OPTIMASI PEMURNIAN POLISAKARIDA DARI MIKROALGA … · Helikase Virus Hepatitis C” adalah karya...
68
OPTIMASI PEMURNIAN POLISAKARIDA DARI MIKROALGA BTM 11 SEBAGAI INHIBITOR RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C AKSAR CHAIR LAGES DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Transcript of OPTIMASI PEMURNIAN POLISAKARIDA DARI MIKROALGA … · Helikase Virus Hepatitis C” adalah karya...
OPTIMASI PEMURNIAN POLISAKARIDA DARI
MIKROALGA BTM 11 SEBAGAI INHIBITOR RNA
HELIKASE VIRUS HEPATITIS C
AKSAR CHAIR LAGES
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
RINGKASAN
AKSAR CHAIR LAGES. C34080078. Optimasi Pemurnian Polisakarida dari
Mikroalga BTM 11 sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C. Dibimbing
oleh IRIANI SETYANINGSIH dan APON ZAENAL MUSTOPA.
Infeksi virus Hepatitis C (HCV) merupakan penyebab utama penyakit hati
kronis di seluruh dunia. Pengobatan yang dilakukan terhadap penderita hepatitis C
selama ini adalah melalui terapi dengan pemberian interferon yang
dikombinasikan dengan ribavirin. Pengobatan ini masih belum optimal,
memerlukan biaya yang mahal dan dapat memberikan efek samping.Usaha dalam
menemukan obat HCV terus dilakukan dengan mencari unsur antiviral yang
melawan virus dengan cara menghambat enzim yang berperan dalam proses
replikasi virus HCV, yaitu RNA helikase. Inhibitor enzim RNA helikase dapat
diperoleh dari hasil metabolit mikroalga, salah satunya adalah polisakarida.
Mikroalga BTM 11 yang diekstraksi menggunakan metanol 80% memiliki
aktivitas penghambatan terhadap RNA helikase HCV sebesar 80% (dilusi 5x).
Namun, diperlukan teknik pemurnian polisakarida yang terbaik dalam
menghasilkan aktivitas inhibisi yang maksimal. Oleh karena itu, perlu adanya
optimasi dalam pemurnian polisakarida mikroalga BTM 11.
Penelitian ini bertujuan (1) mengetahui teknik pemurnian terbaik dari
polisakarida mikroalga BTM 11 sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C,
(2) mengetahui kandungan gula dari polisakarida inhibitor termurnikan, dan (3)
mengetahui profil senyawa polisakarida inhibitor yang paling aktif. Tahap satu
yaitu preparasi RNA helikase HCV yang meliputi (1) ekspresi RNA helikase
dengan cara menumbuhkan bakteri E.coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen
NS3 RNA helikase HCV dalam plasmid pET 21b, (2) pemurnian RNA helikase
yang telah terekspresi pada sel bakteri menggunakan kromatografi afinitas. Tahap
dua meliputi (1) kultivasi mikroalga BTM 11 dalam media IMK-Sea Water pada
suhu ruang dengan pencahayaan 4800 lux, (2) ekstraksi polisakarida dari
biomassa mikroalga BTM 11. Penelitian tahap tiga meliputi (1) pemurnian ekstrak
polisakarida menggunakan teknik kromatografi gel filtrasi dan kromatografi ion-
exchange, (2) penentuan profil senyawa polisakarida inhibitor yang paling aktif
menggunakan kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi.
Hasil analisis enzim dengan SDS-PAGE menunjukkan pita tunggal yang
tebal berukuran 54 kDa, sehingga dapat dikatakan RNA helikase telah
terpurifikasi, dan dapat digunakan dalam pengujian aktivitas ATPase secara in
vitro. Sebanyak 25 fraksi yang dikoleksi dari kromatografi gel filtrasi,
menghasilkan fraksi aktif pada fraksi ke-13 dengan nilai penghambatan terhadap
RNA helikase sebesar 78,76% dengan kandungan gula sebesar 2,97 mg/mL.
Fraksinasi menggunakan kromatografi ion-exchange menghasilkan 30 fraksi
dengan aktivitas tertinggi sebesar 74,6% terdapat pada fraksi ke-10, dan
kandungan gula sebesar 3,21 mg/mL. Hasil KLT menunjukkan satu spot senyawa
aktif pada fraksi ke-13 kromatografi gel filtrasi. Hasil KCKT menunjukkan 3
puncak terdeteksi pada fraksi polisakarida dengan retention time (RT) 4,072;
4,706 dan 5,530.
OPTIMASI PEMURNIAN POLISAKARIDA DARI
MIKROALGA BTM 11 SEBAGAI INHIBITOR RNA
HELIKASE VIRUS HEPATITIS C
AKSAR CHAIR LAGES
C34080078
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul : Optimasi Pemurnian Polisakarida dari Mikroalga BTM
11 Sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C
Nama : Aksar Chair Lages
NRP : C34080078
Departemen : Teknologi Hasil Perairan
Menyetujui,
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Ir. Iriani Setyaningsih, MS A. Zaenal Mustopa, M.Si
NIP.19600925 198601 2 001 NIP. 19770412 200502 1 001
Mengetahui:
Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan
Dr. Ir. RuddySuwandi, MS, MPhil.
NIP. 19580511 198503 1 002
Tanggal Lulus:
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Optimasi
Pemurnian Polisakarida dari Mikroalga BTM 11 Sebagai Inhibitor RNA
Helikase Virus Hepatitis C” adalah karya saya sendiri dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Bogor , September 2012
Aksar Chair Lages
C34080078
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 27April
1989. Penulis merupakan anak pertama dari dua
bersaudara pasangan Abdul Chair Husain dan Linda Riau
Rita.
Penulis memulai jenjang pendidikan formal di SD
Hang Tuah 5 Jakarta Utara (1995-2001), selanjutnya
meneruskan pendidikan di SMP Negeri 1 Ternate
(2001-2004). Pendidikan menengah atas ditempuh penulis di SMA Negeri 6
Bekasi (2004-2007). Tahun 2008, penulis diterima di Institut Pertanian Bogor,
pada Fakultas Perikanan Ilmu Kelautan, Departemen Teknologi Hasil Perairan
melalui jalur SNMPTN (Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri).
Penulis aktif dalam berbagai organisasi kemahasiswaan seperti Dewan
Perwakilan Mahasiswa (DPM) FPIK sebagai staf Komisi Internal periode
2009-2010, dan staf Komisi Advokasiperiode 2010-2011, staf Badan Pekerja
Bidang Konstitusi Majelis Permusyawaratan Mahasiswa Keluarga Mahasiswa
Institut Pertanian Bogor (MPM KM IPB) periode 2010-2011. Penulis juga aktif
menjadi panitia dalam berbagai kegiatan kemahasiswaan di Institut Pertanian
Bogor. Prestasi yang pernah diraih penulis diantaranya adalah menjadi delegasi
dalam Pekan Ilmiah Nasional (PIMNAS) XXIV (2011) di Makassar dalam
Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) bidang Penelitian.
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, penulis melakukan penelitian dan
penyusunan skripsi dengan judul “Optimasi Pemurnian Polisakarida dari
Mikroalga BTM 11 Sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C”
dibawah bimbingan Dr. Ir. Iriani Setyaningsih, MS dan A. Zaenal Mustopa, M.Si.
KATA PENGANTAR
Ucapan syukur penulis panjatkan ke hadirat ALLAH SWT, atas karunia-
Nya yang berlimpah, yang membuat penulis sanggup menyelesaikan skripsi yang
berjudul “Optimasi Pemurnian Polisakarida dari Mikroalga BTM 11 Sebagai
Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C”. Skripsi ini merupakan salah satu
syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan
Ilmu Kelautan.
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada semua
pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan skripsi ini, terutama kepada:
1 Dr. Ir. IrianiSetyaningsih, MS dan Apon Zaenal Mustopa, M.Si. selaku
komisi pembimbing yang telah banyak membimbing dan memberikan saran
sehingga penelitian dan penulisan skripsi dapat berjalan dengan baik.
2 Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si selaku dosen penguji atas segala saran, kritik,
arahan, perbaikan dan motivasinya, serta ilmu yang telah diberikan.
3 Keluarga besar Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler (mas
Ridwan, S.Farm, mba Linda, M.Eng, mba Rifqiyah, MS, bang Adyos, S.Si,
Meita, S.Pt, Anggun, S.Si, Neng, Bia, Krisna dan Haryono) yang telah
banyak membantu penulis dalam melakukan penelitian.
4 Kedua orang tua tercinta, untuk dukungan yang diberikan baik dukungan
moral maupun materil yang telah diberikan pada penulis tanpa batas.
5 Teman-teman THP’45 dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu
persatu, yang telah memberikan bantuan dan dukungan moril dalam
penelitian dan penyusunan skripsi ini.
Akhirnya penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan memberikan
kontribusi yang nyata terhadap perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor , September 2012
Aksar Chair Lages
C34080078
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ................................................................................. vi
DAFTAR TABEL ....................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... viii
1 PENDAHULUAN................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1
1.2 Tujuan ................................................................................................ 3
2 TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................... 4
2.1 Mikroalga .......................................................................................... 4
2.2 Pemanfaatan Mikroalga di Bidang Kesehatan .................................. 6
2.3 Hepatitis C ......................................................................................... 6
2.4 Virus Hepatitis C ............................................................................... 8
2.5 Ribonucleid Acid (RNA) Helikase .................................................... 9
2.6 Polisakarida ....................................................................................... 10
2.7 Kromatografi ..................................................................................... 12
2.7.1 Kromatografi gel filtrasi ........................................................... 12
2.7.2 Kromatografi ion-exchange ...................................................... 13
2.7.3 Kromatografi lapis tipis ........................................................... 14
2.7.3 Kromatografi cair kinerja tinggi ............................................... 15
2.8 Uji KolorimetriATPase ..................................................................... 17
3 METODE ................................................................................................ 18
3.1 Waktu dan Tempat ............................................................................ 18
3.2 Bahan dan Alat .................................................................................. 18
3.3 Metode Penelitian .............................................................................. 19
3.3.1 Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV ........................... 19
3.3.2 Kultivasi dan pemanenan mikroalga BTM 11 .......................... 22
3.3.3 Ekstraksi polisakarida BTM 11 ............................................... 22
3.3.4 Pemurnian polisakarida dari mikroalga BTM 11 ..................... 23
3.3.5 Profil kemurnian fraksi aktif polisakarida inhibitor RNA
helikase .................................................................................... 23
3.4 Prosedur Analisis ............................................................................... 24
3.4.1 Analisis enzim RNA helikase dengan SDS-PAGE ................. 24
3.4.2 Uji aktivitas ATPase RNA helikase HCV ............................... 25
3.4.3 Analisis kandungan gula fraksi polsakarida BTM 11 .............. 26
v
Halaman
4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 28
4.1 RNA Helikase Virus Hepatitis C ....................................................... 28
4.2 Kultivasi Mikroalga BTM 11 ............................................................ 32
4.3 Ekstrak Polisakarida Mikroalga BTM 11 .......................................... 34
4.4 Pemurnian Polisakarida Inhibitor RNA Helikase .............................. 36
4.5 Analisis Kandungan Gula .................................................................. 38
4.6 Analisis Kemurnian Fraksi Aktif Polisakarida Inhibitor ................... 39
5 SIMPULAN DAN SARAN .................................................................... 43
5.1 Simpulan ............................................................................................ 43
5.2 Saran .................................................................................................. 43
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 44
LAMPIRAN ................................................................................................ 50
DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman
1 Morfologi mikroalga ...................................................................... 4
2 Tahap perkembangan kerusakan hati pada penderita hepatitis C ... 7
3 Struktur virus hepatitis C (HCV) .................................................... 8
4 Peta genomik HCV ......................................................................... 9
5 Mekanisme kerja RNA helikase HCV ............................................ 10
6 Polisakarida Porphyridium cruentum ............................................. 11
7 Kromatografi gel filtrasi .................................................................. 12
8 Kromatografi ion-exchange ............................................................ 14
9 Kromatografi lapis tipis................................................................... 15
10 Skematik komponen HPLC............................................................. 16
11 Diagram alir prosedur kerja penelitian ............................................ 20
12 Pengikatan resin TALON (A) dengan 6xHis-tag (B) ..................... 30
13 Analisis SDS-PAGE pemurnian RNA helikase HCV .................... 31
14 Kondisi kultivasi mikroalga BTM 11 ............................................ 32
15 Mikroalga BTM 11 dengan perbesaran 1000x................................ 33
16 Kurva pertumbuhan mikroalga BTM 11 ......................................... 33
17 Inhibisi polisakarida fraksi gel filtrasi terhadap aktivitas ATPase
RNA helikase HCV ......................................................................... 37
18 Inhibisi polisakarida fraksi ion-exchange terhadap aktivitas
ATPase RNA helikase HCV ........................................................... 38
19 Kromatogram KLT dengan deteksi sinar UV 254 nm .................... 40
20 Kromatogram KCKT fraksi 13 ....................................................... 41
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
1 Komposisi kimia protein, karbohidrat, lipid dan asam nukleat
dalam % dari bobot kering mikroalga ............................................ 5
2 Sistem reaksi enzim untuk satu sampel dengan volume total
175 µL ............................................................................................ 26
3 Aktivitas inhibisi dari ekstrak polisakarida .................................... 35
4 Analisis kandungan gula ................................................................ 38
5 Nilai Rf senyawa aktif polisakarida ................................................ 40
11 16
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Halaman
1 Komposisi media IMK-SW............................................................ 51
2 Komposisi larutan yang digunakan dalam SDS-PAGE ................. 52
3 Kurva standar fosfat (Uji ATPase) ................................................. 53
4 Tabulasi data hasil fraksinasi kromatografi gel filtrasi .................. 54
5 Tabulasi data hasil fraksinasi kromatografi ion-exchange ............. 55
6 Kurva standard glukosa (Uji kandungan gula)............................... 56
11 16
1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Infeksi virus hepatitis C (HCV) merupakan penyebab utama penyakit hati
kronis di seluruh dunia. Dampak yang ditimbulkannya sangat bervariasi, mulai
dari hepatitis kronis, fibrosis, sirosis hingga kanker hati (hepatocellular
carcinoma). Jumlah penderita kronis di seluruh dunia hampir mencapai 200 juta
jiwa (EASL 2011).Data yang dikeluarkan Kementerian Kesehatan menyebutkan
bahwa pada tahun 2010 jumlah penderita hepatitis C di Indonesia mencapai7 juta
jiwa (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia 2010).
Pengobatan yang dilakukan terhadap penderita hepatitis C selama ini adalah
terapi dengan pemberian interferon yang dikombinasikan dengan ribavirin. Akan
tetapi terapi ini memiliki tingkat efektivitas yang tidak lebih dari 50% terhadap
infeksi HCV genotip 1 dan 4, dan tidak lebih dari 80% terhadap genotip 2 dan 3.
Terapi ini juga dapat menimbulkan efek samping berupa flu, depresi dan anemia
(Clercq 2004), oleh karena itu diperlukan suatu obat baru yang dapat mengatasi
infeksi virus hepatitis C.
Upaya dalam menemukan obat HCV terus dilakukan dengan mencari unsur
antiviral yang melawan virus dengan cara menghambat enzim yang penting bagi
HCV, salah satunya adalah ribonucleid acid (RNA) helikase. Borowski et al.
(2008) menjelaskan bahwa enzim RNA helikase berperan dalam proses replikasi
virus HCV, yaitu membuka ikatan dupleks RNA virus agar dapat
direplikasikan.Utama et al. (2000) menjelaskan bahwa apabila proses pembukaan
ikatan dupleks RNA virus sebagai induk (template) genetik tidak dapat dilakukan,
maka proses translasi informasi genetik tidak dapat berjalan sehingga siklus hidup
HCV terhenti.
Borowski et al. (2002) menjelaskan bahwa selain membuka ikatan dupleks,
RNA helikase juga memiliki aktivitas ATPase, yaitu aktivitas yang menguraikan
ATP (adenosine triphosphate) menjadi ADP (adenosine diphosphate) dan Pi
(fosfat anorganik). Proses penguraian ini menghasilkan energi yang digunakan
untuk menguraikan pasangan DNA atau RNA. Hal ini menjelaskan bahwa
2
penghambatan terhadap aktivitas enzim RNA helikase dianggap lebih potensial
sebagai target obat hepatitis C.
Inhibitor enzim RNA helikase dapat diperoleh dari senyawa metabolit,
misalnya metabolit dari mikroalga. Ye et al. (2008) menjelaskan bahwa mikroalga
memiliki banyak komponen bioaktif yang sangat berpotensi sebagai obat anti-
inflamasi, antitumor, antimikroba dan antivirus. Sanchez et al. (2007)
menjelaskan bahwa biomassa mikroalga mengandung beberapa komposisi kimia
yang potensial, misalnya protein, karbohidrat, pigmen (klorofil dan karotenoid),
asam amino, lipid dan hidrokarbon. Karbohidrat yang dihasilkan dapat ditemukan
dalam bentuk pati, glukosa, gula dan polisakarida lainnya. Umumnya objek yang
dijadikan target penemuan obat adalah senyawa kimia. Sebaliknya, jarang yang
memfokuskan pada polisakarida sebagai antivirus hepatitis C.
Hasil-hasil penelitian sebelumnya juga telah menjelaskan potensi
polisakarida dari mikroalga dalam aktivitasnya sebagai antivirus. Salah satunya
adalah Huleihel et al. (2001) yang menunjukkan bahwa terdapat beberapa
polisakarida mikroalga yang diketahui memiliki aktivitas antivirus dalam
melawan berbagai jenis virus pada hewan. Polisakarida ini tidak berpengaruh
terhadap penetrasi atau infeksi virus ke dalam sel inang, akan tetapi menghambat
sintesis protein virus di dalam sel.
Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Pusat Penelitian
Bioteknologi, LIPI Cibinong telah melakukan penapisan terhadap 30 isolat
mikroalga dengan pelarut metanol. Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak kasar
mikroalga BTM 11 memiliki aktivitas penghambatan tertinggi terhadap RNA
helikase HCV dan bersifat stabil dibandingkan isolat lainnya, namun dalam
pengembangan polisakarida dari mikroalga BTM 11 sebagai inhibitor RNA
helikase HCV dibutuhkan informasi awal mengenai teknik pemurnian yang
terbaik dalam menghasilkan aktivitas inhibisi yang optimum. Oleh karena itu
perlu adanya optimalisasi dalam pemurnian polisakarida dari mikroalga BTM 11
sehingga dapat diaplikasikan sebagai inhibitor RNA helikase HCV.
3
1.2 Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah :
1) Mempelajari teknik pemurnian terbaik dari polisakarida mikroalga BTM 11
sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C;
2) Mengukur kandungan gula dari polisakarida inhibitor termurnikan;
3) Mempelajari profil senyawa polisakarida inhibitor yang paling aktif.
11 16
2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Mikroalga
Mikroalga merupakan mikroorganisme fotosintetik yang dapat ditemukan di
perairan tawar dan laut. Mekanisme fotosintesis mikroalga mirip dengan
tumbuhan darat, dikarenakan kesamaan pada struktur selulosa yang
dimilikinya.Bila dibandingkan dengan organisme fotosintetik lainnya, mikroalga
paling efisien dalam menangkap dan memanfaatkan energi matahari dan CO2
untuk keperluan fotosintesis karena organisme ini mengandung klorofil serta
pigmen-pigmen lain untuk mengkonversi fotosintesis menjadi biomassa dan
akumulasi pati. Mikroalga hidup secara planktonik di perairan, namun juga dapat
hidup secara epifit dan bentik di dasar perairan yang memiliki intensitas cahaya
yang cukup (Rodjaroen et al. 2007; Gouveia 2011; Barsanti & Gualtieri 2005).
Mikroalga juga memiliki bentuk yang bervariasi seperti filamen, spiral dan bulat.
Berbagai macam morfologi mikroalga dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Morfologi mikroalga A: Pterosperma, B: Nephroselmis, C:Tetraselmis
D: Chlorella, E: Oocytis, F: Haematococcus, G: Pediastrum, H: Bulbochaete, I: Chaetophora dan J: Ulothrix (Leliaert et al. 2012).
Mikroalga dapat dibagi ke dalam empat kelompok utama (NREL 2003):
1) Diatom (Bacillariophyceae).
Mikroalga dalam kelompok ini mendominasi mikroalga di laut, namun
beberapa jenis diketahui hidup di air tawar. Sebanyak 100.000 jenis mikroalga
yang termasuk dalam kelompok ini. Diatom mengandung silika yang
5
terpolimerisasi dalam dinding sel. Karbon disimpan dalam bentuk minyak nabati
maupun polimer karbohidrat yang disebut chrysolaminarin.
2) Alga hijau (Chlorophyceae).
Mikroalga yang memiliki kelimpahan tinggi terutama di perairan tawar dan
hidup dalam bentuk soliter maupun koloni. Karbon disimpan dalam bentuk pati.
3) Alga hijau biru (Cyanophyceae).
Mikroalga kelompok ini memiliki struktur yang lebih menyerupai bakteri
dan berperan dalam fiksasi nitrogen. Sekitar 2000 jenis mikroalga yang termasuk
dalam kelompok ini tersebar dalam berbagai habitat.
4) Ganggang emas (Chrysophyceae).
Kelompok alga ini menyerupai diatom, namun memiliki pigmen yang lebih
rumit, dan nampak berwarna kuning, jingga atau cokelat.
Mikroalga telah sejak lama dimanfaatkan sebagai sumber bahan makanan,
terutama sebagai sumber vitamin, antioksidan, pewarna atau bahan aditif yang
aman, serta digunakan pula dalam industri farmakologi dalam skala besar. Hal ini
tidak lepas dari komposisi kimia yang terkandung dalam mikroalga, dapat dilihat
pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi kimia protein, karbohidrat, lipid dan asam nukleat dalam %
dari bobot kering mikroalga.
Mikroalga Protein Karbohidrat Lipid As. Nukleat
Scenedesmus obliquus
Scenedesmus quandricauda
Scenedesmus dimorphus
Chlamydomonas rheinhardii
Chlorella vulgaris
Chlorella pyrenoidosa
Spirogyra sp.
Dunaliella salina
Euglena gracilis
Prymnesium parvum
Tetraselmis maculata
Porphyridium cruentum
Spirulina platensis
Spirulina maxima
Synechoccus sp. Anabaena cylindrica
50-56
47
48-18
48
51-58
57
56-20
57
39-61
28-45
52
28-39
46-63
60-71
63 43-56
10-17
10-
21-52
17
12-17
26
33-64
32
14-18
25-33
15
40-57
48-14
13-16
15 25-30
12-14
11,9
16-40
21
14-22
12
11-21
16
14-20
22-38
23
29-14
24-9
26-7
11 14-7
3-6
3-
3-
3-
4-5
4-
4-
4-
4-
1-2
1-
1-
2-5
3-4,5
5 5-
Sumber: Becker (1994)
6
2.2 Pemanfaatan Mikroalga di Bidang Kesehatan
Mikroalga dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku industri farmasi dan
kosmetika, karena adanya kandungan berbagai senyawa kimia yang dapat
dimanfaatkan sebagai bahan dasar untuk pengobatan dan pencegahan berbagai
macam penyakit. Yuan dan Walsh (2006) menjelaskan bahwa konsumsi alga laut
berkorelasi dengan rendahnya tingkat penderita kanker payudara di Asia Timur.
Sebagai contoh, prevalensi kasus penderita kanker payudara dalam 1 tahun per
100.000 penduduk di Jepang dan Cina masing-masing adalah 42,2 dan 13,1,
dibandingkan dengan kasus di Amerika Utara dan Eropa yang masing-masing
sebesar 125,9 dan 106,2. Teas et al. (2004) juga menjelaskan bahwa sebagian
besar kelompok masyarakat di Chad mengkonsumsi Spirulina rata-rata sebanyak
1-2 sendok makan (3-13 g) per harinya, hal ini diyakini dapat mencegah infeksi
virus HIV.
Hasil-hasil riset menjelaskan bahwa terdapat komponen aktif mikroalga
yang menunjukkan aktivitas biologis sebagai antivirus. Talyshinsky et al. (2002)
menjelaskan bahwa dekstran sulfat dan polisakarida yang dihasilkan mikroalga
berpotensi menghambat HIV tipe 1 dan 2 dengan cara menghambat induksi
sitopatogenetik dan ekspresi antigen dari virus HIV. Sulfat polisakarida yang
dihasilkan juga dapat menghambat aktivitas reversetranscriptase dan RNAse pada
proses replikasi retrovirus. Hasil riset Shih et al. (2003) menjelaskan bahwa
allophycocyanin yang dihasilkan oleh Spirulina platensis dapat menetralisir efek
sitopatik dari enterovirus pada sel manusia secara in vitro.
2.3 Hepatitis C
Hepatitis merupakan penyakit yang menyebabkan pembekakan pada hati.
Penyakit hepatitis terdiri atas beberapa jenis, yaitu hepatitis A, B, C, D, E, F dan
G. Ketujuh hepatitis ini disebabkan oleh virus yang berbeda (WHO 2002).
Penderita hepatitis C seringkali tidak menunjukkan gejala khusus walaupun telah
bertahun-tahun terinfeksi. Gejala yang ditunjukkan sangat umum seperti lelah,
hilangnya selera makan, mual, sakit perut, urin menjadi gelap dan kulit atau mata
berwarna kuning (Solga et al. 2007). Penderita baru menyadari bahwa telah
7
terinfeksi virus hepatitis C (HCV) ketika berada pada tahap yang lebih kritis.
Kerusakan organ hati penderita hepatitis C dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 Tahap perkembangan kerusakan hati pada penderita hepatitis C
(Solga et al. 2007).
Kerusakan hati dapat ditandai dengan adanya konsentrasi enzim alanin
aminotransferase (ALT) yang lebih tinggi dari normal. Pada penyakit hepatitis C,
setelah terjadinya infeksi (tahap infeksi akut), 15-40% penderita akan sembuh
dengan sendirinya dalam waktu 6 bulan dan tidak beresiko menderita penyakit
hati melalui hepatitis C serta tidak menularkan kepada yang lainnya. Pada tahap
ini, hati dapat melawan patogen dan mengembalikan fungsinya yang terganggu
dengan membentuk fibrosis (luka kecil atau parut). Namun, sekitar 60-80%
penderita hepatitis C akut ini tidak dapat sembuh dan berkembang menjadi
hepatitis kronis. Pada tahap ini, penderita akan rentan terhadap sirosis hati,
kegagalan fungsi hati, dan kanker hati (hepatocellular carcinoma), tetapi
untungnya, perkembangan ini terjadi sangat lambat. Hanya 10 hingga 15%
penderita kronis yang mengalami sirosis hati dalam jangka waktu 20 tahun
(Shiffman 2006).
Terapi hepatitis C pada umumnya dengan pemberian interferon seminggu
sekali yang dimasukkan ke tubuh melalui injeksi. Pemberian interferon tersebut
dikombinasikan dengan ribavirin. Mekanisme terapi untuk hepatitis C dari kedua
bahan tersebut masih belum banyak diketahui. Selain itu, terapi tersebut kurang
efektif karena menimbulkan efek samping, seperti mual, anemia, depresi, dan
harganya relatif mahal. Manfaat terapi kedua bahan tersebut berbeda hasilnya di
tiap individu, tergantung pada genotip dari virus hepatitis C
(Jawaid & Kuwaja 2008)
8
2.4 Virus Hepatitis C
Virus Hepatitis C (HCV) merupakan anggota dari famili Flaviviridae
dengan genus Hepacivirus. Virus ini merupakan virus RNA positif. Virus
berbentuk bulat dengan diameter partikelnya 55-65 nm, dan memiliki selubung
glikoprotein. Selain itu, terdapat inti (core) dan di dalamnya terdapat viral RNA.
Virus hepatitis C dibagi menjadi enam genotipe yang disandikan dengan angka,
yaitu genotipe satu sampai enam (Worman & Lin 2000). Bentuk dari virus
hepatitis C dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Struktur virus hepatitis C (HCV) (Moradpour et al. 2007).
Genom HCV berukuran 9,6 kilobasa yang mengkodekan sekitar 3011 asam
amino. Poliproteinnya dipotong setelah proses translasi dan dibagi menjadi
protein struktural dan nonstruktural. Protein struktural terdiri dari sebuah
nukleokapsid inti, protein p7, dan dua glikoprotein selubung virusnya (E1 dan
E2). Dua daerah pada E2 merupakan daerah hipervariabel 1 dan 2. Daerah
tersebut menunjukkan hipermutasi dari selubung sehingga sangat spesifik
terhadap antibodi. Daerah E2 juga terdapat sisi pengikatan terhadap cluster of
differentiation 81 (CD81), reseptor virus pada hepatosit dan sel limfosit B
(Tellinghuisen et al. 2007).
Protein nonstruktural pada HCV terbagi menjadi empat macam, yaitu NS1,
NS2, NS3, NS4 (NS4A dan NS4B), dan NS5 (NS5A dan NS5B). Protein
nonstruktural tersebut berfungsi dalam reaksi enzimatis yang berperan dalam
replikasi virus. NS1 berinteraksi dengan NS4A dibutuhkan untuk replikasi RNA.
NS2A bersifat hidrofobik yang berfungsi dalam perakitan virion (virus baru) dan
9
pelepasan partikel virus. NS2B membentuk kompleks dengan NS3 berperan
sebagai kofaktor bagi serin protease dari NS3. Protein NS3 mengkodekan RNA
helikase yang berperan dalam replikasi virus. NS5A merupakan daerah yang
sensitif terhadap interferon, sedangkan NS5B berperan di dalam RNA-dependent
RNA polimerase (RdRp) (Tellinghuisen et al. 2007). Peta genomik dari HCV
dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Peta genomik HCV (Anzola dan Burgos 2003).
2.5 Ribonucleid Acid (RNA) Helikase
Helikase berasal dari kata “helix” yang berarti struktur pasangan DNA
“double helix” dan “ase” yang berarti enzim, sehingga helikase berarti enzim yang
memisahkan pasangan rantai DNA (DNA helikase) atau RNA (RNA helikase).
Helikase pertama kali ditemukan dalam proses replikasi DNA bakteri
Eschericia coli. RNA helikase ditemukan pada bakteri, khamir, dan virus. Pada
virus hepatitis C, enzim ini dikodekan oleh protein NS3 RNA helikase
(Kadare & Haenni 1997).
Mekanisme kerja RNA helikase HCV secara umum adalah pertama-tama
helikase akan berikatan pada ujung 3’ RNA utas ganda. Tahap kedua, ATP akan
berikatan pada sisi aktif RNA helikase dan dihidrolisis pada gugus fosfat terluar
menghasilkan ADP dan fosfat anorganik (Pi). Pada proses hidrolisis ATP ini
mengeluarkan energi yang cukup besar dan digunakan untuk memisahkan RNA
utas ganda menjadi utas tunggal. Pemisahan RNA utas ganda dilakukan dengan
pemutusan ikatan hidrogen yang mengikat kedua utas tersebut
10
(Utama et al. 2005). Mekanisme kerja RNA helikase HCV dapat dilihat pada
Gambar 5.
Gambar 5 Mekanisme kerja RNA helikase HCV (Hairany 2010).
Berdasarkan mekanisme kerja tersebut, selain memiliki aktivitas untuk
memisahkan utas ganda RNA, RNA helikase juga memiliki aktivitas untuk
menghidrolisis ATP (ATPase) dan aktivitas pengikatan RNA (RNA-binding).
Ketiga aktivitas ini saling berpengaruh satu dengan lainnya. Oleh karena itu,
helikase menjadi target yang potensial untuk penemuan obat antivirus. Obat
antivirus ini dapat dikembangkan dengan suatu senyawa yang dapat menghambat
(inhibitor) aktivitas helikase.
2.6 Polisakarida
Polisakarida, atau bisa disebut “glikan”, terdiri dari monosakarida dan
turunannya. Polisakarida terbagi menjadi homopolisakarida dan
heteropolisakarida. Homopolisakarida atau homoglikan merupakan polisakarida
yang penyusunnya hanya terdiri dari satu jenis monosakarida, sedangkan
penyusun heteropolisakarida lebih dari satu jenis monosakarida. Komponen
umum polisakarida adalah glukosa, fruktosa, galaktosa, mannosa, arabinosa dan
xylosa. Beberapa turunan monosakarida yang terdapat pada polisakarida adalah
gula amino (glukosamin dan galaktosamin) dan asam gula sederhana (glukuronat
dan asam iduronat). Penyebutan homopolisakarida dapat berdasarkan unit gula
11
penyusunnya, sehingga glukosa homopolisakarida dapat disebut “glukan”, sama
halnya dengan mannosa homopolisakarida yang dapat disebut “mannan”
(d’Ayala et al. 2008).
Polisakarida telah digunakan sebagai pengental, flokulan dan minyak
pelumas. Beberapa polisakarida dari mikroalga berpotensi sebagai antivirus
(Huleihel et al. 2001). Salah satu jenis mikroalga merah, Porphyridium cruentum
merupakan salah satu penghasil polisakarida ekstraseluler dalam jumlah besar.
Sel-sel mikroalga dibungkus oleh polisakarida sulfat dalam bentuk gel. Selama
pertumbuhan dalam media cair, viskositas medium meningkat karena pengeluaran
polisakarida dari permukaan sel ke dalam media (polisakarida larut air). Kapsul
polisakarida paling tipis selama fase pertumbuhan dan tebal selama fase stasioner
(Arad & Richmond 2004). Menurut Laurienzo (2010) bahwa mikroalga diketahui
memanfaatkan polisakarida yang disintesisnya untuk bertahan hidup pada kondisi
lingkungan yang ekstrim. Letak polisakarida pada sel mikroalga dapat dilihat pada
Gambar 6.
Gambar 6 Polisakarida Porphyridium cruentum (Arad & Richmond 2004).
Prosedur isolasi polisakarida dari mikroorganisme tergantung pada letak
polisakarida terikat pada dinding sel atau diekskresikan oleh sel sebagai pelindung
atau pengotor. Isolasi dapat dilakukan dengan ekstraksi dari biomassa sel. Namun,
pada masa ini isolasi polisakarida dilakukan dengan sentrifugasi maupun filtrasi
untuk memisahkan produk dari sel (Giavasis & Bilianderis 2006).
12
2.7 Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu proses migrasi diferensial, komponen-
komponen senyawa yang dibawa oleh fasa gerak, dan ditahan secara selektif oleh
fasa diam. Peristiwa tersebut terjadi di dalam kolom kromatografi. Adanya
peristiwa yang komplek pada metode kromatografi, menjadikan kromatografi
dapat digunakan untuk menganalisis senyawa sampai sedetail mungkin. Prinsip
kromatografi adalah penggunaan dua fase yang berbeda yaitu fasa tetap dan fasa
bergerak. Proses pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa tersebut
(Al Baarri 2003). Penelitian ini menggunakan 4 teknik kromatografi, yaitu
kromatografi gel filtrasi, kromatografi penukar ion (ion-exchange), kromatografi
lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi.
2.7.1 Kromatografi gel filtrasi
Kromatografi gel filtrasiatau sering disebut filtrasi gel merupakan salah satu
metode yang digunakan untuk memisahkan senyawa menurut ukuran dan bentuk.
Sampel kemudian dimasukan pada ujung atas kolom dan elusi dilakukan dengan
memberikan larutan bufer melalui kolom. Larutan bufer ini memiliki prinsip tidak
boleh lebih polar dibandingkan dengan fase diam atau yang disebut juga kolom.
Besar molekul akan terbagi menjadi 3 bagian yang ditunjukkan oleh berbagai
warna pada Gambar 7.
Gambar 7 Kromatografi gel filtrasi (Koolman 2005).
Molekul yang berukuran besar tidak mampu menembus matriks dari kolom
sehingga akan melewati kolom lebih dahulu. Bobot molekul menengah dan bobot
13
molekul kecil akan tertahan oleh kolom lebih lama (Koolman 2005). Batas
pemisahan dari sebuah ukuran merupakan indikasi bobot molekul untuk tipe
polimer (Hagel 1998).
Keuntungan dari metode ini adalah dapat memisahkan dengan baik molekul
besar dari molekul kecil serta dapat menggunakan berbagai pelarut tanpa harus
mengganggu proses pemisahan. Penggunaan kromatografi gel filtrasi ini akan
didapatkan pemisahan yang baik, sensitifitas yang baik, dan waktu yang
diperlukan untuk pemisahan cepat. Selain itu tidak ada sampel yang tertinggal
karena pelarut tidak berinteraksi dengan fase diam (Skoog 2006). Namun
Kehilangan molekul dapat terjadi selama proses pemurnian dengan menggunakan
teknik kromatografi gel filtrasi karena autolisis (Scopes 1987).
Prinsip dasar kromatografi gel filtrasi adalah partikel dengan ukuran yang
berbeda akan dielusi melalui fase stasioner pada tingkat yang berbeda. Hal ini
menyebabkan pemisahan partikel berdasarkan ukuran. Setiap kolom memiliki
jangkauan berat molekul yang dapat dipisahkan. Molekul besar tidak dapat
terjebak dalam matriks fase diam sehingga akan terlebih dahulu terlewati kolom.
Bobot molekul menengah dan kecil terjebak dalam matriks sehingga akan lebih
lama untuk terlewati fase diam (Skoog 2006).
2.7.2 Kromatografi ion-exchange
Kromatografi penukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa
digunakan untuk pemurnian materi biologis. Purwadaria (1999) menjelaskan
bahwa pada sistem kromatografi ini, molekul senyawa dipisahkan berdasarkan
perbedaan afinitas terhadap penukar ion. Afinitas molekul dengan penukar ion
dapat dilepaskan dengan mengubah kadar garam atau pH larutan eluen. Selain itu
sistem pengaturan perubahan kadar garam atau pH eluen baik dengan gradasi
linier ataupun gradasi bertingkat dapat pula mempengaruhi jumlah molekul yang
terpisah.
Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun
ruang datar (planar). Terdapat dua tipe penukaran ion, yaitu penukaran kation
(cation exchange) dan penukaran anion (anion exchange). Pada penukaran kation,
fase stasioner bermuatan negatif sedangkan pada penukaran anion, fase stasioner
bermuatan positif, dapat dilihat pada Gambar 8.
14
Gambar 8 Kromatografi ion-exchange (Harper 2005).
Muatan-muatan molekul akan memiliki sifat ketika muatan molekul yang
sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi, namun muatan pada
molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk
ikatan ionik dengan kolom (Carrier 1997). Prinsip dasar yang digunakan adalah
molekul dengan muatan positif bersih pada pH tertentu akan berikatan dengan
gugus fungsional bermuatan negatif seperti carboxylates atau sulfat (penukar
kation). Demikian pula, molekul bermuatan negatif bersih berikatan dengan
molekul bermuatan positif pada gugus fungsional, biasanya tersier atau kuaterner
amina (penukar anion).
2.7.3 Kromatografi lapis tipis
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan
Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain
kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang
mana fase diamnya diisikan atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis
tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan
bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik
(Gandjar & Rohman 2007). Teknik ini biasa digunakan untuk memisahkan
komponen dari suatu campuran senyawa organik alam, sintetis, dan campuran
kompleks anorganik. Fase gerak yang digunakan tergantung dari senyawa yang
ingin dipisahkan (Harjadi 1976).
Pemisahan komponen melalui berbagai tahap. Pertama dilakukan pemisahan
sampel dengan penotolan pada plat silika yang telah didesain. Plat silika pada
bagian bawah diberi sebuah garis untuk menandakan posisi awal penotolan.
15
Selanjutnya dibuat pula sebuah garis akhir menggunakan pensil. Jarak antara garis
awal dengan garis akhir biasanya 5 cm. Plat yang telah ditotol dengan sampel
dimasukkan ke dalam bejana pengembang yang telah terdapat eluen hasil proses
penjenuhan yang dilakukan selama 20 menit. Penjenuhan berfungsi agar eluen
lebih efektif dalam memisahkan komponen tersebut. Eluen akan memisahkan
komponen hingga garis akhir yang telah didesain. Semakin dekat kepolaran antara
sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut
(Wilson & Walker 1994). Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Kromatografi lapis tipis (Tissue 1996).
Tahapan selanjutnya adalah visualisasi atau deteksi. Deteksi atau visualisasi
sampel yang tidak berwarna dapat menggunakan dua cara, yaitu penyinaran
dengan sinar UV (254 nm dan 356 nm) dan pereaksi kimia (ninhidrin, FeSO4,
Dragendroff, dan anilin). Pada saat disinari dengan sinar UV, komponen yang
terpisahkan akan terlihat seperti spot atau bidang kecil yang berwarna gelap.
Deteksi komponen juga dapat dilakukan dengan menempatkan kromatogram pada
bejana tertutup yang telah dijenuhkan dengan kristal iod. Uap kristal iod bereaksi
dengan komponen yang terpisahkan dan terlihat seperti bercak-bercak kecoklatan.
Aplikasi dari teknik ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif
(membandingkan retardation factor (Rf) senyawa murni dengan komponen, pola
sidik jari, dan menentukan jumlah komponen) dan preparatif (untuk memperoleh
senyawa murni). Nilai Rf yang akan dihasilkan dari suatu senyawa bernilai sama
meskipun jarak plat yang digunakan berbeda (Wilson & Walker 1994).
2.7.4 Kromatografi cair kinerja tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan suatu metode yang sensitif dan akurat untuk
penentuan kuantitatif serta baik untuk pemisahan senyawa yang tidak mudah
16
menguap. Pemisahan dengan HPLC mempunyai beberapa keuntungan
dibandingkan dengan metode konvensional seperti waktu analisis yang cepat,
biaya yang rendah dan kemungkinan untuk menganalisis sampel yang tidak stabil
(Nurhamidah 2005). Komponen penyusun HPLC secara skematik dapat dilihat
pada Gambar 9.
Gambar 10 Skematik komponen HPLC (LC Resources Inc. 2001)
Mardiana dan Ramdani (2008) menjelaskan komponen HPLC yang terdiri
dari :
1) Tandon (Reservoir)
Reservoir terbuat dari gelas atau stainless stell. Jumlahnya bisa satu, dua
atau lebih. Reservoir yang baik disertai degassing system yang berfungsi untuk
menghilangkan gas-gas yang terlarut dalam solven. Gas terlarut tersebut antara
lain adalah oksigen. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert dengan
kelarutan yang sangat kecil.
2) Pompa
Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam kolom
dengan aliran yang konstan dan reproducible.
3) Katup injektor
Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya
dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom.
4) Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Berhasil atau tidaknya suatu
analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
17
Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok yaitu kolom analitik dan kolom
preparatif.
5) Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).
6) Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian
dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan kromatogram. Untuk
HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas kromatogram
dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.
2.8 Uji Kolorimetri ATPase
Penentuan aktivitas penghambatan RNA helikase HCV menggunakan uji
kolorimetri ATPase (Utama et al. 2000). Pengujian ini mengukur besar
penghambatan terhadap RNA helikase pada salah satu aktivitas enzimatiknya,
yaitu ATPase (RNA-stimulated ATPase). Penghambatan terhadap aktivitas
ATPase, secara tidak langsung juga menghambat aktivitas RNA helikase secara
keseluruhan, karena helikase membutuhkan energi yang dihasilkan dari hidrolisis
ATP untuk memisahkan untai ganda RNA (Hairany 2010).
Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas/anorganik (Pi) yang
terbentuk dari hidrolisis ATP oleh RNA helikase. Fosfat bebas akan membentuk
kompleks warna dengan amonium molibdat membentuk fosfomolibdat.
Fosfomolibdat akan bereaksi dengan enzim RNA helikase sehingga protein akan
mengendap dan menimbulkan kekeruhan. Polivinil alkohol akan melarutkan
kembali protein yang mengendap sehingga tidak terjadi kekeruhan. Warna yang
terbentuk sebanding dengan konsentrasi fosfat bebas yang dihasilkan dari
hidrolisis ATP. Penghentian reaksi warna dengan penambahan Na-sitrat yang
dapat mencegah pembentukan warna yang berlebih (Chan et al. 1986).
11 16
3 METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari hingga April 2012, dan
bertempat di Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Laboratorium
Biorekayasa Lingkungan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong, Bogor
dan Laboratorium Analisis Kimia, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi,
PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan untuk ekspresi dan pemurnian enzim RNA
helikase meliputi bakteri Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen
NS3 RNA helikase virus hepatitis C dalam plasmid pET 21b (koleksi Andi
Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), media Luria Bertani (LB), akuades, ampisilin,
isopropil β-D-thiogalaktopiranosidase (IPTG) 0,3 M; bufer B (Tris HCl 10 mM
pH 8,5; NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%), resin TALON, dan bufer elusi
(400 mM imidazola dalam bufer B).
Bahan-bahan yang digunakan untuk menganalisis bobot molekul protein
RNA helikase meliputi akuabides; Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; akrilamid 30%,
sodium dedosil sulfat (SDS) 10%, TEMED, amonium persulfat (APS) 10%,
comassie blue, dan loading dye.
Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi dan pemurnian polisakarida
dari mikroalga BTM 11 adalah isolat BTM 11 (koleksi Dwi Susilaningsih,
Laboratorium Biorekayasa Lingkungan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI),
trichloroacetic acid (TCA), etanol, metanol, tris HCl 10 mM pH 8, glukosa
1 mg/mL, fenol, asam sulfat, sepharose 4B, media IMK-Seawater; adenosin
trifosfat (ATP) 0,1 mM; 4-asam morfolinopropana sulfonat (MOPS) 0,1 mM;
MgCl2 1 mM, larutan hijau malakit, polivinil alkohol 2,3%; amonium molibdat,
natrium sitrat, dan akuades.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah ultrasentrifus Sorvall
RC-26 plus, sonikator, waterbath, tabung sentrifus, erlenmeyer, inkubator, rotator,
microtiter plate, microplate reader (Multiscan EX Thermo), pipet mikro, oven,
19
kolom kromatografi, SDS-PAGE, tabung vial, hot plate magnetic stirer, dan
timbangan digital.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap. Tahap satu yaitu preparasi
RNA helikase HCV yang meliputi (1) ekspresi RNA helikase dengan cara
menumbuhkan bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA
helikase HCV dalam plasmid pET 21b (Utama et al. 2000), (2) pemurnian RNA
helikase yang telah terekspresi pada sel bakteri menggunakan kromatografi
afinitas (Utama et al. 2000). Tahap dua meliputi (1) kultivasi mikroalga BTM 11
dalam media IMK-Sea Water pada suhu ruang dengan pencahayaan 4800 lux, (2)
ekstraksi polisakarida dari biomassa mikroalga BTM 11 (Wang et al. 2004).
Tahap tiga meliputi (1) pemurnian ekstrak polisakarida menggunakan teknik
kromatografi gel filtrasi dan kromatografi ion-exchange, (2) penentuan profil
senyawa polisakarida inhibitor yang paling aktif menggunakan kromatografi lapis
tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi. Diagram alir prosedur kerja penelitian
dapat dilihat pada Gambar 11.
3.3.1 Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV (Utama et al. 2000)
Ekspresi RNA helikase protein NS3 HCV dilakukan berdasarkan metode
Utama et al. (2000). Ekspresi dilakukan pada skala 400 mL. Sebanyak 10 µL stok
gliserol bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa vektor ekspresi pET-
21b/HCV NS3 helikase diinokulasi ke dalam 10 mL medium LB cair yang
mengandung 1 µg/mL ampisilin, kemudian dikultur selama satu malam dalam
inkubator goyang (shaker incubator) pada suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm.
Hasil kultur diinokulasikan ke dalam 400 mL medium LB yang
mengandung ampisilin, selanjutnya dikultur dalam inkubator berpenggoyang pada
suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm, selama 30 menit sampai dengan 1 jam
hingga OD600 mencapai ±0,3. Apabila OD600 telah mencapai ±0,3 maka
ditambahkan 0,3 M isopropil β-D-thiogalaktopiranosidase (IPTG). Kultur E. coli
BL21 (DE3) pLysS kemudian diinkubasi selama 3 jam dalam inkubator goyang
pada suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm selama 3 jam atau hingga OD600
mencapai ±1.
20
Gambar 11 Diagram alir prosedur kerja penelitian.
Mikroalga BTM 11
Kultivasi mikroalga BTM 11
Biomassa
Mikroalga BTM 11
Ekstraksi polisakarida
Ekstrak
polisakarida
Pemurnian polisakarida
(kromatografi gel filtrasi)
Pemurnian polisakarida
(kromatografi ion-exchange)
Uji ATPase Analisis total
gula
Analisis total
gula Uji ATPase
Fraksi paling aktif
polisakarida terpurifikasi
Analisis kemurnian
(kromatografi lapis tipis)
Analisis kemurnian
(kromatografi cair kinerja tinggi)
Uji ATPase
E.coli BL 21(DE3) pLysS pembawa gen
helikase
Ekspresi dan purifikasi
enzim helikase
RNA helikase
terpurifikasi
SDS
PAGE
Uji
ATPase
21
Hasil kultur disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 4000 rpm
selama 10 menit. Pelet diresuspensi dengan sisa medium LB cair, kemudian
disentrifugasi kembali. Pelet yang diperoleh disimpan pada suhu -20 °C.
Pelet E. coli BL21 (DE3) pLysS dipecah dengan metode freeze & thaw
sebanyak 3 kali ulangan yaitu dengan membekukan pelet pada suhu -20 °C selama
30 menit, lalu dicairkan pada suhu ruang selama 30 menit. Pelet kemudiian
diresuspensi dengan 20 mL larutan bufer B (Tris HCl 10 mM pH 8,5;
NaCl 100 mM, Tween 20 0,25%). Tahap kedua pemecahan sel dilakukan dengan
metode sonikasi (Amplitudo 40; siklus 0,5; waktu 3x15 detik; interval waktu
1 menit). Suspensi sel disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 20 menit. Supernatan diambil untuk tahapan selanjutnya, sedangkan pelet
disimpan untuk analisis SDS-PAGE.
Enzim RNA helikase yang diduga berada dalam supernatan dipurifikasi
menggunakan metode kromatografi afinitas. Supernatan ditambahkan dengan 300
µL resin TALON, kemudian dilakukan tahap pengikatan (binding) menggunakan
rotator selama 3 jam dalam ruang pendingin (4 °C). Sampel selanjutnya
disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.500 rpm selama 7 menit.
Supernatan (inner volume) disimpan pada suhu 4 °C untuk analisis SDS-PAGE.
Pelet (resin binding) diresuspensi dengan 10 mL larutan bufer B dan
disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.500 rpm selama 5 menit.
Tahapan ini dilakukan sebanyak 2 kali sehingga diperoleh 2 larutan supernatan
(washing 1 & washing 2) yang disimpan pada suhu 4 °C dan digunakan untuk
analisis SDS-PAGE.
Resin binding dari hasil washing 2 kemudian dielusi untuk melepaskan
enzim yang terikat pada resin. Elusi dilakukan dengan menambahkan 150 µL
larutan bufer elusi (imidazol 400 mM dalam bufer B), kemudian diinkubasi
menggunakan rotator dalam ruangan pendingin (4 °C) selama satu malam. Sampel
disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit.
Supernatan yang mengandung enzim dipindahkan dalam eppendorf yang baru
(E1), sedangkan pelet ditambahkan 75 µL larutan bufer elusi, kemudian
diinkubasi dengan menggunakan rotator selama 1 jam. Sampel kembali
22
disentrifugasi sehingga diperoleh supernatan (E2). Supernatan (E1 dan E2)
disimpan pada suhu 4 °C dan digunakan untuk analisis ATPase dan SDS-PAGE.
3.3.2 Kultivasi dan pemanenan mikroalga BTM 11
Kultivasi BTM 11 dilakukan dengan media IMK-SW. Namun sebelum
dikultivasi, inokulum disegarkan terlebih dahulu dengan media IMK. Media
IMK-SW digunakan untuk membuat suatu kondisi yang sama dengan media awal
pertumbuhan mikroalga tersebut. Penyegaran stok mikroalga dilakukan dalam
keadaan aseptik pada erlenmeyer 500 mL dengan penyinaran lampu 4800 lux, dan
diberi aerasi. Mikroalga dikultur selama 14 hari sebelum dipindahkan ke kultur
dengan skala yang lebih besar. Komposisi media IMK-SW dapat dilihat pada
Lampiran 1. Pemanenan dilakukan dengan teknik filtrasi, yaitu hasil kultur
disaring menggunakan kain filtrasi sehingga didapatkan biomassa basah.
Biomassa basah tersebut dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60 °C selama
2 hari. Biomassa kering yang didapatkan kemudian dilakukan pengecilan ukuran
menjadi bentuk serbuk dengan menggunakan mortar.
3.3.3 Ekstraksi polisakarida BTM 11 (modifikasi Wang et al.2004)
Serbuk mikroalga BTM 11 sebanyak 5 g dilarutkan dalam 100 mL etanol
absolut. Sampel dimaserasi selama 6 jam, kemudian disaring untuk didapatkan
peletnya. Pelet tersebut dilarutkan dalam 100 mL aseton dan dimaserasi kembali
selama 6 jam. Hasil maserasi tersebut disaring dan diambil peletnya untuk
kemudian dilarutkan dalam NaCl 0,9%. Maserasi sampel dilakukan selama satu
malam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 4.500 rpm selama 15 menit.
Supernatan hasil sentrifugasi diambil 15 µL untuk analisis ATPase. Supernatan
yang telah didapatkan kemudian dilakukan presipitasi dengan trichloroacetic acid
(TCA) 10%. Hasil pengendapan disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan
7.500 rpm. Supernatan hasil sentrifugasi diambil 15 µL untuk analisis ATPase.
Supernatan dipekatkan dengan freeze dryer untuk mendapatkan ekstrak kasar
polisakarida. Ekstrak kasar polisakarida diresuspensi dengan Tris HCl dan diambil
15 µL untuk analisis ATPase.
23
3.3.4 Pemurnian polisakarida dari mikroalga BTM 11
1) Kromatografi gel filtrasi (Amersham 1999)
Matriks gel Sepharose 4B dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom
kromatografi. Ekstrak kasar polisakarida BTM 11 dilarukan dalam buffer
(Tris HCl 10mM pH 8) dan sebanyak 5% dari volume kolom dimasukkan ke
kolom gel filtrasi. Sampel dielusi dengan eluen etanol 30%, dengan laju alir 1
mL/menit tiap fraksi. Masing-masing fraksi hasil pemurnian diuji aktivitas
penghambatannya terhadap RNA helikase virus hepatitis C dengan uji ATPase.
2) Kromatografi ion-exchange(modifikasi Baumgartner dan Chrispeels 1976)
Kolom kromatografi dibilas dengan menggunakan kation-anion exchange.
Setelah itu, sebanyak 1 mL sampel polisakarida inhibitor diinjeksikan ke dalam
kolom kromatografi. Eluen yang digunakan adalah NaCl 0,1-1 M. Hasil elusi
ditampung dalam tabung vial dengan volume masing-masing 1 mL. Masing-
masing fraksi diuji aktivitas inhibisinya dengan uji ATPase.
3.3.5 Profil kemurnian fraksi aktif polisakarida inhibitor RNA helikase
Fraksi yang memiliki aktivitas paling tinggi dari masing-masing teknik
pemurnian dibandingkan dan dipilih fraksi paling aktif untuk dilihat profil
kemurniannya menggunakan kromatografi lapis tipis, dan diperjelas kembali
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi.
1) Kromatografi lapis tipis (modifikasi Putri 2011)
Plat silika F254 disiapkan dan diatur jarak antara garis penotolan dengan
garis akhir. Bejana (chamber) KLT diisi dengan eluen asetonitril : etanol dengan
perbandingan 3:7 dan diinkubasi selama beberapa menit hingga jenuh. Plat yang
telah ditotol dengan sampel hasil pemurnian yang memiliki aktivitas inhibisi
tertinggi dikembangkan dalam bejana sampai eluen mencapai garis akhir. Hasil
KLT kemudian divisualisasi menggunakan sinar UV dengan panjang gelombang
254 nm, setelah itu disemprot dengan penampak bercak serium sulfat dan
dipanaskan hingga terlihat spot hasil kromatografi.
2) Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) / HPLC
Sampel atau fraksi paling aktif diambil sebanyak 20 µL untuk diinjeksikan
ke dalam HPLC. Kondisi HPLC yang digunakan adalah sebagai berikut :
24
a. Fase Gerak : H2SO4 0,008 N
b. Kolom : Aminex® HPX-87H, 300 mm x 7.8 mm
c. Detektor : Refractive Index
d. Flow rate : 1 mL/min
e. Suhu kolom : 35 ºC
f. Back Pressure : 1553 psi
3.4 Prosedur Analisis
Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi (1) penentuan bobot
molekul RNA helikase murni menggunakan SDS-PAGE, (2) uji aktivitas
penghambatan RNA helikase HCV terhadap ekstrak polisakarida dan fraksi
polisakarida termurnikan, (3) penentuan kandungan gula pada fraksi polisakarida
murni yang memiliki aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap RNA helikase
HCV.
3.4.1 Analisis enzim RNA helikase dengan SDS-PAGE (Speicher 1997)
Analisis menggunakan alat SDS-PAGE. Glass plate sandwich (short plate
& spacer plate) dibersihkan dengan etanol. Short plate ditempatkan di depan kaca
spacer plate. Kedua kaca kemudian dimasukkan ke dalam casting frame dengan
posisi bagian bawah kedua kaca sama rata lalu dikunci dengan menekan cams.
Casting frame dipasang pada casting stand. Setelah peralatan siap, larutan gel
separating dibuat sesuai dengan prosedur (Lampiran 2a). Larutan tersebut
dimasukkan di antara celah short plate & spacer plate sampai duapertiga bagian
lalu ditambah akuades sampai dengan batas atas kaca, ditunggu ±20 menit sampai
terbentuk gel. Selama menunggu 20 menit, larutan gel stacking dibuat sesuai
dengan prosedur (Lampiran 2b). Sebelum larutan gel stacking dimasukkan, air
yang ada pada gel separating dibuang. Larutan gel stacking dituang sampai batas
atas kaca, comb dimasukan, ditunggu ±20 menit sampai gel terbentuk.
Gel dipindahkan dari casting frame dengan cara menekan cams pada
casting frame.Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan
posisi short plate menghadap dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame,
kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber
25
dimasukan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution (Buffer
Elektroforesis SDS 1X pH 8,3).
Masing-masing sampel diambil 4 µL lalu dicampur dengan 2 µL loading
dye (Lampiran 2c). Campuran didenaturasi pada suhu 95 °C selama 15 menit.
Marker protein (BIORAD®) sebanyak 4 µL/gel dimasukkan ke dalam well.
Masing-masing sampel yang sudah dicampur dengan loading dye, dimasukkan ke
dalam well sebanyak 5 µL/well.Gel dielektroforesis selama 90 menit dengan arus
40 mA. Gel diangkat lalu direndam dalam Commasie Blue G-250 staining
solution (Lampiran 2d) selama 1 jam sambil digoyang-goyang di atas rocker. Gel
dibilas dengan Commasie Blue G-250 destaining solution (Lampiran 2e) ±20
menit, dilakukan dua kali. Gel dibilas dengan H2O sampai bau asamnya hilang
dan disimpan pada suhu 4 °C.
Gel menunjukkan elektroforegram dari RNA helikase HCV berupa pita
protein dengan bobot molekul 54 kDa. Perhitungan bobot molekul (BM)
dilakukan terlebih dahulu dengan menghitung retardation factor (Rf) dari masing-
masing pita protein marker dan pita protein target menggunakan rumus :
Nilai Rf pada pita-pita protein marker digunakan untuk memperoleh kurva
standar terhadap log standar BM dari marker. Bobot molekul dihitung melalui
persamaan regresi linier kurva standar yang diperoleh, yaitu y = ax + b. Nilai “x”
yang dimasukkan merupakan nilai Rf dari pita protein target, sedangkan nilai “y”
merupakan nilai log BM dari pita protein target. Nilai bobot molekul diperoleh
dari antilog BM pita protein target.
3.4.2 Uji aktivitas ATPase RNA helikase HCV (Utama et al. 2000)
Pengujian aktivitas inhibisi enzim helikase virus hepatitis C dengan sampel
hasil pemurnian polisakarida BTM 11 menggunakan uji ATPase kolorimetri
(Utama et al. 2000), yaitu dengan mengukur jumlah fosfat yang dilepaskan dari
hidrolisis senyawa ATP menjadi ADP dan fosfat anorganik (Pi). Konsentrasi
akhir reaksi adalah sebesar 175 µL/sumur.Sistem reaksi enzim selengkapnya
untuk satu sampel dengan volume total 175 µL dapat dilihat pada Tabel 2.
Rf =Jarak dari titik awal elektroforesis ke pita protein
Jarak dari titik awal ke titik akhir elektroforesis
26
Tabel 2 Sistem reaksi enzim untuk satu sampel dengan volume total 175 µL
Blanko (µL) Enzim (µL) Kontrol (-) (µL) Sampel (µL)
Sampel
Pelarut
H2O
Buffer (MOPS)
Kofaktor (MgCl2)
Substrat (ATP)
RNA helikase
-
-
43,5
5
0,5
1
-
-
-
38,5
5
0,5
1
5
-
5
33,5
5
0,5
1
5
5
-
33,5
5
0,5
1
5
Inkubasi pada suhu ruang selama 45 menit
Dye solution* 100 100 100 100
Inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit
Na-sitrat 25 25 25 25
Pembacaan pada λ 620 nm dengan referensi 405 nm (Abs. 620 nm – 405 nm)
*H2O : hijau malakit : polivinil alkohol : amonium molibdat (2 : 2 : 1 : 1)
Persentase aktivitas penghambatan senyawa inhibitor terhadap RNA
helikase ditentukan dengan rumus:
Keterangan :
A = Absorbansi RNA helikase tanpa senyawa inhibitor
I = Absorbansi RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor
3.4.3 Analisis kandungan gula fraksi polisakarida BTM 11 (Dubois et al.
1956)
Analisis ini bertujuan untuk memastikan bahwa fraksi aktif dari
kromatografi gel filtrasi dan ion-exchange terdapat kandungan polisakarida
dengan cara mendeteksi komponen gula penyusunnya menggunakan metode
fenol-asam sulfat. Langkah awal yaitu membuat kurva standar dengan glukosa
(1 mg/mL) sebagai standar dari konsentrasi tertinggi hingga terendah. Sebanyak
0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; dan 1 mg/mL glukosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi
dan ditambahkan akuades hingga mencapai volume 100 µL. Sebanyak 0,5 mL
larutan fenol 5%; 2,5 mL H2SO4 pekat dicampurkan ke dalam tabung tersebut dan
dicampur rata. Standar glukosa diganti dengan akuades untuk blanko, sedangkan
untuk analisis sampel, standar diganti dengan (polisakarida 1%). Setelah itu
campuran diinkubasi selama 15 menit di ruang asam. Lalu tabung berisi campuran
diinkubasi dalam waterbath (40 °C) selama 15-30 menit, dan diamati perubahan
warna yang terjadi. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 490 nm.
Kandungan gula dihitung melalui persamaan regresi linier kurva standar yang
% Inhibisi = A − I
A× 100 %
27
diperoleh, yaitu y = ax + b. Nilai “y” yang dimasukkan merupakan absorbansi
yang terbaca dari sampel, sedangkan nilai “x” merupakan kandungan gula dalam
sampel.
11 16
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Ekspresi dan Pemurnian RNA Helikase Virus Hepatitis C
Ekspresi dan pemurnian RNA helikase HCV dilakukan untuk memperoleh
RNA helikase HCV murni yang dapat digunakan dalam pengujian aktivitas
polisakarida inhibitor terhadap aktivitas ATPase. Ekspresi RNA helikase HCV
dilakukan pada bakteri Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS dalam plasmid pET
21b. Sambrook & Russell (2001) menjelaskan bahwa E. coli BL21 (DE3) pLysS
merupakan sel kompeten yang bersifat resisten terhadap antibiotik kloramfenikol
dan berperan sebagai sel inang pada ekspresi gen, sedangkan pET 21b pada
ekspresi gen berperan sebagai vektor ekspresiyang memiliki sifat resisten
terhadap antibiotik ampisilin.
Ekspresi RNA helikase diawali dengan penumbuhan bakteri E. coli BL21
(DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase virus hepatitis C dalam
plasmid pET 21b ke dalam 10 mL media Luria-Bertani (LB) yang sudah
ditambahkan ampisilin. Penggunaan media ini dipilih karena media LB
merupakan media yang cocok bagi pertumbuhan bakteri, termasuk E.coli
dikarenakan pertumbuhan yang relatif cepat dan rendemen yang lebih baik
(Sezonov et al. 2007). Penambahan ampisilin bertujuan sebagai penanda seleksi
untuk membedakan E. coli rekombinan yang membawa gen NS3 helikase HCV
dengan bakteri lain yang tidak membawa gen NS3 helikase HCV. Tahap ini
merupakan pembuatan prekultur yang bertujuan untuk menyegarkan kembali stok
biakan bakteri ke dalam media baru sehingga dapat tumbuh dengan optimal ketika
dikultur ke skala yang lebih besar. Prekultur diinkubasi selama satu malam di
inkubator berpenggoyang dengan suhu 37 °C pada kecepatan 150 rpm. Warna
kultur yang berubah menjadi kuning keruh menunjukkan bahwa bakteri E.coli
BL21 (DE3) pLysS berhasil ditumbuhkan.
Prekultur yang telah siap, dipindahkan ke dalam LB yang sudah
ditambahkan ampisilin dengan volume yang lebih besar. Kultur diinkubasi pada
inkubator berpenggoyang dengan suhu 37 °C dan kecepatan 150 rpm hingga
optical density (OD600) mencapai 0,3. Pada nilai tersebut diperkirakan kultur
sudah memasuki fase awal logaritmik. Sezonov et al. (2007) menjelaskan bahwa
29
bakteri E. coli yang ditumbuhkan pada media LB memasuki fase pertumbuhan
eksponensial pada saat nilai OD600 sebesar 0,2 atau 0,3; dan mengakhiri fase
tersebut ketika nilai OD600 sebesar 0,6 hingga 1.
Pembelahan sel E. coli yang mengekspresikan RNA helikase pada fase
logaritmik terjadi sangat cepat, sehingga diperlukan penambahan isopropil β-D-
thiogalaktopiranosidase (IPTG) yang akan menginduksi gen NS3 RNA helikase
HCV agar terjadi ekspresi berlebih. Utama et al. (2000) menjelaskan bahwa
ekspresi berlebih pada gen NS3 menyebabkan pembentukan enzim RNA helikase
dalam jumlah yang lebih banyak dari fase logaritmik hingga fase awal stasioner.
Koleksi sel E. coli menggunakan sentrifugasi dilakukan setelah nilai OD600
mencapai ±1 (±3 jam), yang menunjukkan bahwa kultur sudah memasuki fase
awal stasioner. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah untuk menghindari
protein mengalami denaturasi. Sentrifugasi akan memisahkan E. coli dengan
media LB. Bakteri E. coli akan mengendap sebagai pelet, dan disimpan pada suhu
-20 °C untuk menjaga stabilitas sel bakteri.
Enzim RNA helikase HCV terekspresi secara intraseluler pada sel E.coli
BL21 (DE3) pLysS, sehingga untuk memurnikannya harus dilakukan pemecahan
dinding sel agar komponen intraseluler termasuk RNA helikase HCV dapat keluar
dari dalam sel E. coli. Pemecahan sel dilakukan dengan metode freeze-thaw dan
sonikasi. Proses freeze-thaw dilakukan dengan mengkondisikan sel E. coli selama
±30 menit secara bergantian di suhu ruang dan suhu beku (-20 °C) sebanyak tiga
kali ulangan. Hal ini dapat menyebabkan terjadinya pembentukan kristal es pada
sel E. coli, sehingga sel akan lebih mudah untuk dipecah. Pemecahan sel
selanjutnya adalah dengan sonikasi. Pada tahap sonikasi, sel E. coli dilarutkan
dalam bufer B, dengan komponen penyusunnya yaitu Tween 20, NaCl dan
Tris HCl.
Tween 20 merupakan detergen non-ionik yang dapat menghancurkan lipid
bipolar pada membran sel. Rusaknya lipid bipolar akan menyebabkan disosiasi
membran sel dengan bagian hidrofobik dari RNA helikase yang sebelumnya
menempel pada lipid bipolar tersebut (SIGMA-ALDRICH 2008). NaCl berperan
sebagai penghilang kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik
30
dengan RNA helikase (Vanz et al. 2008), sedangkan Tris HCl berfungsi sebagai
larutan penyangga.
Hasil pemecahan sel bakteri (cell lysate) diduga telah mengandung enzim
RNA helikase HCV, sehingga harus dimurnikan menggunakan kromatografi
afinitas. Metode ini didasarkan pada pengikatan spesifik logam Ni2+
atau Co2+
yang dimiliki resin TALON dengan label 6xHis-tag (tag protein dengan enam
histidin) yang terdapat pada ujung RNA helikase. Petty (1996) menjelaskan
bahwa histidin akan berikatan secara selektif ke logam Co2+
resin TALON
meskipun dalam resin tersebut terdapat ion metal bebas lainnya. BD Bioscience
Clontech (2003) menjelaskan bahwa resin TALON menggunakan tetradentate
metal chelator untuk purifikasi protein rekombinan polyhistidine-tagged.
Chelator tersebut mengikat kuat logam elektropositif pada kantung elektronegatif
yang ideal untuk pengikatan ion logam seperti kobalt. Kantung pengikatan
tersebut adalah sebuah struktur oktahedral yaitu 4 dari 6 situs logam kobalt
berikatan dengan ligan resin TALON, sedangkan dua situs yang bebas akan
berikatan dengan 6xHis-tag. Tetradendate metal berarti tidak ada logam yang
tidak berikatan selama purifikasi protein dalam berbagai kondisi. Pengikatan resin
TALON dengan 6xHis-tag dapat dilihat pada Gambar 12.
Gambar 12 Pengikatan resin TALON (A) dengan 6xHis-tag (B) (BD Bioscience
Clontech 2003).
Resin yang telah mengikat dengan protein target, dimurnikan kembali
dengan pencucian dalam bufer B. Pencucian bertujuan untuk menghilangkan
protein non target. Pemisahan protein target dari ikatan resin dilakukan dengan
penambahan imidazol yang terdapat dalam bufer elusi. BD Bioscience Clontech
(2003) menjelaskan bahwa konsentrasi imidazol hingga lebih dari 200 mM
menyebabkan protein yang memiliki residu His-tag terdisosiasi karena tidak
mampu lagi bersaing untuk berikatan dengan resin.
31
Analisis kemurnian protein target menggunakan pengukuran bobot molekul
dengan SDS-PAGE. Hasil pelisisan sel, pencucian dari hasil pengikatan dengan
resin TALON dan hasil elusi dengan imidazol dilihat kemurniannya berdasarkan
ada atau tidaknya protein target pada masing-masing tahapan tersebut.
Elektroforesis dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi 8%. Hal
ini dikarenakan protein target (enzim) memiliki bobot molekul yang besar,
sehingga dibutuhkan gel akrilamid dengan konsentrasi rendah agar terjadi
pemisahan pita protein yang optimal. Elektroforegram SDS-PAGE dapat dilihat
pada Gambar 13.
Gambar 13 Analisis SDS-PAGE pemurnian RNA helikase HCV. P: pelet sel,
S: supernatan hasil lisis, IV: inner volume (supernatan binding),
W1: pencucian pertama, W2: pencucian kedua, E1&E2: RNA
helikase HCV, M: marker protein.
Hasil SDS-PAGE menunjukkan pita protein tunggal dengan bobot 54 kDa
pada hasil elusi dengan imidazol, sehingga dapat dikatakan bahwa RNA helikase
HCV telah berhasil dipurifikasi. Hal ini sesuai dengan hasil yang telah dilaporkan
Utama et al.(2000) yang menyatakan bahwa bobot molekul RNA helikase yang
dimiliki oleh virus hepatitis C adalah sebesar 54 kDa. Hasil pencucian binding
resin TALON (W1 dan W2) tidak menunjukkan terdapatnya pita protein, hal ini
dikarenakan yang terdapat pada tahap itu hanya buffer B. Jalur hasil pelisisan sel
menunjukkan pita protein target yang dalam hal ini diduga adalah RNA helikase,
sehingga dapat dikatakan bahwa sebelumnya RNA helikase telah terekspresi pada
sel bakteri.
32
4.2 Kultivasi Mikroalga BTM 11
Mikroalga BTM 11 merupakan salah satu ganggang atau fitoplankton yang
diisolasi dari perairan laut Batam, dengan lokasi spesifik yaitu pada titik/stasiun
ke-11 di area pengamatan. Kultur mikroalga BTM 11 dilakukan dengan media
IMK-SW. Penggunaan media ini disesuaikan dengan kebutuhan nutrisi mikroalga
BTM 11 yang mengacu kepada habitat asal isolat mikroalga tersebut. Kultur
tersebut berwarna hijau pekat. Warna ini berhubungan dengan pigmen yang
dimiliki oleh BTM 11. Warna kultur semakin pekat seiring dengan lamanya waktu
kultur. Kepekatan warna yang terjadi menunjukkan kepadatan biomasa pada
kultur tersebut. Kondisi kultur mikroalga BTM 11 dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14 Kondisi kultivasi mikroalga BTM 11.(A: prekultur pada galon, B:
Scale-up kultur, C: Hasil panen).
Pertumbuhan BTM 11 diketahui dengan mengukur kepadatan sel
menggunakan spektrofotometer. Hal ini dikarenakan morfologi sel dari BTM 11
yang berbentuk filamen, sehingga tidak memungkinkan untuk dihitung secara
manual menggunakan hemasitometer. Kepadatan sel diukur pada serapan panjang
gelombang 630 nm dikarenakan mikroalga BTM 11 memiliki serapan optimum
pada panjang gelombang tersebut. Andersen (2005) menjelaskan bahwa besarnya
serapan gelombang cahaya monokromatik pada pengukuran kepadatan sel kultur
mikroalga didasari oleh warna yang dihasilkan oleh mikroalga tersebut.
Kultivasi dilakukan pada suhu ruang dengan intensitas pencahayaan sebesar
4800 lux, sehingga mikroalga BTM 11 berhasil tumbuh dengan baik. Kultur yang
ditumbuhkan di bawah cahaya secara kontinyu akan tumbuh dengan cepat. Arad
& Richmond (2004) menjelaskan bahwa faktor lingkungan yang penting untuk
kultur mikroalga adalah cahaya, yang merupakan faktor utama pada fotosintesis.
Morfologi sel mikroalga BTM 11 dapat dilihat pada Gambar 15.
33
Gambar 15 Mikroalga BTM 11 dengan perbesaran 1000x. (Dokumentasi
Laboratorium Biorekayasa Lingkungan 2010).
Biomassa hasil panen mikroalga BTM 11 diperoleh dari Laboratorium
Biorekayasa Lingkungan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI dengan umur panen
14 hari. Kultur mikroalga BTM 11 sebanyak 30 liter menghasilkan biomassa
basah hasil panen sebesar 338 g (kering 38 g). Kurva pertumbuhan mikroalga
BTM 11 dapat dilihat pada Gambar 16.
Gambar 16 Kurva pertumbuhan mikroalga BTM 11.
Mikroalga BTM 11 dipanen sebelum mencapai fase stasioner
(fase pertumbuhan) (Gambar 16). Hal ini berdasarkan pada waktu pembentukan
makromolekul polisakarida dalam sel mikroalga. Arad et al. (1985) menjelaskan
bahwa aktivitas optimum pembentukan polisakarida terjadi pada fase stasioner.
Namun pada fase stasioner, pembentukan optimal polisakarida bersamaan dengan
sekresi polisakarida tersebut oleh mikroalga ke media tumbuh yang dapat dilihat
dari peningkatan viskositas media tumbuh mikroalga. Hasil penelitian Putri
(2011) menunjukkan bahwa biomassa mikroalga BTM 11 yang dipanen pada
akhir fase pertumbuhan eksponensial (umur 50 hari pada media yang berbeda)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 2 4 6 8 10 12 14
Ab
sorb
an
si
Hari ke-
Fase lag
Fase log
34
memiliki aktivitas penghambatan yang optimum terhadap RNA helikase HCV,
yaitu sebesar 81,2%.
4.3 Ekstrak Polisakarida Mikroalga BTM 11
Teknik ekstraksi polisakarida yang digunakan mengacu kepada metode
Wang et al. (2004). Ekstraksi bertujuan untuk memisahkan satu atau lebih
senyawa yang diinginkan dalam suatu larutan atau padatan yang mengandung
campuran senyawa-senyawa tersebut. Ekstraksi dilakukan terhadap BTM 11 yang
sudah dalam bentuk serbuk, dengan tujuan untuk mempermudah kontak antara
sampel dengan pelarut. Ekstraksi polisakarida dilakukan dengan cara maserasi
pada suhu ruang, sehingga dapat dihindari terjadinya penguraian zat aktif yang
terkandung dalam sampel oleh pemanasan. Maserasi dilakukan secara bertingkat
dengan menggunakan pelarut yang berbeda tingkat kepolaran secara bergantian
(polar dan semi polar). Pelarut yang digunakan secara berurutan adalah etanol,
aseton dan air garam.
Penggunaan etanol dapat melarutkan senyawa-senyawa selain polisakarida
yang memiliki tingkat kepolaran sama dengan etanol. Polisakarida cenderung
tidak larut terhadap etanol, dikarenakan terjadinya interaksi secara kovalen antar
monomer penyusunnya yang menyebabkan terbentuknya konformasi ikatan yang
lebih rigid dan kompleks sehingga pada beberapa kasus, polisakarida akan
mengendap sebagai presipitat (Varki et al. 1999; Shi et al. 2007). Penggunaan
aseton pada tingkat ekstraksi selanjutnya akan melarutkan senyawa selain
polisakarida yang pada proses sebelumnya tidak larut terhadap etanol dikarenakan
tingkat kepolaran yang berbeda. Rianudo (2006) menjelaskan bahwa penggunaan
larutan garam (0,9% NaCl) akan melarutkan polisakarida dikarenakan
penambahan garam tidak jenuh dengan konsentrasi rendah menyebabkan molekul
polisakarida menjadi bermuatan sehingga terjadi interaksi ionik antara molekul
polisakarida dengan garam.
Hasil metabolit yang telah larut dibersihkan dari protein dengan
menggunakan TCA. Ekstrak kasar polisakarida diperoleh dengan cara pemekatan
konsentrasi sampel menggunakan freeze dryer. Pemekatan konsentrasi dengan
freeze dryer dapat mengurangi perubahan kimiawi dari senyawa target
35
dikarenakan proses berlangsung pada suhu rendah. Hasil ekstraksi dari 2 g
biomassa kering menghasilkan 50 mg ekstrak polisakarida. Ekstrak kasar
polisakarida inhibitor kemudian diuji aktivitas penghambatannya menggunakan
uji ATPase. Hasil pengujian menunjukkan ekstrak kasar polisakarida BTM 11
dapat menghambat aktivitas ATPase dari RNA helikase HCV sebesar 64,65%.
Nilai ini menunjukkan bahwa inhibitor menghambat sebesar 64,65% aktivitas
enzim per 1 molekul RNA helikase dalam menghidrolisis ATP menjadi ADP dan
fosfat anorganik. Aktivitas inhibisi dari ekstrak kasar polisakarida BTM 11 dapat
dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3Aktivitas inhibisi dari ekstrak polisakarida
No. Tahapan Aktivitas inhibisi (%)
1
2
3
Maserasi akhir
Deproteinasi TCA
Pemekatan menggunakan freeze dryer
103,4
35,1
64,6
Aktivitas inhibisi (Tabel 2) fluktuatif selama proses ekstraksi polisakarida.
Hasil maserasi tahap akhir oleh NaCl 0,9% memiliki aktivitas penghambatan
terhadap RNA helikase lebih besar dari 100%, hal ini dikarenakan masih
terdapatnya banyak senyawa yang dalam aktivitasnya secara in vitro dapat
menghambat aktivitas RNA helikase. Pada tahap selanjutnya, yaitu deproteinasi
menggunakan TCA 10% menunjukkan aktivitas penghambatan yang lebih rendah
dari sebelumnya, hal ini dapat terjadi karena sebagian senyawa terendapkan oleh
TCA sehingga filtrat hasil presipitasi tersebut memiliki aktivitas yang rendah.
Ye et al. (2008) menjelaskan bahwa penambahan TCA dapat menghilangkan
protein yang terkandung dalam sampel.
Ekstrak kasar polisakarida memiliki aktivitas yang lebih tinggi
dibandingkan hasil deproteinasi. Hal ini dikarenakan pemekatan oleh freeze dry
dari hasil deproteinasi yang menyebabkan konsentrasi ekstrak meningkat sehingga
aktivitas penghambatan terhadap RNA helikase pun ikut meningkat karena
minimnya pengaruh dari pelarut. Zhang et al. (2012) menjelaskan bahwa pelarut
dapat mempengaruhi nilai aktivitas antivirus, sehingga pelarut harus dihilangkan
agar dapat diketahui besarnya aktivitas penghambatan yang murni dimiliki oleh
inhibitor.
36
Ekstrak kasar polisakarida yang dihasilkan memiliki aktivitas inhibisi yang
lebih rendah dari penelitian sebelumnya. Mustopa et al. (2010) menjelaskan
bahwa ekstrak kasar mikroalga BTM 11 memiliki aktivitas penghambatan
terhadap RNA helikase sebesar 80% (dilusi 5x). Perbedaan ini karena penggunaan
metode ekstraksi bertingkat pada penelitian ini menyebabkan banyak senyawa
yang dapat berperan sebagai inhibitor ikut hilang selama proses ekstraksi. Namun
ekstrak kasar polisakarida yang dihasilkan pada penelitian ini memiliki aktivitas
inhibisi yang lebih tinggi dari mikroalga jenis lain. Mustopa et al. (2010) juga
menjelaskan bahwa beberapa jenis mikroalga yang diisolasi dari perairan Ciater
(Jawa Barat) memiliki aktivitas penghambatan terhadap RNA helikase HCV
kurang dari 50%.
4.4 Pemurnian Polisakarida Inhibitor RNA Helikase
1) Kromatografi gel filtrasi
Pemurnian polisakarida BTM 11 dilakukan dengan menggunakan kolom
Sepharose 4B. Pemurnian dilakukan dengan memadatkan terlebih dahulu fase
diam berupa matriks gel pada kolom di dalam cold room, kemudian kolom dibilas
secara simultan dengan air hingga tidak ada senyawa yang masih terdapat di
dalam matriks gel tersebut. Sampel dimasukkan sebanyak 1 mL kemudian
digunakan fase gerak berupa campuran etanol:air (3:7). Berbagai macam eluen ini
dipilih berdasarkan tingkat kepolarannya. Soczewinski & Wawrzynowics (2003)
menjelaskan senyawa yang bersifat polar akan keluar paling akhir, senyawa
tersebut akan berikatan lebih kuat dengan fase diam sehingga terelusi paling akhir.
Matriks gel Sepharose 4B dengan menggunakan fase gerak etanol:air (3:7)
menghasilkan penghambatan tertinggi terhadap RNA helikase HCV sebesar
78,76% pada fraksi ke-13 dengan konsentrasi penghambatan sebesar 0,7615 mM.
Nilai ini sudah merupakan nilai murni penghambatan karena sudah dikurangi
dengan kontrol negatif. Kontrol negatif digunakan untuk mengetahui pengaruh
dari pelarut yang digunakan. Kontrol positif tidak digunakan karena belum
ditemukannya obat atau vaksin yang sesuai untuk infeksi virus hepatitis C. Contoh
perhitungan dan tabulasi data dapat dilihat pada Lampiran 3 dan 4. Profil aktivitas
37
penghambatan RNA helikase HCV oleh hasil fraksinasi kromatografi gel filtrasi
dapat dilihat pada Gambar 17.
Gambar 17 Inhibisi polisakarida fraksi gel filtrasi terhadap aktivitas ATPase RNA
helikase HCV.
Hasil fraksinasi dengan aktivitas penghambatan tertinggi yang diperoleh
tergolong cukup efektif, dan lebih tinggi jika dibandingkan dengan hasil
penelitian sebelumnya. Mori et al. (2012) melaporkan bahwa polisakarida yang
diisolasi darimakroalga Cladosiphon okamuranus memiliki aktivitas
penghambatan terhadap replikasi HCV sebesar 60%. Perbedaan ini karena
penggunaan metode ekstraksi dan pemurnian yang digunakan berbeda, sehingga
kandungan polisakarida yang aktif menghambat virus hepatitis C juga berbeda.
Beberapa bahan aktif dari produk alam jenis lain juga diketahui dapat
menghambat aktivitas RNA helikase HCV. Hasil pemurnian ekstrak buah
tanaman mangrove (Avicennia marina) dapat menghambat aktivitas ATPase
enzim RNA helikase HCV sebesar 76,7% (Kusumawati 2011). Selain itu terdapat
pula hasil pemurnian ekstrak rimpang temulawak (Curcuma zanthorrhiza) yang
dapat aktivitas ATPase dari enzim RNA helikase HCV sebesar 73,6%
(Setianingsih 2011).
2) Kromatografi ion-exchange
Pemurnian ini menggunakan sistem elusi gradien, senyawa dihilangkan dari
kolom dengan mengubah kondisi elusi yang tidak cocok untuk ikatan ion molekul
terlarut. Perubahan kondisi elusi dilakukan dengan cara meningkatkan gradien
konsentrasi garam. Eluen yang dipakai adalah NaCl dengan konsentrasi dimulai
dari 0,1-1 M. Profil aktivitas penghambatan RNA helikase HCV oleh hasil
fraksinasi kromatografi ion-exchange dapat dilihat pada Gambar 18.
43,95 55,88
71,23
78,76%
65,77
41,07
-20
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
% P
engh
am
bata
n
Fraksi ke-
38
Gambar 18 Inhibisi polisakarida fraksi ion-exchange terhadap aktivitas ATPase
RNA helikase HCV.
Aktivitas penghambatan tertinggi adalah sebesar 74,6% dengan konsentrasi
0,7205 mM pada fraksi ke-10. Nilai ini merupakan nilai murni aktivitas
penghambatan karena sudah dikurangi dengan kontrol negatif yaitu NaCl 0,25 M.
Aktivitas penghambatan ini lebih rendah dari hasil kromatografi gel filtrasi. Hal
ini diduga karena interaksi yang lebih kuat antara eluen dengan polisakarida
inhibitor pada kromatografi gel filtrasi, sehingga zat aktif akan lebih mudah
terelusi oleh fase gerak. Rinaudo (2006) menjelaskan polisakarida berikatan kuat
dengan molekul polar dengan cara membentuk ikatan hidrogen dari gugus –OH
yang dimilikinya. Tabulasi data aktivitas penghambatan dari hasil fraksinasi
kromatografi ion-exchange dapat dilihat pada Lampiran 5.
4.5 Analisis Kandungan Gula
Fraksi aktif dalam penghambatan terhadap RNA helikase HCV pada tiap
teknik kromatografi dianalisis untuk menentukan konsentrasi gula penyusun
polisakarida pada sampel. Gula penyusun polisakarida yang dianalisis dalam
penelitian ini adalah glukosa. Penentuan konsentrasi gula mengacu pada kurva
standar glukosa (Lampiran 6). Hasil analisis gula dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Analisis kandungan gula
Sampel Aktivitas inhibisi (%) Kandungan gula (mg/mL)
Kromatografi
gel filtrasi
Fraksi 12 71,23 3,51
Fraksi 13 78,76 2,97
Fraksi 14 65,77 0,45
Kromatografi
ion-exchange
Fraksi 10 74,57 3,21
Fraksi 11 72,94 3,50
Fraksi 12 70,42 3,77
74,6%72,92
62,72
71,66
49,89
24,84
-20
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
%P
engh
am
bata
n
Fraksi ke-
39
Hasil pada Tabel 4 menunjukkan bahwa fraksi 13 kromatografi gel filtrasi
dengan nilai aktivitas penghambatan tertinggi terhadap RNA helikase HCV
memiliki konsentrasi gula sebesar 2,97 mg/mL, sedangkan fraksi 10 kromatografi
ion-exchange memiliki konsentrasi gula sebesar 3,21 mg/mL. Hal ini
menunjukkan bahwa kandungan gula tidak selalu berkorelasi dengan aktivitas
penghambatan dari polisakarida inhibitor, dikarenakan analisis hanya dilakukan
terhadap glukosa yang merupakan salah satu penyusun polisakarida. Sehingga
dalam aktivitas menghambat RNA helikase HCV, tidak tertutup kemungkinan
bahwa glukosa berikatan dengan senyawa lain.
Penelitian ini menggunakan metode fenol-asam sulfat. Dubois et al. (1956)
menjelaskan bahwa prinsip metode fenol-asam sulfat adalah gula sederhana,
oligosakarida, polisakarida dan turunannya, termasuk metil eter akan membentuk
warna kuning ketika direaksikan dengan fenol yang terkonsentrasi pada asam
sulfat. Metode ini mengukur besarnya kandungan gula di dalam sampel, baik yang
dalam kondisi berikatan maupun senyawa bebas.
Bennet dan Steitz (1978) menjelaskan bahwa senyawa glukosa dalam
keadaan terikat/terkonjugasi dapat menghambat aktivitas ATPase dengan cara
mengubah konformasi bentuk enzim heksokinase. Hal ini menunjukkan bahwa
senyawa glukosa juga dapat menghambat aktivitas ATPase dari enzim RNA
helikase. Utama et al. (2000) menjelaskan bahwa enzim RNA helikase
memperoleh energi untuk membuka ikatan dupleks RNA virus hepatitis C dari
aktivitasnya sebagai ATPase dalam menghidrolisis ATP menjadi ADP dan fosfat
anorganik (Pi). Mukherjee et al. (2012) menyebutkan bahwa terdapat beberapa
senyawa lain yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase HCV yaitu
triphenylmethane, acridone, amidinoanthracycline, tropolone, symmetrical
benzimidazole, dan turunan senyawa primuline.
4.6 Analisis Kemurnian Fraksi Aktif Polisakarida Inhibitor
1) Kromatografi lapis tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis dilakukan untuk melihat profil kimiawi dari fraksi
13 kromatografi gel filtrasi yang memiliki aktivitas penghambatan paling besar
terhadap RNA helikase. Hasil fraksi tersebut akan menunjukkan spot pemisahan
40
senyawa aktif pada plat KLT. Eluen (fase gerak) yang digunakan adalah
asetonitril:metanol (6:4),sedangkan adsorben atau fase diam yang digunakan
adalah silika gel. Menurut Bintang (2010), silika gel umumnya digunakan pada
KLT untuk memisahkan senyawa asam amino, alkaloid, gula, asam lemak, lipid,
minyak esensial, anion dan kation anorganik, steroid dan terpenoid. Tiap spot
yang terdeteksi merupakan gambaran suatu senyawa. Hasil kromatogram dan
retardation factor (Rf) yang dihasilkan dapat dilihat padaGambar 19dan Tabel 5.
Gambar 19 Kromatogram KLT dengan deteksi sinar UV 254 nm.(kiri: fraksi 13
kromatografi gel filtrasi, kanan: standar glukosa 1 mg/mL).
Tabel 5 Nilai Rfsenyawa aktif polisakarida
Sampel Rf
Fraksi 13 kromatografi gel filtrasi
Standar glukosa
0,832
0,834
Hasil KLT menunjukkan bahwa fraksi 13 mempunyai 1 spot dengan nilai Rf
sebesar 0,832. Nilai ini mendekati spot yang ditunjukkan oleh standar glukosa
yang digunakan dengan nilai Rf sebesar 0,834 sehingga diduga bahwa komponen
aktif yang terdeteksi merupakan senyawa glukosa. Hasil penelitian lain yang
dilaporkan Biringanine et al. (2012) menunjukkan bahwa polisakarida inhibitor
HCV dari tumbuhan Plantago palmata memiliki kandungan monosakarida jenis
ramnosa, arabinosa dan glukosa dengan nilai Rf pada KLT sebesar 0,3; 0,5 dan
0,65. Perbedaan nilai Rf dapat dipengaruhi oleh fase gerak yang digunakan.
Soczewinski & Wawrzynowics (2003) menjelaskan bahwa senyawa yang
41
berikatan lebih kuat dengan fase diam akan terpisah paling akhir dikarenakan daya
serap adsorben dengan komponen-komponen senyawa tidak sama sehingga
senyawa tersebut akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan
tingkat kepolarannya.
2) Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT/HPLC)
Fraksi dengan aktivitas tertinggi (fraksi 13) dari hasil fraksinasi gel filtrasi
dianalisis kemurniannya menggunakan teknik kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT/HPLC). Tingkat kemurnian akan terlihat dari banyaknya peak atau
puncak yang terdeteksi yang menunjukkan banyaknya senyawa yang terdeteksi
dalam sampel. Tingkat kemurnian paling tinggi diperoleh jika hanya terdapat satu
peak yang terdeteksi. Kromatogram yang ditunjukkan oleh fraksi 13 dan hasil
analisisnya dapat dilihat pada Gambar 20.
Gambar 20Kromatogram KCKT fraksi 13.
Fraksi 13 memiliki tiga peak (Gambar 19), satu peak tajam yang
menunjukkan retention time (Rt) sebesar 4,072, dan dua peak lainnya yang
terdeteksi dengan Rt 4,706 dan 5,530. Hal ini menunjukkan bahwa hasil fraksi
aktif yang didapat tersebut belum murni karena masih terdapat senyawa lain.
Senyawa-senyawa yang terdeteksi diduga berperan dalam penghambatan aktivitas
RNA helikase virus hepatitis C, namun belum diketahui aktivitas inhibisi dari
masing-masing senyawa tersebut. Mekanisme inhibitor RNA helikase meliputi (1)
inhibitor menempel pada RNA helikase tidak pada sisi aktifnya, namun terjadi
perubahan konformasi bentuk enzim yang mengakibatkan berkurangnya interaksi
enzim dengan substrat (Borowski et al. 2008), (2) inhibitor berikatan pada sisi
aktif enzim (RNA binding-site) sehingga ATP tidak dapat berikatan dengan enzim,
42
menyebabkan enzim tidak memiliki cukup energi untuk membuka untai ganda
RNA (Yamashita et al. 2012).
11 16
5 SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
Enzim RNA helikase berhasil dipurifikasi dengan bobot molekul sebesar 54
kDa. Kultur mikroalga BTM 11 dapat tumbuh pada media IMK-Sea Water
dengan menghasilkan biomassa basah sebesar 338 g pada umur panen 14 hari.
Polisakarida yang memiliki aktivitas inhibisi tertinggi terhadap RNA helikase
HCV diperoleh melalui pemurnian menggunakan kromatografi gel filtrasi, dengan
aktivitas sebesar 78,76% dan kandungan gula sebesar 2,97 mg/mL. Hasil
pemurnian lanjutan menggunakan kromatografi lapis tipis menghasilkan satu spot
senyawa aktif dengan nilai Rf sebesar 0,832. Hasil analisis fraksi aktif dengan
menggunakan KCKT diperoleh 3 puncak senyawa yang menandakan bahwa hasil
fraksi polisakarida belum murni.
5.2 Saran
Saran untuk penelitian lanjutan adalah uji toksisitas, identifikasi dan analisis
bobot molekul dari polisakarida inhibitor yang memiliki aktivitas tertinggi.
Karakterisasi polisakarida inhibitor perlu dilakukan untuk mengetahui kestabilan
aktivitas inhibitor pada berbagai kondisi. Selain itu, diperlukan pula pengujian
secara in vitro menggunakan sel virus aktif dan secara in vivo menggunakan
hewan model untuk mengetahui secara pasti efektifitas, mekanisme
penghambatan dan efek samping dari polisakarida mikroalga BTM 11 terhadap
virus hepatitis C.
11 16
DAFTAR PUSTAKA
Al Baarri AN. 2003. Analisis perbedaan kolom pada determinasi karbohidrat susu
fermentasi dengan metode HPLC. Journal of The Indonesian Tropical
Animal Agriculture. 28(1): 27-32.
Amersham PB. 1999. Protein Purification Handbook. USA: Amersham
Pharmacia Biotech Inc. 98 hlm.
Andersen RA. 2005. Algal Culturing Techniques. New York: Elsevier Academic
Press. 588 hlm.
Anzola M, Burgos JJ. 2003. Hepatitis C virus (HCV): model structure and
genome organisation. [terhubung berkala]. http://www.expertreview.org
[1 Juni 2012].
Arad SM, Adda M, Cohen E. 1985. The potential of production of sulfated
polysaccharides from Porphyridium. Plan and Soil 89: 117-127.
Arad SM, Richmond A. 2004. Industrial Production of Microalgal Cell-mass and
Secondary Products-Species of High Potential Porphyridium sp. Dalam
Richmond A, editor. Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and
Applied Phycology. United Kingdom: Blackwell Publishing Company.
Barsanti L, Gualtieri P. 2005. Algae: Anatomy, Biochemistry and Biotechnology.
New York: CRC Press. 320 hlm.
Baumgartner B, Chrispeels. 1976. Partial characterization of a protease inhibitor
which inhibits the major endopeptidase present in the cotyledons of mung
beans. Plant Physiology 58: 1-6.
BD Bioscience Clontech. 2003. BD TALONTM
Metal Affinity Resins User Manual.
Becton: Dickinson & Company. 47 hlm.
Becker EW. 1994. Microalgae: Biotechnology and Microbiology. New York:
Cambridge University Press. 305 hlm.
Bennet WS, Steitz TA. 1978. Glucose-induced conformational change in yeast
hexokinase. Proceedings of The National Academy of Sciences 75(10):
4848-4852.
Beress A, Wassermann O, Tahhan S, Bruhn T, Beress L, Kraiselburd EN,
Gonzalez LV, de Motta GE, Chavez PI. 1993. A new procedure for
isolation of anti-HIV compounds (polysaccharides and polyphenols) from
the marine alga Fucus vesiculosus. Journal of Natural Products 56:
478-488.
Biringanine G, Ouedraogo M, Vray B, Samuelsen AB, Duez P. 2012. Partial
chemical characterization of immunomodulatory polysaccharides from
Plantago palmata. International Journal of Carbohydrate Chemistry: 1-7.
Borowski P, Niebuhr A, Schmitz H, Hosmane RS, Bretner M, Siwecka MA,
Kulikowski T. 2002. NTPase/helicase of Flaviviridae: inhibitors and
inhibition of the enzyme. Acta Biochimica Polonica 49: 597-614.
45
Borowski P, Heising MV, Miranda IB, Liao CL, Choe J, Baier A. 2008. Viral
NS3 helicase activity is inhibited by peptides reproducing the Arg-rich
concerved motif of the enzyme (motif VI). Biochemical Pharmacology 76:
28-38.
Chan KM, Delfert D, Junger KD. 1986. A direct colorimetric assay for Ca2+
stimulated ATPase activity. Analytical Biochemistry157: 375-380.
Clercq ED. 2004. Antivirals and antiviral strategies. Nature Review:
Microbiology2: 704-720.
d’Ayala GG, Malinconico M, Laurienzo P. 2008. Marine derived polysaccharide
for biomedical applications: chemical modification approaches. Molecules
13: 2069-2106.
[EASL] European Association for the Study of the Liver. 2011. EASL Clinical
Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of
Hepatology 55: 245-264.
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Colorimetric
method of determination of sugars and related substances. Analytical
Chemistry 28(3): 350-356.
Gandjar IG, Rohman A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka
Pelajar. 486 hlm.
Ghosh T, Chattopadhyay K, Marschall M, Karmakar P, Mandal P, Ray B. 2009.
Focus on antivirally active sulfated polysaccharides: From structure-
activity analysis to clinical evaluation. Glycobiology 19(1): 2-15.
Giavasis I, Bilianderis CG. 2006. Microbial Polysaccharides. Dalam Bilianderis
CG dan Izydorczyk, editor. Functional Food Carbohydrates. New York:
CRC Press. 570 hlm.
Gouveia L. 2011. Microalgae as a Feedstock for Biofuels. London: Springer
Heodelberg Dordrecht. 76 hlm.
Hagel L. 1998. Gel filtration chromatography. Dalam Coligan JE, Dunn BM,
Ploegh HL, Speicher DW, dan Wingfiled PT, editor. Current Protocols In
Protein Science. Wahington: John Wiley & Sons Inc. 610 hlm.
Hairany A. 2010. Pemurnian dan karakterisasi protein inhibitor RNA helikase
virus hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095 [tesis]. Bogor:
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Harjadi W. 1976. Ilmu Kimia Analitik. Bogor: IPB Press. 290 hlm.
Huang S, Ning Z. 2010. Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum
and its immune enhancement activity. International Journal of Biological
Macromolecules, in press.
Huleihel M, Ishanu V, Tal J, Arad SM. 2001. Antiviral effect of red microalgal
polysaccharide on Herpes simplex and Varicella zoster viruses. Journal of
Applied Phycology 13: 127-134.
Jawaid A, Khuwaja AK. 2008. Treatment and vaccination for hepatitis C: present
and future. Journal Medical College Abbottabad 20: 129-133.
46
Kadare G, Haenni A. 1997. Virus encoded RNA helicases. Journalof Virology 71:
2583-2590.
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. 2010. Menkes meluncurkan program
pendataan penyakit hepatitis C tahap II. [terhubung berkala]
http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release [1 Juni 2012].
Koolman J, Rohm K. 2005. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Wanandi,
penerjemah; Jakarta: Terjemahan dari: Hipokrates. 435 hlm.
Kusumawati IS. 2011. Isolasi dan identifikasi pendahuluan bahan bioaktif sebagai
inhibitor RNA helikase virus hepatitis C dari ekstrak metanol buah
tanaman mangrove Avicennia marina [skripsi]. Jakarta: Fakultas Farmasi,
Universitas Pancasila.
Laurienzo P. 2010. Marine polysaccharides in Pharmaceutical applications: an
overview. Marine Drugs 8: 2435-2465.
LC Resources Inc. 2001. Getting started in HPLC. [terhubung berkala]
http://www.lcresources.com/resources/getstart/1c01.htm [12 Juni 2012].
Leliaert F, Smith DR, Moreau H, Herron MD, Verbruggen H, Delwiche CF, Clerk
OD. 2012. Phylogeny and molecular evolution of the green algae. Critical
Reviews in Plant Sciences 31: 1-46.
Mardiana U, Ramdani D. 2008. Analisis kadar akrilamida menggunakan HPLC
(High Performance Liquid Chromatography) pada ubi (Ipomea batatas L.)
cilembu sebelum dan setelah pemanggangan. Jurnal Kesehatan BTH 1(1):
21-31.
Mori N, Nakasone K, Tomimori K, Ishikawa C. 2012. Beneficial effects of
fucoidan in patient with chronic hepatitis C virus infection. World Journal
of Gastroenterology 18(18): 2225-2230.
Mukherjee S, Hanson AM, Shadrick WR, Ndjomou J, Sweeney NL, Hernandez
JJ, Bartczak D, Li K, Frankowski KJ, Heck JA, Arnold LA, Schoenen FJ,
Frick DN. 2012. Identification and analysis of hepatitis C virus NS3
helicase inhibitors using nucleic acid binding assays. Nucleic Acids
Research : 1-15.
Mustopa AZ, Susilaningsih D, Hasim, Ridwan M, Rahman DY, Farida H. 2010.
Purification of polysaccharide as spesific RNA helicase inhibitor from
microalgae BTM 11. ITSF, unpublished.
[NREL] National Renewable Energy Laboratory. 2003. A Look Back at The U.S.
Department of Energy’s Aquatic Species Program: Biodiesel from algae.
Colorado: National Renewable Energy Laboratory. 328 hlm.
Nurhamidah. 2005. Penentuan kondisi optimum HPLC untuk pemisahan residu
pestisida imidakloprid, profenofos dan deltametrin pada cabai
(Capsicum annum). Jurnal Ilmu-ilmu Pertanian Indonesia 7(2): 87-93.
Petty KJ. 1996. Metal-chelate affinity chromatography. Dalam Coligan JE, Dunn
BM, Ploegh HL, Speicher DW, dan Wingfiled PT, editor. Current
Protocols In Protein Science. Wahington: John Wiley & Sons Inc.
610 hlm.
47
Poendjiadi A, Supriyanti T. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Depok: UI Press.
476 hlm.
Purwadaria MBT. 1999. Penggunaan kromatografi tukar ion DEAE-Sepharose
CL-6B dalam purifikasi komponen selulase Cellulomonas CS1-17. Jurnal
Mikrobiologi Indonesia 4(1): 30-33.
Putri PH. 2011. Isolasi dan pemurnian bahan aktif dari mikroalga BTM 11 sebagai
inhibitor RNA helikase virus hepatitis C [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Rinaudo M. 2006. Non-covalent interaction in polysaccharide systems.
Macromoleculer Bioscience6: 590-610.
Rodjaroen S, Juntawong N, Mahakhant A, Miyamoto K. 2007. High biomass
production and starch accumulation in native green algal strain and
cyanobacterial strains of Thailand. Kasetsart Journal (Natural Sciences)
41: 570-575.
Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning: a laboratory manual. New
York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2344 hlm.
Sanchez-Moyano JE, Garcia-Asencio IM, Garcia-Gomez JC. 2007. Effect of
temporalvariation of the seaweed Caulerpa prolifera cover on the
associated crustacean community. Marine Ecology 28: 324-337.
Scopes RK. 1987. Protein Purification, Principles, and Practices. Ed ke-2. New
York: Springer Verlag. 380 hlm.
Setianingsih D. 2011. Isolasi dan identifikasi awal senyawa aktif dari ekstrak
rimpang temulawak (Curcuma zanthorrizha) sebagai inhibitor RNA
helikase virus hepatitis C (HCV) [skripsi]. Jakarta: Fakultas Farmasi,
Universitas Pancasila.
Sezonov G, Petit DJ, D’Ari R. 2007. Escherichia coli physiology in luria-bertani
broth. Journal of Bacteriology 189(23): 8746-8749.
Shih SR, Tsai KN, Li YS, Chueh CC, Chan EC. 2003. Inhibition of enterovirus
71-induced apoptosis by allophycocyanin isolated from a blue-green alga
Spirulina platensis. Journal of Medical Virology 70: 119-125.
SIGMA-ALDRICH. 2008. Detergents and solubilization reagents. Biofiles 3(3):
1-36.
Skoog DA. 2006. Principles of Instrumental Analysis 6th ed. Belmont: Thompson
Brooks/Cole. 1107 hlm.
Soczewinski E, Wawryznowicz T. 2003. Gel filtration chromatography. Di dalam
Jack Cazes, editor: Encyclopedia of Chromatography. New York: Marcel
Dekker. 1679 hlm.
Solga S, Pooedad FF, Rai R, Norwitz L, Kalloo AN. 2007. Viral hepatitis C. The
Johns Hopkins University. [terhubung berkala]. http://www.hopkins-
gi.nts.jhu.edu [8 Juni 2012].
48
SpeicherDW. 1997. Electrophoresis. Dalam Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL,
Speicher DW, Wingfield PT, editor. Current Protocol In Protein Science.
USA: John Wiley & Sons Inc. 610 hlm.
Talyshinsky M, Souprun Y, Huleihel M. 2002. Anti-viral activity of red
microalgal polysaccharide againts retroviruses. Cancer Cell International
2(8): 1-7.
Teas J, Hebert JR, Fitton JH, Zimba PV. 2004. Algae – a poor man’s HAART?.
Medical Hypotheses 62(4): 507-510.
Tellinghuisen TL, Evans MJ, Hahn T, You S, Rice CM. 2007. Studying hepatitis
C virus: making the best of a bad virus. Journal of Virology 81(17): 8853-
8867.
Tissue BM. 1996. Thin-Layer Chromatography (TLC). [terhubung berkala]
http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/tlc/tlc.htm [12 Juni 2012].
Utama A, Shimizu H, Morikawa S, Hasebe F, Morita K, Igarashi A, Hatsu M,
Takamizawa K, Miyamura T. 2000. Identification and characterization of
the RNA helicase activity of japanese enchepalitis virus NS3 protein.
FEBS Letter 456:74-78.
Vanz ALS, Renard G, Palma MS, Chies JM, Dalmora SL, Basso LA, Santos DS.
2008. Human granulocyte colony stimulating factor (Hg-CSF): cloning,
overexpression, purification and characterization. Microbial Cell Factories
7: 13-15.
Varki A, Cummings R, Esko J, Freeze H, Hart G, Marth J. 1999. Essentials of
Glycobiology. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press. 671
hlm.
Wang Y, Zhang M, Ruan D, Shashkov AS, Kilcoyne M, Savage AV, Zhang L.
2004. Chemical component and molecular mass of six polysaccharides
isolated from the sclerotium of Poria cocos. Carbohydrate Research 339:
327-334.
[WHO] World Health Organization. 2002. Guidelines for Drinking-water Quality:
addendum microbiological agents in drinking water. Geneva: World
Health Organization. 140 hlm.
Wilson K, Walker JM. 1994. Principles and Techniques of Practical
Biochemistry. Ed 4. Cambridge: Cambridge University Pr. 808 hlm.
Worman HJ, Lin F. 2000. Molecular biology of liver disorders: the hepatitis C
virus and molecular targets for drug development. World Journal of
Gastroentestinal 6: 465-469.
Yamashita A, Salam KA, Furuta A, Matsuda Y, Fujita O, Tani H, Fujita Y,
Fujimoto Y, Ikeda M, Kato N, Sakamoto N, Maekawa S, Enomoto N,
Nakakoshi M, Tsubuki M, Sekiguchi Y, Tsuneda S, Akimitsu N, Noda N,
Tanaka J, Moriishi K. 2012. Inhibition of hepatitis C virus replication and
viral helicase by ethyl acetate extract of the marine feather star
Alloeocomatella polycladia. Marine Drugs 10: 744-761.
49
Ye H, Wang K, Zhou C, Liu J, Zeng X. 2008. Purification, antitumor and
antioxidant activities in vitro of polysaccharide from the brown seaweed
Sargassum pallidum. Food Chemistry 111: 428-432.
Yuan YV, Walsh NA. 2006. Antioxidant and antiproliferative activities of
extracts from a variety of edible seaweeds. Food and Chemical Toxicology
44: 1144-1150.
Zhang T, Wu Z, Du J, Hu Y, Liu L, Yang F, Jin Q. 2012. Anti-Japanese-
Encephalitis-Viral effects of kaempferol and daidzin and their RNA-
binding characteristics. PLOS One 7(1): 1-16.
11 16
LAMPIRAN
51
Lampiran 1 Komposisi media IMK-SW
IMK – SW, dengan komposisi per liter :
- NaNO3 = 0,2 gram
- Na2HPO4 = 0,0014 gram
- K2HPO4 = 0,005 gram
- NH4Cl = 0,00268 gram
- Fe-EDTA = 0,0052 gram
- Na-EDTA = 0,0372 gram
- ZnSO4.7H2O = 0,0000023 gram
- CoSO4.7H2O = 0,000014 gram
- Na2MoO4.H2O = 0,00000073 gram
- CuSO4.5H2O = 0,0000025 gram
- MnCl2.4H2O = 0,000018 gram
- Biotin = 0,0000015 gram
- Thiamin HCl = 0,0002 gram
- Vitamin B12 = 0,0000015 gram
52
Lampiran 2 Komposisi larutan yang digunakan dalam SDS-PAGE
Medium dan larutan-larutan Bahan-bahan
a Larutan separating 8% H2O 7,25 ml
1,5 M Tris-Cl pH 8,8 containing 0.4% SDS 3,75 ml
30% Akrilamid 4 ml
10% Amonium Persulfat 0,05 ml
TEMED 0,015 ml
b Larutan stacking 3,9% H2O 3,05 ml
0,5 M Tris-Cl pH 6,8 containing 0.4% SDS 1,25 ml
30% Akrilamid 0,65 ml
10% Amonium Persulfat 0,025 ml
TEMED 0,005 ml
c Dapar sampel SDS 2X (Loading
Dye) 4x Tris Cl/SDS pH 6,8 25 ml
Gliserol 20 ml
SDS 4 g
β- mercaptoethanol (2-ME) 2 ml
Bromphenol blue 1 mg
H2O 53 ml
d Commasie Blue G-250 Staining
Solution (500 ml) 45% H2O 225 ml
45% Metanol 225 ml
10% Asam asetat glacial 50 ml
0,05%Commasie brilliant blue 250 mg
e Commasie Blue G-250
Destaining Solution (1000 ml) 50% H2O 500 ml
10% Asam asetat glacial 100 ml
40% Metanol 400 ml
53
Lampiran 3 Kurva standard fosfat (Uji ATPase)
Data :
Konsentrasi K2HPO4
(mM)
Absorbasi 620 nm
dengan referensi 405 nm
0,0
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0,000
0,102
0,239
0,417
0,622
0,834
1,022
Grafik :
Perhitungan konsentrasi enzim:
y = 1,0207x + 0,0103
1,203666 = 1,0207x + 0,0103
x = 1,203666−0,0103
1,0207
x = 1,1692 mM (konsentrasi enzim tanpa inhibitor)
Konsentrasi enzim yang telah dihambat oleh inhibitor mikroalga BTM 11
Contoh perhitungan pada Fraksi ke-13
y = 1,0207x + 0,0103
0,787593 = 1,0207x + 0,0103
x = 0,787593−0,0103
1,0207
x = 0,7615 mM (besar konsentrasi enzim yang berhasil dihambat)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Ab
s 620/4
05 n
m
[K2HPO4] (mM)
y = 1,0207x + 0,0103
R2 = 0,9989
54
Lampiran 4 Tabulasi data hasil fraksinasi kromatografi gel filtrasi
Rata-rata Selisih λ620-λ405 Abs Blanko Abs Enzim (Abs enzim-Abs Sampel)/ Abs enzim0,442 0,147666667 blanko
2,002 1,351333333 1,203666333 enzim 17x
1,812333333 1,227666667 1,079999667 0,123666333 0,102741403 10,27414028 etanol : air (3:7)
1,811333333 1,237333333 1,089666333 0,113999667 0,094710382 9,471038201 -0,803101799 Fraksi 1
1,815 1,234333333 1,086666333 0,116999667 0,097202768 9,720276777 -0,553863223 Fraksi 2
1,836666667 1,249666667 1,101999667 0,101666333 0,084463907 8,446390721 -1,827749279 Fraksi 3
1,851666667 1,258333333 1,110666333 0,092999667 0,077263682 7,726368167 -2,547771833 Fraksi 4
1,777 1,218666667 1,070999667 0,132666333 0,11021856 11,02185601 0,747716008 Fraksi 5
1,874333333 1,276 1,128333 0,075333 0,062586299 6,258629886 -4,015510114 Fraksi 6
1,312 0,858666667 0,710999667 0,492666333 0,409304851 40,93048515 30,65634515 Fraksi 7
1,284333333 0,798 0,650333 0,553333 0,45970643 45,97064302 35,69650302 Fraksi 8
1,129 0,698666667 0,550999667 0,652666333 0,542232092 54,22320921 43,94906921 Fraksi 9
1,177 0,73 0,582333 0,621333 0,516200507 51,62005074 41,34591074 Fraksi 10
0,965 0,555 0,407333 0,796333 0,661589677 66,15896769 55,88482769 Fraksi 11
0,735333333 0,370333333 0,222666333 0,980999667 0,815009867 81,50098671 71,22684671 Fraksi 12
0,619333333 0,279666667 0,131999667 1,071666333 0,890335303 89,03353034 78,75939034 Fraksi 13
0,810666667 0,436 0,288333 0,915333 0,760454312 76,04543121 65,77129121 Fraksi 14
1,188 0,733333333 0,585666333 0,617999667 0,51343119 51,34311899 41,06897899 Fraksi 15
2,092 1,337 1,189333 0,014333 0,011907788 1,190778837 -9,083361163 Fraksi 16
2,045333333 1,319 1,171333 0,032333 0,026862103 2,686210294 -7,587929706 Fraksi 17
2,070666667 1,322 1,174333 0,029333 0,024369717 2,436971718 -7,837168282 Fraksi 18
2,089333333 1,347 1,199333 0,004333 0,003599836 0,359983583 -9,914156417 Fraksi 19
1,741666667 1,185 1,037333 0,166333 0,138188667 13,8188667 3,544726696 Fraksi 20
1,730666667 1,184666667 1,036999667 0,166666333 0,138465599 13,84655987 3,572419871 Fraksi 21
1,760333333 1,185666667 1,037999667 0,165666333 0,137634803 13,76348035 3,489340345 Fraksi 22
1,722 1,179666667 1,031999667 0,171666333 0,142619575 14,2619575 3,987817498 Fraksi 23
1,715333333 1,192 1,044333 0,159333 0,1323731 13,23731002 2,963170018 Fraksi 24
1,698333333 1,149 1,001333 0,202333 0,168097296 16,80972961 6,535589609 Fraksi 25
Persentase
55
Lampiran 5 Tabulasi data hasil fraksinasi kromatografi ion-exchange
Rata - Rata Selisih λ620-λ405 Abs Blanko Abs Enzim (Abs enzim-Abs Sampel)/ Abs enzim Nama sampel
0,7583 0,3893 blanko
2,0220 1,2657 0,8763 enzim 26x
1,2617 0,7633 0,7467 0,0657 0,0808 8,0837 NaCl 0,25 M
1,3127 0,7990 0,7823 0,0300 0,0369 3,6931 NaCl 0,5 M
1,2710 0,7640 0,7473 0,0650 0,0800 8,0017 NaCl 0,75 M
1,8357 1,2320 0,8427 0,0337 0,0384 3,8418 3,8418 fraksi 1
1,8793 1,2467 0,8573 0,0190 0,0217 2,1682 2,1682 fraksi 2
1,9003 1,2607 0,8713 0,0050 0,0057 0,5706 0,5706 fraksi 3
1,9360 1,2723 0,8830 -0,0067 -0,0076 -0,7607 -0,7607 fraksi 4
1,9653 1,2847 0,8953 -0,0190 -0,0217 -2,1681 -2,1681 fraksi 5
1,9673 1,2640 0,8747 0,0017 0,0019 0,1902 0,1902 fraksi 6
1,9490 1,2380 0,8487 0,0277 0,0316 3,1571 -4,9266 fraksi 7
2,0140 1,2483 0,8590 0,0173 0,0198 1,9780 -6,1058 fraksi 8
1,8893 1,2443 0,8550 0,0213 0,0243 2,4344 -5,6493 fraksi 9
0,9453 0,5413 0,1520 0,7243 0,8265 82,6550 74,5712 fraksi 10
0,9677 0,5557 0,1663 0,7100 0,8102 81,0194 72,9356 fraksi 11
0,9930 0,5777 0,1883 0,6880 0,7851 78,5089 70,4252 fraksi 12
1,0117 0,5943 0,2050 0,6713 0,7661 76,6071 72,9140 fraksi 13
1,0653 0,6377 0,2483 0,6280 0,7166 71,6622 67,9691 fraksi 14
1,1193 0,6837 0,2943 0,5820 0,6641 66,4131 62,7200 fraksi 15
1,0960 0,6657 0,2763 0,6000 0,6847 68,4671 64,7740 fraksi 16
1,0193 0,6053 0,2160 0,6603 0,7535 75,3518 71,6587 fraksi 17
1,0440 0,6233 0,2340 0,6423 0,7330 73,2978 69,6047 fraksi 18
1,1977 0,7583 0,3690 0,5073 0,5789 57,8927 49,8911 fraksi 19
1,9197 1,2220 0,8327 0,0437 0,0498 4,9829 -3,0188 fraksi 20
2,0147 1,1567 0,7673 0,1090 0,1244 12,4382 4,4365 fraksi 21
2,0180 1,0930 0,7037 0,1727 0,1970 19,7033 11,7017 fraksi 22
1,9543 1,0480 0,6587 0,2177 0,2484 24,8384 16,8367 fraksi 23
1,9060 1,1000 0,7107 0,1657 0,1890 18,9046 10,9029 fraksi 24
1,9390 1,0667 0,6773 0,1990 0,2271 22,7083 22,7083 fraksi 25
1,9383 1,0687 0,6793 0,1970 0,2248 22,4801 22,4801 fraksi 26
1,9447 1,1293 0,7400 0,1363 0,1556 15,5573 15,5573 fraksi 27
1,9183 1,1377 0,7483 0,1280 0,1461 14,6063 14,6063 fraksi 28
1,9400 1,1607 0,7713 0,1050 0,1198 11,9818 11,9818 fraksi 29
1,9580 1,1657 0,7763 0,1000 0,1141 11,4112 11,4112 fraksi 30
Persentase
56
Lampiran 6 Kurva standard glukosa (Uji kandungan gula)
Data :
Konsentrasi Glukosa
(mg/mL) Absorbasi 490 nm
0,0
0,1
0,3
0,5
0,8
1,0
0,000
0,022
0,137
0,273
0,395
0,399
Grafik :
Perhitungan kandungan gula (glukosa) pada fraksi ke-10 ion-exchange:
y = 0,4427x + 0,0051 0,151 = 0,4427x + 0,0051
x = 0,151−0,0051
0,4427
x = 0,3212 x 10 (dilusi sampel 10x)
x = 3,212 mg/mL
y = 0,4427x + 0,0051
R² = 0,9583
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Ab
sorb
an
si
490n
m
konsentrasi (mg/mL)
