LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI VIROLOGI

“Perhitungan Jumlah Bakteri dengan

Metode Most Probable Number (MPN)”

Dosen Pengampu :

Ganet Eko Pramukantoro, M.Si., Apt.

Teori : EAnggota : Wilujeng Sulistyorini (191338 A)

Fitri Jaya Santi (191338 A) Wahyu Purwanjani (191338 A)

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SETIA BUDI

SURAKARTA

2015

I. Judul

Perhitungan Jumlah Bakteri dengan Metode Most Probable Number (MPN)

II. Tujuan

Melakukan perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung dengan metode

MPN menggunakan media kultur tertentu.

Memahami prinsip perhitungan jumlah bakteri metode MPN.

Mengetahui ada tidaknya pertumbuhan bakteri coliform pada sampel.

III. Dasar Teori

Pertumbuhan secara umum dapat didefinisikan sebagai pertambahan secara teratur

semua komponen didalam sel hidup. Perbanyakan sel adalah konsekuensi pertumbuhan-

pertumbuhan makhluk hidup dapat juga ditinjau dari dua sudut,  yakni pertumbuhan sel dan

pertumbuhan koloni sebagai satu populasi. Pada mikroorganisme, pertumbuhan individu (sel)

dapat berubah langsung menjadi pertumbuhan populasi, sehingga batas antara pertumbuhan

sel pertumbuhan populasi, serta sebagai satu kesatuan populasi yang kemudian terjadi,

kadang-kadang karena telah cepat perubahannya, sulit untuk diamati dan dibedakan. Umur

sel jasad renik ditentukan segera setelah proses pembelahan sel selesai, sedangkan umur

kultur ditentukan dari waktu atau lamanya inkubasi ukuran sel tergantung dari kecepatan

pertumbuhannya (Dwidjoseputro, 1994).

Air tanah mengandung zat-zat organik maupun zat-zat anorganik dan oleh karena itu

merupakan tempat baik bagi kehidupan mikroorganisme. Mikroorganisme yang autotrof

merupakan penghuni pertama dia dalam air yang mengandung zat-zat anorganik. Sel-sel yang

mati merupakan bahan organik yang memungkinkan kehidupan mikroorganisme-

mikroorganisme yang heterotrof. Temperatur turut menentukan populasi mikroorganisme

dalam air. Temperatur sekitar 30°C atau lebih sedikit baik sekali bagi kehidupan bakteri

pathogen yang berasal dari hewan maupun manusia. Sinar matahari, terutama sinar

ultraugunya, memang dapat mematikan bakteri, akan tetapi daya tembus sinar ultraviolet ke

dalam air tidak seberapa. Contohnya bakteri golongan Coliform yang  merupakan bakteri

yang dapat hidup hanya pada usus hewan mammalia termasuk manusia. Penyebaran kotoran

baik manusia dan hewan yang tidak terkontrol dalam lingkungan perairan dapat

menyebabkan lingkungan perairan tercemar oleh bakteri ini (Dwidjoseputro, 1994).

Beberapa spesies atau kelompok bakteri telah dievaluasi untuk menentukan sesuai

tidaknya untuk digunakan sebagai mikroorganisme indikator. Diantara organisme-organisme

yang dipelajari yang hampir memenuhi semua persyaratan sebagai mikroorganisme indikator

yang ideal yaitu bakteri golongan Coliform terutama Escherichia coli, bakteri tersebut

dianggap sebagai indikator polusi tinja yang dapat diandalkan. Escherichia coli merupakan

penghuni normal saluran pencernaan manusia dan hewan berdarah panas. Pada umumnya

tidak patogenik. Anggota lainnya kelompok Coliform adalah Klebsiella pneumoniae yang

tersebar luas dialam. Terdapat ditanah air, padi-padian, dan juga pada saluran pencernaan

manusia dan hewan. Enterobacter aerogenes, sejenis bakteri Coliform yang terdapat pada

saluran pencernaan manusia dan hewan berdarah panas, juga terdapat di tanah, air dan

produk-produk diari. Coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai dicirikan sebagai

bakteri berbentuk batang gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik dan anaerobik

fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48

jam pada suhu 35°C (Hastowo, 1992).

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai

macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung jumlah

mikroorganisme. Akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara

tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan

membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan

penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung

hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja

(viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu perhitungan pada cawan petri

(total plate count atau TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil

atau terdekat (metode MPN), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Hastowo,

1992).

      Ada tiga dasar untuk mendeteksi keberadaan bakteri golongan Coliform  dalam air,

yaitu dapat diuraikan sebagai berikut:

1. Uji Penduga (Presumtive Test)

Didalam medium cair tersebut lebih dulu di letakan tabung durham dalam

posisi terbalik. Jika dalam waktu 48 jam tabung-tabung durham mengandung gas,

dinyatakan positif. Sebaliknya jika setelah 48 jam tidak ada gas, dinyatakan negatif,

ini berarti air umum untuk diminum.

2. Uji Lanjutan (Confirmed Test)

Uji ini dilakukan untuk menegaskan bahwa gas yang terbentuk disebabkan

oleh bakteri Coliform dan bukan disebabkan oleh kerja sama beberapa spesies

sehingga menghasilkan gas, untuk uji penegas dilakukan dengan BGLB yang

diinokulasi dengan satu ose media BGLB yang diinokulasi dengan satu ose media

yang memperlihatkan hasil positif pada uji duga kaldu yang BGLB diinkubasi pada

suhu 35C selama 24-48 jam.

3. Uji Pelengkap (Complete Test)

Uji ini dilakukan untuk memproses inokulasi dari suatu koloni terpencil pada

cawan petri tersebut. Inokulum dimasukan kedalam medium cair yang mengandung

laktosa, dan dari inokulum tersebut juga dibuat gesekan pada agar-agar miring. Jika

kemudian timbul gas dalam cairan laktosa, lagi pula pada agar-agar miring ditentukan

basil-basil gram negatif yang berspora, maka ada golongan bakteri koloni dalam

contoh air semula (Dwidjoseputro, 1994).

Dalam metode MPN, pengenceran sampel harus lebih tinggi dari pada hitungan

cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan

larutanhasil pengenceran tersebut mengandung jasad renik, beberapa tabung mungkin

mengandung lebih dari satu sel, sedangkan tabung yang lain tidak mengandung sel sama

sekali. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa

tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positif, sedangkan tabung lainnya negatif. Metode

MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam sampel yang berbentuk

cair, meskipun dapat juga digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam sampel yang

berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang berbentuk padat dengan

terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari sampel tersebut. Kelompok jasad renik yang

dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan

untuk pertumbuhan (Lay, 1992).

Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masing-masing

dimasukan 1 ml kedalam tabung reaksi yang berisi medium, dimana untuk setiap

pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu,

dihitung jumlah tabung yang positif. Kriteria tabung positif atau tidak ditandai dengan

timbulnya kekeruhan atau gas pada tabung durham. Misalnya, pada pengenceran pertama 3

tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran kedua tabung positif. Pada

pengenceran ketiga 1 tabung positif, dan pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positif,

kombinasi menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil 3 pengenceran pertama kombinasinya menjadi

3,2,1. Angka kommbinasi ini kemudian dicocokan dengan tabel MPN, kemudian nilai MPN

sampel dapat dihitung (Lay, 1992).

Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari 3 seri tabung berbeda

dengan tabel untuk 5 seri tabung berbeda dengan tabel untuk 5 seri tabung. Kombinasi dipilih

dimulai dari pengenceran  tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung gas yang negatif,

kombinasi yang diambil dari 3 pengenceran. Jika pada pengenceran yang keempat dan

seterusnya masih ditemukan  tabung yang positif tersebut ditambahkan  pada angka

kombinasi ketiga mencapai jumlah maksimum. Metode MPN dapat digunakan untuk

menghitung jumlah mikroba tertentu yang terdapat diantara campuran  campuran mikroba

lain. Misalnya, jika digunakan medium kaldu laktosa, ditunjukan dengan terbentuknya  gas

dalam tabung durham. Cara ini dapat digunakan untuk menentukan MPN kelompok bakteri

Coliform, termasuk juga bakteri-bakteri yang dapat memfermentasikan laktosa (Lay, 1992).

MPN dengan menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi. Perhitungan MPN

berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif yakni yang ditumbuhi oleh mikroba

setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat

dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung

durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik yang membentuk gas.

Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih

banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas

(tabung reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Irianto, 2006).

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel tingkat tertentu sehingga

didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas atau sesuai dan jika ditanam dalam tabung

menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif. Semakin besar jumlah sampel yang di

masukan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin rendah tabung positif

yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukan (semakin tinggi pengenceran

yang dilakukan) maka semakin jarang tabung positif yang muncul. Jumlah sampel atau

pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif yang dihasilkan sangat

memepengaruhi metode ini. Frekuensi positif atau negatif ini menggambarkan konsentrasi

mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan. Asumsi yang diterapkan dalam metode

MPN yaitu bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel, sel bakteri terpisah-pisah secara

individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri Coliform termasuk E.coli

terpisah sempurna tiap selnya dan termasuk rantai, media yang dipilih telah sesuai dengan

untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal

1 sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut, jumlah yang

didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup. Sel yang terkena dan tidak  mampu

menghasilkan tabung positif tidak terdeteksi (Hadioetomo, 1993).

IV. Alat dan Bahan

Alat Bahan

- Pembakar bunsen - Spirtus

- Korek - Media Brilliant Green Lactose Broth (BGLB)

- Tabung reaksi - Media Endo Agar (EA)

- Tabung durham - Media Lactose Broth (LB)

- Pipet ukur - Sampel (air ledeng)

- Pipet pump - Tabel MPN (tabel Jenkins)

- Inkubator

V. Cara Kerja

1. Menyiapkan alat dan bahan.

2. Menyiapkan tiga seri tabung reaksi yang masing-masing terdiri dari tiga

tabung reaksi yang didalamnya berisi media LB dan tabung durham, dimana

perlakuan ini masuk dalam uji penduga.

a. Seri pertama untuk 10 cc sampel,

b. Seri kedua untuk 1 cc sampel,

c. Seri ketiga untuk 0.1 cc sampel.

3. Memipet masing-masing 10 cc sampel, kemudian dimasukkan ke tiga tabung

reaksi seri pertama.

4. Memipet masing-masing 1 cc sampel, kemudian dimasukkan ke tiga tabung

reaksi seri kedua.

5. Memipet masing-masing 0.1 cc sampel, kemudian dimasukkan ke tiga tabung

reaksi seri ketiga.

6. Setelah selesai memasukkan semua sampel, kemudian diinkubasi pada suhu

37C ± selama 24 jam.

7. Setelah diinkubasi, mengamati tabung reaksi. Hasil yang positif ditandai

dengan keruhnya media dan adanya gas pada tabung durham.

8. Tabung reaksi yang positif dilanjutkan ke tahap yang kedua yaitu uji penguat.

9. Langkah selanjutnya yaitu dengan mengambil 1-2 ose dari tabung reaksi yang

positif lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media BGLB dan

tabung durham.

10. Kemudian diinkubasi pada suhu 37C ± selama 24 jam.

11. Setelah diinkubasi, mengamati tabung reaksi. Hasil yang positif ditandai

dengan keruhnya media dan adanya gas pada tabung durham.

12. Tabung reaksi yang positif dilanjutkan ke tahap yang ketiga yaitu uji

pelengkap.

13. Langkah selanjutnya yaitu dengan mengambil 1-2 ose dari tabung reaksi yang

positif lalu digoreskan atau diratakan ke permukaan media EA.

14. Kemudian diinkubasi pada suhu 37C ± selama 24 jam.

15. Setelah diinkubasi, mengamati tabung reaksi. Hasil yang positif ditandai

dengan terbentuknya koloni dengan kilat logam.

16. Kemudian hasil yang diperoleh dicocokkan pada tabel MPN.

VI. Hasil Pengamatan

Sampel Pengenceran Jumlah tabung positifMPN

count/ml

Air ledeng

100 0 3 MPN

count/ml10-1 0

10-2 0

Sampel 10 cc Sampel 1 cc

Sampel 0.1 cc

VII. Pembahasan

Pada praktikum perhitungan jumlah bakteri kali ini menggunakan metode MPN.

Metode MPN (Most Probable Number) adalah metode yang digunakan untuk menghitung

koliform di dalam air dengan menggunakan pengujian fermentasi dalam tabung. Metode ini

terdiri dari tiga tahap, yaitu uji penduga (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan

uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan bakteri coliform

masih dalam tingkat probabilitas rendah, masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat

fermentatif bakteri coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis bakteri selain Coliform

juga memiliki sifat fermentatif, diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran

adanya bakteri coliform dengan bantuan medium selektif differensial. Uji kelengkapan

kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan

pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri bakteri coliform yang merupakan gram negatif,

berbentuk batang, dan tidak berspora.

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu

sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai dan jika ditanam dalam tabung

menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif. Semakin besar jumlah sampel yang

akan dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung

positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi

pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung positif yang muncul. Jumlah

sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif. Semua tabung

positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet

saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi

metode ini.

Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit

tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel.

Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri.

Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi misalnya terdapat nilai

MPN 10/g dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan

setidaknya mengandung 10 coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, maka air

tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum. Metode MPN memiliki limit

kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN

terendah dan nilai MPN tertinggi. Kelebihan dari  metode MPN ini adalah waktu yang

dibutuhkan sangat sedikit atau sangat singkat, sedangkan kekurangan dari metode MPN yaitu

hasil yang diperoleh terkadang tidak begitu akurat.

Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih

tepatnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen.

Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti

berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh

lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Contoh bakteri

coliform adalah Esherichia coli dan Entereobacter aerogenes. Jadi, coliform adalah indikator

kualitas air. Makin sedikit kandungan bakteri coliform, artinya kualitas air semakin baik.

Banyaknya kontaminan dalam air memerlukan standar tertentu untuk menjamin

kebersihannya. Air yang terkontaminasi oleh bakteri patogen saluran cerna sangat berbahaya

untuk diminum. Hal ini dapat dipastikan dengan penemuan organisme yang ada dalam tinja

manusia atau hewan dan yang tidak pernah terdapat bebas di alam. Ada beberapa organisme

yang termasuk kategori ini, yaitu bakteri coliform (Esherichia coli), Enterococcus faecalis,

Clostridium sp. Di Indonesia, bakteri indikator air terkontaminasi adalah Esherichia coli.

Uji Penduga (Presumptive test)

Uji penduga dilakukan dengan cara menginokulasikan sampel air ke dalam tabung

yang berisi medium LB dan tabung durham. Volume dari sampel air yang digunakan masing-

masing 10 ml, 1 ml dan 0,1 ml dilakukan pada 3 tabung, sehingga seluruh tabung berjumlah 9

buah. Semua tabung diikubasi pada  suhu 37C selama ± 24 jam. Hasil positif dapat diketahui

dengan terbentuknya gas atau gelembung yang terdapat pada tabung durham dan keruhnya

media pada taung reaksi. Fungsi dari tabung durham adalah untuk mengetahui terbentuknya

gas gelembung atau untuk menangkap gas yang ditimbulkan akibat adanya fermentasi laktosa

menjadi asam dan gas.

Berdasarkan percobaan yang dilakukan pada sampel yang volumenya 10 ml, 1 ml dan

0,1 terdapat 9 buah tabung yang hasilnya semua negatif. Dari masing-masing perlakuan yang

sudah diketahui hasilnya maka dapat diperoleh MPN-nya dengan cara melihat tabel MPN

yang ada dibuku petunjuk praktikum. MPN yang diperoleh dari hasil perhitungan diperoleh

hasil kurang dari 3. Jumlah bakteri coliform dalam sampel diperoleh hasil kurang dari 3 per

100 ml sampel.

Uji Penguat (Confirmed Test)

Uji penguat dilakukan dengan menginokulasikan satu sampai dua ose biakan dari

tabung yang memberikan hasil uji positif ke media BGLB. Media BGLB merupakan media

yang akan berwarna hijau metalik jika terdapat reaksi fermen dengan media. Warna ini

berasal dari adanya bakteri coliform yang bereaksi dengan BGLB. E.Coli merupakan bakteri

fermentasi, seringkali menghasilkan warna hijau metalik mengkilap. Bakteri yang

menfermentasi dengan lambat akan menghasilkan koloni berwarna merah muda. Brilliant

Green Lactose Broth terbuat dari peptone 10 g, lactose 10 g, oxgall 20 g, brilliant green

0.0133 g, dan aquades 1 liter. Lalu tabung yang berisi media dan biakan tersebut diinkubasi

pada suhu 37C selama ± 24 jam, kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan gas

yang terbentuk.

Uji Pelengkap (Completed Test)

Uji pelengkap dilakukan apabila terdapat hasil positif dari uji penguat, yaitu terdapat

koloni bakteri yang berwarna hijau metalik pada media BGLB. Uji bakteri coliform yang

terakhir adalah uji pelengkap yang bertujuan untuk memastikan adanya coliform dalam air.

Uji pelengkap ini dilakukan dengan cara menggoreskan ose ke permukaaan media EA.

Biakan yang diinokulasikan ke dalam media EA selanjutnya diinkubasi pada suhu 37C

selama ± 24 jam. Kemudian mengamati hasil yang diperoleh dimana akan terbentuk koloni

denga kilat logam dan selanjutnya hasil yang diperoleh dicocokkan dengan tabel MPN.

Fungsi dari media EA adalah sebagai agen penyerap asetildehid yang merupakan komponen

utama reaksi pembentukan koloni tipikal. Media ini merupakan campuran dan basic fuchsin

laktosa agar dan juga sodium sulfit.

VIII. Kesimpulan

Dari percobaan yang telah dilaksanakan diperoleh kesimpulan dari hasil ketiga uji

diatas yaitu uji penduga, uji penguat dan uji pelengkap bahwa sampel yang dianalisis tidak

mengandung bakteri coliform yang ditandai dengan diperolehnya hasil yang negatif pada

hasil uji yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan tabel MPN. Hal ini menunjukkan

bahwa air yang digunakan belum tercemar dan aman untuk dikonsumsi.

IX. Daftar Pustaka

Dwijoseputro, D. 1994. Dasar - dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan

Hastowo, Sugyo. 1992. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Rajawali Press

Lay, Bibiana. 1992. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Raja Grafindo

Persada

Hadioetomo, RS. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi.

Jakarta : Gramedia

Irianto,  Koes. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung :

Yrama Widya