BPP BIOMOL

BUKU PENUNTUN PRAKTIKUM MODUL BIOLOGI MOLEKULER

SEMESTER II

FAKULTAS KEDOKTERANUNIVERSITAS PALANGKA RAYA

TAHUN AJARAN 2014/2015

Buku Penuntun Praktikum (BPP), Modul Biologi Molekuler, FK UNPAR 2014/20151

KATA PENGANTAR

Bidang biologi molekuler terus menjadi bagian yang paling menarik dan dinamis ilmu pengetahuan dan diperkirakan akan mendominasi abad ke-21. Hanya dengan menyelidiki fenomena biologis pada tingkat molekuler adalah mungkin untuk memahami mereka secara rinci. Pemahaman demikian sangat penting untuk kemajuan di bidang kedokteran, dan industri farmasi yang memproduksi obat baru dan obat sangat bergantung pada biologi molekuler. Biologi molekular juga berkontribusi pada pemahaman kita tentang apa yang manusia dan bagaimana mereka masuk ke dalam alam semesta ini. Membandingkan asam amino dan urutan nukleotida manusia dengan orang-orang dari organisme lain hanya bisa mengkonfirmasi bahwa manusia adalah salah satu bagian sangat kecil dari dunia kehidupan.

Protein dan asam nukleat adalah subyek utama dari biologi molekuler. Mereka membawa, mengirim, dan mengekspresikan informasi genetik yang menentukan setiap organisme hidup. Di jantung biologi molekuler adalah teknik yang digunakan untuk memahami makromolekul kompleks. Asam nukleat memiliki keuntungan besar bahwa para anggota dari setiap jenis berperilaku hampir identik, terlepas dari urutan nukleotida mereka tetapi terutama tergantung pada panjang mereka. Akibatnya, teknik yang sama kemungkinan besar akan berhasil dengan salah satu dari mereka, dan resep dan kit yang tersedia untuk banyak eksperimen rutin dan pengukuran. Sebaliknya, protein sangat individualistik, dan banyak teknik biasanya harus bervariasi untuk diterapkan untuk setiap protein spesifik. Dalam hal ini, sangat penting untuk memahami dasar biologi dan kimia teknik. Bahkan dalam hal asam nukleat, protein, lipid dan karbohidrat satu harus menyadari bagaimana dan mengapa pekerjaan teknik, dan ketika tidak, agar tidak keliru kesalahan dalam interpretasi hasil yang diperoleh hanya mengikuti resep.

Materi Praktikum:Buku Penuntun Praktikum (BPP), Modul Biologi Molekuler, FK UNPAR 2014/2015

2

1. Isolasi DNA2. Polymerase Chains Reaction (PCR)3. Electroforesis DNA 4. Karbohidrat dalam Kehidupan Organisme 5. Lipid6. Protein

Materi Praktikum:ISOLASI DNA


POLYMERASE CHAINS REACTION (PCR)ELEKTROFORESIS DNA

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS PALANGKA RAYA


Isolasi DNA dari Darah Vena

Pendahuluan

Sampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit dianalisis, karena strukturnya yang panjang dan secara kimiawi monoton. Sebagai materi genetik suatu organisme nukleotida hanya dapat dianalisis secara tidak langsung melalui analisis urutan protein dan RNA atau melalui analisis genetic. Kini menjadi hal yang mungkin untuk mengisolasi suatu region spesifik dari suatu genome, yaitu total informasi genetic yang dimiliki oleh suatu organisme; dan untuk memproduksi jumlah kopi yang tidak terbatas dari region tersebut, atau untuk mendeterminasi urutan nukleotida dari region tersebut hanya dalam semalam, dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per detik.

Teknologi rekombinan DNA yang menjadi pusat kegiatan dalam aktifitas Bioteknologi, merupakan suatu teknik yang menggabungkan suatu segmen DNA dengan DNA yang lain, telah menjadi pengetahuan yang memberikan banyak manfaat bagi kehidupan manusia, seperti dalam produksi vaksin dan hormone. Aktifitas utama dalam teknik rekombinan DNA, antara lain:

1. Memotong DNA pada tempat (site) yang spesifik dengan enzim restriksi nuclease. Dengan teknik ini, dimungkinkan untuk mengisolasi dan memanipulasi gen secara individual.

2. Kloning DNA dengan menggunakan suatu vector atau teknik Polymerase Chains Reaction (PCR), yang memungkinkan suatu


molekul DNA dapat dikopi untuk meghasilkan jutaan molekul identik.

3. Hibridisasi asam nukleat, teknik untuk menemukan urutan DNA atau RNA yang spesifik dengan tingkat akurasi yang tinggi berdasarkan kemampuannya mengikat urutan asam nukleat komplemennya

4. Pengurutan (sequencing) semua nukleotida dari fragmen DNA yang telah dipurifikasi. Bertujuan untuk mengidentifikasi gen dan memperkirakan urutan asam amino yang membentuk protein.

5. Pemantauan (monitoring) tingkat ekspresi suatu gen di dalam sel dengan menggunakan teknik mircroarry asam nukleat.

Tujuan Praktikum- Mengisolasi DNA dari darah vena dengan menggunakan kit Wizard genomic DNA purification

Metodologi1. Alat

a. Microcentrifuge tube 1,5 mlb. Micropipet 0,5-10 ul, 10-100 ul, 100-1000ulc. Tip birud. Tip kuninge. Tip putihf. Vortexg. Microcentrifugatorh. Inkubatori. Spuit disposable 5 ml.

2. Bahana. Wizard® Genomic DNA Purification Kit 100 isolations A1120, yang

terdiri dari:- Cell Lysis Solution


- Nuclei Lysis Solution- Protein Precipitation Solution- DNA Rehydration Solution- RNase Solution

b. Isopropanolc. Alkohol 70%d. Heparine. Darah vena 5 ml

3. Cara KerjaAda empat (4) tahap dalam proses isolasi/purifikasi DNA dari sel:

a. Melisiskan sel dengan cell lysis solutionb. Melisiskan inti sel dengan nuclei lysis solution, kemudian

(optional) menguraikan/merusakan molekul RNA dengan RNase solution

c. Mempresipitasikan protein dengan protein precipitation solutiond. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh

Urutan cara kerja:1. Masukan 900 ul cell lysis solution ke dalam tabung

microcentrifuge steril2. Tambahkan 300 ul darah dan tabung diputar bolak balik 5-6 kali

untuk homogenasi3. Inkubasi campuran diatas selama 10 menit dalam suhu ruang

(bolak balik 2-3 kali selama inkubasi).4. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang

selama 2 menit.5. Buang supernatan tanpa mengganggu pellet 6. Tambahkan 600 ul cell lysis solution ke pellet dan vortex

sebentar.7. Ulangi tahap 4 dan 5 sampai pellet terlihat putih


8. Tambahkan 300 ul nuclei lysis solution ke pellet. Pipet larutan 5-6 kali untuk melisiskan sel darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental. Jika masih terlihat butiran-butiran kecil setelah pencampuran, inkubasi campuran tersebut pada suhu 37 oC sampai butiran tersebut hilang.

9. Optional. Tambahkan 1,5 ul RNase solution dan campurkan dengan cara membolak balik tabung. Inkubasi campuran pada suhu 37 oC selama 15 menit, lalu dinginkan pada suhu ruang.

10. Tambahkan 100 ul protein precipitation solution ke dalam lisate dan vortex selama 20 detik. Setelah divortex akan terlihat butiran-butiran protein halus.

11. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000rpm selama 4 menit pada suhu ruang. Akan terlihat pellet dengan warna coklat terang. Bila supernatant masih berwarna coklat , ambil supernatant tersebut, pindahkan ke tabung microcentrifuge bersih, ulangi langkah 10 dan 11.

12. Pindahkan supernatant ke dalam tabung microcentrifuge bersih yang sudah berisi 300 ul isopropanol.

13. Bolak balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA).

14. Untuk optimalisasi, simpan tabung pada suhu -20 oC selama 1 jam.

15. Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 3 menit. Akan terlihat pellet putih.

16. Buang supernatant, cuci dengan 400 ul alcohol 70% dingin.17. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit

pada suhu ruang, sampai DNA berubah menjadi transparan.18. Buang supernatant, kering anginkan DNA pada suhu ruang.19. Larutkan DNA dengan 100 ul rehydration solution.20. Rehidrasi DNA pada suhu 65 oC selama 1 jam atau pada

suhu 4 oC overnight.Buku Penuntun Praktikum (BPP), Modul Biologi Molekuler, FK UNPAR 2014/2015

8

21. Simpan DNA pada suhu -20 oC.

Polymerase Chains Reaction (PCR)Pendahuluan

Polymerase Chains Reaction (PCR) adalah teknik/metode in vitro untuk mensintesis asam nukleat dengan cara mereplikasi atau mengamplifikasi suatu segmen DNA yang spesifik. Metode ini membutuhkan pasangan primer oligonukleotida, yang akan menentukan fragmen DNA mana yang akan di amplifikasi. Dengan metode ini, DNA dapat diamplifikasi sampai jutaan kopi dengan cepat dan tepat. Produk dari PCR merupakan suatu fragmen DNA yang cukup untuk digunakan pada kloning gen, digesti DNA dengan enzim restriksi, elektroforesis dan sekuensing.

Prinsip dasar suatu PCR adalah: Pangasangan primer menghibridisasi sekuens komplemen target pada rantai DNA yang sebelumnya telah terdenaturasi. Sintesis DNA kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase di sepanjang daerah diantara primer. PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi sample pada 3 temperatur yang berbeda pada 3 tahap, dalam suatu siklus PCR; yaitu tahap:1. Denaturasi Dengan pemanasan 95 oC rantai ganda DNA akan terpisah, karena

panas dapat merusak ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar.

2. Penempatan/pemasangan primer (annealing)


Primer ditempatkan/dipasang pada tempat yang sesuai (berkomplementer dengan rantai tungal DNA) melalui proses pembentukan ikatan hidroksi. Untuk proses pemasangan primer ini dibutuhkan temperature yang berbeda dari setiap primer.

3. Perpanjangan (extension) Setelah primer ditempatkan pada posisi yang tepat, dimulailah

proses pemanjangan rantai baru DNA yang komplementar, dengan

bantuan enzim DNA polymerase, sehingga terbentuk suatu fragmen rantai ganda

DNA yang spesifik. Enzim yang stabil pada temparatur tinggi ini akan membantu proses penempatan nukleotida yang dibutuhkan sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA. Temperatur optimal yang dibutuhkan untuk proses ini adalah 72 oC. Proses ini dapat diulang melampaui beberapa siklus (biasanya 23 – 35 siklus). Kopi dari fragmen target spesifik yang diperoleh dapat dihitung dengan rumus 2n, dimana n adalah jumlah siklus dari amplifikasi yang dilakukan.

Metode PCR bermanfaat untuk :- mendeteksi penyakit yang disebabkan oleh adanya kelainan gen- mengidentifikasi gen yang menyebabkan kanker atau tumor- mengidentifikasi DNA dari sample yang sangat sedikit pada kasus forensic- mempelajari ekspresi gen suatu gen dan mutagenesis


Gambar 1. Amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR. Dimulai ketika dua rantai DNA terpisah karena adanya pemanasan (tahap 1). Setelah terpisah, dengan adanya penurunan suhu kedua, primer menghibridisasi rantai komplemennya (tahap 2). Inkubasi reaksi dengan enzim DNA polymerase dan dNTP menyebabkan sintesa DNA terjadi, dimulai dari kedua primer (tahap 3). Prosedur PCR dilakukan berulang, fragmen DNA baru akan menjadi cetakannya.

Tujuan praktikumMengamplifikasi atau memperbanyak fragmen gen reseptor

hormone FSH dengan teknik PCR (Polymerase Chains Reaktion)

Metodologi1. Bahan-bahan yang diperlukan:

a. DNA rantai ganda yang diperoleh dari praktikum Isolasi DNA.b. Primer (Oligonukleotida) yang terdiri dari primer up stream dan down stream.


Karakteristik primer menentukan keberhasilan suatu reaksi PCR. Primer dapat didisain sendiri menurut kebutuhan, dengan memperhatikan kriteria-kriteria berikut ini:

- Komposisi pasangan basa G-C diusahakan sekitar 50 % - Basa-basa yang terdapat pada kedua primer sebaiknya tidak berkomplementasi, untuk mencegah terbentuknya dimmer

primer - Panjang primer sebaiknya 20 – 30 nukleotida

Dalam praktikum ini digunakan primer dari urutan gen reseptor Vitamin Dc. Enzim DNA polimerase yang dapat mengkatalisis polimerisasi nukleotida (dNTP)mulai dari primer memanjang ke arah 3’ terminal. DNA polmerase merupakan enzim yang stabil terhadap pemanasan dan pendinginan berkali-kali, yang diisolasi dari bakteri, seperti Thermus aquaticus (tag polimerase).d. Deoxynucleotide triphosphat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP,

dGTP dan dTTP.e. Larutan buffer dan garam sebagai sumber ion

2. Cara Kerja

Dalam praktikum ini digunakan kit PCR core system (Promega)a. Buatlah larutan campuran untuk PCR dalam suatu tabung reaksi PCR yang terdiri dari:

No Komponen Volume (µL) Konsentrasi akhir

1. MgCl2 25mM 5 2.5mM

2. 5x Green GoTaq 10 1x

3. dNTP 1 200µM


4. Primer upstream 1 1 µM

5. Primer downstream 1 1 µM

6. GoTaq polymerase 0.25 1.25 U/50µl

7. DNAtemplate 10

8 ddH2O 21.75

Total 50

Catatan: volume air yang ditambahkan bervariasi, tergantung jenis enzim dan larutan buffer yang digunakan, serta konsentrasi masing-masing larutan yang diperlukan dalam PCR tersebut.

b. Campurkan larutan tersebut dengan baik (dengan menggunakan vortex)c. Memprogram mesin PCR (Thermocycler) dengan profil (30 siklus) sebagai berikut:

Tahapan Temperatur (ºC) waktu Jumlah siklus

Denaturasi awal 94 5.00 1 siklus

Denaturasi 94 0.30

30 siklusAnnealing 56 0.30

Ekstensi 72 0.30

Ekstensi akhir 72 7.00 1 siklus

Penyimpanan 4 1 siklus

d. Letakkan tabung reaksi PCR pada mesin PCR dan jalankan (on) program yang telah dibuat.

e. Setelah selesai reaksi PCR, ambil tabung reaksi dan DNA hasil amplifikasi siap dinilai melalui gel elektroforesis DNA.


Gel Elektroforesis DNAPendahuluan

Molekul DNA atau suatu fragmen DNA yang telah di amplifikasi dapat dipisahkan berdasarkan ukuran atau besarnya pasangan basanya melalui gel elektroforesis. Deteksi fragmen DNA tersebut dapat dilakukan dengan cara mewarnai gel dengan suatu zat yang dapat meng-interkalasi rantai ganda DNA, yaitu misalnya dengan ethidiumbromida. Metoda pemisahan/separasi DNA secara luas digunakan untuk tujuan analisis molekul DNA atau tujuan preparatif.

Tujuan praktikum1. Melakukan elektroforesis DNA hasil isolasi dari darah vena dan

hasil amplifikasi, dengan gel agarosa 2. Melakukan analisis hasil elektroforesis total DNA genom manusia

dan hasil amplifikasi fragmen gen dengan metode PCR.

Metodologi1. AlatSatu set alat elektroforesis DNA berikut power supply, yang terdiri dari:

- chamber elektroforesis- tray elektroforesis- sisir- power supply

2. Bahan- Larutan hasil isolasi DNA darah vena- Larutan hasil PCR (produk PCR)- Larutan TAE 1x (Tris-base, glacial acetic acid dan EDTA)- Marker DNA + loading dye- Ethidiumbromida

3. Cara kerjaBuku Penuntun Praktikum (BPP), Modul Biologi Molekuler, FK UNPAR 2014/2015

14

a. Timbang agarosa bubuk untuk membuat 1,5% gel agarosa dalam larutan TBE (catatan: 1,5 % untuk DNA yang panjangnya 300-1000bp).

b. Masak larutan agarosa tersebut sampai mendidih dan larut semuac. Biarkan larutan tersebut dingin sampai kira-kira 70 oC, kemudian

masukkan 5 ul 0,1% ethidiumbromida.d. Tuang larutan agarose ke dalam tray elektroforesis yang telah

disiapkan terlebih dahulu dan dipasangi sisire. Biarkan agarose dingin dan mengerasf. Sementara menunggu sampai mengeras, siapkan larutan untuk

marker DNA dengan larutan loading dye dengan komposisi: - 2 ul loading dye + 3 ul larutan marker DNA + 3 ul ddH2Og. Setelah gel agarose mengeras, pasang tray berikut isinya ke

dalam chamber elektroforesis, ambil/cabut sisir pada gel, kemudian tuang larutan TAE sampai melebihi permukaan gel.

h. Masukkan larutan DNA hasil PCR ke dalam sumur yang terbentuk dari sisir yang telah terangkat, secara hati-hati dan perlahan.

i. Hubungkan alat elektroforesis tersebut dengan power supply yang telah diatur dengan voltase 90 volt selama 1 jam.

j. Amati pita-pita (bands) yang terbentuk dengan menggunakan UV transluminator, dan apabila diperlukan dapat difoto dengan kamera langsung jadi.


Gambar 2. Gambaran Skematik proses elektroforesis.


http://en.wikipedia.org/wiki/File:Agarose-Gelelektrophorese.png

Materi Praktikum:Karbohidrat dalam Kehidupan Organisme

LipidProtein


FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS PALANGKA RAYA

KARBOHIDRAT DALAM KEHIDUPAN ORGANISME

PendahuluanKarbohidrat memiliki banyak peran pada makhluk hidup.

Polisakarida berfungsi untuk penyimpanan energi (pati dan glikogen), dan sebagai komponen struktural (selulosa pada tanaman dan kitin dalam arthropoda). Ribosa 5-karbon monosakarida merupakan komponen penting dari koenzim (ATP, FAD, dan NAD) dan sebagai RNA, deoksiribosa terkait komponen dari DNA. Saccharides dan turunannya termasuk banyak biomolekul penting lainnya yang memainkan peran kunci dalam sistem kekebalan tubuh, pemupukan, mencegah patogenesis, pembekuan darah, dan pengembangan sistem tubuh manusia. Untuk mengetahui adanya karbohidrat dalam sel mahluk hidup dilakukan dengan menggunakan tes molish, tes benedict, tes barfoed, selliwanoff

1. Tes Molisch

Tujuan :

Merupakan test umum karbohidrat

Prinsip :

Karbohidrat dengan asam sulfat pekat menghasilkan senyawa furfural. Senyawa furfural dengan pereaksi alfa naftol menghasilkan senyawa yang berwarna ungu. Hasil negatif merupakan suatu bukti bahwa tidak ada karbohidrat.

Cara kerja :

2 ml larutan monosakarida dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diberikan 3 tetes pereaksi Molisch. Kocoklah. Miringkan tabung tsb sekitar 45 derajat, kemudian tambahkan dengan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung reaksi itu, sehingga tak bercampur. Jangan dikocok. Reaksi positif ditandai oleh pembentukan suatu cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan cairan.


Ulangi percobaan dengan larutan disakarida dan polisakarida. 2. Tes Benedict

Tujuan:

Mengetahui sifat reduksi karbohidrat

Prinsip :

Larutan tembaga dalam suasana basa akan direduksi oleh gula yang mempunyai gugus aldehida atau keton bebas dan akan terbentuk endapan kupro-oksida yang berwarna merah. Larutan Benedict mengandung kupri sulfat, natrum karbonat dan natrium sitrat.

Cara kerja :

Masukkan 1 ml larutan Benedict ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 2 mL larutan glukosa atau fruktosa. Masukkan ke dalam penangas air mendidih selama 3 menit, dinginkan perlahan-lahan. Perhatikan apakah ada endapan yang terbentuk. Adanya endapan menandakan reaksi positif.Percobaan diulangi terhadap larutan laktosa atau malltosa dan sukrosa.

3. Modifikasi tes Barfoed

Tujuan :

Membedakan monosakarida dan disakarida.

Prinsip :

Tes ini untuk mendeteksi adanya monosakarida. Reaksi Barfoed berlangsung dalam suasana asam. Reagen Barfoed mengandung larutan kupri asetat yang ditambah dengan asam laktat. Monosakarida akan memberikan warna biru tua.

Cara kerja :

2 tetes larutan glukosa + 18 tetes H2O dalam tabung reaksi, kemudian tambahkan 1 ml larutan barfoed .Panaskan dalam


penangas air mendidih selama tiga menit. Dinginkan dalam gelas kimia yang berisi air selama lima menit. Tambahkan 1 ml pereaksi posfomolibdat. Warna biru tua menunjukan adanya mono sakarida atau jumlah di sakarida yang sangat berlebihan dalam larutan yang diperiksa. Ulangi percobaan terhadap sukrosa, laktosa dan air sebagai blanko.

4. Tes Selliwanoff

Tujuan :

Membedakan karbohidrat yang mempunyai gugus keto dan aldehid

Prinsip :

Karbohidrat atau turunannya (4-hidroksi metil furfural) dengan resorsinol menghasilkan senyawa yang berwarna merah.

Cara Kerja :

Masukan 2 ml larutan glukosa ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 2 ml pereksi Selliwanoff. Campur dan panaskan dalam penangas air mendidih selama 60 detik. Perhatikan warna yang terjadi. Ulangi percobaan ini terhadap larutan fuktosa dan sukrosa .

LIPID

Pendahuluan

Lipid memiliki peran penting dalam organisme hidup, seperti struktur membranel Cell, Merupakan penghalang bagi sel, control fluiditas membran, Kontrol aliran material masuk dan keluar dari sel, Energi penyimpanan (misalnya, lemak disimpan dalam jaringan adiposa), Lipid seperti hormon steroid dan eicosanoids memediasi komunikasi antara sel, Sinyal transduksi - fungsi dalam transmisi informasi dalam sel, vitamin Lipid - diperlukan untuk metabolisme, biasanya sebagai koenzim. Untuk mengetahui adanya lipid dalam sel organism dilakukan dengan metode Hubl


Tes Hubl

Tujuan :Mengetahui ikatan tak jenuh dalam suatu lipid.

Prinsip :

Lipid dapat mengalami reaksi adisi. Untuk menentukan adanya ikatan rangkap, sampel direaksikan dengan larutan Hubl.Berkurangnya warna merah larutan Hubl, menunjukan adanya ikatan rangkap.

Cara kerja :

Masukkan ke dalam tabung reaksi 2 ml minyak, tambahkan 2 tetes larutan Hubl , kocok.

PROTEIN

PendahuluanPeran protein dalam organisme hidup dan genetika yang paling

penting adalah sebagai struktur strain protein yang membantu kita untuk memahami bagaimana kehadiran protein benar-benar mempengaruhi kita. Hal ini hanya dapat dipahami pertama, kehadiran dan kebutuhan protein, mengapa protein dibutuhkan dalam tubuh. Protein memainkan peran penting dalam siklus hidup dan kualitas hidup manusia. Tergantung pada peran dan obligasi dan struktur asam amino, protein dalam membran sel berperan sebagai saluran untuk memfasilitasi difusi. Pengangkutan aktif yang dihasilkan datang karena protein globular. Protein memfasilitasi difusi dan bertindak sebagai transporter. Protein mengikat dengan molekul glukosa untuk mengangkut mereka ke sisi lain dari membran. Hal ini memudahkan glukosa untuk melepaskan diri. Protein, pada organisme hidup, memainkan peran saluran untuk mentransfer molekul sesuai dengan kualitas listrik dan kimia. Untuk mengetahui adanya protein dalam mahluk hidup dapat dilakukan beberapa test, diantaranya melalui reaksi biuret, reaksi millon, pengarud alcohol terhadap air, 1. Reaksi Biuret

Tujuan :Buku Penuntun Praktikum (BPP), Modul Biologi Molekuler, FK UNPAR 2014/2015

21

Mengetahui adanya ikatan peptida pada protein

Prinsip :

Proten dengan tembaga hidroksida membentuk kompleks berwarna ungu.

Cara kerja : 2 ml larutan albumin dicampur dengan 2 ml NaOH dan tambahkan 5 tetes larutan CuSO4 , kocok. Ulangi percobaan ini dengan larutan kasein.

2. Reaksi Millon

Tujuan :

Untuk mengetahui gugus mono hidroksi benzen dalam sampel

Prinsip :

Reaksi ini bergantung adanya derivat mono hidroksi benzen seperti tirosin dan fenol. Reaksi ini akan terganggu dengan adanya ion klorida atau amonium.

Cara kerja : Dalam tabung reaksi, campurkan 2 mL albumin dangan 3 tetes

reagen Millon. Panaskan 5 menit. Adanya endapan merah menunjukan positip reaksi Millon. Ulangi percobaan dengan gelatin dan kasein.

3. Pengaruh alkohol terhadap protein.

Tujuan : Mengetahui pengaruh alkohol terhadap protein.

Prinsip :Protein dapat membentuk presipitat dengan alkohol. Penambahan air, dapat menyebabkan protein akan jernih kembali. Percobaan ini menunjukan sifat reversibilitas protein.

Cara kerja :


2 ml larutan albumin dicampur dengan 3 ml alkohol, kemudian tambahkan 5 ml air. Percobaan diulangi terhadap gelatin.

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODA BIURET

1. Pendahuluan : Di alam protein terdapat dalam 3 ( tiga ) bentuk, yaitu ;

a. Protein bebas.b. Protein yang tidak terlarut , terdapat dalam tulang, otot, rambut dan gumpalan darah.


SAMPEL

1 mL NaOH + 2 tetes CuSO4

KARBOHIDRATPROTEIN

UNGU

1. Millon2. Alkohol

BIRU

1. Molisch2. Barfoed3. Benedict4. Seliwanoff

c. Protein terlarut, terdapat banyak dalam bahan pangan seperti susu, telur dan daging.

Kadar protein terlarut dapat ditentukan berdasarkan pada berbagai metoda, misalnya : titrasi formol, spektrofotometri dan sebagainya. Teknik spektrofotometri yang biasa digunakan untuk analisis protein antara lain adalah dengan metode biuret.

2. Prinsip Reaksi Dalam suasana basa, zat yang mengandung dua atau lebih ikatan peptida dapat membentuk kompleks berwarna ungu jika direaksikan dengan garam tembaga (pereaksi biuret)

3. Tujuan Untuk menentukan kadar protein terlarut dengan metode biuret

4. Bahan & Alat Larutan protein yang diselidiki (larutan sampel) dan larutan standar protein Pereaksi biuret Tabung reaksi 20 ml Spektrofotometer Kuvet 5. Cara kerja a. Persiapan larutan standar dan blanko

1. Masukkan campuran berikut ke dalam tabung reaksi 20 ml :No.

TabungVol stok standar protein 20 mg/ml

(ml)

Vol Akuades

(ml)

Vol pereaksi biuret(ml)

Konsentrasi standar protein

(mg/ml)1 - 1,00 9,002 1,00 - 9,003 0,75 0,25 9,004 0,50 0,50 9,00


Kompleks tembaga-protein(ungu)

2. Tentukan konsentrasi standar protein yang baru dan masukkan datanya ke dalam tabel di atas. b. Persiapan alat spektrofotometer

1. Panaskan spektrofotometer 30 menit sebelum digunakan2. Atur nilai absorban menjadi nol3. Atur panjang gelombang pada 550 nm 4. Masukkan larutan tabung no. 1 ke dalam kuvet (sebagai

larutan blanko) dan letakkan kuvet pada alat spektrofotometer5. Atur nilai absorban blanko menjadi 0 (100% transmitan)

c. Pembuatan kurva standar1. Masukkan larutan tabung no. 2 s/d no. 4 ke dalam kuvet2. Baca nilai absorban tabung no. 2 s/d no. 4, masukkan datanya

pada tabel di bawah ini

No. Tabung Konsentrasi standar protein

(mg/ml)

Nilai Absorban (A)

234

3. Buat kurva kalibrasi antara A dengan konsentrasi standar protein (C) pada kertas grafik atau buat persamaan garis A= mC + b

dengan : A = Nilai absorban yang diukur (A)C = Konsentrasi standar protein (mg/ml)m = Gradien garis atau dy/dxb = Nilai perpotongan garis pada sumbu y

d. Pengukuran larutan sampel1. Masukkan 1,00 ml sampel, dan 9,00 ml pereaksi biuret ke dalam

tabung reaksi 20 ml

2. Masukkan larutan sampel ke dalam kuvet3. Ukur nilai absorban larutan sampel 4. Tentukan konsentrasi larutan sampel dengan memplot nilai A

sampel pada kurva hubungan antara A dengan konsentrasi standar,

atau dengan memasukkan nilai A sampel pada persamaan garis

A= mC +


BPP BIOMOL

Documents

Transcript of BPP BIOMOL