme dari sampel dengan hati-hati di atas permukaan media secara zig zag. Media pertumbuhan (biakan) yang digunakan adalah media PDA (Potato Dextrose Agar) dan NA (Nutrient Agar). Saat melakukan eksplorasi bahan, yang didapat oleh kelompok kami yaitu serangga yang terdapat dibawah pohon jambu biji , serangga tersebut adalah belalang yang sudah mati diduga terserang bakteri dikarenakan tubuhnya berwarna agak kehitam-hitaman dan lembek. Sampel tanah yang kami dapatkan berasal dari daerah perakaran tanaman bambu yang diduga terdapat agen hayati antagonis di sekitar daerah perakaran tersebut. Selanjutnya untuk daun, kami menemukan daun jambu biji yang diduga terkena penyakit akibat cendawan dikarenakan daun tersebut mengering dan mengeriting di bagian tepi dan ujung daun.

Berdasarkan gambar 1 (satu) yang terdapat pada tabel 1 (satu) , dapat diketahui bahwa pada media PDA yang digunakan untuk mengisolasi daun jambu biji dan sampel tanah ( diteteskan sebanyak 3 titik ) setelah satu minggu pengamatan mengalami kontaminasi. Kontaminasi tersebut berupa media menjadi berlendir, baunya menyengat dan terdapat koloni cendawan yang diduga merupakan koloni cendawan atau fungi Penicillium sp. dan cendawan Colletotrichum gloeosporioides. Hal tersebut dikarenakan koloni yang terbentuk pada media PDA memiliki karakteristik dimana misellium tidak bersekat, bentuk hifa memanjang bercabang dengan warna putih hingga bening, konidoifor memiliki fialid, bentuk koloni tidak beraturan, dan warna konidia putih, serta koloni berwarna putih terang. Karakteristik tersebut merupakan karakteristik cendawan Penicillium sp . Berikut ini merupakan klasifikasi dari cendawan Penicillium sp. :Kingdom: FungiPhylum : AscomycotaClass: EurotiomycetesOrder: EurotialesFamily: TrichocomaceaeGenus : PenicilliumSpesies : Penicillium sp.Selain itu pada media PDA terdapat koloni berwarna cokelat, bentuk koloni tidak beraturan, permukaan koloni timbul-datar, tepi koloni bentuknya agak bergerigi, konidium hialin berbentuk silinder, tidak bersekat. Karakteristik tersebut merupakan karakteristik cendawan atau fungi dari Colletotrichum gloeosporioides. Berikut ini adalah klasifikasi dari cendawan atau jamur Colletorichum gleosporioides :Kingdom: FungiPhylum : MycotaClass : DeuteromycetesOrder : MelanconialesFamily: MelanconiaceaeGenus : ColletotrichumSpesies : Colletorichum gleosporioidesMenurut Dwidjoseputro (2003), Penicillium sp. adalah genus fungi dari ordo Hypomycetes, filum Askomycota. Penicillium sp. dapat ditemukan dengan mudah dan secara luas pada perakaran tanaman, sisa-sisa tanaman maupun di udara. Jamur Penicillium sp. dapat menyebabkan infeksi pada tanaman. Colletotrichum gloeosporioides termasuk cendawan yang berupa parasit lemah yang dapat menginfeksi dan berkembang pada jaringan yang telah menjadi lemah, khususnya karena proses penuaan. Cendawan ini dapat menginfeksi melalui luka atau lentisel. Konidium jamur (fungi) dipencarkan oleh angin dan air hujan. Infeksi buah banyak terjadi dari konidium yang berasal dari bercak pada daun dan tangkai daun. Cendawan (jamur) Colletotrichum gloeosporioides dikenal sebagai cendawan yang merupakan penyebab penyakit antraknosa. Gejala serangan berupa adanya bercak-bercak coklat kehitaman, tepi daun menggulung, mengeriting, mengering. Serangan lebih lanjut menyebabkan bercak tersebut akan menjadi lubang. Berdasarkan gambar 2 (dua) yang terdapat pada tabel 1 (satu), dapat diketahui bahwa pada media NA yang digunakan untuk mengisolasi serangga (belalang) setelah satu minggu pengamatan mengalami kontaminasi. Kontaminasi tersebut berupa media menjadi berlendir, baunya menyengat dan terdapat koloni bakteri yang diduga sebagai koloni bakteri Bacillus cereus. Hal tersebut dikarenakan koloni yang terbentuk pada media NA memiliki karakteristik berbentuk ireguler, permukaan koloni kasar, warna dari koloni kuning agak kehijauan. Karakteristik tersebut merupakan karakteristik bakteri Bacillus cereus. Berikut ini merupakan klasifikasi dari Bacillus cereus:Kingdom : BacteriaPhylum : FirmicutesClass : BacilliOrder : BacillalesFamily : BacillaceaeGenus : BacillusSpesies : Bacillus cereusMenurut Waluyo (2005), Serangga yang telah terinfeksi bakteri ini umumnya akan mati, warna tubuh serangga menjadi kehitam-hitaman dan tubuhnya lembek, bila disentuh kulit serangga akan sedikit pecah dan mengeluarkan cairan berwarna hitam dan berbau busuk. Timbulnya warna hitam disebabkan karena bakteri telah sampai ke bagian hemokoel (bagian serangga) sehingga sel-sel darah serangga menjadi keracunan.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan Isolasi agen hayati didefinisikan sebagai suatu proses pengambilan agen hayati berupa mikroorganisme dari lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu media di laboratorium. Isolasi pada sampel tanah perakaran bambu dan daun tanaman jambu biji yang terserang penyakit dalam media PDA (Potato Dextrose Agar) setelah satu minggu pengamatan diidentifikasi mengalami kontaminasi berupa media menjadi berlendir, baunya menyengat dan terdapat koloni cendawan yang diduga merupakan koloni cendawan Penicillium sp. dan koloni cendawan Colletotrichum gloeosporioides. Isolasi pada serangga (belalang) yang terserang penyakit dalam media NA (Nutrient Agar) setelah satu minggu maka dapat diidentifikasi mengalami kontaminasi berupa media menjadi berlendir, baunya menyengat dan terdapat koloni bakteri yang diduga merupakan koloni bakteri Bacillus cereus.

Saran Sebelum dilakukan penggoresan dengan jarum ose, harus dipastikan bahwa jarum ose telah dipanaskan sebentar diatas bunsen supaya steril. Pengamatan bakteri dan cendawan (fungi) pada media harus dilakukan secara teliti agar mengidentifikasi jenis bakteri maupun cendawan dapat dilakukan dengan benar dan tepat.

DAFTAR PUSTAKA

Djafaruddin. 2008 . Dasar-dasar Pengendalian Penyakit Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara.Dwidjoseputro. 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan Press.Hidayat, I. M., I. Sulastrini, Y. Kusandriani dan A. H. Permadi. 2004. Lesio Sebagai Komponen Tanggap Buah 20 Galur Dan Varietas Cabai Terhadap Proses Inokulasi Colletotrichum. J. Hort. 14 (3) :161-162.Kusnadi. 2003. Mikrobiologi Dasar. Yogyakarta: Kanisius. Lay, B.W & S. Hastowo. 1992. Mikrobiologi. Jakarta: Rajawali Pers. Pelczar, M.J. 2005 . Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.Semangun. 2001. Penyakit-Penyakit Pada Tanaman. Yogyakarta: UGM Press.Suhardi. 1984. Serangan Penyakit Antraknosa Tanaman Lombok Di Kabupaten Demak. Warta penelitian pertanian 6(6):4-5.Suharni. 1999. Penyakit-penyakit Pada Tanaman Hortikultura. Yogyakarta: UGM Press.Suriawiria, U. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.Suryaningsih ER, Suhardi. 1993. Pengaruh Penggunaan Pestisida Untuk Mengendalikan Penyakit Antraknosa Pada Cabai. Bull Hort 20 (2): 37-43. Strobel. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes And Their Natural Product. Microbiology and Molecular Biology Review, 67: p.491-502.Tjahjadi, Nur. 1989. Hama dan Penyakit Tanaman. Yogyakarta: Kanisius. Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.Zinniel, et al. 2002. Isolation and Characterization of Endophytic Bacteria. Applied and Enviromental Microbiology, 68 ; p. 2198-220.

LAMPIRANProses penggoresan pada media PDA menggunakan jarum ose.

Proses penggoresan pada media NA menggunakan jarum ose.

Penutupan cawan petri dengan alumunium foil.

Pemanasan jarum ose diatas bunsen.