Uji Kuantitatif Karbohidrat melalui Metode Khromatografi

Metode khromatografi adalah teknik analisis yang paling kuat untuk analisis jenis dan konsentrasi

monosakarida dan oligosakarida dalam makanan. Macam uji khromatografi berdasarkan fase gerak diataranya

khromatografi lapis tipis (KLT), khromatografi gas (GC) dan khromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).

Sedangkan macam uji khromatografi berdasarkan mekanisme pemisahan dibagi menjadi empat, yaitu :

khromatografi adsorpsi ( contoh : khromatografi lapis tipis), khromatografi partisi, khromatografi penukaran ion,

khromatografi eksklusi.

Dalam khromatografi, ekstrak yang akan ditentukan karbohidratnya perlu dimurnikan dan dijernihkan.

Selain itu senyawa-senyawa anorganik yang ada harus dihilangkan. Misalnya dengan cara, melewatkan ekstrak di

dalam suatu alat penukar ion (ion exchanger). Perlakuan ini dikerjakan untuk mencegah terjadinya tailing,

misalnya pada khromatografi kertas atau khromatografi lapis tipis. Adanya tailing menunjukkan pemisahan yang

tidak sempurna dari komponennya sehingga menyebabkan kesukaran dalam analisa kuantitatif selanjutnya.

Salah satu cara penentuan karbohidrat akan diuraikan sebagai berikut, menggunakan contoh yaitu

khromatografi kertas. Khromotografi kertas merupakan kromotografi cairan-cairan dimana sebagaian fasa diam

adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas. Kertas yang digunakan untuk khromatografi

merupakan ikatan serabut-serabut selulosa yang saling berhubungan dengan ikatan hydrogen, dan diantara sel

terdapat air sebanyak ± 2-5%. Kertas yang dipakai adalah kertas Whatman yang dapat dibedakan menjadi 3

berdasarkan kecepatan merambat zat yaitu cepat, sedang, dan lambat. Selain itu, pemilihan kertas ini juga

didasari dengan pertimbangan tingkat dan kesempurnaan pemisahan, difusivitas pembentukan spot, efek tailing

dan pembentukan komet. Kertas yang biasa digunakan adalah kertas Whatman no 1 karena memilki kecepatan

rambatan zat yang sedang sehingga menyaring 98% partikel atau zarah berukuran 11 µm, permukaan yang licin,

mutu kertas kuantitatif dengan kadar abu 0,06 %.

Pelarut yang digunakan dalam metode ini adalah pelarut campuran atau murni. Untuk penentuan gula-

gula sederhana pelarut yang dipakai adalah campuran butanol : asetat : air atau propanol : asam asetat : air. Atau

asam asetat : pyridine : air dengan perbandingan 4 : 1: 5. Campuran pelarut tersebut pada umumnya terdiri atas

pelarut organic air dan asam atau basa. Pemberian asam atau basa dimaksudkan untuk mempercepat penyerapan

air pada partikel karbohidrat. Perbedaan jenis pelarut yang dipakai didasari dengan perbedaan kelarutan zat dalam

pelarut. Semakin tinggi kelarutan molekulnya, semakin jauh migrasinya pada kertas. Jika suatu bahan kimia

bersifat sangat non-polar, ia tidak akan larut dalam pelarut yang sangat polar. Begitu pula sebaliknya untuk bahan

kimia yang sangat polar dalam pelarut yang sangat non-polar.

Deteksi dan identifikasi gula-gula dalam kertas khromatografi dapat dilakukan dengan cara fisis atau

kimiawi. Secara fisis dapat dilakukan dengan menyinari kertas dengan sinar ultra violet dengan panjang

gelombang sinar 254 nm – 370 nm. Dapat pula dengan cara kimiawi yaitu dengan menyemprotkan larutan kimia

tertentu misalnya anilinphtalat atau m-phenyleneidamine atau perak nitrat untuk gula reduksi. Untuk gula non-

reduksi dapat menggunakan nepthoresorsinol dalam asam fosfat. Larutan phloroglusinol dan asam klorida dapat

digunakan untuk aldosapentosa (memeberikan warna violet); ketopentosa (hijau tua); keto heksosa (kuning

coklat) dan dengan metil pentose memberikan warna hijau. Selain larutan tersebut diatas dapat pula dipakai uap

iodin.perbedaan larutan penyemprotan didasari dari bentuk rantai gula yang akan diidentifikasi. Reagen kimia

tersebut disemprotkan pada kertas di ruang asam karena dapat mengganggu kesehatan operatornya.

2. Diagram Alir

Di dalam analisa khromatografi kertas diukur besarnya Rf (Rf = retardation factor). Berikut adalah cara

menentukan Rf.

Rf = jarak perpindahan molekul zat

jarak perpindahan pelarut

Harga Rf dari tiap-tiap jenis gula adalah tertentu untuk suatu perlakuan yang sama. Nilai Rf suatu jenis

gula dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain macam zat pelarut, suhu, ukuran bejana, macam fase tetap dan

Diamati warna yang terbentuk lalu di tentukan nilai Rf

Cara kimiawi : disempotkan larutan kimiaCara fisis : Disinari kertas dengan sinar Ultra Violet dengan Panjang gelombang

Spotkan sampel, jarak antara spot 1,5 cm ( diteteskan pada salah satu ujung kertas

Dilakukan penetesan 3-4 kali dengan setelah penetasan pertama kering

Dimasukkan kertas kedalam wadah yang berisi zat pelarut kemudian ditutup dan dibiarkan

beberapa lama hingga kering lalu diidentifikasi

Ditandai kira-kira 1,5 cm dari bagian bawah kertas sebagai titik start

Digunting kertas whatman no 1 ukuran 20 x 20 cm (Sesuai Kebutuhan)

sifat zat yang dianalisis. Dengan demikian dalam mencantumkan harga Rf dari suatu zat harus dicantumkan pula

kondisi analisanya.