Polimorfisme Gen Golongan Darah ABO Secara Keseluruhan:

Tiga Silsilah Alel Mayor Untuk Fenotip ABO yang Lazim

K. Ogasawara, M. Bannai, R. Yabe, N. Saitou, K. Nakata, M. Takenaka, K. Fujisawa, M.

Uchikawa, Y. Ishikawa, T. Juji, K. Tokunaga

Abstrak

Polimorfisme gen golongan darah ABO telah diinvestigasi pada 262 donor

sehat orang-orang jepang oleh suatu metode pencocokan untai tunggal reaksi rantai

polymerase ( PCR-SSCP), dan telah diidentifikasi 13 alel-alel yang berbeda. Jumlah

alel yang telah diidentifikasi pada setiap golongan darah yaitu 4 untuk A1

( dahulunya disebut ABO*A101, *A102, *A103 dan *A104 berdasarkan pada

pedoman untuk nomenklatur gen manusia), 3 untuk B ( ABO*B101, *B102 dan

*B103) dan 6 untuk O (ABO*O101, *O102, *O103, *O201, *O202 dan *O203).

Sequence nukleotida dari penjelasan fragmen-fragmen dengan gambaran SSCP yang

berbeda telah ditetapkan dengan sequencing secara langsung. Analisa hubungan

filogenetik mengungkapkan bahwa alel-alel tersebut dapat diklasifikasikan kedalam

tiga garis silsilah utama, *A/*O1, *B dan *O2. Pada orang-orang Jepang, telah

diamati *A102 dan *B101 merupakan alel-alel yang dominan dengan frekuensi

sebesar 83% dan 97% berturut-turut pada setiap golongan, sedangkan pada golongan

darah O, biasanya 2 alel, *O101 (43%) dan *O201 (53%). Hasil tersebut mungkin

digunakan untuk menetapkan genotif ABO, dan hal itu baru menggambarkan

indikator alel-alel ABO yang mungkin menguntungkan untuk populasi penelitian.

Pendahuluan

Gen yang menentukan golongan darah ABO tersebut, dan yang mengkode

suatu glikosiltransferase spesifik, telah diklon dan disequencing sebelumnya oleh

Yamamoto dkk. (1990). Sebagai hasil pengamatan tersebut, beberapa peneliti telah

mengembangkan metode genotyping ABO itu menggunakan analisa reaksi rantai

polimerase- restriksi panjang fragmen polimorfisme (PCR-RFLP) dan PCR spesifik

alel. Fischer dkk (1992) mengaplikasikan metode PCR-RFLP untuk mendiagnosis

keadaan golongan darah B yang didapat. Selanjutnya, Yamamoto dkk (1992, 1993)

menetapkan sequence alel-alel untuk golongan antigen yang lemah, seperti

A2,A3,B3,cis-AB, Ax dan B(A), serta tipe alel O lainnya.

Dari pengamatan tersebut, terlihat bahwa polimorfisme gen tersisa dalam

golongan darah ABO menjadi bahan penelitian. Oleh karena itu kami telah

mengembangkan suatu metode pencocokan polimorfisme untai tunggal (Single-

Strand Conformation Polimorphism/ SSCP)- PCR untuk menganalisa polimorfisme

gen golongan darah ABO secara keseluruhan.

Bahan dan Metode Penelitian

Sempel DNA

DNA genomik diperoleh dari sel leukosit darah tepi 262 donor sukarela

orang-orang Jepang yang tidak memiliki hubungan kekerabatan, dengan ekstraksi

fenolkloroform standard. Donor terdiri dari individu-individu dengan 74 golongan

darah A1, 73 golongan darah B, 61 golongan darah A1B, dan 54 golongan darah O.

Analisa dengan PCR-SSCP

Kondisi PCR dan sequencing semua primer diperlihatkan dalam Tabel 1 dan

2. Amplifikasi PCR dari empat fragmen (I-IV) dilakukan dengan 35 siklus

amplifikasi dalam 10 μl reaksi campuran PCR (Bannai dkk, 1994). Seperti yang

diperlihatkan pada Gambar 1, fragmen PCR I-IV mengcover dua exon terakhir (exon

6 dan 7) (Bennett dkk, 1995; Yamamoto dkk, 1995) dari gen ABO pada posisi

nukleotida berturut-turut 240-374, 375-564, 526-855, dan 845-1065. Keseluruhan

panjang exon 6 dan 7 adalah 826 bp (78% dari kode sequencing) sedangkan exon 1-5

adalah 239 bp (22%).

Analisa SSCP pada dasarnya dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya

(Bannai dkk, 1994), menggunakan 12,5%-15% gel poliakrilamid dengan atau tanpa

gliserol 5%. Secara singkat, 1 μl larutan DNA amplifikasi yang telah dicampur

dengan 7 μl larutan denaturasi, dipanaskan dalam temperature 95oC selama 5 menit,

dengan segera didinginkan di es; 1 μl campuran itu diletakkan pada gel poliakrilamid

elektroforesis. Salinan fragmen DNA untai tunggal dalam gel dapat diperlihatkan

dengan pewarnaan perak

.

Kelompok PCR Spesifik

Seperti ditunjukkan pada tabel 2, tiga kumpulan primer yang digunakan untuk

kelompok PCR spesifik: GS-AB dan ABO-10 untuk golongan A dan B. GS-O dan

ABO-10 untuk golongan O, dan GS-AO dan ABO-10 untuk sebagian alel A dan O.

Sense primer (GS-AB, GS-O dan GS-AO) tersebut berada pada fragmen I, dan

antisense primer 3’-terminal (ABO-10) berada pada basa 19 dari 3’-terminal fragmen

IV (gambar 1). Jadi, amplifikasi fragmen tersebut termasuk fragmen II hingga IV

secara lengkap. Kelompok PCR spesifik dilakukan dengan kondisi yang sama seperti

PCR-SSCP kecuali bahwa 5% (volumenya) dimethylsulfoxide (DMSO) dibuat untuk

PCR campuran.

Sequencing Langsung

Template DNA untuk siklus sequencing dihasilkan oleh tambahan PCR.

Untuk contoh-contoh proses hanya satu alel tunggal, fragmen-fragmen ( kira-kira 2,5

kb termasuk fragmen I sampai IV dan dua intron) diamplifikasi menggunakan

sepasang primer generik ABO-9 dan ABO-10. Untuk contoh-contoh proses dua alel

yang berbeda, suatu fragmen 737 bp (fragmen II sampai IV) diamplifikasi dengan

sepasang primer ABO-3 dan ABO-8 menggunakan hasil kelompok PCR spesifik

sebagai template. Amplifikasi DNA tersebut dimurnikan seperti contoh sebelumnya

(Bunnai dkk,1994) menggunakan 1% pelarut gel agarose bersuhu rendah (BRL,

Gaithersburg, Md., USA). Pemurnian DNA dan kemudian sequence secara langsung

sekurang-kurangnya dua kali untuk setiap petunjuk dengan satu metode siklus

sequencing dengan primer yang sama seperti yang digunakan untuk PCR-SSCP,

menggunakan suatu alat sequencing DNA automatis (373A; Aplikasi Biosistem,

Foster City, Calif., USA).

Klasifikasi Sementara Alel-alel ABO

Temuan alel-alel secara sementara dinamakan berdasarkan petunjuk

(guidelines) untuk nomenklatur gen manusia (Shows dkk, 1987).

Analisis Filogenetik

Maximum parsimony method (Fitch, 1977) dan metode hubungan filogenetik

(Bandelt, 1994) digunakan untuk menggambarkan hubungan alel-alel. Metode

hubungan filogenetik secara tertutup berhubungan dengan maximum parsimony

method, meskipun hal itu menghasilkan hubungan yang lebih sulit. Metode ini dapat

dipertimbangkan untuk generalisasi dari diagram yang terpecah (Fitch, 1977).

Program computer PAUP 3.1.1 (Univ. Illinois National History Survey) telah

digunakan dalam analisa sementara, yang mana hubungan filogenetik tersebut

dihasilkan secara manual.

Hasil Penelitian

Alel-alel ABO yang diidentifikasi dengan PCR-SSCP

DNA genomik dari 262 donor dengan fenotip ABO yang diketahui, yang

ditentukan dengan serologi, telah diuji dengan PCR-SSCP. Suatu gambaran khas

SSCP diperoleh dari sempel seorang individu yang memiliki alel tunggal yang

menunjukan dua pita/ band, bersamaan pada untai sense dan antisense, dan fragmen

diperoleh dari dua alel yang berbeda yang menunjukan empat pita/band (Gambar 2).

Pada beberapa kasus, gambaran tiga pita/band telah diamati, meskipun sampel hanya

dengan alel tunggal (Gambar 2a). Hal ini mungkin saja terjadi karena begitu banyak

DNA yang dielekroforesis, atau karena penyeimbang dari dua penyesuaian yang

berbeda fragmen DNA untai tunggal. Jumlah perbedaan gambaran SSCP diamati

setiap empat kali untuk fragmen I, empat kali untuk fragmen II, enam kali untuk

fragmen III dan dua kali untuk fragmen IV. Alel-alel diamati berdasarkan pada

kombinasi gambaran SSCP pada keempat fragmen tersebut. Saat gambaran SSCP

dari fragmen I-IV menunjukan hanya gambaran tunggal dengan dua pita/band,

sampel biasanya dinilai sebagai pembawa alel homozigot. Empat puluh empat dari

262 sampel dinilai sebagai alel homozygot yang normal dan 195 sampel sebagai alel-

alel heterozygot yang normal.

Alel-alel yang tidak normal diidentifikasi dengan mengurangi gambaran alel-

alel yang normal dari pengamatan tersebut dengan sisa 23 sampel heterozygot. Alel-

alel yang jarang tersebut lebih lanjut dianalisa untuk mengkonfirmasi kombinasi

fragmen I-IV menggunakan kumpulan PCR. Dengan kelompok PCR spesifik hanya

satu dari dua alel heterozygot yang bisa secara khusus diamplifikasi (PCR pertama);

dengan sepasang primer GS-AB/ABO-10 untuk golongan darah A dan B,

GS-O/ABO-10 untuk golongan darah O, dan GS-AO/ABO-10 untuk sebagian dari

alel A dan O. Fragmen DNA yang diperoleh dari alel tunggal termasuk fragmen II-

IV kemudian menjadi subjek analisa PCR-SSCP untuk setiap fragmennya (PCR

kedua). Jadi, gambaran SSCP dari fragmen tersebut hanya menunjukan dua pita/band

seperti diperlihatkan dalam Gambar 2b,c.

Seperti ditunjukan pada Tabel 3, gambaran SSCP yang terlihat dalam

golongan darah A yang secara sementara disebut Ia dan Ib untuk fragmen I, IIa, IIb

dan IIc untuk fragmen II, IIIa untuk fragmen III, dan IVa untuk fragmen IV. Maka

dari itu pada golongan darah A, kami mengidentifikasi empat alel-alel yang berbeda,

ABO*A101, *A102, *A103 dan *A104, berdasarkan pada kombinasi gambaran

SSCP. Diantara keempat alel tersebut, ABO*A101 dan *A102 terlihat pada keadaan

homozygot.

Pada golongan darah B, terlihat gambaran SSCP yaitu Ib untuk fragmen I, IId

untuk fragmen II, IIIb dan IIIc untuk fragmen III, dan IVb untuk fragmen IV.

Diantara fragmen tersebut, IId, IIIb dan IIIc hanya terlihat pada golongan darah B.

Karena itu pada golongan darah B, kami mengidentifikasi tiga alel-alel yang berbeda,

dengan ABO*B101 yang sangat dominan.

Pada golongan darah O, terlihat gambaran SSCP yaitu Ic dan Id untuk

fragmen I, IIa untuk fragmen II, IIIa, IIId,IIIe dan IIIf untuk fragmen III, dan IVa

untuk fragmen IV. Diantara fragmen-fragmen tersebut, Ic dan Id terbatas untuk

golongan darah O. Dua dari enam alel-alel golongan darah O, ABO*O101 dan

*O201, yang lebih sering terlihat.

Secara keseluruhan, kami mengidentifikasi 13 alel-alel yang berbeda. Selain

itu, PCR-SSCP menganalisa fragmen I dan II, atau fragmen I dan III, membuat kami

dapat menentukan genotif ABO yang biasa: Gambaran SSCP Ic dan Id untuk

golongan darah O, IId dan IIIb atau IIIc untuk golongan darah B, dan gambaran

fragmen I-III lainnya untuk golongan darah A.

Urutan Nukleotida dari Alel-alel ABO

Semua fragmen-fragmen DNA yang membedakannya dari yang lainnya

dengan analisa SSCP telah diurutkan agar mengungkapkan beberapa tanda-tanda

khas dari laporan sequence sebelumnya. Gambar 3 menunjukan suatu skema

ringkasan hasil sequencing.

Pada golongan darah A, ABO*A101 memiliki suatu tanda sequence identik

yaitu dari cDNA klon FY-66-1 seperti yang dijelaskan oleh Yamamoto dkk (1990).

Alel ABO*A102 memiliki suatu pengganti nukleotida tunggal pada kodon 156

sebagai perbandingan dengan alel ABO*A101; ABO*A102 memiliki tanda CTG

untuk leusin, sedangkan ABO*A101 memiliki tanda CCG untuk prolin. Pengganti

yang sama telah diamati pada FY-59-5 (Yamamoto dkk,1990), tapi urutan klon ini

berbeda dengan delesi tiga basa pada posisi nukleotida 240-242 dari klon yang

lainnya (Yamamoto dkk, 1990) dan juga pada alel-alel termasuk ABO*A102.

[Mengenai sistem penomoran nukleotida pada gen ABO, nomor sebelumnya

(Yamamoto dkk, 1990) berbeda dari nomor yang sekarang digunakan dalam

penelitian ini] (Yamamoto, 1992, 1993a-d). Alel ABO*A103 memiliki satu

pengganti nukleotida tunggal pada posisi 564 sebagai perbandingan dengan

ABO*A102. ABO*A104 dan *A101 berbeda dengan pengganti tunggal pada posisi

297 (berturut-turut G dan A).

Pada golongan darah B, ABO*B101 memiliki suatu tanda sequence identik

yaitu dari yang digambarkan alel B sebelumnya (Yamamoto dkk, 1990). Sedangkan

ABO*B102 dan *B103 memiliki pengganti yang berbeda dari *B101 pada posisi

berturut-turut yaitu 930 (A menjadi G) dan 657 (T menjadi C).

Pada golongan darah O, keseluruhan enam alel tersebut berbagi suatu delesi

nukleotida tunggal (G) pada posisi 261, mengakibatkan suatu perubahan dalam

pembacaan kerangka/ badan yang membawa gambaran penghentian codon pada

posisi 353-355. Keenam alel-alel tersebut dapat dikelompokkan, berdasarkan

penggantian dan hubungan filogenetik yang digambarkan dibawah, ke dalam dua sub

kelompok, yaitu ABO*O1 dan *O2. Alel ABO*O101 berbeda dari ABO*O201

dengan lima pengganti nukleotida pada posisi 297,646, 681, 771 dan 829, dan kedua

alel tersebut identik terhadap gambaran alel O sebelumnya (yamamoto dkk,

1990,1993). Alel ABO*O102 dan *O103 memiliki satu nukleotida pengganti

dibandingkan dengan ABO*O101 pada posisi berturut-turut 579 (T menjadi C) dan

297 (A menjadi G). Kesamaannya, alel ABO*O202 dan *O203 memiliki satu

nukleotida pengganti dibandingkan dengan alel ABO*O201 pada posisi berturut-

turut yaitu 297 (G menjadi A) dan 721 (C menjadi T).

Selanjutnya, 9 dari 13 alel-alel (ABO*A102,*A103,*A104,*B102,*B103,

*O102, *O103, *O202 dan *O203) disequence lagi alel-alel ABO, tetapi tidak

terdapat penggantian nukleotida pada alel-alel tersebut, kecuali untuk posisi 467 dari

*A102 dan *A103, yang membawa pada perubahan asam amino.

Perkiraan Frekuensi Alel

Kami menyeleksi sampel dari total 262 donor sehat orang jepang, yang terdiri

dari 74 fenotip A, 73 fenotip B, 61 AB dan 54 fenotip O, dan frekuensi alel pada

setiap golongannya telah diuji dengan analisa PCR-SSCP (Tabel 4). Pada golongan

darah A, ABO*A102 lebih sering muncul dengan frekuensi 83%. Walaupun

ABO*A101 memiliki tanda identik sequencing untuk alel A yang dijelaskan oleh

Yamamoto dkk. (1992), diperkirakan frekuensinya pada orang-orang Jepang lebih

rendah dibandingkan ABO*A102 (kira-kira satu-lima). Dalam golongan darah B,

alel ABO*B101 merupakan alel yang dominan dengan frekuensi 97%. Berbeda

dengan golongan darah O, keduanya alel ABO*O101 dan alel *O201 biasanya

dengan frekuensi yang sama (berturut-turut, 43% dan 53%).

Pohon Filogenetik Alel-alel ABO

Pertama kami menggunakan maximum parsimony method terhadap

sequencing data 13 alel-alel ABO untuk merekonstruksi pohon filogenetik. Tiga

puluh tujuh pohon yang sama sifatnya dihasilkan menggunakan PAUP 3.1.1 dengan

pilihan cabang dan ikatan. Saat cabang bagian dalam dengan panjang nol diabaikan,

maka, jumlah pohon topologis jelas berkurang sebanyak 16 (pohon yang tidak

terlihat). Jelasnya maximum parsimony method tidak tepat menggambarkan sifat

dasar polimorfisme alel-alel ABO yang kompleks.

Kami juga menggunakan metode hubungan filogenetik (phylogenetic

network method), dan menghasilkan hubungan tunggal yang dipresentasikan pada

Gambar 4. Terdapat tiga persegi panjang dalam hubungan tersebut, mengindikasikan

adanya posisi yang saling bertentangan. Sebagai contoh, persegi panjang yang terdiri

dari 3 alel-alel B dihasilkan karena konfigurasi nukleotida pada tempat ke 8 (dalam

Gambar 3 posisi 657), tidak konsisten dengan yang pada tempat ke 16 (dalam

Gambar 3 posisi 930). Tiap tempat diasumsikan mengalami penggantian yang sama.

Pada beberapa kasus, keseluruhan 16 pohon yang sama sifatnya dapat dibuat dari

hubungan tunggal ini.

Diskusi

Sejak ditetapkan struktur molekular gen golongan darah ABO yang diuraikan

sebelum ini, beberapa metode DNA typing termasuk analisa RFLP-PCR dan PCR

spesifik alel telah dijelaskan. Metode tersebut mungkin dapat dipakai dalam ilmu

forensik (Lee dan Chang, 1992; Masuki dkk,1994; Fukumori dkk, 1995), diagnosis

laboraturium (fischer dkk, 1992) dan penelitian masyarakat (Grunnet dkk, 1994;

Franco dkk, 1994) dengan alel-alel ABO yang terbatas sebagai subjek. Walaupun

metode RFLP-PCR dan PCR spesifik alel digunakan untuk mendeteksi variasi dalam

menilai kepastian sequence enzim-enzim restriksi atau primer-primer spesifik, hal itu

secara keseluruhan tidak dapat digunakan untuk mendeteksi alel-alel dengan

pengganti yang tidak diketahui dalam amplifikasi fragmen DNA. Baru-baru ini,

Johnson dan Hopkinson (1992) menjelaskan perbedaan empat alel-alel golongan

darah O, seperti juga dua alel golongan darah B dan satu golongan darah A dari

orang-orang Eropa yang tidak memiliki hubungan kekeluargaan dengan memakai gel

elektroforesis denaturasi tinggi, tapi tidak melakukan analisa sequencing. Dari

pengamatan mereka dan komunikasi perorangan (K.Kobayashi), jumlah alel-alel

yang berbeda pada sistem golongan darah ABO diperkirakan lebih banyak dari pada

yang secara luas disangka sebelumnya.

Pada penelitian ini, kami mengaplikasikan suatu metode PCR-SSCP untuk

mendeteksi perbedaan alel-alel golongan darah ABO. Metode ini memungkinkan

kita untuk mendeteksi point mutasi (mutasi titik) pada berbagai posisi dalam

amplifikasi fragmen, dan hal itu bisa digunakan untuk menetapkan genotif ABO

seperti juga untuk mendeteksi alel-alel golongan darah ABO yang tidak dapat

digambarkan. Pada analisa PCR-SSCP ini, kami mengidentifikasi 13 alel-alel

golongan darah ABO yang berbeda dan jumlah alel-alel dalam golongan darah A, B

dan O yaitu berturut-turut 4, 3 dan 6. Empat dari diantaranya, ABO*A101, *B101,

*O101 dan O*201, memiliki sequencing alel-alel golongan darah ABO yang identik

dengan yang mereka tetapkan sebelumnya (Yamamoto dkk, 1990). Kesembilan alel-

alel lainnya, ABO*A102, *A103, *A104, *B102, *B103, *O102, *O103, *O202 dan

*O203 baru diteliti.

ABO*A102 memiliki sequencing yang sama dengan ABO*A101 kecuali

untuk penggantian basa tunggal pada posisi nukleotida 467 (C menjadi T).

ABO*A103 dan *A104 memiliki hanya satu atau dua pengganti nukleotida

dibandingkan dengan ABO*A101 atau *A102, demikian keempat alel-alel ABO*A

dapat termasuk menjadi suatu silsilah evolusioner tunggal.

Yamamoto dkk (1990) menjelaskan suatu alel golongan darah B dengan tujuh

pengganti nukleotida dibandingkan dengan alel A, dan empat diantaranya membawa

perubahan asam amino yang mungkin bertanggung jawab untuk spesifisitas

transferase golongan darah A atau B. Keempat pengganti nukleotida tersebut terlihat

pada tiga alel-alel golongan darah B yang diamati dalam penelitian sekarang ini.

ABO*B102 dan *B103 hanya memiliki satu pengganti nukleotida dibandingkan

dengan ABO*B101. Jadi, ketiga alel-alel ABO*B tersebut termasuk kepada suatu

silsilah evolusioner tunggal, yang berbeda dari silsilah ABO*A.

Pada golongan darah O, kami mengidentifikasi enam alel-alel yang berbeda,

yang semuanya mengalami suatu delesi nukleotida tunggal pada posisi 261.

Dibandingkan pada sampel orang-orang Jepang yang diteliti sekarang ini, kami tidak

dapat menemukan tipe alel golongan darah O lainnya yang disebut O2 (Yamamoto

dkk, 1993; Franco dkk, 1994). ABO*O101 memiliki sequencing yang sama dengan

ABO*A101 kecuali untuk suatu delesi nukleotida tunggalnya. ABO*O102 dan

*O103 memiliki satu pengganti nukleotida dibandingkan dengan AO*O101. Jadi,

ketiga alel-alel tersebut dapat termasuk kepada silsilah evolusioner yang sama

seperti pada ABO*A. Sebaliknya, ABO*O201 memiliki lima pengganti nukleotida

dibandingkan dengan ABO*O101. Lebih lanjut, ABO*O202 dan *O203 memiliki

satu pengganti nukleotida relatif terhadap ABO*O201, dan jadi ketiga alel-alel

tersebut dapat termasuk kedalam silsilah lainnya, yang berbeda dari silsilah golongan

darah A atau golongan darah B.

Hasil ini mengindikasikan bahwa alel-alel golongan darah ABO orang-orang

Jepang dibagi kedalam tiga silsilah mayor, *A/*O1, *B dan *O2. Analisa hubungan

filogenetik dari alel-alel golongan darah ABO tersebut didukung hipotesis yang

tertera diatas.

Metode PCR-SSCP kami mungkin berguna untuk menguraikan berbagai

macam gen ABO seperti juga penentuan genotip ABO. Selanjutnya, metode tersebut

dapat diaplikasikan untuk mengidentifikasi alel-alel yang ditentukan berfenotip tidak

lazim.

Pernyataan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada Mrs. Hiroko Ogata untuk bantuan teknisnya

pada persiapan DNA genomik.