DETEKSI PATOGEN DALAM FERMENTASI TEMPE (Salmonella dan Shigella)

Kelompok I:

Ahmad Soni (0810910002)Hiasinta Guruh (0810910010)Firli Rahma (0810910009)Yayuk Sri Rahayu (0810910070)Eka Oktavianti (0810913026)Ervina Nawa (0810913027)

LABORATORIUM MIKROBIOLOGIJURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG2010

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangBahan makanan merupakan sumber gizi bagi manusia, dan juga merupakan sumber

makanan bagi mikroorganisme. Pertumbuhan mikroorganisme dalam bahan pangan dapat menyebabkan perubahan yang menguntungkan seperti perbaikan bahan pangan secara gizi, daya cerna ataupun daya simpan makanan tersebut. Selain itu pertumbuhan mikroorganisme dalam bahan pangan juga dapat mengakibatkan perubahan fisik atau kimia yang tidak diinginkan, sehingga bahan pangan tersebut tidak layak dikomsumsi. Kejadian ini biasanya terjadi pada pembusukan bahan pangan akibat kontaminasi mikroorganisme. Secara umum, istilah keracuan makanan yang sering digunakan untuk menyebut gangguan yang disebabkan oleh mikroorganisme., mencakup gangguangangguan yang diakibatkan termakannya toksin yang dihasilkan organismeorganisme tertentu dan gangguan-gangguan akibat terinfeksiorganisme penghasil toksin. Toksin-toksin dapat ditemukan secara alami pada beberapa tumbuhan dan hewan atau suatu produk metabolit toksik yang dihasilkan suatu metabolisme. Dengan demikian, intoksikasi pangan adalah gangguan akibat mengkonsumsi toksin dari bakteri yang telah terbentuk dalam makanan, sedangkan infeksi pangan disebabkan masuknya bakteri ke dalam tubuh melalui makanan yang telah terkontaminasi dan sebagai akibat reaksi tubuh terhadap bakteri atau hasil-hasil metabolismenya. (Siagian, A., 2002). Deteksi patogen yang menunjukkan adanya bakteri kontaminan Salmonella dan Shigella dalam produk makanan dapat membahayakan konsumen. Sehingga perlu dilakukan, pengujian keberadaan Salmonella dan Shigella selama tahap perendaman kedelai, produk kedelai, dan daging ayam sangat diperlukan. Hal inilah yang melatarbelakangi dilakukannya praktikum deteksi pathogen dalam fermentasi tempe (Salmonella dan Shigella).

1.2 Rumusan Masalah 1. Bagaimana mengetahui jumlah total bakteri kontaminan yang terdapat pada beberapa bahan makanan menggunakan media KIA dan LIA?

2. Bagaimana mendeteksi keberadaan bakteri Salmonella dan Shigella pada sampel rendaman awal kedelai, akhir kedelai, produk tempe, dan daging ayam?

1.3 Tujuan Mendeteksi keberadaan bakteri kontaminan (Salmonella dan Shigella) dari air rendaman

kedelai awal dan akhir serta produk tempe.

1.4 ManfaatSetelah melakukan praktikum ini diharapkan praktikan dapat terampil menggunakan

peralatan. Serta dapat memilah-memilah produk makanan yang baik untuk kesehatan dan mengetahui mikrobia yang terlibat dalam proses pembuatan tempe.

BAB IIMETODOLOGI

2.1 Waktu dan TempatPraktikum ‘Deteksi Patogen Dalam Fermentasi Tempe (Salmonella dan Shigella)

dilaksanakan pada hari Jum’at tanggal 08 Oktober 2010 bertempatkan di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.

2.2 Alat dan BahanAlat dan Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah timbangan, mortar dan

pastle, Bunsen, Erlenmeyer, vortex, pipet ukur, tabung reaksi, cawan petri, handtally counter, air rendaman kedelai awal dan akhir, produk tempe, daging ayam, media seletif XLD agar, media Kliger Iron Agar (KIA), media Lysine Iron Agar (LIA), cat gram dan H2O2 3% dan garam fisiologis steril.

2.3 Cara KerjaSampel cair 10 ml atau sampel padat 10 gram dicampurkan dengan 90 ml larutan garam

fisiologis dan dihomogenkan sampel dengan menggunakan vortex sehingga didapatkan pengenceran 10-1 dan dilanjutkan dengan pengenceran 10-5. Suspensi dari pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5 diambil sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril yang berbeda secara aseptis. Kemudian dituangkan media XLD Agar dengan metode pour plate, diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Pengamatan koloni dilakukan setelah dikeluarkan dari inkubator dan diambil sedikit bakteri dari koloni yang dicurigai. Selanjutnya dikultur pada media NA dan dilakukan uji katalase serta pewarnaan gram. Koloni yang diduga sebagai Salmonella dan Shigella ditanam pada media KIA dan LIA tegak dan miring. Kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Amati perubahan dan pertumbuhan yang terjadi.

BAB IIIPEMBAHASAN

3.1 Analisa ProsedurSampel produk tempe seberat 10 gram, sampel rendaman awal dan akhir kedelai diambil

10 ml masing-masing sampel ditambah 90 ml akuades steril dan dihomogenkan lalu dilakukan pengenceran 10-1 hingga 10-5. Menghomogenkan sampel dengan aquadest menggunakan vortex, dan dipastikan putaran cairan sampai kebagian atas. Hal tersebut dilakukan agar sampel tercampur sempurna. Pengenceran yang digunakan adalah mengenceran 10-2, 10-3, dan 10-4 untuk air rendaman awal, sedangkan air rendaman akhir, tempe, dan daging ayam 10-3, 10-4, dan 10-5. Menggunakan pengenceran yang berbeda dikarenakan kepekatan sampel mempengaruhi ada tidaknya mikroorganisme patogen dalam sampel. pengenceran yang berbeda diambil masing-masing 10 ml yang ditambah dengan media XLD Agar menggunakan pour-plate method.

Media XLD (Xylose Lysine Deoxycholate) adalah media terbaru untuk isolasi dan identifikasi bakteri patogen yang berasal dari feses terutama Salmonella dan Shigella. Media ini lebih superior dibandingan media Salmonella-Shigella (SS) Agar untuk mengisolasi Shigella. Media ini terdiri atas campuran reagen yang dirancang secara khusus untuk terjadinya fermentasi xilosa, laktosa, dan sukrosa, dekarboksilasi lisin, dan produksi H2S sehingga dapat digunakan untuk membedakan anggota Enterobacteriaceae. Setelah dilakukan metode pour-plate maka, media XLD yang berisi sampel diinkubasi selama 24 jam. inkubasi ini bertujuan untuk mengetahui reaksi sampel yang ditumbuhkan dalam media. Sehingga, dapat dideteksi keberadaan mikroorganisme patogen.

Setelah 24 jam, dilakukan pengamatan bakteri yang diduga bakteri patogen, Salmonella berwarna bening dan terdapat warna hitam pada bagian tengah, sedangkan Shigella koloni berwarna bening. Apabila telah ditemukan maka, bakteri patogen tersebut dikultur dalam media NA. Kultur dalam media NA bertujuan untuk memurnikan bakteri dan memudahkan dalam uji katalase dan pengecatan gran berikutnya. Setelah uji katalase dan pengecatan gran, bakteri ditanam dalam media KIA dan LIA tegak maupun miring.

Media lysine iron agar (LIA) merupakan media diferensiasi yang digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam mendekarboksilasi atau mendeaminasi lisin dan untuk pembentukan hidrogen sulfida. Media ini digunakan untuk menumbuhkan Salmonella dan Enterobactericeae. Media ini mengandung dextrose yang digunakan dalam fermentasi karbohidrat. Indikator positif dari tumbuhnya bakteri adalah pH media di bawah 5.2 dan terjadi perubahan warna media dari ungu menjadi kuning. Kultur memproduksi hidrogen sulfat sehingga menyebabkan hitam, hal ini juga disebabkan media menjadi mengandung besi sulfida. Berikut ini komposisi dari LIA agar (Bdtechnical, 2009):

Media Kliger Iron Agar (KIA) merupakan media diferensiasi yang digunakan menentukan fermentasi karbohidrat dan gas yang diproduksi dari fermentasi. KIA sangat baik digunakan

untuk menentukan bakteri gram negatif berbentuk batang dari famili Enteribacteraceae. Yang mengalami fermentasi adalah glukosa dan menghasilkan produk yang asam. Kandungan dari KIA adalah (Soilmicrobes, 2009):• 2% polypeptone (nitrogen source)• 1% lactose (tests for fermentation)• 0.1% glucose (tests for fermentation)Setelah dilakukan penanaman pada media KIA dan LIA sampel diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. inkubasi tersebut bertujuan untuk mengetahui perubahanyang terjadi pada bakteri Salmonella dan Shigella.

3.2 Analisa Hasil Sampel rendaman awal kedelai, rendaman akhir kedelai dan tempe didapati adanya Salmonella yang memiliki bentuk sel basil, Gram negatif, dan menghasilkan uji katalase yang negatif. Dalam media LIA tegak, sampel pada rendaman awal menghasilkan H2S yang relatif lebih rendah dibanding pada rendaman akhir dan tempe. Perubahan warna pada LIA tegak dan miring menjadi ungu. Rendaman akhir pada media KIA menghasilkan H2S yang relatif tinggi dibanding pada sampel lainnya. Perubahan warna menjadi kuning kecoklatan pada media KIA tegak dan merah keoranyean pada KIA miring. Sampel rendaman awal kedelai, rendaman akhir kedelai dan tempe juga mengandung Shigella yang berbentuk basil, Gram positif. Positif dalam menghasilkan H2S dan tetap ungu pada media LIA. Sampel pada media KIA menhasilkan H2S dan terjadi perubahan warna.

Sampel rendaman awal, rendaman akhir kedelai dan tempe terdapat bakteri Salmonella berbentuk basil, Gram negatif, dan uji katalase menunjukkan positif dengan ditunjukkan munculnya gelembung udara. Terjadi perubahan warna menjadi bagian atas hitam dan ungu pada media LIA tegak dan miring. Pada media KIA tegak terjadi perubahan warna menjadi hitam pada bagian atas dan orange pada bagian bawah sedangkan pada KIA miring terjadi perubahan warna menjadi merah dan hitam. Terdapat pula bakteri Shigella yang berbentuk basil,Gram negatif. Pada media LIA terjadi perubahan warna menjadi ungu gelap yang mengindikasikan bakteri menghasilkan aktivitas H2S. Pada media KIA terjadi perubahan warna menjadi hitam pada bagian bawah dan orange pada bagian atas.

LIA merupakan media diferensiasi yang digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam mendekarboksilasi atau mendeaminasi lisin dan untuk pembentukan hidrogen sulfida. Indikator positif dari tumbuhnya bakteri adalah pH media di bawah 5.2 dan terjadi perubahan warna media dari ungu menjadi kuning. Kultur memproduksi hidrogen sulfat sehingga menyebabkan hitam, hal ini juga disebabkan media menjadi mengandung besi sulfida.

Indikator positif dari tumbuhnya bakteri pada KIA yaitu terjadi perubahan media dari warna merah menjadi warna kuning . Hal ini disebabkan adanya fermentasi glukosa. Secara umum Salmonella pada sampel menghasilkan H2S namun tidak melakukan dekarboksilasi dan aminasi lisin. Salmonella juga melakukan fermentasi anaerob yang ditunjukkan dengan uji KIA. KIA dan LIA tegak untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghasilkan H2S, sedangkan KIA miring untuk mengetahui aktivitas fermentasi dari bakteri. LIA miring digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam melakukan dekarboksilasi dan aminasi lisin.

Bakteri Salmonella berbentuk batang pendek, gram negatif, anaerob/fakultatif, tidak berspora, bergerak dengan flagella peritrichous, tidak memfermentasi adonitol dan sukrosa, tidak membentuk indol, tidak merubah urea maupun acetil-methyl carbinol. Beberapa serotipe dari Salmonella kadang-kadang sifatnya berubah menjadi bakteri yang tidak bergerak (atrichous) misalnya S. pullorum dan S. gallinarum. Genus Salmonella ini diklasifikasikan

menjadi dua spesies yaitu S. enteritica dan S. bongori. Berdasarkan perbedaan sifat-sifat biokimianya maka spesies dapat dikelompokkan lagi menjadi sub spesies, kemudian berdasarkan struktur antigeniknya subspesies dikelompokkan lagi menjadi serovar/serotipe. Menurut data di dalam database koleksi plasma nutfah mikroba di BCC, menunjukkan bahwa jumlah koleksi Salmonella sampai dengan akhir tahun 2005 sebanyak 131 koleksi, dengan variasi serotipe sebanyak 64. Sembilan puluh dua dari koleksi tersebut merupakan isolat asal Indonesia (indigenous/lokal) dengan variasi serotipe sebanyak 25 dan selebihnya sebanyak 39 koleksi berasal dari luar negeri. Plasma nutfah mikroba Salmonella dapat dimanfaatkan sebagai kandidat untuk produksi vaksin, perangkat diagnostik penyakit ternak, acuan di laboratorium pengujian, uji probiotik, penelitian lebih lanjut untuk pengembangan IPTEK dan lainnya (Chotiah, 2006).

Hal yang perlu diperhatikan untuk mempertahankan kesegaran antara lain: Penangkapan harus dilakukan hati-hati agar ikan-ikan tidak luka. Sebelum dikemas, ikan harus dicuci agar bersih dan lendir.Wadah pengangkut harus bersih dan tertutup. Untuk pengangkutan jarak dekat (2 jam perjalanan), dapat digunakan keranjang yang dilapisi dengandaun pisang/plastik. Untuk pengangkutan jarak jauh digunakan kotak dan seng atau fiberglass. Kapasitas kotak maksimum 50 kg dengan tinggi kotak maksimum 50 cm. Ikan diletakkan di dalam wadah yang diberi es dengan suhu 6-7 derajat C. Gunakan es berupa potongan kecil-kecil (es curai) dengan perbandingan jumlah es dan ikan=1:1. Dasar kotak dilapisi es setebal 4-5 cm. Kemudian ikan disusun di atas lapisan es ini setebal 5-10 cm, lalu disusul lapisan es lagi dan seterusnya. Antara ikan dengan dinding kotak diberi es, demikian juga antara ikan dengan penutup kotak (WHO, 2009).

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal

Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk pertumbuhan aerobik karena H2O2 yang dibentuk dengan pertolongan berbagai enzim pernafasan bersifat racun terhadap sel mikroba. Beberapa bakteri yang termasuk katalase negatif adalah Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, dan Clostridium (Bluefame, 2008).

Gambar 1. Hasil Pengamatan Bakteri Salmonella pada Media KIA.

Gambar 2. Hasil Pengamatan Bakteri Shigella pada Media KIA.

Gambar 3. Hasil Pengamatan Bakteri Salmonella pada Media LIA.

Gambar 4. Hasil Pengamatan Bakteri Shigella pada Media LIA.

BAB IVPENUTUP

4.1 Kesimpulan4.2 Saran

Untuk praktikum kedepan diharapkan digunakan metode modern dan tradisional agar dapat dilakukan pembanding diantara kedua metode. Termasik kelebihan dan kekurangan masing-masing dari keduanya.

DAFTAR PUSTAKA

Bdtechnical. 2009. Lysine Iron Agar. www. bd.com/ ds/ technical Center/inserts/ Lysine_Iron_Agar.pdf. Tanggal akses 11 November 2010

Bluefame.2008. Uji Biokimia http://www.bluefame.com. tanggal 11 November 2010

BPOM. 2009. Pengujian Mikrobiologi Pangan. Perpustakaan.pom.go.id /KoleksiLainnya /InfoPOM/0208.pdf. Tanggal akses 11 November 2010

Chotiah, S. 2006. Viabilitas dan karakteristik mikroba Salmonella setelah dikonservasi Dalam jangka lama (Viability and Characteristic of Salmonella After Long Periode Conservation) www. Peternakan . litbang . deptan.go.id /publikasi /semnas/pro06-145.pdf. Balai Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor 16114 Tanggal akses 11 November 2010

Siagan, A., 2002. Mikroba Patogen pada Makanan dan Sumber Pencemarannya. FKM USU. Sumatra Utara

Soilmicrobes. 2009. Kliger Iron Agar. www . soilmicrobes. net/lectures/ 3400/ Exercise% 2018_KIA.ppt. Tanggal akses 11 November 2010