PENYANDI GEN TUMBUH CEPAT

UNTUK BENIH DAN INDUK UDANG

WINDU Penaeus monodon

HARYANTI et al.

BALAI BESAR RISET BUDIDAYA LAUT DAN PENYULUH PERIKANAN

BUDIDAYA LAUT- GONDOL

PERMASALAHAN KERAGAAN FENOTIP -

GENOTIP PADA UDANG

KELANGSUNGAN HIDUP ٭

VARIASI PERTUMBUHAN ٭

KETAHANAN TERHADAP PENYAKIT ٭

KERAGAAN KEMATANGAN GONAD ٭

RATIO PEMIJAHAN ٭

FEKUNDITAS ٭

RATIO PENETASAN ٭

FEED CONVERTION RATIO PAKAN (FCR) ٭

RATIO MORFOLOGI (carapace : daging) ٭

SELEKTIF BREEDING

PROGRAM SELEKSI YANG BAIK BISA DIPEROLEH

PENINGKATAN 12-15% PER GENERASI

SALMON, TILAPIA, CATFISH , CARP

KEUNTUNGAN TERHADAP COST RATIO, PROGRAM

Atlantic Salmon MENCAPAI 15 : 1

SELEKTIF BREEDING

PROSPEK

• KONVENSIONAL / KLASIK

• PENDEKATAN MOLEKULER (MOLEKULAR MARKER)

PROGRAM SELEKTIF BREEDING • CAPABILITAS :

Fasilitas

SDM

Beaya : perbaikan produksi & nilai pasar

Waktu

• KEUNTUNGAN & PERBAIKAN LINGKUNGAN

Kualitas Air

Perbaikan Managemen - FCR

Perbaikan Pakan

Perbaikan System

• OPTIMALISASI SISTIM PEMELIHARAAN, BUKAN

PROJECT SHG BERUBAH PADA WAKTU

TERTENTU

►SELEKTIF BREEDING DITERIMA SECARA LUAS

SEBAGAI CARA PERBAIKAN GENETIK DALAM

PROGRAM SELEKSI :

■ MEMERLUKAN INDUK DALAM JUMLAH BESAR

■ MEMERLUKAN SUMBER INVESTASI BESAR

■ MEMERLUKAN WAKTU YANG PANJANG

►KETEPATAN PERBAIKAN GENETIK UNTUK

MEMBERIKAN significant & sustainable SISTIM

AKUAKULTUR

►PERBAIKAN GENETIK TERMASUK DALAM

PERKEMBANGAN INDUSTRI PERIKANAN

1. EKSPLOITASI ADITIF KERAGAMAN GENETIK SELECTIVE BREEDING KLASIK

PENINGKATAN SELECTIVE BREEDING

(Penggunaan molekular markers)

2. EXPLOITASI NON-ADITIF KERAGAMAN GENETIK

HYBRIDISASI

CROSS BREEDING

3. MANIPULASI GENETIK

CHROMOSOM SET MANIPULATION

SEX CONTROL

TRANSGENESIS (GMOs)

PERBAIKAN GENETIK

SELEKSI KONVENSIONAL / KLASIK

1. PROTEIN POLYMORPHISM: ALLOZYMES

2. DNA POLYMORPHISM :

■ MICROSATELLITES (SSR)

■ MINISATELLITES

■ RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM ( RFLP)

■ AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)

■ RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)

■ SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM (SSCP)

■ SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM (SNPs)

3. MITOCHONDRIA DNA

MARKER MOLEKULER

♣ MENGEKSPRESIKAN KARAKTER / SIFAT BAWAAN SECARA

GENETIK

♣ UMUM DIGUNAKAN

♣ POLIMORFISME YANG TINGGI

♣ MEMBEDAKAN BEBERAPA TINGKATAN : SPECIES, POPULASI

♣ PERKEMBANGAN STADIA TIDAK DIPERLUKAN

♣ KONSERVASI SUMBER DAYA ALAM

PENGGUNAAN MARKER MOLEKULER

☻ SULIT UNTUK SAMPLE PURBAKALA

☻ HOMOPLASIES (KESAMAAN)

☻ DIPERLUKAN KUALIFIKASI TEKNIK TINGGI

☻ MAHAL

KELEBIHAN

KELEMAHAN

RESTRICTION FRAGMENT

LENGTH POLYMORPHISM

(RFLP)

High reproducibility

Highly polymorphic

Co-dominant inheritance

High DNA quantity and quality required

Transference and probe labelling

KELEBIHAN

KELEMAHAN

M Hae III Hha I Nla III

500 bp

PERFORMANSI

HOMOZIGOSITAS INDUK

INTRODUKSI L.VANNAMEI ASAL

FLORIDA

PERFORMANSI

HOMOZIGOSITAS INDUK

INTRODUKSI L.VANNAMEI

ASAL HAWAII

M Hae III Hinf I Nla III

RFLP ( RESTRICTION FRAGMENT

LENGTH POLYMORPHISM)

PERFORMANSI HOMOZIGOSITAS BENIH TURUNAN

UDANG INTRODUKSI L. vannamei

UKURAN KECIL UKURAN BESAR

UKURAN KECIL UKURAN BESAR

RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC

DNA (RAPD)

DETEKSI POLIMORFISM CEPAT

JUMLAH DNA YANG DIPERLUKAN SEDIKIT (nano-grams)

PRIMER PENDEK ( 7-15 BASA) DG SEKUENS ACAK

• REPRODUKSIBILITAS

SUHU DENATURASI

• KONSENTRASI DNA DALAM REAKSI PCR

• VOLUME REAKSI

• JUMLAH PRIMER YANG DITAMBAHKAN

• KONSENTRASI ENZIM TAQ POLYMERASE

KELEMAHAN

1325 bp

1280 bp

1025 bp

297 bp

488 bp

510 bp

RAPD BENIH F-1 UDANG WINDU

DENGAN PERTUMBUHAN CEPAT

DAN LAMBAT

SINGLE STRAND CONFORMATION

POLYMORPHISM (SSCP)

KEUNTUNGAN

= SENSITIBILITAS TINGGI UNTUK DETEKSI ALLEL BARU

= HAMPIR 100% PERBEDAAN DAPAT TERDETEKSI PADA

FRAGMENT < 200 bp

KELEMAHAN

OPTIMASI

MUTASI TIDAK DINYATAKAN DG PERUBAHAN STRUKTUR

APLIKASI

DETEKSI TARGET MUTASI

IDENTIFIKASI SPESIES

POPULASI GENETIK

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 22 23 25 26 27 28 29 30 A B

F-0 Jantan

F-0 Betina

PERFORMANSI SEPARASI PITA DNA DG ANALISIS SSCP

MACROSATELLITES (Simple

Sequence Repeats / SSR)

LOKUS MIKROSATELIT SEBAGAI MARKER GENETIK

MENUNJUKKAN SIFAT KODOMINAN

MENGIKUTI POLA DASAR KETURUNAN MENDEL

REPRODUKTIBILITAS TINGGI

MENGHASILKAN ALLEL TERDETEKSI DALAM JUMLAH BANYAK

VARIASI GENETIK TINGGI

BEAYA TINGGI (3 - 4 KALI ALLOZYME MARKER)

DIPERLUKAN SEQUENSING

ADANYA SEQUENS YG NON - AMPLIFIABLE (null alleles)

HOMOPLASIES

- Cross-amplification

KELEMAHAN

1. PENCIRI /PENYANDI / MARKER GEN TERHADAP SUATU KARAKTER :

♠ TUMBUH CEPAT

♠ TOLERAN TERHADAP LINGKUNGAN EKSTRIM

♠ RESISTEN PENYAKIT

2. PENGGUNAAN PENYANDI GEN AKAN MEMPERMUDAH DLM SELEKSI

DENGAN MARKER (MAS = Marker Assisted Selection)

3. DAPAT DIPRODUKSI BENIH / CALON INDUK UDANG DENGAN

KARAKTER GENOTIP YG DI INGINKAN

PENGGUNAAN MACROSATELLITES (Simple

Sequence Repeats / SSR) UNTUK SELEKSI UDANG

AMPLIFIKASI DNA UNTUK 13 PRIMER : SPEEDY PCR

Primer Repeate Sequence Sequence

PmMS-8 F

PmMS-8 R

(AAT)9 (AGT)(AAT)5 5’-TTT GAG TCA TAA CTT CCA AGC-3’

5’-TGC CAT AAA CTC TCT AAC GAC -3’

PmMS-9 F

PmMS-9 R

(TTTA)14 5’-GGC AGA TTT TCT AGC CTT TTC A-3’

5’-AGA AGG AGG CGT GTT TCT GA -3’

PmMS-10 F

PmMS-10 R

(CTC)8 (CAT)33 5’ – CCC CTT TCC TCA TGT ACC – 3’

5’- GAT GAT GAT GGA TGA TGG AT- 3’

PmMS-14 F

PmMS-14 R

(GAT)23 5’-ACA AAA ACA ACA GTA GCA CTT G-3’

5’-GCT GAA CCT AGG CGT ATA GT-3’

PmMS-16 F

PmMS-16 R

(CATA)35 5’-TGG GCA GCG TGT GTG TAT-3’

5’-TGG GCA GCG TGT TGT TAT-3’

PmMS-19 F

PmMS-19 R

(CAGT)42 5’-TCA TTC CTT CAT TCA GTC ATT CA-3’

5’-AGA GAG TAT GCC CAC GCA TT-3’

PmMS-2D2 F

PmMS-2D2 R

(CAGT)3(CGGT)9(CAGT)25 5’-TGC AGC TTC ACA CAC CCA TAC ACG-3’

5’-TAT GAC AGG CAG TTG CGC CAG GTA-3’

PmMS-4CA F

PmMS-4CA R

(TTA)7(TTG)25 5’-CAG GTG TTG GGC TGT ATG TGGTAGA-

3’

5’-GAC AAG AAG TCG GGT TAA TTT CAC

CAA-3’

PmMS-8A2 F

PmMS-8a2 R

(GACT)8…(GTCT)19 5’-GTC TGT CCA TCC TTC CTG CTG ACC-3’

5’-TGG GAG TAA ACA AAG CGT TTG AGA TTG -3’

PmMS-9GG F

PmMS-9GG R

(CAA)22 5-’ACA AGG AAC CTG CCC AGA ACA TT-3’

5’-CCC ACC TCC TGC TTG GGA ATA TAC A-3’

PmMS-11A F

PmMS-11A R

(CACT)16 5’-TGT CTG TGG CTC CCT GTC TCT CTG-3’

5’-TGC CCT TGA TAC GAG CTT TAT CTG TT-3’

PmMS-7HG F

PmMS-7HG R

(GAT)54 5’-GAA GGA GAA GGA GGA GGA TTA CAA GGA-3’

5’-TCG GGC GGA GAA TAT GCA AAT TAA A-3’

PmMS-6 F

PmMS-6 R

(tac)9…(TAC)25 5’-CTA CTG CTG CTG CTA CTG CTG-3’

5’-CAC TGC AAG ATT AAG GTG AGA AA-3’

INDUK BETINA

INDUK JANTAN

BENIH BESAR

BENIH SEDANG

BENIH KECIL

PERFORMANSI GEN HASIL

AMPLIFIKASI PCR dg Pm MS-11A

(Agarose 2%)

MICROSATELIT : PRIMER PmMS-2D2

A C G T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 A C G T

Besar Sedang Kecil

315

298

295

290

298

280

271

Fragmentasi DNA untuk benih ukuran

besar,sedang dan kecil

Benih udang besar 60% (290 dan 295 bp),

ukuran sedang 0% dan ukuran kecil sebesar

40 % (290 bp) dan 60% (295 bp).

MICROSATELIT : PRIMER PmMS-16

A C G T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 A C G T

176

172

168

142

109

97

Besar Sedang Kecil

Benih udang ukuran besar tidak dapat

terekspresi pada 172 bp secara jelas dan

sempurna, benih sedang dan kecil

terekspresi 20%

MICROSATELIT : PRIMER PmMS- 4 CA

A C G T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 A C G T

Besar Sedang Kecil

202

205

211

217

220 224

Ekspresi DNA pada 202 bp menunjukkan

80% pada benih besar, benih sedang

hanya 20% dan benih ukuran kecil sebesar

40%.

A C G T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 A C G T

BESAR SEDANG KECIL

(60 %)

(20 %)

(20%)

MICROSATELIT : PRIMER PmMS-11A

150

149

144

165

158

182

141

Aksesi Deskripsi Score

maximum

Jumlah

Score

Query

coverage

Similarity/

Max

identity

DQ307245.1 B-6 172 172 75% 97%

DQ307245.1 B-15 191 191 76% 96%

DQ307245.1 B-20 187 187 68% 98%

DQ307245.1 B-22 180 180 67% 98%

Similaritas sequen total nucleotid DNA udang windu tumbuh

cepat pada GenBank dengan nomor aksesi yang sama

Produksi benih udang P. monodon dengan penyandian gen tumbuh

cepat pada lokus PmM-11A

Pemanenan benih udang P.monodon PL-12

tumbuh cepat

KEGIATAN PENEBARAN BENIH UDANG WINDU DG APLIKASI

MARKER GEN TUMBUH CEPAT DI TAMBAK BRPBAP –

MAROS SUL-SEL

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 30 60 90 120 150waktu (hari)

berat (g)

Fast Growth

Control

0

5

10

15

20

25

45 75 105 135 150waktu (hari)

Berat (g)

Fast growth

Control

KEPADATAN UDANG 10 ekor/m2

KEPADATAN UDANG 2 ekor/m2

PERFORMANSI PERTUMBUHAN

UDANG DG APLIKASI MARKER

GEN TUMBUH CEPAT

► Penyandi gen untuk tumbuh cepat pada

udang windu untuk seleksi diperoleh dg

metode microsatelit pada berat molekul

144bp dengan primer PmMS11-A.

► Primer PmMS11-A. dapat dijadikan locus

kuantitatif untuk sifat tumbuh cepat

dengan adanya akurasi prediksi karakter

fenotip, yaitu sebanyak 60%, sedangkan

udang tumbuh reguler dan lambat,

masing-masing hanya sebanyak 20%.