Penetapan Kadar Simultan Deksametason Dan

JURNAL ILMU KEFARMASIAN INDONESIA, September 200(\, hal. 60-73ISSN 1693-1831

Penetapan Kadar Simultan Deksametason danMetilprednisolon dengan Metode Kromatografi Gas-

Spektrometri Massa melalui Derivatisasi

SWASONO R. TAMAT1*, ERNAWATF, LINDA ROSALINN,SONNY PUJIANT03

1Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka, BATAN, Kawasan Puspiptek, Serpong2Laboratorium Pengawasan Doping, LABKESDA, DKI Jakarta

3Fakultas Farmasi Universitas Pancasila,Srengseng Sawah, Jagakarsa, Jakarta 12640

Diterima 4 April 2006, Disetujui 3 Juli 2006

Vol. 4, NO.2

Abstract: This investigation is intended to find a simultaneous assay method for glucocorticosteroidsdeclared as doping compound by the International Olympic Committee. Experiments were carried out inthe determination of dexamethason and methylprednisolon in urine matrix by gas chromatography- massspectrometry (GC-MS) using various derivatisation reagents, reaction temperature and time. Selectionof the best derivatisation reagent was based on the separation of total ion chromatogram (TIC) andappearance of three characteristic ions, m/z 305, 345, 680 or m/z 206, 456, 662 for dexamethasone; and m/z 279,369,459 or m/z 147,424,644 for methylprednisolone. Dexamethasone and methylprednisolonederivates in the GC-MS spectra were identified by characteristic ions of m/z 305 (dexamethasone) and m/z 279 (methylprednisolone). The best derivatisation yield was achieved by a combination of TMSI -[BSTFA- TMCS (99: 1)] (2: 1) reacted at 90C for 90 minutes, which produced a linear correlation betweenconcentration (0-150 ng/ml ) and ratio of quantitation-ion abundance of standard compound/ionabundance of D3-testosterone internal standard with r= 0.9937 for dexamethasone and r=0.9823 formethylprednisolone; high precision CV= 12.14% (dexamethasone) and CV= 13.87% (methylprednisolone);high recovery for both dexamethasone and methylprednisolone, and LOD values of 4,44ng/ml(dexamethasone) and 1.80ng/ml (methylprednisolone). The method can be used for simultaneousquantitative assay of glucocorticosteroids, and has been validated for ten other glucocorticosteroidcompounds.

Key words: glucocorticosteroids, dexamethasone, methylprednisolone, D3-testosterone, gaschromatography-mass spectrometry

PENDAHULUAN

Di era modem seperti sekarang ini, olah ragatelah menjadi salah satu kebutuhan manusia untukmenjaga kesehatan tubuh secara alami dan jugasebagai sarana hiburan yang menyenangkan. Dalamolah raga pertandingan terjadi persaingan antar atlet,sehingga pada umumnya atlet terus berusahamemacu kemampuannya agar dapat meraih prestasiyang tinggi. Namun karena persaingan yang ketattersebut, ada atlet yang menempuh langkah-Iangkahyang tidak sah dengan menggunakan obat-obatanuntuk meningkatkan kemampuan tubuh secara tidakalami. Obat-obatan yang dapat meningkatkan

* Penulis korespondensi, Hp.08129695600,e-mail: [email protected]

kemampuan tubuh secara tidak alami tersebut olehKomite Olimpiade Internasional (InternationalOlympic Committee-IOC) telah dilarang peng-gunaannya oleh atlet, baik di luar pertandingan, masalatihan, maupun selama pertandingan. Penggunaanobat-obatan te~sebut dikategorikan sebagai doping,yaitu pemakaian suatu zat atau penggunaan suatumetode tertentu yang dikategorikan dalam ke1ompokzat dan metoda yang terlarang penggunaannya dalamolah raga(IJ.Obat-obatan yang dilarang penggunaan-nya oleh atlet antara lain senyawa golongan stimulan,golongan narkotik-analgetik, senyawa anabolik,golongan diuretik, glukokortikosteroid, dan fJ-blocker(l).

Sejak tahun 2004, glukokortikosteroid jugadikategorikan sebagai senyawa doping, yang berartibahwa penggunaan glukokortikosteroid dengan cara

http://www.univpancasila.ac.id 8/20

Vol. 4, 2006

apapun dilarang, misal dengan cara pemberian peroral, per rektal, dan suntikan intravena maupunintramuskular. Cara pemakaian yang lain, seperti:topikal di sekitar anus, telinga, kulit, inhalasi; intraartikular, hi dung, dan mata, hams disertai suratketerangan dokter(l).

Glukokortikosteroid adalah senyawa antiinflamasiyang kuat, umumnya dipakai untuk mengobati kondisiinflamasi kronik, seperti arthritis, asma, inflamasisendi, dan reaksi alergi. Senyawa golongan gluko-kortikosteroid dilarang penggunaannya karena dapatmenyebabkan atropi otot, dan memiliki banyak efeksamping misalnya euforia, inotropik positif,meningkatkan tekanan darah, meningkatkan kadargula darah, retensi cairan, osteoporosis, iritasilambung, depresi, dan psikosis(2,3).Dengan adanyalarangan tersebut maka kemungkinan penggunaan-nya oleh atlet hams diawasi, dengan cara meng-analisis secara kuantitatif adanya senyawa tersebutdalam urin atlet.

Penetapan kadar senyawa glukokortikosteroiddalam urin biasanya dilakukan dengan metodekromatografi gas-spektrometri massa(4) karenamemiliki kepekaan yang tinggi dan kemampuankuantitasi yang baik. Senyawa dengan kerangka

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 61

dasar steroid seperti senyawa steroid anabolik tidakmudah menguap sehingga sulit dianalisis denganmetode kromatografi gas-spektrometri massa secaralangsung. Oleh karena itu, senyawa ini dianalisismelalui proses derivatisasi agar lebih mudahmenguap, dan dapat menghasilkan rendemen produkderivat dengan ion massa intensitas tinggi dan hasilreaksi yang konsisten(5). Metode kromatografi gas-spektrometri massa dapat digunakan untukidentifikasi senyawa melalui puncak-puncakspektrogram khas (characteristic ion) yang dihasil-kan, dan puncak yang paling tinggi pada character-istic ion dapat digunakan untuk tujuan kuantitatif dandisebut ion kuantitasi(6).

Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh satusistem penetapan kadar senyawa golonganglukokortikosteroid menggunakan metode kro-matografi gas-spektrometri massa melalui reaksiderivatisasi dan optimalisasi reaksi dengan variasisenyawa pereaksi, variasi suhu dan waktu reaksiderivatisasi (trimetilsililasi). Dalam penelitian inisebagai model senyawa glukokortikosteroid akan di-analisis dua senyawa, yaitu deksametason danmetilprednisolon (Gambar 1).

o

Gambar 1. Rumus bangun deksametason (A) =9-fluoro-ll J},17,21-trihidroksi-16a-metilpregna 1,4-diena-3,20-dion;BM 392,47; dan metilprednisolon (B) = llJ},17a,21-trihidroksi-6a-metil-pregna-l,4-diena-3,20-dion; 8M 374,5.

trimetilsilil-trifluoroasetamida (MS TFA)(Sigma);[N,0- bis( trimetilsilil )trifl uoro-asetamida (BSFTA)dan trimetilsilil-klorosilan (TMCS)] (99: 1) (Sigma).

BAHAN DAN METODE

BAHAN. Baku pembanding deksametason(BPOM), baku pembanding metilprednisolon(Sigma), metanol p.a. (Merck), amonium iodida(Merck), D3-testosteron (ASDTL) standar internal,metiltestosteron (ASDTL) kontrol eksternal, kolomSep-pak C18, dapar asetat 2M pH 5, enzim helixpomatia (Sigma), dapar karbonat pH 9, t-butil metileter p.a. (Merck). Pereaksi derivatisasi (mutu untukderivatisasi) yang digunakan adalah trimetilsilil-klorosilan (TMCS) (Sigma), N-trimetilsilil-imidazol(TMSI) (Sigma), 2-merkaptoetanol (Merck), N,O-bis(trimetilsilil)asetamida (BSA), N-metil-N-

(MSTFA)

(TMSI) (CH3hSi--N~NI~_I


62 TAMAT ET AI.Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia

Alat. Kromatografi gas-spektrometri massa(Hewlett Packard 6890 Series); evaporator vakum(BUCHI B480); timbangan (Sartorius MC210P);waterbath (GRANT SUB 14 dan Zymark Turbo VapLV Evaporator); ekstraktor (RATEK RSM 6); sentri-fuga (SAVANT Speed Vac Plus SC210A); drybath(Thermolyne 16500); pengocok (BOECO Vortex VIPlus).

Penelitian ini dilakukan di LaboratoriumPengawasan Doping, LABKESDA, DKI Jakarta.

METODE. Pembuatan larutan baku pem-banding deksametason dan metilprednisolon.Lebih kurang 1mg baku pembanding deksametasonditimbang saksama dan dimasukkan ke dalam labutentukur 10 ml, kemudian dilarutkan dan diencerkandengan metanol hingga 10 ml, kemudian dibuatlarutan pengenceran lOx dengan metanol. Dengancara yang sarna dibuat larutan baku pembandingmetilprednisolon.

Pembuatan standar internal D3Testosteron.D3-testosteron ditambahkan ke dalam sampel yangakan ditetapkan kadamya sebelum tahap ekstraksi,yang berfungsi sebagai faktor koreksi dalamperhitungan kadar senyawa yang dianalisis.

Lebih kurang 1mg baku pembanding D3-testosteron, ditimbang saksama dan dimasukkan kedalam labu tentukur 10ml. Kemudian dilarutkan dandiencerkan dengan metanol hingga 10 ml. Empatratus i llarutan dipindahkan ke dalam labu tentukur10 ml dan ditambah metanol sampai tanda.

Pembuatan kontrol metiltestosteron. Lebihkurang 1 mg baku pembanding metiltestosteronditimbang saksama dan dimasukkan ke dalam labutentukur 10ml. Kemudian dilarutkan dan diencerkandengan metanol hingga 10ml. Empat ratus i llarutandipindahkan ke dalam labu tentukur 10 ml, danditambah metanol sampai tanda.

Metiltestosteron yang ditambahkan ke dalamsampel setelah tahap ekstraksi, berfungsi sebagaikontrol eksternal terhadap sensitivitas alat saatdioperasikan.

Pengambilan blanko urin. Dalam analisis jugadigunakan blanko urin sebagai matriks yang akanditambah kedua baku pembanding dan digunakansebagai sampel pada tahap validasi metode.Pengumpulan blanko urin secara khusus adalahsebagai berikut:

(BSTFA)

(TMCS)

Sukarelawan yang akan diambil urinnya untukblanko harus menandatangani formulir persetujuanpenggunaan urin. Satu minggu sebelum pengambilanurin dilaksanakan, sukarelawan dipersiapkan untuktidak mengkonsumsi obat-obatan, vitamin, healthyfood, makanan, dan minuman seperti kopi, teh, coklat,soft drink, atau min urn an kesehatan. Urinsukarelawan dikumpulkan selama 48 jam dalam botolpenampung kemudian ditambahkan natrium azida0,1% kedalarnnya. Blanko urin disimpan di dalamfreezer(9).

Percobaan pendahuluan. Percobaan dilakukanpada 150 i llarutan baku pembanding deksametasondan metilprednisolon dalam metanol yang telahdikeringkan, menggunakan 14 macam variasikombinasi pereaksi derivatisasi masing-masing 100i 1 dimasukkan ke dalam tabung ulir, ditutup, dandipanaskan dalam dry bath pada 70C selama 90menit. Pereaksi derivatisasi yang dimaksudadalah(4,'O):(i) MSTFA-NH4I-Etantiol;(ii) MSTFA-TMSI (50:1);(iii) TMSI;(iv) TMSI-BSA-TMCS (3:3:2);(v) MSTFA-NH4I-Merkaptoetanol;(vi) sampai (xiv) adalah kombinasi TMSI dengan

[BSTFA-TMCS(99:1)] rasio (5:1); (4:1); (3:1)(2: 1); (1: 1); (1 :2); (1 :3); (1 :4); dan (1 :5).Masing-masing hasil reaksi kemudian dianalisis

dengan kromatografi gas-spektrometri massa dengankondisi kromatografi sebagai berikut:

Suhu inlet 280C; mode split; split rasio 10:1,aliran gas split 8,2 ml/menit; gas hellum, aliran gastotal konstan 12,0 ml/menit, tekanan 16,92 psi; kolomkapiler "HP Ultra 1" (crosslinked methyl siloxane),ketebalan film 0,11 flm, panjang 17 meter, diameter200 flm, aliran gas gerak 0,8 ml/menit, volume injeksi:4 fll. Suhu oven awal 180C, kenaikan suhu gradien3C/menit sampai 229C, kemudian 40oC/menitsampai 310C, dan suhu konstan selama 5 menit.

Pereaksi derivatisasi yang dipilih berdasarkanpada kriteria pereaksi yang dapat secara jelasmemberikan characteristic ion spesifik; yaitu m/z305, 345, 680 atau m/z 206, 456, 662 untukdeksametason; dan m/z 279,369,459 atau m/z 147,424,644 untuk metilprednisolon.

Pemilihan pereaksi derivatisasi. Duakombinasi pereaksi derivatisasi saja yang dipilih daripercobaan pendahuluan dan diuji lebih lanjut untukmemilih salah satu saja yang terbaik. Dua pereaksikombinasi tersebut dipersiapkan sebagai berikut:MSTFA-NH4I-Merkaptoetanol(\O). Botol bersihdisiapkan, dibilas dengan metanol dan dikeringkansatu jam pada suhu 120C. Lebih kurang 100 mg


Vol. 4, 2006

amonium iodida ditimbang seksama, dimasukkankedalam botol, dan ditambah 5 ml MSTFA.Campuran pereaksi dilar:utkan pada suhu 120Cselama dua jam, didinginkan, dan ditambah 175 i 1merkaptoetanol. Kemudian sebelas bagian pereaksiterse but di atas ditambah dengan seratus bagianMSTFA. TMSI-[BSTFA-TMCS (99:1)](2:1), duabagian TMSI ditambah satu bagian BSFTA- TMCS(99:1).

Tahapan kerja. Seratus lima puluh i 1 larutanbaku deksametason dan 150i 1 larutan bakumetilprednisolon dimasukkan ke dalam tabung reaksiulir 10 em kemudian dikeringkan pada 60C dengangas nitrogen dalam Turbo Yap.

Kemudian 100 ml pereaksi derivatisasi dimasuk-kan ke dalam tabung tersebut, ditutup, dan tabungdipanaskan dalam dry bath pada 70C selama 90menit. Hasil derivatisasi dipindahkan ke vial.

Masing-masing hasil reaksi kemudian dianalisisdengan kromatografi gas-spektrometri massa padamode full scan dengan sistem kromatografi sepertipada pereobaan pendahuluan. Data kromatogramyang diperoleh dibandingkan dan dipilih pereaksi yangmemberikan selektivitas paling baik seperti padapereobaan pendahuluan.

Data kromatogram yang diperoleh dibandingkandan dipilih pereaksi yang menghasilkan spektrogramderivat senyawa dan teridentifikasinya tiga fragmenion spesifik (characteristic ion) bagi masing-masingbaku pembanding, untuk derivat senyawa deksa-metason adalah m/z 305,345, dan 680; atau m/z 206,456, dan 662; sedang characteristic ion untuk derivatsenyawa metilprednisolon adalah m/z 279,369, dan459; atau m/z 147,424, dan 644(4).Lampiran 1 danLampiran 2 menggambarkan reaksi derivatisasi danpola fragmentasi deksametason dan metilprednisolon.

Penetapan suhu optimum reaksi derivati-sasi. Baku pembanding deksametason dan bakupembanding metilprednisolon disiapkan seperti padapereobaan pemilihan pereaksi derivatisasi, kemudianditambah 100 i 1pereaksi derivatisasi yang terpilihpada langkah pemilihan pereaksi derivatisasi. Setelahditutup, panaskan tabung dalam dry bath pada suhu60, 70, 80, atau 90C selama 90 menit. Hasilderivatisasi dipindahkan ke vial, lalu dianalisis dengankromatografi gas-spektrometri massa menggunakansistem kromatografi di atas pada mode full scan.

Pemilihan suhu reaksi derivatisasi optimumdilakukan berdasarkan spektrogram yang memilikitiga characteristic ion yang spesifik, dan denganmemplot data kelimpahan ion kuantitasi (charac-teristic ion tertinggi) terhadap suhu reaksi deri-vatisasi, kemudian dipilih suhu yang memberikankelimpahan ion kuantitasi yang tinggi dan stan dar


deviasi yang rendah. Ion kuantitasi untuk deksa-metason adalah m/z 305 atau m/z 662, dan ionkuantitasi metilprednisolon adalah m/z 147 atau m/z279(4).

Penetapan waktu optimum reaksi derivati-sasi. Pereobaan dilakukan seperti pada pereobaanpenetapan waktu optimum reaksi derivatisasi, denganpemanasan tabung pada suhu reaksi yang telah di-pilih dari pereobaan penetapan waktu optimum reaksiderivatisasi, dan dengan variasi waktu 30, 60, 90 dan120 menit.Hasil derivatisasi dianalisis dengankromatografi gas-spektrometri massa menggunakansistem kromatografi tersebut di atas pada mode fullscan.

Waktu reaksi derivatisasi optimum dipilih ber-dasarkan kelimpahan ion kuantitasi yang paling tinggidengan standar deviasi yang kecil. Kromatogramyang diuji harus memiliki waktu retensi sarna sertamemiliki characteristic ion dengan rasio kelimpahanion relatifyang konstan.

Validasi metode kromatogafi gas-spek-trometri massa. Karena deksametason danmetilprednisolon terdapat dalam matrik urin, makaanalisis kedua senyawa dilakukan melalui ekstraksidari matrik urin, kemudian derivatisasi menjadisenyawa yang non polar dan mudah menguap.Kombinasi pereaksi derivatisasi, suhu dan waktureaksi derivatisasi yang optimum selanjutnyadigunakan untuk validasi metode penetapan kadardeksametason dan metilprednisolon seeara simultandari matrik urin seeara Kromatografi Gas-Spektrometri Massa menggunakan senyawa standarinternal dan standar eksternal.

Vji linearitas. Sejumlah 12,5 i 1;25 i 1;37,5 i 1;50 i 1; dan 75 i 1 masing-masing larutan bakudeksametason dan larutan baku metilprednisolondimasukkan ke dalam 5,0 ml blanko urin. Kadar akhirmasing-masing senyawa berturut-turut adalah 25 ng/ml, 5,0 ng/ml, 75ng/ml, 100 ng/ml, dan 150 ng/ml.Masing-masing larutan dan satu blanko urin ditambah501 llarutan standar internal D3- Testosteron 4 Ilg/ml, dan dicampur homogen(lO).

Tahap pemisahan. Semua larutan di atas dielusike dalam kolom Sep-Pak CI8 yang sebelumnya telahdikondisikan dengan 3 ml metanol dan 3 mlaquabides. Kemudian kolom dieuei dengan 2 mlaquabides, dan dielusi dengan 3 ml metanol ke dalamtabung reaksi bertutup asah.

Fase metanol diuapkan dengan vakum evapo-rator, kemudian tambahkan 1ml aquabidest, 50 i 12M dapar asetat pH 5, dan 50 i 1enzim Helix pomatia;tabung ditutup dan diinkubasi dalam waterbath padasuhu 52C selama 3 jam. Setelah 3 jam tabungdidinginkan, kemudian ditambahkan 250 i 1 dapar


64 TAMAT ET AL.

karbonat pH 9, dan 5 ml t-butil metil eter, kemudiandikoeok selama 30 menit.

Tahap derivatisasi. Larutan hasil ekstraksidisentrifugasi selama 5 menit. Lapisan eterdimasukkan ke dalam tabung bertutup ulir 10 em danditambahkan 50 i Imetiltestosteron 4 ~g/ml, dieampurhomogen. Fase eter dikeringkan pada suhu 60Cdengan gas nitrogen dalam Turbo Yap. Seratusmikroliter pereaksi derivatisasi dimasukkan ke dalamtabung. Tabung ditutup dan dipanaskan dalam drybath pada suhu dan waktu optimum.

Hasil derivatisasi dipindahkan ke dalam vial, laludianalisis dengan kromatografi gas-spektrometrimassamenggunakan sistem kromatografi di atas,mode Selected Ion Monitoring (SIM).

Data kromatogram dan spektrogram dianalisisseeara kualitatif dengan melihat waktu retensi dancharacteristic ion. Persamaan garis regresihubungan antara konsentrasi senyawa (deksame-tason/metilprednisolon) sebagai absis dan rasiokelimpahan ion kuantitasi senyawa terhadapkelimpahan ion kuantitasi standar internal sebagaiordinat, serta koefisien korelasi (R) dihitung dari datakonsentrasi zat uji dengan rasio kelimpahan ionkuantitasi sampel terhadap kelimpahan ion kuantitasiD3-testosteron. Hubungan linear dinilai baik bilaharga koefisien korelasi tidak kurang dari 0,98(11).Tahap pemisahan dan tahap derivatisasi tersebut diatas akan digunakan seterusnya dalam analisis setiapkali ada sampel dalam matrw

Vol. 4, 2006 Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 65

Tabel 1. Hasil percobaan pendahuluan

Gambar 2. Reaksi Substitusi Nukleofilik (SN2) olehpereaksi trimetilsililasi.

tidak ada characteristic ion+ = Memberikan characteristic ion spesifik; yaitu m/z 305,

345, 680 atau m/z 206, 456, 662 untuk deksametason;dan m/z 279, 369, 459 atau m/z 147, 424, 644 untukmetilprednisolon.

memberikan ion m/z 305, 345, 680 untuk deksame-tason dan m/z 279,369,459 untuk metilprednisolon.Dari sembilan kombinasi konsentrasi TMSl-[BSTFA-TMCS(99:1)], hanyakombinasi (2:1) Crabell no. 9)yang memberikan kelimpahan ion paling tinggi;dengan demikian kombinasi TMSI-[BSTFA-TMCS(99:1)] (2:1) dipilih untuk digunakanseterusnya.

Pemilihan pereaksi derivatisasi berdasartotal ion chromatogram. Dengan cara yang samaseperti di atas, kombinasi pereaksi MSTFA-ONH

4I-

Merkaptoetanol dibandingkan dengan kombinasiTMSI-[BSTFA- TMCS(99: 1)] (2: 1) dan dipilih yangdapat menghasilkan kromatogram lebih baik. Darikedua kromatogram tersebut (Gambar 3 dan Gambar4) dapat dilihat bahwa kedua pereaksi derivatisasidapat memenuhi syarat selektivitas dengan baik,karena puncak dari kedua baku pembanding dapatdibedakan dari puncak yang lain.Namun, karenaterbentuknya puncak lain di sekitar puncak bakupembanding lebih sedikit pada kombinasi pereaksiTMSI-[BSTFA-TMCS (99:1)] (2:1) (Gambar 4),maka pereaksi tersebut dipilih untuk selanjutnyadigunakan dalam penelitian ini.

Suhu optimum reaksi derivatisasi. Kelim-pahan ion kuantitasi yang dimaksud sebagai kriteriapemilihan adalah respon characteristic ion tertinggi,yaitu m/z 305 untuk deksametason, m/z 279 untukmetilprednisolon, dan m/z 435 untuk D3-Testosteronseperti terlihat pad a Gambar 5.

Dari keempat suhu reaksi derivatisasi 60, 70, 80,90C sebagaimana ditunjukan pada Tabel 2 danGambar 6, diamati bahwa suhu reaksi 90C dapatmemberikan kelimpahan ion kuantitasi yang tertinggidengan koefisien variasi yang rendah, yaitu x=617306; KV=4,58% pada deksametason, dan x=1913586; KV=7,23% pada metilprednisolon.Walaupun suhu reaksi di atas 90C mungkin dapatmenghasilkan kelimpahan ion kuantitasi yang lebihtinggi lagi, percobaan tidak dapat dilakukan karenamaksimum suhu dry bath adalah 90C. Reaksiderivatisasi dan pola fragmentasi deksa-metason danmetilprednisolon sehingga dapat memberikancharacteristic ion m/z 305 untuk deksametason danm/z 279 untuk metilprednisolon, ditunjukkan padaLampiran 1 dan Lampiran 2.

Waktu optimum reaksi derivatisasi. Reaksiderivatisasi yang dilakukan dengan pereaksi TMSI-[BSTFA-TMCS(99: I)] (2: 1), pada suhu reaksi 90Cdan variasi waktu reaksi 30, 60, 90, dan 120 menit.Dari keempat waktu reaksi derivatisasi sepertiditunjukan pada Tabel 3 dan Gambar 7, diamatibahwa waktu reaksi 90 menit memberikankelimpahan ion kuantitasi yang tinggi secara simultan

++++++++++

Karakterist ikion

Pereaksi derivatisasi

MSlF A-NI--4I-Etantiol

MSlFA-TMSI (50:1)

lMSI

lMSI-BSA-TMCS (3:3:2)

MSlF A-NI--4I-Merkaptoetanol

lMSI{BSlFA-TMCS (99:1)] (5:1)

lMSI{BSlFA-TMCS (99:1)] (4:1)

lMSI-[BSlFA-TMCS (99:1)] (3:1)

lMSI-[BSlFA-TMCS (99:1)] (2:1)

lMSI-[BSlFA-TMCS (99:1)] (I :1)

lMSI-[BSlFA-TMCS (99:1)] (1 :2)

lMSI-[BSlFA-TMCS (99:1)] (l :3)



reaksi substitusi nukleofilik (SN2)dengan mekanismereaksi seperti pada Gambar 2 .

Percobaan pendahuluan. Percobaan pen-dahuluan dilakukan untuk secara cepat memilih(screening) dua pereaksi derivatisasi dari sejumlah14 kombinasi pereaksi, yang dapat secara jelasmemberikan characteristic ion.

Dari keempatbelas pereaksi yang dicoba, hanyakombinasi MSTFA-NH4I-Merkaptoetanol (Tabel 1no.5) dan TMSI-[BSTFA-TMCS (99:1)] (Tabel 1no.6-14) yang dapat memberikan spektrogram derivatsenyawa yang spesifik. Kombinasi MSTFA-NH4I-Merkaptoetanol memberikan ion m/z 206, 456, 662untuk deksametason; dan m/z 147,424,644 untukmetilprednisolon.

Kombinasi TMSI-[BSTFA- TMCS(99: 1)]

R-O:+IH


66 TAMAT ET AL.Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia

Metilprednisolon

TIC

-______ 21.28---,_ 21.83

'-",

Deksametason2e+07

pada kedua baku pembanding dengan koefisien1 bundance1.5e+07

I

1e+0744

ime->

\~l '~. I "', =; ,'''r-' I ,,?,. I' ~.. , I' i ' I' "i 'i ' .' , I'15.Q(>-:16.00.:17.00.j8.00. 19.00 20.00 21,00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00

WaktuRetensi'----'

Gambar 3. Total ion ihromatogram campuran baku pembanding deksametason dan metilprednisolon 300 ng/mldengan pereaksi derivatisasi MSTFA-NH41 merkaptoetanol.

undanceTIC

Metilprednisolon

1e-t-07

Deksametason "}

.me ...-::=o-

.--/-_."--_ . I I' I I15.00 16.00 17.00. '18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26 00 .00 28.00

Waktll::Retensi-----'"

Gambar 4. Total ion chromatogram campuran baku pembanding deksametason dan metilprednisolon 300 ng/mldengan pereaksi derivatisasi TMSI-[BSTFA-TMCS (99:1)) (2:1).

o4OWOO

350000

3lOOOO

ZiWOQ

:mllXI147

150000

100000183

5000045 103,121

...:>

Deksamelason

305

Gambar 5. Tipikal spektrum massa hasil analisis kromatografi gas-spektrometri massa derivat trimetilsilil darideksametason.


Vol.4, 2006 Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 67

73 2

Metilprednisolon

459

369

171135

311 343 395 416 439 485502 541558575591!m626 647665682 756 I l'

-> 20 40 60 SO 100 120 140 160 100 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 o4EO 480 500 520 540 560 5SO500 620 640 660 680 700 720 740 760 7eO800

200000

Gambar 5. Tipikal spektrum massa hasil analisis kromatografi gas-spektrometri massaderivat trimetilsilil dari metilprednisolon.

03- Testostemn

Gambar 5. Tipikal spektrum massa hasil analisis kromatografi gas-spektrometri massaderivat trimetilsilil dari D3-testosteron.

Tabel 2. Kelimpahan ion kuantitasi baku pembanding deksametason dan metilprednisolon (1500 ng) pada berbagaisuhu reaksi

KelimpahanIonKuantitasiSenyawa

600e 700e 800e 900e

219282 347168 360615 636990Deksametason 266569 277474 446952 584944

295376 339488 463056 629984

X 260409 321377 423541 617306

SD 38419 38214 55087 28244KV(%) 14,75 11,89 13,01 4,58

1267056 1528600 1588248 2037912Metilprednisolon 1427464 1506064 1982360 1938312

1493264 1724376 1403768 1764472

X 1395928 1586347 1658125 1913565SD 116355 120067 295558 138389KV(%) 8,34 7,57 17,82 7,23

.)


68 TAMAT ET AL. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia

Deffiamets5cn

Melilpreclnisolon

:0 "",nil III mend 00 ,"lIl1~ l~ mtnit HillmonlO+--....---,----..----r---,

o

1600000

200000

'in 1~00000.!!lE 12()OaOO!!l.. '1000000c:.'~ 800000

~ 600000.E~ ~OOOOOl

OekSametason

Melilprednisoron

ao'c 1000'C

ISOOC 70'C SOOC

Suhu

2500000

OS.!!l 2000000""0::~

1500000~Ii

1000000~!~ 500000

00

Gambar6. Hubungan kelimpahan ion terhadap suhureaksi derivatisasi

Gambar 7. Hubungan kelimpahan ion terhadap waktureaksi derivatisasi

Tabel 3. Kelimpahan ion kuantitasi baku pembanding deksametason dan metilprednisolon (1500 ng) pada berbagaiwaktu reaksi

Ke1impahan Ion KuantitasiSenyawa

30 menit 60 menit 90menit 120 menit

246664 291784 262696 240176

Deksametason 246736 251272 252520 237480

255317 271712 248608 241480

X 249572 271589 254608 239712

SD 4975 20256 7272 2040

KV(%) 1,99 7,46 2,86 0,85

1094680 1441816 1323568 1242128

Met ilpredniso10n 1098256 1201952 12%536 1361904

1095064 1532168 1376688 1260480

X 1096000 1391979 1332264 1288171

SD 1963 170656 40777 64511

KV(%) , 0,18 12,26 3,06 5,01

variasi yang cukup rendah, yaitu x = 254608,KV=2,86% pada deksametason, dan x = 1332264,KV=3,06% pada metilprednisolon. Waktu reaksi lainyang menghasilkan kelimpahan ion kuantitasi lebihtinggi atau koefisien variasi lebih rendah, tidak dipilihkarena tidak terjadi secara simultan pada deksame-tason dan metilprednisolon.

Vji linearitas metode kromatografi gas-spektrometri massa. Tabel 4 menunjukkan ke-limpahan ion kuantitasi pada berbagai konsentrasibaku pembanding deksametason (m/z 305),metilprednisolon (m/z 279) dan standar internal D3-testosteron (m/z 435), serta rasio kelimpahan ionkuantitasi baku pembanding terhadap D3-testosteronpada berbagai konsentrasi tersebut (D/D3 dan M/D3).

Kurva baku yang dibuat antara berbagai konsen-

trasi deksametason terhadap rasio kelimpahan ionD/D3 menghasilkan persamaan garis regresi y =O,013x+0,0106 (Gambar 8) dengankoefisienkorelasiR = 0,9937, yang menunjukkan bahwa ada korelasiyang baik antara konsentrasi deksametason dan rasiokelimpahan ion D/D3 dalam rentang konsentrasisampai 150 ng/ml.

Persamaan garis regresi yang dibuat dari berbagaikonsentrasi metilprednisolon terhadap rasiokelimpahan ion MlD3, adalah y = 0,0081x + 0,3067(Gambar 9) dengan koefisien korelasi r = 0,9823yang menunjukkan bahwa ada korelasi yang baikantara konsentrasi metilprednisolon dan rasiokelimpahan ion MID3 dalam rentang konsentrasisampai 150 ng/ml.

Vji ketelitian. Analisis dilakukan 5 kali peng-ulangan dengan campuran baku pembanding deksa-


Vol. 4,2006

metason dan metilprednisolon pada konsentrasi 50ng/m!. Tabel 5 menunjukkan kelimpahan ionkuantitasi deksametason, metilprednisolon, danstandar internal D3-testosteron, serta rasiokelimpahan ion kuantitasi baku pembanding terhadapstandar internal D3-testosteron. Secarasimultandiperoleh koefisien variasi sebesar 12,14%


(deksametason), dan 13,87% (metilprednisolon).Hasil ini memenuhi syarat uji presisi, yaitu koefisienvariasi tidak lebih dari 15% pada konsentrasi 100Ilg/kg-l0 Ilg/kg atau 100 ng/ml-l 0 ng/ml (12).

Vji perolehan kembali. Hasil uji perolehankembali penambahan baku pembandingdeksametason dan metilprednisolon masing-masing

Tabel 4. Kelimpahan ion kuantitasi berbagai konsentrasi deksametason, metilprednisolon, dan stan dar internalD3- testosteron

''.l~.

Kelimpahan ion kuantitasi

I Control 25 ng/ml 50 ng/ml 75 ng/ml 100 ng/ml 150ng/ml1

Deksametason 0 31072 128480 191504 294168 339840

Metilprednisolon 48775 96329 147936 148384 241016 280224

D3- Testoteron 228667 148699 197587 176321 222585 181284

DID3 0,00 0,21 0,65 1,09 1,32 1,87

MID3 0,21 0,65 0,75 0,84 1,08 1,54

D/D3 = Rasio kelimpahan ion kuantitasi deksametason (m/z 305)/kelimpahan ion kuantitasi D3-testosteron (m/z 435) .M/D3 = Rasio kelimpahan ion kuantitasi metilprednisolon (m/z 279) Ikelimpahan ion kuantitasi D3-testosteron (m/z 435).

2.52

1.5C"l

E! 1Q

0.5o

.0.5

y :: O.013x 0.0106R2= 0.9875R = 0.9937

50 100 150 200

2

15f'I

~ 1:I 0.5

oo

y= 0.0081x + 0.3067

R2= 0.9649R= 0.9823

50 100 150

Konsentrasi (nglrnl)

Gambar 8. Kurva kalibrasi, persamaan garis regresidan koefisien korelasi deksametason dalam rentang

kadar 0-150ng/ml.

Konsemasi (nglrnl)

Gambar 9. Kurva kalibrasi, persamaan garis regresi dankoefisien korelasi metilprednisolon dalam rentang

kadar 0-150ng/ml.

Tabel 5. Kelimpahanion kuantitasi pada uji ketelitian konsentrasi baku pembanding 50 ng/ml dan standar internalD3-testosteron

Kelimpahan Ion Kuanitasi Rasio Kelimpahan Ion KuantitasiPerulangan

Deksametason Metilprednisolon D3-Testosteron Dim MlD3

1 126840 170584 204962 0,62 0,83

2 153832 147936 186448 0,83 0,79

3 128480 147936 197587 0,65 0,75

4 113512 106096 176025 0,64 0,60

5 139824 133856 211457 0,66 0,63

x 0,68 0,72SD 0,08 0,10

KV(%) 12,14 13,87


70 TAMAT ET AL.

Tabel 6. Respon ion kuantitasi uji perolehankembalideksametason dan metilprednisolon

a). Konsentrasi 75 ng/ml

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia

Tabel 8. Hasil uji perolehan kembali deksametasondan metilprednisolon

a). Deksametason 100 ng/ml

Persen ketepatan rata-rata = 95,65%

SD = 7,18

KV=7,51%

PerulanganSenyawa

2 3

Deksametason 191504 217784 281008

Metilprednisolon 148384 189640 242056

D3- Testosteron 176321 237693 246976

D/m 1,09 0,91 1,14

M/m 0,84 0,80 0,98

No

1

2

3

DID3

1,27

1,32

1,15

Kadar yang diperolehkembali (ng/ml)

97,76

101,5:1-

87,65

Persenketepatan

(%)97,76

101,54

87,65

b). Konsentrasi 100 ng/ml

PerulanganSenyawa

2 3

Deksametason 339600 294168 283488

Metilprednisolon 298112 241016 286800

D3 -Testosteron 266575 222585 247249

D/m 1,27 1,32 1,15

Mlm 1,12 1,08 1,16

Tabel 7. Hasil uji perolehan kembali deksametason danmetilprednisolon

a). Deksametason 75 ng/ml

b). Metilprednisolon 100 ng/ml

Kadar yang diperolehPersen

No DID3 ketepatankembali (ng/ml) (%)1 1,12 101,33 101,33

2 1,08 97,25 97,25

3 1,16 106,12 106,12


SD=4,44

KV=4,37%

Tabel 9. Konsentrasi terkecil yang masih dapatterdeteksi dengan baik

Konsentrasi


SD = 12,27

KV = 11,54%

No

1

2

3

DID3

1,09

0,91

1,14


82,85

69,37

86,95

Persenketepatan

(%)110,47

92,49

115,94

No MetilprednisolonDeksametason (ng/ml) (ng/ml)

4,93 3,45

2 6,79 4,93

3 5,12 4,00

4 3,15 2,42

5 2,19 1,83

X 4,44 3,33

SD 1,80 1,23

b). Metilprednisolon 75 ng/ml


SD = 14,58

KV = 11,95%

No

1

2

3

DID3

0,84

0,80

0,98


69,52

64,50

85,45

Persenketepatan

(%)92,70

86,00

113,93

75 ng/ml dan 100 ng/ml dalam blanko urin dirangkumdalam Tabel 6, yaitu data kelimpl}han ion kuantitasideksametason, metilprednisolon, dan D3-testosteron.Dari Tabel6 dapat dihitung kadar deksametason danmetilprednisolon yang diperoleh kembali melaluipersamaan garis regresi kurva kalibrasi yang didapatpada uji linearitas. .

Data kadar yang diperoleh kembali dapat dilihatpada Tabel 7 dan Tabel 8. Uji perolehan kembali inimenunjukkan bahwa pada konsentrasi 75 ng/mlmaupun 100 ng/ml, secara simultan dapat mem-berikan perolehan kembali deksametason lJlaupunmetilprednisolon dengan baik sesuai persyaratan, yaitu


Vol. 4, 2006

80% - 120% (14).Uji batas deteksi. Pengolahan data uji ketelitian

pada kon~entrasi baku pembanding 50 ng/ml dapatmeng?asllkan data rasio signal/noise (SIN), yangs~lanJutnya dengan formula LOD=(5/(SIN)xC]dlgunakan untuk menghitung nilai batas deteksi.Deksametason masih dapat terdeteksi dengan baikpada kadar 4,44 ng/ml dengan SD 1,8 ng/ml,sedangkan metilprednisolon masih dapat terdeteksipada 3,33 ng/ml dengan SD 1,23 ng/ml (Tabel 9).

SIMPULAN

Metode kromatografi gas-spektrometri massamenggunakan kombinasi pereaksi derivatisasi TMSI-(BSTFA-TMCS(99:l)](2:l) pada suhu reaksi 90Cdan waktu reaksi 90 men it merupakan metode yangpeka dan teliti dengan keterulangan yang baik untukpenetapan kadar deksametason dan metilprednisolonsecara simultan.

Metode ini memberikan hubungan linier yangbaik antara konsentrasi deksametason danmetilprednisolon dan rasio kelimpahan ion kuantitasibaku pembanding terhadap kelimpahan ion kuantitasistandar internal D3-testosteron dengan koefisienkorelasi (R)=0,9937 untuk deksametason dan(R)=0,9823 untuk metilprednisolon dalam rentangkonsentrasi 0-150 ng/ml urin.

Metode juga mempunyai ketelitian yang tinggidengan koefisien variasi 12,14% untuk deksa-metason dan 13,87% untuk metilprednisolon,ketepatan yang tinggi dengan perolehan kembalideksametason 100,98% dan metilprednisolon99,55%, serta batas deteksi sebesar 4,44 ng/ml(deksametason) dan 1,80 ng/ml (metilprednisolon).Semua hasil uji validasi metode tersebut telahdikonfirmasi dengan uji anova dua arah dengan tingkatkepercayaan a = 0,01. Metode ini telah ditunjukkandapat digunakan untuk analisis senyawa glukokor-tikosteroid di dalam matrik urin.

Metode kromatografi gas-spektrometri massadengan pereaksi derivatisasi yang terpilih tersebut diatas disarankan diuji lebih lanjut untuk deteksi danpenentuan kadar senyawa glukokortikosteroid yanglain, terutama senyawa glukokortikosteroid yangtercantum dalam daftar International OlympicCommittee (IOC) tahun 2004.


DAFTAR PUSTAKA

1. Magiakou MA, Chro.usos GP. Glucocorticoid therapyand adrenal supresslOn; 2002. diambil dari: http ://www.endotext.com/adrenaVadrenaI14/adrenalframe14.htm. diakses 14 Juli, 2004.

2. Glucocorticoids. diambil dari: http://cpharm.vetmed.~.edu/vm8784/ GLUCOCORTICOIDS/glucocort.htm.dlakses 14 Juli, 2004.

3. Laboratorium Pemeriksaan Doping dan KesehatanMasyarakat. Buku panduan atlet. Jakarta: PemerintahProvinsi Daerah Khusus Ibukota Jakarta, 2004; hal. 1-2.

4. Pereira HMO, Marques MAS, Cardoso IN, Neto FRA.Derivatization study on endogenous and syntheticcorticosteroid by gas chromatography massspectrometry. Rio de Janeiro: Ladetec Doping ControlLaboratory; 2001. p.l-IS.

5. Knapp DR. Handbook of analytical derivatizationreaction. South Carolina: South Carolina'sDepartement of Pharmacology Medical University ofSouth Carolina; 1979. p.2, 9, 12.

6. Poole CF, PoUe SK. Chromatography today.Amsterdam: Elsevier Science; 1991. p. 982.

7. Departemen Kesehatan Repub1ik Indonesia.Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: DirektoratJenderal Pengawasan o.bat dan Makanan; 1995.hal.286-7.

8. Moffat AC, Clarke's. Isolation and identification ofdrug. Second edition. London: The PharmaceuticalPress; 1986. p.772.

9. Laboratorium Pengawasan Doping Jakarta. Instruksikerja pembuatan urin blanko. Jakarta: LaboratoriumKesehatan Provinsi Daerah Khusus Ibukota Jakarta;2003. hal. 1.

10. Laboratorium Pengawasan Doping Jakarta. Instruksikerja skrinning anabolik steroid dengan seppak C 18.Jakarta: Laboratorium Kesehatan Provinsi DaerahKhusus Ibukota Jakarta; 2003. hal. 3-4.

11. Badan Pengawas Obat dan Makanan. Petunjukoperasional penerapan cara pembuatan obat yangbaik. Edisi 2001. Jakarta: Badan Pengawas Obat danMakanan; 2001. hal.412-21.

12. Sumardi. Validasi metode pengujian. Jakarta: BadanStandardisasi Nasional; 2001. haLlS.

13. Sriwoelan S. Validasi dan pemilihan metode analisis.Jakarta: Prosiding Temu Ilmiah Nasional BidangFarmasi VI; 1997. ha1.17.

14. Laboratorium Pengawasan Doping Jakarta. Instruksikerja pelaksanaan validasi metode analisis. Jakarta:Laboratorium Kesehatan Provinsi Daerah KhususIbukotaJakarta; 2003. hal.l3.

15. Urine, anatomy and physiology. diambil dari http://reference. allrefer. com/ encyc lopedia/U /urinehtmldiakses 17Agustus, 2004.


72 TAMAT ET AL.Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia

Lampiran L Reaksi derivatisasi dan pola fragmentasi deksametason

Derivatisasi

+4TMS

CHOTM3

IIC-OTMS

BM 392,5 BM680

CHOTMS

IIC-OTMS

m/z 680

TMSO

TMSO

m/z 662

CHOTMS

IIC-OTMS

J:bCH3

. ITMSO ~

m/z206

TMSO

F

CHOTMS

IIC-OTMS

CH3

TMS = gugus Trimetilsilil --L-CHI 3CH3

m/z456

-=--=-----.::- -~---=.=......... --._-- ----- - ---~-~-


Vol. 4, 2006 Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 73

Lampiran 2. Reaksi derivatisasi dan pola fragmentasi metilprednisolon

CHOTMS

IIC-OTMS

Derivatisasi~

+4TMS

0 TMSOBM 374,5

,BM 662

CH3 CH3

1-,CHOTM S CHOTMS +.II +. IIC-OTMS C-OTMS

CH3

~-H2O

~

TMSO~

TMSOm/z 644 m/z 662

CH3 CH3

1CHOTMS +.II. +.C-OTMS

CH3

TMSOHO

~

m/z424 mlz 147

CH3

ITMS= gugusTrimetilsilil --Si-CH3

ICH3


Penetapan Kadar Simultan Deksametason Dan

Documents

Transcript of Penetapan Kadar Simultan Deksametason Dan