PDF Biomol Print

7/21/2019 PDF Biomol Print

1/20

Metode Deteksi Asam NukleatYuni Dwi Lestari, Teknik Kimia (1306370575)

ABSTRAK

Asam nukleat merupakan suatu polimer nukleotida yang berperan dalam

penyimpanan serta pemindahan informasi genetik. Asam nukleat terdapat pada semuasel hidup dan bertugas untuk menyimpan dan mentransfer genetic, kemudianmenerjemahkan informasi ini secara tepat untuk mensintesis protein yang khas bagimasing-masing sel. Asam nukleat, jika unit-unit pembangunnya deoksiribonukleotida,disebut asam deoksiribonukleotida (DNA atau deoxyribonucleic acid) dan jika terdiri- dariunit-unit ribonukleaotida disebut asam ribonukleaotida (RNA atauribonucleic acid). Untukmelakukan pengujian terhadap keberadaan dari komponen asam nukleat dilakukanmetode deteksi yaitu secara kualitatif dan kuantitatif.

Kata kunci : hibridisasi, amplifikasi, elektroforesis, PCR, RLFP, STR, sequences,hibridisasi, flourosense, staining, blotting, spektroskopik, annealing, elongasi, polimerase,denaturisasi.

Pendahuluan

Asam nukleat terdiri atas ikatan-ikatan polimer nukleotida. Nukleotida terdiri atasgugus fosfat, gula, dan basa nitrogen. Nukleotida tersebut yang akan membentuk DNAdan RNA dari berbagai mahluk hidup baik eukariotik maupun prokariotik. Pada dasarnyaDNA dan RNA merupakan komponen penyusun kehidupan, dimana pada DNA terdapatinformasi berupa kode dan sifat genetik yang diturunkan dan RNA merupakan organelpenting dalam sintesis protein yang dibutuhkan untuk menunjang kehidupan.

Butuh waktu yang lama sampai akhirnya manusia dapat mengetahui keberadaandari dua komponen penting ini dikarenakan sistemnya yang begitu rumit. Dilihat dari

keberadaan kedua komponen asam nukleat tersebut yang vital dan kompleks, makadibutuhkan metode analisis atau deteksi yang dapat digunakan untuk mengetahuikeberadaan dari DNA dan RNA.

Analisis DNA manusia bertujuan untuk mengarakterisasi DNA seseorang untukmengidentifikasi susunan DNA-nya. Analisa DNA banyak digunakan untuk karakterisasisifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip(materi genetik) yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisis DNA ini terdiri dari tigatahap yaitu ekstraksi DNA, PCR, dan Elektroforesis. Pada dasarnya pengelompokanmetode deteksi DNA dan RNA terbagi atas dua kelompok besar, yaitu : metodeanalisis kualitatif dan metode analisis kuantitatif.

Metode Deteksi DNA dan RNA

Metode ini digunakan untuk mengetahui dan menganalisis keberadaan darizat/senyawa yang akan dianalisis, metode ini terdiri atas :

1. Metode Kuantitatif DNA dan RNA

Metode ini bertujuan bukan hanya untuk mengetahui keberadaan/komposisi darisample atau bahan uji, tetapi menentukan secara matematis berapa konsentrasi atau


2/20

kadar dari bahan tertentu dari suatu sampel. Dimana dalam hal ini berarti dapat diketahuiberapa kadar atau konsentrasi dari DNA/RNA yang di uji.

A. Metode Spektroskopi UV-Vis

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapatdideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadangmerupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna denganpenambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpapreparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasiatau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih danlarut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Alat ini menggunakan duabuah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible.Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuksample tak berwarna. DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat

menyerap cahaya UV.

B. Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR merupakan salah satu metode dalam menganalisis DNA dimana metode inimemanfaatkan salah satu sifat DNA yang dapat direplikasi. Biasanya, dalam analisisDNA, diperlukan jumlah DNA yang tidak sedikit. Oleh karenanya, diperlukan metode PCRyang fungsi utamanya ialah melakukan penggandaan DNA dengan bantuan enzimpolymerase. Penggandaan ini dilakukan pada bagian atau daerah tertentu dari suatuDNA template. PCR berlangsung dalam 20 hingga 40 siklus.

PCR terdiri atas beberapa siklus dimana pada setiap siklus terjadi penggandaanmateri genetik dan jika siklus ini dilakukan berulang-ulang, maka materi genetik yangdiperoleh akan menjadi banyak sehingga mempermudah deteksi keberadaannya. Secaraumum, PCR dilakukan sebanyak 25-35 siklus. Dalam prosesnya, PCR melibatkan variasisuhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase yang tetap stabildalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakanberasal dari bakteri Thermusaquaticus(Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari90 oC.

Komponen dari PCR itu sendiri terdiri atas DNA polimerase. DNA Polimerase adalahsebuah enzim yang mengkatalisasi reaksi polimerisasi deoksiribonukleotida menjadirantai DNA, dengan kata lain enzim ini mengkatalisasi reaksi pembentukan DNA. DNA

polimerase membaca rantai pada DNA template untuk dibentuk rantai baru. Rantai baruyang telah dicetak memiliki molekul primer yang identik dengan rantai yang lama. Sesuaidengan tujuan utamanya yaitu untuk melakukan penggandaan, maka dibutuhkan DNAPrimer. Yaitu sepasang DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai inisiator pemanjanganrantai DNA ketika polimerisasi DNA sekaligus pembatas pemanjangan rantai DNA ini.Dalam penggandaannya, PCR hanya mampu menggandakan daerah tertentu pada DNAsepanjang 10000 bp saja (dengan teknik tertentu dapat mencapai 40000 bp). Primerdirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang
http://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Polimerisasihttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Deoksiribonukleotida&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Deoksiribonukleotida&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Polimerisasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzim


3/20

agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.Untuk melakukan metodePCR dibutuhkan dNTP yang berfungsi sebagai penyusun DNA yang baru. Terdapat 4jenis dari dNTP, dNTP berguna untuk menjadi bahan dasar untuk pembuatan rantai DNAyang baru.

Pada PCR terdapat tiga tahapan utama, yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi.

Diawali dengan tahapan denaturisasi, pada tahap ini dilakukan pada temperatur yangtinggi sehingga untai ganda DNA dapat dipisahkan. Rentang temperatur yang dianjurkanialah 92o C hingga 95o C pada rentang waktu antara 30 - 60 detik. Pemisahan ini akanmengakibatkan DNA menjadi berbentuk utas tunggal.

Selanjutnya yaitu tahapan annealing, pada tahap ini, temperatur sistem diturunkanhingga kisaran 40 - 60 o C pada rentang waktu antara 20-40 detik setelah DNA menjadiutas tunggal. Bersamaan dengan itu, primer dibiarkan menempel pada DNA templatepada tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

Tahap terakhir adalah elongasi. Elongasi merupakan tahap dimana untai DNA akandiperpanjang. Proses pemanjangan ini tentu dibantu oleh enzim polimerase dimana

pemanjangannya akan dilakukan sampai ke ujung. Proses pemanjangan ataupembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basanukleotida yang ditargetkan. Kisaran temperatur yang digunakan ialah antara 70-72 o C(temperatur dimana enzim polimerase bekerja secara optimum). Lamanya waktuekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnyaadalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.


4/20

Gambar 1.Prosedur Metode PCRSumber :www.affemetrix.com

Analisis produk dari PCR dapat dilakukan secaraex-vitro (dilakukan di luar tabungPCR, misalnya : elektroforesis gel, hibridisasi DNA) maupun in-vitro(dalam tabung PCR

dan selama reaksi PCR berlangsung). Kedua teknik tersebut membutuhkan produk PCRyang telah di visualisasikan sebelum dianalisis.Visualisasi produk amplifikasi PCR:1. menandai DNA untai ganda dengan bahan pewarna kimia atau ion perak yang

berinterkalasi di antara untai ganda DNA2. labelisasi primer PCR atau nukleotida dNTP dengan bahan pewarna fluoresen

(fluorophore) atau hapten sebelum amplifikasi PCR.

Pada PCR konvensional, jumlah salinan fragmen DNA target yang terbentuk padaakhir siklus PCR yaitu pada fase plateau dengan rumus berikut :

Y = jumlah salinan DNAn = jumlah siklusx = jumlah sampel DNA awal

Real Time PCR

qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) merupakan salah satu teknikanalisis kuantitatif asam nukleat dengan memanfaatkan metode PCR. Metode qPCRsering juga dikenal dengan Real-Time PCR. Prinsip kerja dari metode qPCR miripdengan metode PCR. Yang membedakan kedua metode ini adalah pada metode qPCR,detektor langsung diberikan dalam analisis. Detektor dapat berupa pewarna fluorosen.Detektor bekerja dengan mengeluarkan cahaya fluoresen (warna hijau) yang nantinya

akan dianalisis untuk menghitung konsentrasi asam nukleat dalam sampel. Cahayafluorosen yang dilepaskan akan ditangkap oleh sistem komputasi dalam instrumentqPCR.

Gambar 2.Hasil analisis metode qPCR(Sumber : http://www.matriks.no/produkter/pcr-real-time-pcr/assays-primere)
http://www.affemetrix.com/http://www.affemetrix.com/


5/20

Kelebihan dari metode PCR adalah memiliki sensivitas yang tinggi, spesifik dalammengidentifikasi, cepat dan sederhana. Oleh sebab itu pemanfaatan PCR saat inidilakukan dalam skala yang sangat luas dan dengan variasi mesin yang terusberkembang.

C. Metode DNA Microarray

DNA Microarray adalah suatu metode yang digunakan untuk menganalisa ekspresigen dalam jumlah besar secara simultan dan dalam satu kali eksperimen saja karenametode ini dapat menyaring ribuan gen dalam satu eksperimen saja. DNA Microarray(DNA array) dikenal juga sebagai Chip-DNA. DNA Microarray terdiri dari satu set yangterdiri dari ribuan titik-titik mikroskopis DNA oligonucleotides, disebut fitur, masing-masingberisi picomoles (10-12 mol) dari sekuens DNA tertentu, yang dikenal sebagai probe(atau reporter). Ini bisa menjadi bagian pendek dari sebuah gen atau unsur DNA lainyang digunakan untuk berhibridisasi cDNA atau cRNA sampel (disebut sasaran) di bawahkondisi keketatan tinggi.

Array itu sendiri merupakan suatu susunan teratur sampel di mana pencocokan

sampel DNA diketahui dan tidak diketahui didasarkan pada aturan-aturan dasarkorespondensi. Eksperimen array memanfaatkan sistem assay umum sepertimicroplates atau immunoblotting standar membran. Ukuran sampel spot umumnyakurang dari 200 mikron diameter biasanya berisi ribuan bintik-bintik.

Prinsip di balik inti microarray adalah hibridisasi antara dua untai DNA, milikkomplementer sekuens asam nukleat pasangan secara khusus satu sama lain denganmembentuk ikatan hidrogen yang saling melengkapi antara pasangan basa nukleotida.

a)


6/20

b)

Gambar 3a) proses hibridisasi target ke probe, b) langkah pembuatan microarray.Sumber : http://www.transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php

1. Proses produksi microarray

Fragmen DNA yang diperkuat dengan teknik PCR diletakkan pada glass slidemikroskop dilapisi dengan polylysine sebelum proses spotting. Pelapisan polylysine inibertujuan untuk memastikan fiksasi DNA melalui interaksi elektrostatik. Persiapan slidedicapai dengan memblok polylysine tidak terfiksasi pada DNA untuk menghindari bindingtarget. Sebelum hibridisasi, DNA didenaturasi untuk memperoleh untai tunggal DNA padamicroarray, ini akan memungkinkan probe untuk mengikat untai komplementer daritarget.

2. Persiapan target

RNA diekstraksi dari 2 kultur berbeda dimana untuk dibandingkan tingkat ekspresi.mRNA ditansformasi menjadi cDNA dengan reverse transcription. Pada tahap ini, DNAdari kutur 1 pertama dengan pewarnaan hijau, sedangkan DNA dari kultur 2 diberi labeldengan pewarna merah.

3.Hibridisasi

cDNA berlabel hijau dan merah dicampur bersama-sama (hal ini disebut target)kemudian diletakkan pada matriks untai tunggal DNA (hal ini disebut probe). Chip ini
http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=id&langpair=en%7Cid&u=http://transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php&prev=/translate_s%3Fhl%3Did%26q%3Dprinsip%2Bkerja%2BDNA%2Bmicroarray%26tq%3Dworking%2Bprinciple%2Bof%2BDNA%2Bmicroarrayhttp://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=id&langpair=en%7Cid&u=http://transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php&prev=/translate_s%3Fhl%3Did%26q%3Dprinsip%2Bkerja%2BDNA%2Bmicroarray%26tq%3Dworking%2Bprinciple%2Bof%2BDNA%2Bmicroarray


7/20

kemudian diinkubasi satu malam pada suhu 600. Pada suhu ini, strand DNA bertemudengan untai komplementer dan cocok bersama untuk menciptakan untai ganda DNA.DNA fluorescent akan terhibridisasi.

Gambar 4. Hibridisasi pada microarraySumber : http://www.imgarcade.com

4. Scanning slide

Laser tertarik pada setiap titik dan emisi fluorescent akan bergabung melaluiphoto-multiplicator (PMT) untuk bersatu dengan mikroskop konfocal. Disini terlihat 2image dimana skala abu-abu memperlihatkan intensitas fluorescent. Jika kita menggantiwarna abu-abu dengan warna hijau untuk image yang pertama dan warna merah untukimage yang kedua. Dengan menempatkan kedua image ini, ada satu image pada titikhijau (dimana hanya DNA dari kondisi pertama terfiksasi) berubah menjadi merah(dimana DNA dari kondisi kedua yang terfiksasi) melewati warna kuning (dimanamerupakan DNA dari 2 kondisi terfiksasi dnegan jumlah yang sama).

5.Analisis data

Terdapat 2 image microarray dimana harus dihiitung jumlah molekul DNA padasetiap kondisi. Untuk mengukur jumlah sinyal pada panjang gelombang emisi warna hijaudan jumlah sinyal pada emisi panjang gelombang warna merah . Kemudian jumlah inidinormalkan sesuai dengan parameter ( jumlah ragi pada percobaan ini dalam setiapkondisi kultur). Dengan menganggap bahwa jumlah DNA fluorescent yang terfiksasisebanding dengan jumlah mRNA yang hadir di setiap sel kemudian dihitung rasio merah /hijau fluoresensi. Jika rasio ini lebih besar dari image 1 (telihat merah pada gambar),ekspresi gen lebih besar dalam kondisi percobaan kedua, jika rasio ini lebih kecil dari 1( terlihat hijau pada gambar), ekspresi gen yang lebih besar pada kondisi pertama.
http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=id&langpair=en%7Cid&u=http://transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php&prev=/translate_s%3Fhl%3Did%26q%3Dprinsip%2Bkerja%2BDNA%2Bmicroarray%26tq%3Dworking%2Bprinciple%2Bof%2BDNA%2Bmicroarrayhttp://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=id&langpair=en%7Cid&u=http://transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php&prev=/translate_s%3Fhl%3Did%26q%3Dprinsip%2Bkerja%2BDNA%2Bmicroarray%26tq%3Dworking%2Bprinciple%2Bof%2BDNA%2Bmicroarray


8/20

Gambar 5: Analisis data pada metode microarraySumber : http://www.slideshare.net

7. Ekspresi pengelompokan profil

Kemudian untuk mengumpulkan gen yang memiliki profil ekspresi yang sama padabeberapa eksperimen. Pengelompokan ini dapat dilakukan secara bertahap sebagaianalisis filogenetik, yang terdiri dari penghitungan kesamaan kriteria antara ekspresiprofil dan pengumpulan yang paling mirip. Kita juga dapat menggunakan teknik yanglebih kompleks seperti analisis komponen utama atau neuronal networks. Pada akhirpengelompokan biasanya ditampilkan sebuah matriks dimana setiap kolom mewakili satuekpresimen dan setiap baris gen. Rasio ditampilkan berkat skala warna dari hijau(repressed gen) menjadi merah (induced gen).
http://transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/images/cluster.gif


9/20

Gambar 6. Metode pengelompokan dataSumber : http://www.slideshare.net

2. Metode Kualitatif DNA dan RNA

Metode ini merupakan metode yang bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu

zat yang akan dideteksi dari suatu sampel. Metode kualitatif berfokus pada penampakandari zat yang tertentu tanpa disertai penambahan metode matematis yang dapatdigunakan untuk pengukuran kadar zat tersebut. Untuk metode kuantitatif deteksi DNAmaka metode ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan dari suatu DNA yang dapatberupa beberapa kelompok nukleotida tertentu yang harus ditemukan/dipisahkan untukberbagai aplikasinya.

A. Metode Spektroskopi NMR

Spektroskopi NMR didasarkan pada penyerapan gelombang radio oleh inti-intitertentu dalam molekul organik, apabila molekul tersebut berada dalam medan magnetyang kuat. Pada asam nukleat terdapat purin dan pirimidin yang keberadaannya dapat

dideteksi dengan NMR. Deteksi dengan NMR ini menunjukkan ada tidaknya DNA/RNAdalam sampel yang kita uji melalui ada tidaknya purin dan pirimidin dalam sampel. PadaDNA, purin terdiri dari adenin dan guanin sedangkan pirimidin terdiri dari sitosin dan timin.Sedangkan pirimidin pada RNA berubah terdiri dari urasil dan timin. Berikut adalah tabelyang menunjukkan keberadaan basa-basa tersebut dengan metode spektroskopi NMR.

Gambar 7. Rentang unsur kimia pada asam nukleatSumber : http://bioc.aecom.yu.edu/
http://bioc.aecom.yu.edu/http://bioc.aecom.yu.edu/


10/20

B. Elektroforesis Gel.

Metode ini mulai dilakukan awal tahun 1970. Metode ini pada dasarnya adalah untukmengukur panjang DNA dan tingkat kemurnian dari molekul-molekul penyusun suatuDNA atau RNA. Metode ini merupakan pengembangan lebih lanjut setelah terbukti dapatmemisahkan rantai-rantai pada protein. Metode dari tahapan pemisahan menggunakan

elektroforesis gel untuk asam nukleat jauh lebih sederhana daripada metode untukmemisahkan protein, karena pada dasarnya setiap nukleotida yang menjadi penyusunasam nukleat sudah memiliki muatan yang bersifat negatif. Pemisahan eletroforesis baikuntuk RNA ataupun DNA pada dasarnya menggunakan gel poliakrilamida.

Dengan menggunakan gel poliakrilamida ini dapat memisahkan nukleotida padaDNA dan RNA berdasarkan panjang dari masing-masing nukleotidanya. Gelpoliakrilamida diketahui memiliki pori-pori yang sangat kecil, sehingga sangat sulit untukdilalui oleh DNA dengan ukuran yang cukup besar, oleh sebab itu dalam penggunaanyagel agarose lebih sering digunakan karena memiliki pori-pori yang jauh lebih besar.Sehingga sesuai untuk dilalui oleh molekul DNA dan RNA. Gel Agarose adalah sejenispolisakarida yang diisolasi dari ganggang laut.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, danlistrikdialirkan kepadanya.Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satukutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal ini asam nukleat, arah pergerakanadalah menuju elektrode positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangkagula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleatbenar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natriumhidroksida atauformamidadigunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus.

Metode elektroforesis gel berpulsa mampu mengadakan perubahan teratur terhadaparah dari medan maget tersebut. Sehingga molekul-molekul tersebut dipaksa untuk

mengubah orientasi geraknya, perubahan tersebut menyebabkan laju dari molekul yangberukuran besar menjadi lebih lambat, dibandingkan dengan molekul yang lebih kecil.Sehingga terjadi perbedaan kecepatan dalam mencapai kutub positif dari gel tersebutdan menyebabkan molekul DNA dan RNA terpisah menjadi bentuk pita-pita. Selanjutnyasetelah masing-masing pita terpisah, dilakukan hibridisasi dengan menggunakan DNAprobe yang telah di tandai. DNA probe adalah suatu fragmen DNAatauRNAatauproteinpelacak target gen. DNA probe yang telah dilabel (flourosense, ehidium bromida,radiosiotop) akan berkomplementasi dengan target melalui hibridisasi sehingga dapatmendeteksi keberadaangendilacak.
http://id.wikipedia.org/wiki/Larutan_penyanggahttp://id.wikipedia.org/wiki/Listrikhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kutub_listrik&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Muatan_listrikhttp://id.wikipedia.org/wiki/Elektrodehttp://id.wikipedia.org/wiki/Gulahttp://id.wikipedia.org/wiki/Fosfathttp://id.wikipedia.org/wiki/Natrium_hidroksidahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Formamida&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/RNAhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Protein_pelacak&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Genhttp://id.wikipedia.org/wiki/Genhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Protein_pelacak&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/RNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Formamida&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Natrium_hidroksidahttp://id.wikipedia.org/wiki/Fosfathttp://id.wikipedia.org/wiki/Gulahttp://id.wikipedia.org/wiki/Elektrodehttp://id.wikipedia.org/wiki/Muatan_listrikhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kutub_listrik&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Listrikhttp://id.wikipedia.org/wiki/Larutan_penyangga


11/20

Gambar 8.Metode elektroforesis gelSumber : http://www.slideshare.net

C. Metode DNA Sekuensing

Metode pengurutan DNA ini merupakan tahap lanjutan setelah dilakukan pemurnian.

Metode ini bertujuan untuk mengurutkan urutan DNA yang lengakap untuk ratusan genpada mahluk hidup. Jumlah informasi yang terkandung dari urutan DNA ini mencapaijutaan nukleotida sehingga untuk melakukan analisis dan penyimpanan data dibutuhkankomputer. Contohnya jika DNA dari virus Epstein Barr di rentangkan maka akanmengandung lebih dari 10^5 pasangan nukleotida.

Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuanurutanbasa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenalsebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasarsuatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untukpembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untukmenentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara

membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.

Sampai saat ini terdapat dua metode pengurutan DNA yang penerapannya sudahsangat luas. Yaitu metode kimiawi dan metode enzimatik. Pada dasarnya baik metodeenzimatik ataupun kimia adalah untuk menentukan urutan nukleotida yang dikenali olehprotein pengikat DNA. Pada dasarnya protein-protein tersebut memiliki peran pentingdalam menentukan gen-gen mana yang aktif dalam suatu sel tertentu dengan caramengikatkan diri ke rangkaian-rangkaian DNA pengatur. DNA pengatur biasanya beradadi bagian luar daerah penyandi dalam sebuah gen.

Metode Sekuensing Secara Kimia.

Biasa dikenal dengan Metode Maxam-Gilbert. Pada metode ini fragmen-fragmenDNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanyamenggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3.Metode maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untaitunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin.Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkanfragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basadimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akanmemetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis Cdan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja padaC. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan

ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C. Dari hasil dapat diketahui sekuensfragmen DNA yang dipelajari atas dasar laju migrasi masing-masing pita. Seperti halnyapada elektroforesis gel agarosa, laju migrasi pita menggambarkan ukuran fragmen.Makin kecil ukuran fragmen, makin cepat migrasinya. Dengan demikian, ukuran fragmenpada contoh tersebut di atas dapat diurutkan atas dasar laju/posisi migrasinya. Jadi,kalau diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar, hasilnya adalahfragmen-fragmen dengan ujung TTGCCCCGCGTGGCGCAAAGG. Inilah sekuensfragmen DNA yang dipelajari.
http://id.wikipedia.org/wiki/Basa_nukleotidahttp://id.wikipedia.org/wiki/Nukleotidahttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Sekuens_DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Genhttp://id.wikipedia.org/wiki/Genomhttp://id.wikipedia.org/wiki/Makhluk_hiduphttp://id.wikipedia.org/wiki/Makhluk_hiduphttp://id.wikipedia.org/wiki/Genomhttp://id.wikipedia.org/wiki/Genhttp://id.wikipedia.org/wiki/Sekuens_DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Nukleotidahttp://id.wikipedia.org/wiki/Basa_nukleotida


12/20

Metode Secara Enzimatik.

Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif. Metode Sanger padadasarnya memanfaatkan dua sifat sub unit enzim DNA polimerase yang disebut fragmenklenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA denganadanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika

molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gulapentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OHpada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jikaddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, makapolimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujungmolekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.

Berdasarkan prinsip tersebut sekuensing DNA menggunakan metode dideoksidilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehinggapolimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi jugaditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti ditempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan.

Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil sekuensing tersebut dilakukanelektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sehingga akan terjadi perbedaan migrasisesuai dengan ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya diketahui, dilakukanpengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek hingga yang paling panjang, yaitufragmen dengan ujung C (satu basa) hingga fragmen dengan ujung G (sembilan basa).Dengan demikian, misalnya hasil sekuensing yang diperoleh adalah CCACGTATG.Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan yang komplementer dengan hasilsekuensing ini, yaitu GGTGCATAC.

Metode Dye Terminator

Pada metode yang Sanger asli urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkandengan membuat secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salahsatu dari empat jenis basa pemutus rantai pada masing-masing reaksi.Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk dideteksi dengan menandai(labelling) primer yang digunakan dengan fosfor radioaktif sebelum reaksi sekuensingdilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesis pada empat lajuryang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida.

Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macam primer yang ditandaidengan pewarna berpendar (fluorescent dye). Hal ini memiliki kelebihan karena tidakmenggunakan bahan radioaktif; selain menambah keamanan dan kecepatan, keempathasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel. Metode ini

dikenal sebagai metode dye primer sequencing.

Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebutmetode sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh prosessekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksiterpisah yang diperlukan pada penggunaan primer berlabel. Pada cara tersebut,masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens,yang berpendar padapanjang gelombangyang berbeda-beda.
http://id.wikipedia.org/wiki/Fosforhttp://id.wikipedia.org/wiki/Radioaktifhttp://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesishttp://id.wikipedia.org/wiki/Fluoresensihttp://id.wikipedia.org/wiki/Radioaktifhttp://id.wikipedia.org/wiki/Panjang_gelombanghttp://id.wikipedia.org/wiki/Panjang_gelombanghttp://id.wikipedia.org/wiki/Radioaktifhttp://id.wikipedia.org/wiki/Fluoresensihttp://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesishttp://id.wikipedia.org/wiki/Radioaktifhttp://id.wikipedia.org/wiki/Fosfor


13/20

Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karenalebih sederhana dan lebih murah. Primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabelsecara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untuk primer yang dibuat untuk sekali pakai),walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan universal primer.

Gambar 9 .a) Proses DNA sequensing b) Interpretasi urutan nukleotida pada komputer.

D. Metode Hibridisasi

Hibridisasi bisa terjadi antara :1. DNA target dengan pelacak cDNA/mRNA (disebut Southern Blot Technique)2. RNA target dengan pelacak RNA/DNA (disebut Northern Blot Technique)

Southern Blot

DNA utas ganda dipisahkan menjadi utas tunggal kemudian dicampur sebelumyadidinginkan dan ditempelkan kembali. Jika terdapat molekul DNA yang original yangmempunyai sekuen yang mirip. Utas tunggal dari berbagai banyak bagian dengan utaslawannya dari berbagai DNA molekul. Lawan itu diketahui sebagai proses hibridisasi dandapat digunakan utuk menentukan berbagai sekuen, dipisahkan sampel yang


14/20

berhubungan dari DNA dan RNA.

Percobaan hibridisasi, yang diartikan digunakan untuk mengetahui sekuen DNA ataugen yang digunakan untuk memilih sampel atau memilih DNA yang mirip. Molekul probeSouthern blot digunakan untuk menentukan hubungan DNA dengan DNA yang lainnyadari berbagai sumber. Metode ini diawali dengan persiapan sampel yaitu sampel DNA

yang dicampur dengan enzim restriksi sehingga menghasilkan fragmen DNA restriksi.Karena kekuatan selektif dari hibridasi asam nukleat, materi awal untuk analisi dapatberupa seluruh genom organismenya. Gel hasil dari elektroforesis gel ditempatkan diatasspons yang dicelupkan dalam larutan alkali. Diatas gel diletakkan membran filter danmaterial absorban secara berturut-turut seperti tumpukan kertas.

Bila diperjelas susunan tumpukkan dari bawah ke atas yaitu spons yang direndamdalam larutan alkali- gel - membran filter nitroseluler material adsorban. Larutan alkalimenyebabkan DNA mengalami denaturasi menjadi rantai tunggal. Larutan alkali ini jugamengalami suatu perpindahan menuju ke material absorban melalui proses kapilarisasi.Saat larutan alkali melewati gel, fragmen rantai tunggal DNA yang dibawa berikatandengan membran nitroselulosa nitroselulosa sehingga membran filter memiliki cetakan

fragmen-fragmen DNA yang sama persis posisinya dengan yang ada di gel tetapi lebihmudah untuk dianalisis lebih jauh.

Selanjutnya adalah proses hibridisasi dengan probe radioaktif. Suatu larutan yangberisi molekul probe radioaktif diinkubasi dengan filter yang mengandung rantai tunggalDNA. DNA probe berhibridasi (berpasangan basa) dengan DNA komplementer padafilternya, DNA sisanya dibilas. Proses pemasangan probe dengan DNA komplementerrantai tunggal menjadi DNA rantai ganda ini adalah hibridisasi. Selanjutnya filter inidiletakkan pada film fotografik. Radioaktivitas pada probe yang terikat memapar filmuntuk membenuk bayangan yang sesuai dengan pita DNA spesifik-pita yangmengandung DNA yang berpasangan basa dengan probe itu.

Gambar 10. Metode Southern BlottingSumber : Garland Science 2010


15/20

Northern Blot.

Teknik ini pada dasarnya hibridisasi asam nukleat, perbedaannya pada RNA sebagaitarget. Probe sama dengan southern blot dengan target adalah mRNA. Didalam eukariotpemilihan mRNA lebih efisien karena genomic DNA tidak mempunyai intron yangmungkin interference yang mengikat probe untuk mengoreksi sekuen. Dasarnya, teknik

ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak menggunakan perlakuandenaturasi dengan asam kuat. Tahapan yang digunakan dalam metode ini yaitu:pemisahan mRNA dengan elektroforesis, dipindahkan kedalam membrane nylon dandiinkubasi dengan probe yang utas tunggal. Probe yang sebelumnya dilabel denganbiotin atau digoxigenin atau radioaktif. Membran kemudian diperlihatkan difilem atausubstrad kromegenic. Variasi dari hibridisasi nortnblot adalah dengan teknik blot titikdimana sampel tidak diseparasi berdasarkan ukuran. Melalui teknik ini mudah dilakukanhanya dengan membrane ditetesi dengn mRNA dan probe. Sepertihalnya sourthern blotDNA harus dibuat utas tuggal sebelum dblot. Sebelum ditetesi dengan DNA sampel makaprobe terlebih dahulu untuk menghibridisasi probe. Kemudian membrane difisualisasikandi filem. Jika probe dan DNA atau RNA target mirip maka filem akan berwarna hitam. Dotblot sangat mudah dan cepat untuk menentukan sampel target yang berhubungan

dengan sekuen sebelum dilakukan percobaan sesungguhnya.

Gambar 11. Metode Northren Blotting(Sumber :www.textmed.com)

Sourthen dari perkawinan molekul DNA untuk menentukan jika sebuah sempelmempunyai kehomologian dengan probe. Northen menentukan jika sampel mempuyaikesamaan dengan DNA probe didalam jumlah genom banyak, menggunakan mRNAlebih efisien karena intron sudah hilang

E. Spektroskopi IR ( Infra Red)

Spektroskopi IR merupakan suatu teknik analisis spektroskopi molekuler yangmemanfaatkan sinar infra merah. Teknik ini berguna untuk mengetahui gugus fungsipada senyawa organik. Prinsip kerja dari spektroskopi IR adalah menembakan sinar inframerah (panjang gelombang diantara 0,75 1000 m) pada sampel. Senyawa yangdiradiasikan akan menyerap sebagian energi. Energi yang diserap akan membuatgerakan vibrasi molekuler apabila energi pada ikatan gugus fungsi sama dengan energiyang diserap.
http://www.textmed.com/http://www.textmed.com/


16/20

Proses-proses yang dilakukan untuk melakukan analisis spektroskopi IR adalah sebagaiberikut:

1. Melakukan preparasi sampel dan meletakan sampel pada ruang sampel pada alatdan meletakan standar/referensi (bila ada) pada ruang referensi.

2. Menembakan sinar infra merah pada senyawa (dan referensi). Sinar akan

diteruskan ke monokromator dan detektor. Detektor akan memberikan spektra IRdari sampel (dan referensi). Hasil spektra kemudiaan akan dianalisis dandibandingkan.

Gambar berikut merupakan contoh spektra IR untuk DNA dan beberapa senyawalainnya:

Gambar 12. Spektra IR untuk DNA dan Beberapa Senyawa Lain

(sumber: sitemaker.umich.edu)

Keuntungan dari teknik spektroskopi IR adalah hasil analisis teliti karenamenggunakan referensi. Keuntungan lainnya adalah analisis dapat berjalan baik untukDNA, RNA, maupun protein. Namun, teknik ini memiliki kerugian yang salah satunyaadalah peralatan yang mahal.

F. Metode STR (Short Tandem Repeats ) Analisis.

STR merupakan polimorfisme DNA yang terjadi karena adanya 2 atau lebihnukleotida yang berulang. Pola pengulangannya adalah terdiri dari 2-10 bp dan terjadipada daerah intron dari DNA. Short Tandem Repeats (STR), potongan pendek DNA yangterjadi dalam pola berulang yang sangat berbeda antar individu. Dengan menganalisaloci dari STR dan menghitung berapa banyak perulangan dari sekuen STR yang terjadi di

setiap locus, maka dapat terbaca profil genetik yang unik dari setiap individu. Analisadengan STR memerlukan teknik PCR dan elektroforesis gel agarosa. Dengan PCRdaerah polimorfik dari DNA diamplifikasi dan kemudian fragmen STR dipisahkan denganelektroforesis agarosa sehingga jumlah perulangan yang terjadi dapat dihitung denganmembandingkan perbedaan ukuran dengan alelic ladder. Analisa dengan STR ini tidakdapat dilakukan apabila 2 individu merupakan kembar monozigot.


17/20

Gambar 13. Metode STRSumber : http://www.slideshare.net

G. Metode RFLP(Retriction fragmen length polymerishme)

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Southern blotting juga dapatdigunakan untuk menganalisis susunan genom yang menghasilkan pola pemotonganrestriksi yang berbeda. RFLP adalah perbedaan pada sekuens DNA homolog yang dapatdideteksi dari keberadaan fragmen DNA yang berbeda panjang setelah pemotongan

dengan enzim restriksi tertentu. Pemotongan DNA dari individu berbeda dengan satuenzim restriksi tidak selalu menghasilkan fragmen-fragmen yang sama karena beberapaarea restriksi polimorfik, yakni dapat hadir pada satu individu tetapi tidak hadir padaindividu lain akibat satu perubahan saja pada sekuens nukleotida menyebabkan enzimrestriksi tidak mengenali area restriksi tersebut. Ada atau tidaknya area polimorfikditentukan dari ukuran-ukuran fragmen yang dideteksi dengan Southern blotting.

Probe RFLP adalah sekuens DNA yang berhibridisasi dengan satu atau lebihfragmen sampel DNA yang telah dipotong, yang kemudian menghasilkan pola blottingunik untuk genotip tertentu pada lokus tertentu. Probe RFLP biasa digunakan untukpemetaan genom dan analisis kelainan pada hereditas.


18/20

Gambar 14.Metode RFLP(Sumber: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml)

H. Metode AmpFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism).

DNA profilling dengan menggunakan teknik AmpFLP memiliki beberapa keunggulan,yaitu lebih cepat daripada analisa dengan RFLP dan biaya yang dibutuhkan lebih murah.Teknik ini berdasarkan pada polimorfisme VNTR untukmembedakan alel yang berbeda.Teknik ini menggunakan PCR untuk mengamplifikasi daerah VNTR dan kemudian hasilamplifikasi dipisahkan dengan gel poliakrilamid dandiwarnai dengan teknik silverstained . Salah satu locus yang sering digunakan dlamteknik ini adalah locus D1S80.


19/20

Summary

Jadi pada dasarnya metode yang digunakan untuk mendeteksi asam nukleat(DNA/RNA) terbagi atas metode kuantitatif dan kualitatif. Dimana dari setiap metodetersebut memiliki prinsip kerja, prosedur dan hasil analasis yang berbeda beda.Pemilihan metode yang tepat haruslah disesuaikan dengan kebutuhan dalam hasil output

yang ingin didapatkan. Metode kualitatif menghasilkan data berupa pendeteksiankeberadaan DNA/RNA dalam sampel, pengelompokkan berdasarkan ukuran darifragmen DNA itu sendiri. Metode pada deteksi kualitatif adalah spektrometer UV VIS,spektrometer NMR, elektroforesis gel, southern dan northern blotting, STR, RLSFP.Elektroforesis gel merupakan salah satu metode dasar yang digunakan sebagaipengembangan dari metode lain seperti southern blotting dan lain-lain. Sedangkanmetode kuantitatif merupakan suatu metode yang menghasilkan data kuantitatif berupajumlah dari DNA yang diperbanyak. Metode pada deteksi kuantitatif yaitu microarray,PCR. PCR merupakan metode dasar dari setiap metode kuantitatif, dimana PCR terdiriatas berbagai jenis dalam pengolahan datanya. Dari semua metode yang dapatdigunakan, tahap penting dalam menganalisis DNA/RNA ini adalah melakukanpemurnian dan pemotongan DNA dan RNA menjadi fragmen-fragmennya.

Reference

Anonim. (2008)Deteksi dan Identifikasi DNA. [Online] Tersedia di:>[diakses pada 18Februari 2014]

Alberts B. (1994).Biologi Molekuler Sel. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama.

Campbell. (2002).Biologi. Jakarta : Penerbit Erlangga.

Cox, Michael M., David L. Nelson. 2008. Principles Of Biochemistry. Fifth edition. London:Lehninger.

Fatchiyah. (2012)Buku PraktikumTeknik Analisa Biologi Molekuler. [Online]Tersedia di:[diaksespada 17 Februari 2014].

Koolman, Jan, Klaus-Heinrich Rochm. 2005.Color Atlas of Biochemistry. Second Edition.German: Thieme.

Lister Hill National Center for Biomedical Communications. (2014). Genetics HomeRefernece. U.S National Library of Medicine

Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S L., Matsudaira, P., Baltimore, D., & Darnell, J. (2000).Molecular cell biology (4th ed.). New York: W. H. Freeman.

National Human Genome Research Institute. 2011. DNA Microarray Technology. [online]
http://jurnal.unpad.ac.id/akuatika/article/download/507/593http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/http://www.whfreeman.com/http://www.whfreeman.com/http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/http://jurnal.unpad.ac.id/akuatika/article/download/507/593


20/20

Tersedia di : [Accessed 22 February 2015]

Nelson, David L. Lehninger Principles of Biochemistry. New York : W.H Freeman andCompany.

Nicholas M, Nelson K.2013. North, South, or East? Blotting Techniques.Journal of

Investigative Dermatology, [online]. Tersedia di: [ accesed 26 February 2015]

Oseana. (2005)Mengenal Metode Elektroforesis.[Online] Tersedia di:>[diakses pada 18 Februari 2014]

Schmid F. 2001. Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry.Encyclopedia of Life Sciences, [pdf]. Available at: [Accessed 24 February2015]

University of California School of Medicine, 2006. Blotting.Molecular Methods Web

Module, [online]. Tersedia di [accessed 26 February 2015]

Yuwono, Triwibowo. 2005.Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.
http://www.nature.com/jid/journal/v133/n7/full/jid2013216a.htmlhttp://biomol.edublogs.org/kompetensi/bahan-ajar-20092010/bab-x-perpustakaan-gen/http://biomol.edublogs.org/kompetensi/bahan-ajar-20092010/bab-x-perpustakaan-gen/http://www.nature.com/jid/journal/v133/n7/full/jid2013216a.html

PDF Biomol Print

Documents

Transcript of PDF Biomol Print