Peralatan dan Pewarnaan Mikroorganisme

Tahapan Pengerjaan

• Penggunaan Mikroskop• Pewarnaan• Pertumbuhan Mikroba

STERILISASI MEDIUM PEMILIHAN MEDIA PENANAMAN/ISOLASI TEKNIK BIAKAN MURNI

• Pengujian Terhadap Mikroba

Penggunaan Mikroskop

• Mikroskop sangat erat kaitannya dalam pekerjaan mikrobiologis, mengingat mikroba yang digunakan mempunyai ukuran yang sangat kecil.

• Mikroskop dibedakan atas: mikroskop cahaya dan mikroskop elektron. Dalam praktikum digunakan mikroskop cahaya medan terang (bright field). Mikroskop medan terang ini adalah suatu bentuk mikroskop dengan medan yang mengelilingi spesimen kelihatan terang (berwarna cerah), sedangkan spesimennya memperlihatkan warna gelap. Hal ini disebabkan karena cahaya dari sumber lewat melalui sistem-sistem perubahan sehingga terbentuk medan terang

Mikroskop

• Mikroskop pada dasarnya terbagi atas 2 bagian, yaitu bagian mekanik dan bagian optik. Bagian mekanik terdiri dari statif, kubus, revolver, meja obyek, sekrup penggerak dan obyek. Bagian optik terdiri dari lensa okuler, lensa obyektif dan kondensor.

• Lensa obyektif pada mikroskop ini dibagi atas tiga, yaitu : 1. Lensa 16 mm, berkekuatan 10x 2. Lensa 4 mm, berkekuatan 40x 3. Lensa 1,8 mm, berkekuatan 100x (bantuan minyak imesi untuk menghindari hilangnya

cahaya)

• Angka 16; 4; 1,8 adalah jarak dari fokus setiap lensa terhadap titik fokus setiap lensa obyektif.

• Angka 10; 40; 100 adalah daya perbesaran. • Jarak fokus adalah jarak dari titik pusat lensa terhadap titik

fokus. Makin pendek jarak lensa obyektif, makin pendek pula jarak antara lensa dan preparat.

• Perbesaran total diperoleh dengan mengalikan perbesaran obyektif dengan perbesaran okuler (40x10= 400).

• Perbesaran yang dicapai oleh suatu mikroskop majemuk adalah hasil kerja dua sistem lensa. Lensa obyektif dekat dengan mata. Sistem lensa obyektif memberikan perbesaran mula-mula dan menghasilkan bayangan nyata yang kemudian diproyeksikan ke atas lensa okuler. Bayangan nyata tadi, pada gilirannya diperbesar oleh okuler untuk menghasilkan bayangan maya yang kita lihat.

• Selain perbesaran diperhatikan pula daya pisah yaitu kemampuan suatu obyektif untuk memisahkan dua buah titik yang sangat berdekatan di dalam struktur pada suatu obyek. Jadi makin besar kemampuan suatu obyektif, makin kecil jarak dua buah titik yang berdekatan yang dapat dilihat secara terpisah dengan mikroskop itu.

• Umumnya mikroskop sudah dilengkapi dengan lensa-lensa obyektif dengan kekuatan berbeda-beda dari mikroskop yang sama secara bergantian diletakkan pada posisi kerja, benda yang diamati tetap terfokus. Lensa-lensa semacam ini disebut “parfokal” yaitu obyek yang diamati tetap terfokus tanpa anda perlu menggerakkan tombol-tombol pengatur.

• Kondensor adalah sistem lensa pengumpul cahaya yang memusatkan cahaya yang tersedia pada preparat.

Sejarah Mikroskop

• Antonio van Leeuwenhoek (1675) melihat bakteri menggunakan suatu instrumen optik yang terdiri dari lensa-lensa bikonveks.

• Leeuwenhoek pada menemukan bakteri didalam berbagai cairan diantaranya cairan tubuh, air, ekstrak lada, bir.

• Penemuan mikroskop pada saat itu membuka untuk dilakukan penelitian-penelitian mengenai terjadinya proses fermentasi dan penemuan jasad renik penyebab penyakit.

Mikroskop Ultraviolet• Mikroskop ultraviolet dapat menghasilkan resolusi dan

pembesaran yang lebih tinggi dibandingkan dengan mikroskop biasa.

• sinar UV mempunyai panjang gelombang yang lebih pendek yaitu 180 – 400 nm menghasilkan resolusi sekitar dua kali lebih tinggi daripada mikroskop biasa.

• Karena sinar UV merupakan sinar tidak tampak, maka bayangan baru dapat dilihat dengan mencatatnya pada suatu lempeng fotografik menggunakan tabung pengubah bayangan, atau dengan memperlihatkan pada layar televisi setelah ditangkap oleh suatu tabung foto atau kamera televisi yang sensitif terhadap sinar UV.

Mikroskop cahaya

• Mikroskop majemuk mempunyai dua perangkat lensa yakni Lensa objektif dan lensa Okuler .

• Mempunyai tiga lensa objektif : daya rendah, daya tinggi, imersi minyak.

Mikroskop Pendar (Fluorescence Microscope)

• Bakteri yang diwarnai dengan pewarna pendar (fluorenscent dye) akan berwarna lain dibawah mikroskop pendar daripada jika dilihat dengan mikroskop cahaya biasa.

• Dapat digunakan untuk mengidentifikasi benda asing atau antigen (seperti bakteri,ricketsia, atau virus) dalam jaringan

Mikroskop Pendar(Fluorescence Microscope)

• Bakteri yang diwarnai dengan pewarna pendar akan berwarna lain dibawah mikroskop pendar daripada jika dilihat dengan mikroskop cahaya biasa.

• Kualitas yang dikenal sebagai pendar dapat diamati dengan adanya cahaya ultraviolet. Mycobacterium tuberculosis yang diwarnai dengan auramin(pewarna kuning) akan tampak cemerlang pada latar belakang yang gelap.

• Mikroskop pendar dapat juga digunakan untuk mengidentifikasi benda asing atau antigen (seperti bakteri,ricketsia, atau virus) dalam jaringan.

• Dalam teknik ini , protein antibodi yang khas mula-mula dipisahkan dari serum tempat terjadinya. Kemudian dirangkaikan, atau dikonjugasi dengan pewarna pendar. Karena reaksi antibodi-antigen itu bersifat khas, maka peristiwa pendar hanya akan terjadi jika antigen yang dimaksud itu ada dan diikat oleh antibodi yang ditandai dengan pewarna pendar. Karena antibodi-antigen itu bersifat khas, maka peristiwa pendar akan terjadi jika antigen yang dimaksud itu ada dan diikat oleh antibodi yang ditandai dengan pewarna pendar.

Mikroskop Medan-Gelap ( Dark-field Microscope)

• Digunakan untuk mengamati bakteri hidup, khususnya bakteri yang begitu tipis yang hampir mendekati batas daya pisah mikroskop majemuk.

• Spirochaeta yang bersifat patogen termasuk dalam kategori ini, terutama spirochaeta penyebab sifilis, Triponema pallidu

• Berkas cahaya ini dipantulkan dengan sudut yang lebih kecil dari bagian atas gelas preparat. Setiap berkas cahaya yang menyentuh spesimen akan dipantulkan langsung ke dalam objektif, dengan demikian spesimen kelihatan putih pada latar belakang hitam. Tanpa spesimen, medan pandang kelihatan gelap, karena tak ada sesuatu yang menyebabkan cahaya dapat dipantulkan ke lensa objektif.

Mikroskop elektron• Menggunakan berkas elektron.• Karena panjang gelombang

berkas elektron jauh lebih pendek, daya pisah mikroskop ini menjadi sangat besar dari satu nm , memungkinkan perbesaran sampai sejuta kali diameter.

• Bayangan yang dihasilkan oleh mikroskop elektron dapat dilihat apabila diproyeksikan pada layar pendar (Fluorescent screen).

Mikroskop fasekontras• Mengamati benda hidup ialah

dalam keadaan alaminya : tidak diberi warna dan dalam keadaan hidup.

• Suatu susunan filter dan diafragma pada mikroskop fasekontras akan mengubah perbedaan fase menjadi perbedaan dalam terang- yaitu menjadi daerah-daerah terang dan bayangan yang dapat ditangkap oleh mata- dengan demikian nukleus (atau struktur lain) yang sejauh ini tidak dapat dilihat menjadi dapat dilihat.

Perwarnaan Mikroba

• Untuk mewarnai sel mikroba atau latar belakang mikroba

• Jenis cat warna tergantung jenis pengecatan• Dapat melihat bagian-bagian dari sel• Harus dilakukan fiksasi untuk mendapat

olesan bakteri

Cat Bakteri• Cat bakteri adalah senyawa garam, cat ini dibagi menjadi dua

macam yaitu cat basis dan cat asam tergantung pada muatan listrik cat.

Cat asam• Cat yang ion catnya (khromofornya) adalah anion-anion dan

kation-kationnya Na+, K+, Ca++, NH4+. Asam pikrat adalah salah satu zat asam yang menghasilkan

khromogen anionik.

Cat basis• Yaitu cat yang ion-ion catnya (khromofornya) adalah kation

(bermuatan +) misalnya methylene blue, safranin dan lain-lain. Sedang anion pada umumnya ialah Cl-, SO42-, asetat, oksalat.

Contoh : methylene blue

fiksasi• Fungsi fiksasi ialah :– Mencegah mengkerutnya globula protein sel– Mempertinggi sifat reaktif gugusan (gugus karboksil,

amino primer)– Merubah afinitas cat– Mencegah terjadinya autolisis cat– Membunuh bakteri dengan cepat tanpa merubah bentuk

dan struktur– Melekatkan bakteri di atas gelas benda– Membuat sel lebih kuat

• Cara fiksasi : buat lapisan tipis suspensi bakteri di atas gelas benda kemudian dikeringkan dan dilakukan beberapa kali di atas nyala lampu spirtus.

Substrat

• Atas dasar macamnya cat yang diserap oleh sel dibedakan atas :– Sel yang basofil yaitu sel yang dapat mengikat cat

basa.– Sel yang asidofil yaitu sel yang dapat mengikat

cat asam.– Sel yang sudanofil yaitu sel yang dapat mengikat

cat yang dapat larut dalam minyak.

Peluntur cat

• Untuk mendapatkan kontras yang baik pada bayangan mikroskop.

• Jenis peluntur cat :a.Peluntur cat yang lemah : alkohol, air, aseton, gliserinb.Peluntur cat yang asam : HCl, H2SO4 , HNO3c.Peluntur cat yang basa : KOH, NaOH, sabund.Garam logam berat : AgNO3, CuSO4, e.Garam logam ringan : Na2SO4, MgSO4

Zat Mordan (Pengintensif pengecatan)

• Zat kimia yang menyebabkan sel bakteri dapat dicat lebih intensif atau menyebabkan cat terikat lebih kuat pada jaringan sel.

• Jenis mordan :a.Mordan basa : FeSO4, Kalium antimonium

tartat.b.Mordan asam : asam tanin, asalm pikrat, JKJ.

Cat penutup

• Untuk memberi kontras pada sel yang tidak mengisap cat utama pada akhir pengecatan dilakukan pengecatan lagi.

• Cat penutup : methylene blue, safranin, erytrosin.

Pengecatan Negatif• Pengecatan negatif menggunakan cat asam seperti eosin atau

nigrosin. • Pengecatan negatif dilakukan untuk mewarnai latar belakang

preparat sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna.• Cara :a.Letakkan setetes nigrosin pada ujung objek gelasb.Masukkan inokulum dari ose ke dalam nigrosin dan

campurkanc. Ambil objek gelas baru lalu letakkan di sebelah luar nigrosin

dengan posisi miringd. Geserkan secara perlahan objek gelas tersebut ,sepanjang objek gelas tempat inokulum

Pengecatan Sederhana • Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir

tembus pandang bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna.

• Pewarnaan sederhana dapat digunakan , dengan hanya menggunakan satu jenis zat warna untuik mewarnai mikroba tersebut.

• Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik.

• Zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromatofornya bermuatan positif).Contoh : biru metilen, karbol fuksin dll. Sel bakteri akan berwarna sesuai dengan jenis cat yang dipakai.

Pengecatan tahan asam (Ziehl-Neelsen )

• Bakteri dari genus Mycobacterium dan Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoid didalam dinding selnya. Hal ini menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat warna yang umum sehingga sel bakteri tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa.

• Teknik pewarnaan khusus yaitu Pewarnaan Tahan Asam dikembangkan oleh Paul Erlich (1882) yang kemudian diperbaiki dan sekarang disebut pewarnaan Ziehl Neelsen.

• Termasuk pengecatan differensial karena dapat membedakan bakteri “ Acid fast” (tahan terhadap pencucian asam) dan yang non acid fast (tidak tahan terhadap pencucian asam).

a. Cat bahan asam menggunakan tiga reagen : cat utama, karbol fuchsin. Karbol fuchsin berwarna merah lebih mudah larut dalam fenol daripada dalam

air atau alkohol asam ; dan fenol lebih mudah larut dalam lemak daripada dalam air. Bakteri tahan asam banyak mengandung lemak dan mudah menyerap karbol fuchsin yang larut dalam fenol. Pada pencucian, karbol fuchsin dan fenol sangat tahan karena sifatnya sangat tahan terhadap zat pencuci.

b.Zat pencuci : alkohol asam ( 3 % HCl dan 95 % etanol) c. Cat penutup : metylene blue.

Pengecatan differensial : “Gram”

• Pengecatan ini mula-mula dikembangkan oleh CRISTIAN GRAM (1984) dan kemudian disempurnakan oleh ahli-ahli lain.

Pengecatan gram meliputi 4 tingkatan yaitu :• Pemberian cat utama (larutan cat crystal violet : warnanya

ungu).• Pengintensifan cat utama dengan menambahkan larutan

mordan (JKJ)• Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam• Pemberian cat penutup (cat lawan) counterstain) larutan cat

safranin yang berwarna merah.

Pengecatan gram termasuk pengecatan differencial karena :

– Bakteri gram positif adalah bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan. Pada pngamatan mikroskopik sel-sel bakteri ini tampak berwarna biru ungu (violet Bakteri gram negatif, adalah bakteri yang daya ).

– mengikat cat utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan.

Pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri ini tampak berwarna merah.

Bakteri yang bersifat gram variabel Faktor-faktor tersebut antara lain :• Perubahan keasaman• Apabila pH turun kemungkinan bakteri gram positif dapat berubah menjadi gram

negatif, sebaliknya apabila pH naik ada kemungkinan bakteri gram negatif dapat berubah menjadi gram positif.

• Penyimpanan cara pengecatan misalnya pancucian yang terlalu lama dengan alkohol dapat menyebabkan bakteri gram positif memberi hasil seperti gram negatif.

• Faktor medium juga mempengaruhi, misalnya bakteri gram positif yang lemah apabila terlalu lama ditumbuhkan dalam medium yang mengandung bahan yang mudah difermentasi dapat berubah menjadi gram negatif.

• Umur bakteri : bakteri gram positif yang telah tua atau kekurangan makan dapat berubah menjadi gram negatif.

• Perlakukan khusus : bakteri gram positif yang bagian-bagian selnya (seperti lemak, karbohidrat dan protein) dihilangkan dengan melarutkan dalam air panas, eter atau larutan ribonuklas dapat berubah menjdi gram negatif. Bakteri gram negatif apabila ditambah dengan larutan pekat DNA dapat berubah menjadi gram positif misalnya E. coli.

Mekanisme Pengecatan Gram• Sifat gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel

dan membran sitoplasmanya. • Dinding sel dan membran sitoplasma bakteri gram positif mempunyai

afinitas yang besar terhadap kompleks cat crystal violet dan yodium ; sedang pada bakteri gram negatif afinitasnya sangat kecil.

• Perbedaan sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasma memegang peranan penting dalam menentukan sifat gram tetapi sampai seberapa jauh peranan tersebut belum diketahui dengan jelas.

• Pada waktu pengecatan, larutan crystal violet dan yodium menembus sel-sel bakteri gram positif maupun sel bakteri gram negatif.

• Pada sel bakteri gram positif zat-zat ini membentuk suatu senyawa yang sukar larut juga tidak larut dalam peluntur (alkohol. Hal ini tidak terjadi pada sel bakteri gram negatif, akibatnya cat dapat dilunturkan.

• Pada pemberian cat penutup (cat lawan) sel bakteri gram positif tidak dapat diwarnai sehingga warnanya kontras terhadap warna utama.

Teknik Pengecatan Spora • Umumnya bakteri dalam genus Bacillus dan Clostridium membentuk

suatu struktur didalam sel pada tempat yang khas disebut Endospora. • Endospora memperlihatkan ketahanan yang tinggi karena adanya

selubung spora yang tebal dan keras,sehingga dibutuhkan perlakuan khusus untuk mewarnainya.

• Teknik Pengecatan1. Tutup preparat dengan sepotong kertas saring,tambahkan hijau malakit.2. Panaskan preparat selama 5 menit hingga terlihat uap.Jangan biarkan

mengering2.3. Setelah preparat dingin, buang kertas saring dan cuci air mengalir 4. Warnai safranin selama 1 menit5. Keringkan dengan kertas saring

Teknik Pengecatan Kapsul• Tanpa pewarnaan, kapsul bakteri sangat sukar diamati dengan mikroskop

cahaya biasa karena tidak berwarna dan mempunyai indeks bias yang rendah.

• kapsul bakteri bersifat non ionic, maka pewarnaannya tidak dapat dilakukan dengan prosedur pewarnaan biasa.

• Masalah utama dalam pewarnaan ini ialah olesan bakteri yang telah disiapkan itu difiksasi dengan panas maka kapsul tersebut akan rusak; namun bila tidak difiksasi maka akan meluncur waktu pencucian.

• Tujuan ini dapat dengan mudah dicapai dengan cara menggabungkan prosedur pewarnaan dan pewarnaan sederhana.

• Metode Kerja1.Taruhlah 2 ose preparat mikroba 2. Sebarkan organisme tersebut dan biarkan kering3. Lakukan fiksasi panas terhadap olesan dengan hati-hati untuk melekatkan

organisme pada objek4. Genangi olesan bakteri dengan ungu kristal selama 1 menit5. Bilaslah kelebihan zat warna dengan larutan tembaga sulfat6.Seraplah sisa larutan tembaga sulfat pada kaca objek dengan kertas serap

Pengamatan makroskopis terhadap kapang yang tumbuh pada permukaan cawan

maka hal yang perlu diamati adalah :– Amati perubahan warna pada koloni– Keadaan permukaan koloni (rata, menggunung, seprti tepung,

berbutir, beludru atau seperti kapas)– Amati pula warna koloni :– Keadaan lain yang perlu diamati adalah ;

• “ Radial furrow” : titik pusat• “ Growing zone” : lapisan bening pada bagian terluar• “ Zonation” : ukuran zona yang dihasilkan• “Exudate drups” : titik cair (seperti embun) pada

permukaan koloni • “ Reverse of coloni”: latar belakang koloni (amati apakah

berlapis-lapis atau hanya satu lapis)