DETEKSI ANTIGEN RABIES PADA JARINGAN OTAK

DENGAN METODE FLUORESCENT ANTIBODY TECHNIQUE (FAT)

1. PRINSIP

Organ target virus penyebab penyakit rabies adalah jaringan sistem syaraf pusat (SSP) otak (khususnya, cerebellum, hipokampus, brain stem, Ammons horn, thalamus, cerebral cortex dan medulla oblongata). Hewan yang menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Dalam otak, antigen virus rabies terdapat dalam jumlah yang sangat banyak terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain, seperti gld salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. Jaringan yang direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak dan batang otak (brain stem).

Identifikasi agen infeksi atau diagnosis rabies menggunakan fluorescent antibody test (FAT), yang direkomendasikan oleh WHO dan OIE, karena sensitif, spesifik, dan akurat. Uji FAT merupakan uji gold standard yang digunakan secara langsung pada preparat ulas (smear). Immunoglobulin murni terhadap virus atau protein nukleokapsid rabies yang sudah dilabel dengan fluorescein isothiocyanat (FITC) ditambahkan ke preparat ulas/tekan dari sampel otak yang sudah difiksasi menggunakan aseton. Agregat protein nukleokapsid diidentifikasi dengan adanya fluoresens spesifik dari ikatan antara konjugat dan protein nukleokapsid (antigen /Ag antibody/ Ab) tersebut, saat dilihat di bawah mikroskop FAT berwarna hijau apel yang berpendar dengan intensitas dan bentuk bervariasi.

2. PERALATAN2.1 Gunting dan pinset

2.2 Gelas obyek/ gelas slide2.3 Gelas penutup

2.4 Inkubator 370C

2.5 Mikroskop FAT ( Olympus / Nikon )2.6 Cawan petri2.7 Lemari pendingin ( Kulkas )2.8 Gelas beajer 2.9 Pipet Pasteur Spuit 1 ml3. BAHAN / REAGENSIA / PEREAKSI3.1 PBS pH 7,43.2 Aseton absolut dingin3.3 Aquades

3.4 Larutan evans blue 1:20003.5 Buffer gliserin 50% (mounting media)3.6 Konjugat Rabies (Biorad), antibodi spesifik terhadap virus rabies dilabel FITC

3.7 Jaringan otak kontrol positif3.8 Jaringan otak kontrol negative

4. PROSEDUR KERJA4.1 Pembuatan preparat/ slide tekan : 4.1.1 Buat lingkaran pada gelas obyek yang akan digunakan untuk membuat preparat tekan dengan menggunakan grafir intan

4.1.2 Tulis nomor / kode spesimen pada ujung preparat

4.1.3 Letakkan sampel pada cawan petri dan potong bagian otak (hipokampus, medulla, pons) dan letakkan pada paper towel / kertas minyak4.1.4 Tempelkan gelas obyek pada potongan otak, dimulai dari lingkaran yang dekat dengan nomor specimen, lalu tekan yang kuat. Lakukan hal yang sama pada lingkaran yang satunya. Pindahkan pada kertas towel dan tekan yang sama di atas beberapa kali agar mendapatkan preparat tekan yang tipis. Preparat dikering-anginkan sejenak4.1.5 Buat preparat kontrol positif rabies seperti di atas

4.1.6 Preparat difiksasi dalam asetone absolut dingin pada suhu -20oC selama 30 menit dan dikering-anginkan kembali

4.1.7 Susun preparat dalam cawan petri besar yang telah dialasi kertas saring basah (untuk menjaga kelembaban)

4.1.8 Tetesi preparat (0,1 ml) dengan konjugate rabies yang sudah dilarutkan dengan pelarut konjugat pada lingkaran yang sudah tersedia.

Rekomendasi : U/ memperoleh hasil yang lebih kontras dan lebih baik Fluorescentnya serta mendeteksi sample yang positif lemah / Low Positif, dianjurkan konjuget Biorad dicampur dengan Evans Blue 1 % dengan pernbandingan :

0,1 ml Evans Blue 1 % dicampurkan dengan 2 ml konjuget Biorad.

Cara Pembuatan Evans Blue 1 % ( Stock / 1 : 2000 ) ;

Ambil 1 gram Evans blue dicampur 99 ml Aquadest / Aquabidest steril ( Stock 1 % Evans Blue )

Simpan dilemari es / refrigerator suhu 4 8 C4.1.9 Inkubasikan dalam inkubator selama 30 menit pada suhu 37OC.

4.1.10 Cuci dan rendam dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak 2 (dua) kali lalu dikering- anginkan

4.1.11 Beri 1 tetes buffer gliserin 50% sebagai mounting medium, lalu diberi gelas penutup 4.1. 12 Periksa di bawah mikroskop FAT dg kebesaran 40x5. PENETAPAN HASIL

5.1 Agregat protein nukleokapsid virus Rabies diidentifikasi dengan adanya fluorescens spesifik dari ikatan antara protein nukleokapsid virus rabies dan konjugat, maka sampel dinyatakan Positif Rabies. Agregat akan berwarna hijau apel dan bervariasi intensitas serta bentuknya.

5.2 Protein non antigen terlihat berwarna keputihan dan latar belakang memberikan warna merah.

6. DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2010, Procedures for Rabies and Lyssavirus Diagnosis Including Rabies Fluorescent Antibody Test (FAT) and Virus Isolation, Australian Animal Health Laboratory, CSIRO Livestock Australia, p. 1-18

Anonim, 2011, Rabies, In OIE Terrestrial Manual, Office International des Epizooties (OIE). Pp. 1-20

Anonim, 2010, Manual instruction of anti-rabies nucleocapsid conjugate, Biorad DETEKSI NEGRI BODIES RABIES PADA JARINGAN OTAK

DENGAN PEWARNAAN SELLERS

1. PRINSIP

Hewan yang menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Dalam otak, antigen virus rabies terdapat dalam jumlah yang sangat banyak terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain, seperti gld salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. Jaringan yang direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak. Sel neuron yang terinfeksi rabies, pada uji histologi menunjukkan bentukan agregat material viral yang disebut Negri Bodies dalam sitoplasma neuron. Meskipun demikian, teknik histologi sangat kurang sensitif dibandingkan dengan metoda imunologik, khususnya pada spesimen autolisis.

Negri bodies merupakan benda inklusi kecil dengan diameter 0.25 0.27 m intrasitoplasma sel syaraf hewan yang terinfeksi Rabies. Negri bodies dapat berbentuk bulat (round), ovular, ameboid, segitiga (triangular), atau oval (oblong). Negri bodies dapat dideteksi dengan pemeriksaan histologi jaringan otak dengan pewarnaan Sellers. Jumlah Negri bodies dapat lebih dari satu dalam sebuah neuron. Keberadaan dan konsentrasi Negri Bodies tergantung pada tingkat infeksi hewan yang bersangkutan. Negri Bodies dengan pengecatan Sellers terlihat merah magenta (asidofilik) dan mempunyai granula biru gelap di dalamnya (basofilik), serta strukur yang berbeda-beda. Ini dapat dilihat dibawah mikroskop.2. PERALATAN 2.1 Gunting dan pinset

2.2 Gelas objek/ gelas slide2.3 Penutup gelas objek

2.4 Coplin jar atau staining dish2.5 Mikroskop, perbesaran 1000X2.6 Minyak emersi

3. BAHAN / REAGENSIA3.1 Otak hewan

3.2 Minyak emersi

3.3 Pewarnaan Sellers

3.3.1 Larutan A :

Methylen Blue

1 g

Methyl Alkohol (Bebas Aceton) 100 ml3.3.2 Larutan B :

Basic Fuchsin

0,5 g

Methyl Alkohol

50 ml Pembuatan Pewarnaan Sellers :

3.3.2 Campurkan kedua larutan A dan larutan B dengan perbandingan 2 : 1 dengan baik tanpa disaring

3.3.3 Diamkan / inkubasikan selama 24 jam sebelum digunakan

3.3.4 Simpan didalam ruang yang gelap / hindari sinar cahaya pada suhu ruangan.

3.4 Air kran yang mengalir (tap water)4. PROSEDUR KERJA

4.1 Pembuatan preparat/ slide tekan :

4.1.1 Buat preparat tekan/ulas dari otak anjing yang diuji dengan menekan organ pada kertas

menggunakan gelas objek.

4.1.2 Tulis nomor specimen pada ujung preparat.

4.1.3 Buat preparat kontrol positif rabies seperti di atas sebegai kontrol positif4.1.4 reparat yang masih basah dilakukan pewarnaan/fiksasi dalam larutan yang telah disiapkan selama 5 detik.4.1.5 Bilas slide dengan cepat pada air yang mengalir / kran.4.1.6 Kering anginkan sampai kering tanpa ada noda di preparat tersebut.4.1.7 Tetesi minyak immersi sebagai mounting.4.1.8 Periksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000X5. INTERPRETASI DAN PENETAPAN HASIL

Komponen jaringan akan terwarnai sebagai berikut:

5.1 Sel syaraf

5.1.1 Sitoplasma berwarna biru atau biru keunguan

5.1.2 Nuklei dan nukleoli berwarna biru tua/gelap

5.2 Jaringan interstitial berwarna merah muda

5.3 Serabut syaraf berwarna sangat merah muda 5.4 Sel darah merah berwarna merah tembaga5.5 Spesimen dinyatakan Positif Rabies jika terlihat Negri Bodies yang berwarna merah magenta dan adanya granula biru gelap serta mempunyai strukur yang beraneka ragam / berbeda beda (dapat berbentuk bulat (round), ovular, ameboid, segitiga (triangular), atau oval (oblong).

6. DAFTAR PUSTAKAVelleca, W.M. dan F.T. Forrester, 1981, Laboratory Methods for Detecting Rabies, U.S Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, p. 104-107; 148-149.

UJI BIOLOGIS RABIES PADA MENCIT

1. PRINSIPRabies adalah penyakit zoonotik infeksius yang ditandai oleh encephalitis yang dapat berhubungan dengan paralisis, perubahan tingkah laku dan manifestasi neurologik yang dapat berakibat fatal. Rabies diakibatkan oleh virus neurotropik dari Genus Lyssavirus, family Rhabdoviridae dan dapat menular ke semua jenis mammalia. Organ target virus penyebab penyakit rabies adalah jaringan sistem syaraf pusat (SSP) otak (khususnya, cerebellum, hipokampus, brain stem, Ammons horn, thalamus, cerebral cortex dan medulla oblongata).

Pada hewan yang telah menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Oleh karena itu jaringan otak merupakan pilihan jenis specimen/contoh yang harus dikirim untuk diagnosa rabies. Dalam otak, antigen virus rabies terdapat dalam jumlah yang berlimpah terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain, seperti gld salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. Jaringan yang direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak dan batang otak (brain stem).

Pada kasus jika uji FAT menunjukkan hasil yang tidak dapat disimpulkan, atau kasus paparan rabies pada manusia, diperlukan uji lebih lanjut terhadap sampel yang sama dengan mengisolasi virus pada kultur sel atau uji inokulasi pada mencit. Atau melakukan uji ulang FAT terhadap sampel lain yang direkomendasikan. Uji inokulasi pada mencit dilakukan pada mencit baru lahir atau umur 3-4 minggu yang diinokulasikan intracerebral. Sampel yang digunakan adalah pool sampel otak dan diobservasi selama 28 hari. Jika terdapat mencit yang mati antara hari ke-5 sampai dengan hari ke-28 post inokulasi maka sampel otaknya dikonfirmasi dengan uji FAT.

2. PERALATAN

2.1 Gunting dan pinset steril2.2 Mortar dan pastel steril2.3 Spuit 1 ml dengan jarum 28G2.4 Kandang mencit beserta litter (berupa: sekam)3. BAHAN

3.1 Mencit umur 3-4 minggu (12-14 g) sebanyak 5 ekor atau 1 koloni / litter mencit baru lahir umur 2 hari

3.2 PBS pH 7,4 steril

3.3 Antibiotik

3.4 Diethyl Eter untuk anastesi

3.5 Larutan antiseptik dan kapas

4. CARA KERJA

4.1 Inokulum disiapkan dengan membuat suspensi 10-20% (w/v) dari homogenate otak termasuk batang

otak (seperti cortex, Ammon;s horn, thalamus, medulla oblongata) dalam larutan buffer isotonik yang

mengandung antibiotika, caranya : Gerus potongan otak kira-kira 1 gram sampai lembut, lalu tambahkan PBS ph 7,4 steril 10 ml untuk membuat suspensi 10 %

Lalu sentrifuse selama 10 menit.

Ambil 0,9 supernatan dan tambahkan 0,1 antibiotik

4.2 Mencit dianastesi terlebih dahulu, kemudian diinokulasi dengan menyuntikkan inokulum secara

Intracerebral dengan dosis 0,01 0,03 ml4.3 Mencit diobservasi selama 28 hari

4.4 Setiap mencit yang mati / menunjukkan gejala-gejala rabies ( lumpuh, gemetar ) diuji terhadap rabies dengan uji FAT. Jika menggunakan mencit baru lahir maka setiap ekor bayi mencit tersebut diuji FAT pada hari ke-5, 7, 9, dan 11 post inokulasi. 4.5 Jika terdapat kematian mencit pada empat hari pertama post inouklasi maka dinilai sebagai non

spesifik (kemungkinan akibat stres atau infeksi bakterial, dll)

5. DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2011, Rabies, In OIE Terrestrial Manual, Office International des Epizooties (OIE). Pp. 1-20

Uji FAT Positif Rabies Sampel Otak (hipokampus)

(i) Evans Blue (ii) tanpa Evans Blue

EMBED PowerPoint.Slide.8

_1409027120.ppt

Uji Sellers Positif sampel otak

Berwarna Merah Magenta dan ada Granula Berwarna Biru

_1409027929.ppt

PENGAMBILAN SPESIMEN

U/ Pengambilan spesimen dilapangan ada 2 cara :1. Spesimen Darah u/ memeriksa antibodi 2. Spesimen Otak u/ memeriksa antigenPetugas dalam pengambilan spesimen harus diperhatikan ;- Telah divaksin rabies secara teratur- Memakai baju pelindung yang lengan panjang dari bahan plastik.- Sarung tangan ( Gloves )- Kacamata ( Goggles )- Penutup mulut ( masker )

_1455362210.ppt

HASIL LAB UJI SELLERS

Berwarna Magenta Oblong

HASIL LAB UJI SELLERS Positif

_1409027696.ppt

Uji FAT Positif tanpa Evans Blue Sampel Otak yang lisis

_1408942718.ppt

Uji FAT Negatif Rabies sampel Otak (hipokampus)

(i) Evans Blue (ii) tanpa Evans Blue