2/19/2014

1

By : Lisa Lisdiana, S.Si., M.Si.17.02.2014

MIKROSKOP TEKNIK-TEKNIK LABORATORIUM DI

BIDANG MIKROBIOLOGI TEKNIK ASEPTIK STERILISASI ISOLASI DAN TEKNIK PLATING KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI ENUMERASI

MAIN TOPICS

2/19/2014

2

Suatu instrumen yang tersusun dari beberapa lensa, yangberfungsi untuk memperbesar obyek yang sangat kecil keukuran yang dapat terlihat

Resolusi :Kemampuan dari lensa-lensa mikroskop untukmembedakan dua titik yang berdekatan sebagai dua titikyang berbeda

Prinsip Kerja :Semakin pendek panjang gelombang dari sinar yangdigunakan, maka resolusi akan semakin tinggi

Indeks Refraktif : Suatu unit yang menyatakan kemampuan suatu media untuk membelokkan sinar

Staining

MACAM MIKROSKOP BERDASARKAN SUMBER ILUMINASI :

• Mikroskop Cahaya :

- Mikroskop cahaya biasa / mikroskop medan terang

- Mikroskop bidang gelap

- Mikroskop fase-kontras

- Nomarski Difference Interference Contrast (DIC)

• Mikroskop Confocal

• Mikroskop Fluoresen

• Mikroskop Elektron :

- Transmission Electron Microscope (TEM)

- Scanning Electron Microscope (SEM)

2/19/2014

3

Sumber iluminasi adalah sinar tampak (400 – 700 nm) Tidak dapat digunakan untuk mengamati obyek yang

berukuran < 0,2 µm Visualisasi yang diperoleh menunjukkan spesimen

dengan latar belakang terang

Fungsi :o Untuk mengamati berbagai spesimen yang telah

melalui proses pewarnaano Untuk penghitungan jumlah sel mikroorganisme

Mikroskop Medan Terang(Bright-fields Microscope)

Sumber iluminasi adalah sinar tampak (400 – 700 nm)Menggunakan kondenser khusus berbentuk opaque

disc yang mencegah cahaya untuk dapat melewatilensa obyektif secara langsung Cahaya yang direfleksikan oleh spesimen langsung

melewati lensa obyektif Spesimen tampak terang dengan latar belakang

gelap

Fungsi :o Untuk mengamati spesimen hidup yang tidak tampak

pada mikroskop medan terang, ex. Treponemapallidum

Mikroskop Bidang Gelap(Dark-fields Microscope)

2/19/2014

4

Sumber iluminasi adalah sinar tampak (400 – 700 nm) Menggunakan kondensor khusus yang tersusun dari

suatu diafragma berbentuk annular (ring-shaped) Diafragma tersebut berfungsi mengatur supaya

cahaya dapat langsung melewati kondensor,memfokuskan cahaya pada spesimen dan diffractionplate pada lensa obyektif

Cahaya langsung dan cahaya yangdirefleksikan/didifraksikan tersebut secara bersama-sama akan menghasilkan visualisasi dari spesimen

Spesimen tidak perlu diwarna terlebih dahulu

Fungsi:o Untuk memfasilitasi pengamatan secara mendetail

dari struktur internal spesimen hidup

Mikroskop Fase Kontras(Phase-contrast Microscope)

2/19/2014

5

Sumber iluminasi adalah sinar tampak (400 – 700 nm)Mirip dengan Phase-Contrast Microscope Menggunakan berbagai indeks refraksi untuk

menghasilkan visualisasi spesimen Menggunakan dua cahaya yang dipisahkan oleh

prisma Visualisasi spesimen tampak berwarna sebagai hasil

dari efek prisma Spesimen tidak perlu diwarna terlebih dahulu

Fungsi :o Untuk mengamati spesimen dengan visualisasi tiga

dimensi

Nomarski Difference Interference Contrast (DIC) Microscope

2/19/2014

6

Menggunakan sinar laser untuk mengiluminasi suatuspesimen pada satu waktu

Fungsi :o Untuk mendapatkan visualisasi dua dimensi dan tiga

dimensi dari suatu sel untuk aplikasi di bidangbiomedis

Mikroskop Confocal(Confocal Microscope)

2/19/2014

7

Menggunakan sinar ultraviolet atau sinar yangpanjang gelombangnya mendekati panjanggelombang sinar ultraviolet sebagai sumber iluminasi

Menghasilkan visualisasi spesimen fluoresen yangmemendarkan cahaya

Fungsi :o Untuk pengamatan hasil teknik Fluorescent-

Antibiotic (immunofluorescence)o Untuk mendeteksi dan mengidentifikasi secara

cepat keberadaan mikroorganisme pada spesimenklinis atau spesimen yang berupa jaringan

Mikroskop Fluoresen(Fluorescence Microscope)

2/19/2014

8

Transmission Electron Microscope (TEM) Menggunakan elektron sebagai sumber iluminasi Dapat digunakan untuk mengamati struktur yang

berukuran < 0,2 µm Visualisasi dua dimensi Spesimen harus memiliki ketebalan tertentu

Fungsi :o Untuk mempelajari dan mengamati virus atau

ultrastruktur internal dari suatu sel (denganperbesaran 10.000 – 100.000 x)

ELECTRON MICROSCOPE

2/19/2014

9

Scanning Electron Microscope (SEM) Menggunakan elektron sebagai sumber iluminasi Dapat digunakan untuk mengamati struktur yang

berukuran < 0,2 µm Visualisasi tiga dimensi

Fungsi :o Untuk mempelajari struktur permukaan dari suatu

sel atau virus (dengan perbesaran 1000 – 10.000 x)

2/19/2014

10

TEKNIK PEWARNAAN

Pewarnaan Prinsip Dasar

Sederhana

(ex. methylene blue,

carbolfuchsin,

crystal violet,

safranin)

- Pewarna tunggal yang bersifat aqueous (kadang-

kadang ditambahkan mordant untuk memperkuat

warna).

- Dilakukan untuk memperjelas mikroorganisme

yang diamati sehingga dapat ditentukan morfologi

selnya.

2/19/2014

11

Diferensial/Pembeda

Menggunakan 2 pewarna, yaitu pewarna utama danpewarna pembanding. Dua tipe bakteri yang berbeda akanbereaksi secara berbeda terhadap pewarna sehinggadapat membedakan keduanya.

Gram - Mengelompokkan bakteri ke dalam 2 kelompok besar,yaitu : gram positif and gram negatif.

- Bakteri Gram positif mempertahankan pewarna crystalviolet, sehingga berwarna ungu.

- Bakteri Gram negatif tidak mempertahankan pewarnacrystal violet dan tetap tidak berwarna sampai diberikanpewarna pembanding safranin, sehingga berwarnamerah.

Acid-fast - Digunakan untuk membedakan spesies Mycobacteriumdengan spesies Nocardia.

- Acid fast bacteria akan berwarna merah karena mengikatpewarna utama (carbol fuchsin).

- Non-acid fast bacteria akan berwarna biru karenamengikat pewarna pembanding (methylene blue).

Pewarna Prinsip Dasar

Pewarna Prinsip Dasar

Khusus Digunakan untuk mewarnai struktur tertentu seperti kapsul,endospora, dan flagella.

Negatif Digunakan untuk menunjukkan keberadaan kapsul. Kapsul tidakdapat menyerap pewarna, sehingga akan tampak sebagai halos disekitar sel bakteri dan tampak jelas jika dibandingkan denganlatar belakang yang berwarna gelap

Endospora Digunakan untuk deteksi keberadaan endospora pada bakteri.Pewarna malachite green akan mewarnai endospora sehinggaberwarna hijau, sedangkan safranin akan mewarna sel sehinggaberwarna merah

Flagela Digunakan untuk menunjukkan keberadaan flagela. Mordantditambahkan saat pewarnaan ini untuk meningkatkan visibilitasflagela saat diwarnai dengan carbol fuchsin

2/19/2014

12

Pewarnaan Sederhana dengan Pewarna Methylene Blue

2/19/2014

13

AB

EnvironmentMIKROORGANISME

KULTUR MURNI

HOW ???

A culture consist of a single species

Laboratory Technique in Microbiology

2/19/2014

14

Suatu metode yang dilakukan pada kegiatan mikrobiologiuntuk mencegah kontaminasi dari organisme yang tidakdiinginkan.

Contoh :•Disinfeksi meja kerja → menyemprot meja kerja dengan

agen antimikrobial• Bekerja di dekat api (bunsen)• Mensterilkan semua peralatan yang akan digunkan• Menyemprot tangan dengan alkohol 70 % sebelum dan

sesudah bekerja dengan mikroorganisme• etc.

Teknik Sterilisasi:* Mekanik → Berkefeld filter, Chamberland filter, Seitz filter* Fisika → Pemanasan kering, pemanasan basah, radiasi* Kimia → Agen antimikrobial

Definisi :Suatu usaha atau tindakan untuk membebaskan alat atau mediadari mikroba

2/19/2014

15

• Berdasarkan konsistensi :- Media cair- Media padat- Media setengah padat / semi solid

• Berdasarkan komposisi bahan :- Media sintetik- Media semi sintetik- Media alami

• Berdasarkan fungsi :- Media umum / universal- Media selektif- Media diferensial- Media pengaya / penyubur

ISOLASI MIKROORGANISME

1. Menangkap mikroorganisme dari lingkungan2. Melakukan pemurnian terhadap mikroorganisme yang dikehendaki

Plating Methods :Streak Plate Method → isolasi mikroorganisme, teknik pemurnian

(kuadrant), peremajaan (sub-kultur), dll

Spread Plate Method → isolasi mikroorganisme, enumerasi, ujiantagonistik, dll

Pour Plate Method → isolasi mikroorganisme, enumerasi, karakterisasi, uji resistensi,uji antagonistik, dll

2/19/2014

16

Skema Streak Plate dengan Metode Kuadran

2/19/2014

17

Karakterisasi→ Fenotipik dan Genomik

Fenotipik → Pengamatan morfologi (koloni dan sel), Uji Fisiologis dan Biokimia

Genomik → Repetitif sekuen DNA, analisis 16S DNA

1. Penghitungan Langsung → Haemocytometer2. PenghitunganTidak Langsung → Menghitung Kekeruhan Sel

(Spektrofotometri)→ Menghitung Berat Kering Sel→ Hitungan Cawan (Total Plate Count)

Pengenceran Berseri

ENUMERASI

2/19/2014

18

2/19/2014

19

STANDART PLATE COUNT

Peraturan pelaporan data :• Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, angka pertama

di depan koma dan angka kedua di belakang koma.

Jumlah koloni per pengenceran StandartPlate Count Keterangan

10-2 10-3 10-4

223 28 10 2,2 x 104 28 dan 10 < 30

350 115 29 1,2 x 105 350 > 300; 29 < 30

TBUD TBUD 198 2,0 X 106 TBUD > 300

Syarat : Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang memiliki jumlah koloni antara 30 sampai 300

2/19/2014

20

• Jika hasil penghitungan koloni pada semua cawan petri

menghasilkan jumlah koloni kurang dari 30 koloni, hanya jumlah

koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya

dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya

pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan

dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per pengenceran StandartPlate Count Keterangan

10-2 10-3 10-4

23 17 5 < 30 x 102

(2,3 x 103)

Hasil penghitunganpada pengenceran 10-2

yang digunakan untukpelaporan data

Jumlah koloni per pengenceran Standart

Plate Count Keterangan10-2 10-3 10-4

TBUD TBUD 375 > 30 x 107

(3,8 x 106)

Hasil penghitungan padapengenceran 10-4 yangdigunakan untuk pelaporan data

350 415 29 > 30 x 106

(4,2 x 105)

Hasil penghitungan padapengenceran 10-3 yangdigunakan untuk pelaporan data

• Jika hasil penghitungan koloni pada semua cawan petri

menghasilkan jumlah koloni lebih dari 300 koloni, hanya jumlah

koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung. Hasilnya

dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya

pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan

dalam tanda kurung.

2/19/2014

21

• Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni

dengan jumlah antara 30 sampai 300, dan perbandingan antara hasil

tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil

atau sama dengan 2, tentukanlah rata-rata dari kedua nilai tersebut

dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan

antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang

dilaporkan hanya hasil yang terkecil.

Jumlah koloni per pengenceran Standart Plate

Count Keterangan10-2 10-3 10-4

275 51 25 3,9 x 104 51000/27500 = 1,85 (<2)136 53 21 1,4 x 104 53000/13600 = 3,9 ( >2)

• JIka digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data

yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh

diambil salah satu, meskipun salah satu cawan duplo tersebut

tidak memenuhi syarat jumlah koloni di antara 30 sampai 300

koloni.

Jumlah koloniper pengenceran

StandartPlate Count

Keterangan

10-2 10-3 10-4

175 16 3 1,9 x 104 Rata-rata dari pengenceran 10-2

208 17 2

138 42 3

1,5 x 104

Rata-rata dari pengenceran 10-2

karena perbandingan antarapengenceran 10-2 dan 10-3 adalah2,4

162 42 5

2/19/2014

22

290 36 53,1 x 104

Rata-rata dari pengenceran 10-2

dan 10-3 karena perbandinganantara kedua pengenceranadalah 1,2

280 32 2

291 25 43,0 x 104

Rata-rata dari pengenceran 10-2

meskipun 305 > 300 (angkayang lain < 30)305 27 2