MAKALAH FITOKIMIA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

OLEH:

KELOMPOK VII

AYU ANDHIKADEBBY NATALIA GIRI

EVY YULIASTRIFRANSISKUS OKTOVIANUSJAMES BUDIYANTO MUNTU

MULIYANINENI MARIA A. MAU

RIZA ROSYITA YUSTINIANUSSRY RESKY ANANDA

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI

MAKASSAR

2015

BAB I

PENDAHULUAN

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk

bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara

suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa

berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang

pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan

menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi

diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang

bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga

menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun

Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang

proses kromatografi.

Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai

digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian

pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai

berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938

oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun

1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk

ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat

kroinatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan

kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James

mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun

1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu

teknik analisis yang canggih.

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas

berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama

dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an,

semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai

suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High

Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan

Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam

keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga

sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi

dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik

yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang

sederajat dengan kromatografi gas.

BAB II

PEMBAHASAN

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau biasa juga

disebut denganKromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan metode

yang dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara

mendasar merupakan perkembangantingkat tinggi dari kromatografi kolom,

Selain itu HPLC memiliki kekuatan bertekanan tinggisampai dengan 600 psi, Ini

membuat HPLC dapat bekerja lebih cepat daripada kromatografilain (Yustisiani,

2012).

A. HPLC dapat dilakukan dengan dua teknik yaitu :

1. KCP (Kromatografi-Cair-Padat)

2. KCC (Kromatografi-cair-cair)

Fasa Diam

Dalam penerapannya HPLC menggunakan fasa diam dengan ukuran

yang sangat kecildibandingkan dengan kromatografi kolom yaitu 5-10

dan tekanan sampai 600 psi.Ukuran dari fasa diam yang sangat kecil

menyebabkan fasa diam mempunyai luas permukaan yang besar,

keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien pemisahan

dipertinggi. Tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak (eluen)

dapat bergerak lebih cepat dengan laju alir 1-10 mL per menit sehingga

difusi menjadisekecil-kecilnya.Ukuran butir kecil dari fasa diam dan

tekanan yang tinggi dari fasagerak akan menghasilkan pemisahan yang

baik.

Fasa Gerak 

Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen

atau pelarut.Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih

banyak pilihan fasa gerak,dibandingkan dengan fasa gerak untuk

kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasagerak hanya sebagai

pembawa larutan melewati kolom menuju detector. Sebaliknyadalam

HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen

campuranmenuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan Larutan-

larutan. Oleh karena itu,fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu

faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi

beberapa persyaratan berikut:

a. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang

akan di analisis.

b. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang

dapatmenganggu interpretasi kromatogram.

c. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada

kolom.

d. zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak

beracun.

e. zat cair tidak kental.sesuai dengan detektor.

(Yustisiani, 2012).

B. Peralatan HPLC dapat dibagi dalam 5 unit yaitu :

1. Unit penghantaran atau eluen bertekanan tinggi

Pada bagian ini prinsipnya meliputi peralatan reservoir sampel

beserta sistem penghilang gas ( degassing system), alat pengatur gradient,

dan sistem pompa bertekanan tinggi. Pada peralatan KCKT modern

umumnya disertai dengan bejanasebagai tempat eluen yang terbuat dari

gelas atau “stainless steel” yang berkapsitas 1-2 liter (Yustisiani, 2012).

Pada reservoir dilengkapi dengan sisitem penghilang gas terlarut

seperti gas oksigendan nitrogen. Adanya gas terlarut dapat menyebabkan

gangguan pada sisitem kolomdan detector, serta pelebaran puncak yang

diperoleh. Pada bagian ini juga terdapatsistem pengatur gradien eluen. Jika

digunakan 1 macam pelarut, maka elusinya disebutelusi isokratik, sedangkan bila

digunakan 2 macam pelarut, maka elusinya disebut elusi bergradien. Pada elusi

bergradien perbandingan pelarutnya dapat diubah-ubah secarakontinyu

selama proses elusi. Efisiensi pemisahan pada KCKT ini akan lebih

bagus jika digunakan elusi bergradien.Pada unit penghantar solven juga tedapat

unit pompa yang memiliki kekuatan “output”minimum 100 psi, dan umumnya

bisa sampai 4000-6000 psi dengan kecepatan alir eluen paling sedikit 3

mL/menit (Yustisiani, 2012).

2. Unit sistem penyuntikan atau penginjeksian sampel

Sampel cuplikan harus dimasukkan kedalam kolom sebagai lapisan

setipis mungkin.Ukuran sampel sekitar 1-20 mikro Liter. Ada dua cara

untuk memasukkan cuplikan,yaitu cara injeksi dan katup pemasukkan cuplikan

mikro (micro-sampling valve).

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan

disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja

atmosfir, sistemtertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa

digunakan karena difusi didalam cairan kecil clan resolusi tidak

dipengaruhi

b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang

digunakan padaKromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada

kinerja sampai 60 -70atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan

semua pelarut-pelarutKromatografi Cair. Partikel kecil dari septum

yang terkoyak (akibat jaruminjektor) dapat menyebabkan

penyumbatan.

c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk

menginjeksivolume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara

automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang

lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD,

sampeldiisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE

difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

(Yustisiani, 2012).

3. Unit kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu

analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang

sesuai. Kolom dapat dibagi menjadidua kelompok :

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung

pada. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakanadalah 50 -

100 cm. Untuk kemasan jenismaterial pengisi kolom poros

mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasaini ada yang 5 cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan

panjangkolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya

dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan

temperatur lebih tinggi. Kolom yang lebih panjangakan menghasilkan

resolusi bertambah baik, tetapi perlu tekanan lebih tinggi lagi.Tabung

kolom dapat dikelilingi selubung air (water jacket) untuk pengaturan

suhu.Jenis isi kolom (kemasan kolom) tergantung cara kromatografi yang

dipakai apakahadsorpsi, partisi, atau penukar ion. Pengepakan kolom

tergantung pada model KCKTyang digunakan (Liquid Solid

Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography,LLC; Ion

Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC).

(Yustisiani, 2012).

4. Unit detector

Detector merupakan suatu bagian penting dari sebuah peralatan

analitik kromatografi cair yang modern. Fungsi dari detector yaitu

mendeteksi adanyakomponen cuplikan, dan mengukur banyaknya

komponen.

Klasifikasi detector pada HPLC dibedakan menjadi dua yaitu :

a. Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat molekul sampel

maupun fase gerak (bulk property detector). Detector ini adalah

Detektor indeks bias merupakandetektor yang juga luas

penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah

pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks

bias fasegerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat

dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini

kurang sensitif di banding dengandetector ultraviolet dan sangat

peka terhadap perubahan suhu.

b. Berdasarkan pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul

sampel (soluteproperty detector). Detector ini dibedakan menjadi

Detektor yang tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak.

Contohnya adalah detector fotometer (UV-vis dan inframerah). Pada

detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponensample didasarkan

pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dansinar

tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan

detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan

reprodusibelitasnya yangtinggi serta mudah operasinya. Detektor UV

terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic.

Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang

sehingga panjang gelombang UV yang digunakandapat dipilih

disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun

demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah

pada 254 nm karenakebanyakan senyawa organic menyerap sinar

UV pada sekitar panjanggelombang tersebut. Detektor fotometer

inframerah juga dapat digunakan padaHPLC. Dengan detektor ini

dapat dibuat pola spektrum infra merah darikomponen sampel

sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui. Yangkedua

adalah detector polarografi dan radioaktif. Kedua detector ini

dipengaruhioleh laju aliran. memerlukan pemisahan fase gerak

terlebih dahulu termasuk FIDdan ECD.

Detector yang sering digunankan pada HPLC adalah :

a. Detector spektometrik

Detector spektometrik, biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan

secara luas.Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan

panjang gelombang yangsempurna akan memberikan fleksibilitas

yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut

dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan

digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen

kolomguna menembus berkas sample dari peralatan tersebut.

b. Detector fluorometrik

Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin

biasa. Jenisyang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi

variable yang terus menerusdi sepanjang suatu jangkauan panjang

gelombang yang lebar denganmemanfaatkan sebuah sumber

kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring- penyaring yang

sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran

padafoto detektor untuk menahan radiasi eksitasinya. Versi yang

lebih murahmenggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi

emisi dan memanfatkansumber dengan panjang gelombang eksitasi

yang lebih terbatas. Banyak senyawadapat dideteksi dengan

fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan,

seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati

dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan

neurotransmitter. Kadang-kadangfasa bergerak melewati suatu

reaktor pasca kolom dimana komponen-komponensample

nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu

contohyang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino

pada tingkat subnanogram yang telah bereaksi dengan reagen fluoresamin.

c. Detector elektokimia

Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar

listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis

konduktometri biasanyadigunakan untuk mendeteksi solute-solut

yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun

anorganik. Pada detektor ini, larutan eluen darikolom memasuki

sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas

permukaansebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga,

dimana komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer

electron. Pendeteksian jenis ini telahdigunakan, misalnya untuk

neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalamekstra selular dari

jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa sepertidopamin,

norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan

arusoksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial

+0,60V.

Syarat – syarat pemilihan detector yang baik yaitu:

a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat

b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yangsangat kecil.Stabil dalam pengopersiannya.

c. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

d. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut

pada kisaran yangluas (kisaran dinamis linier).

e. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

(Yustisiani, 2012).

5. Unit pencatat atau recorder

C. Cara kerja HPLC

Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven kemudian masuk ke

dalam katup injeksi berputar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan

pertolngan mikrosiring, sampeldimasukkan ke dalam sampel loop yang

kemudian bersama-sama dengan solven masuk kedalam kolom. Hasil

pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukkanoleh

perekam (recorder). Tekanan solven diatur dengan pengatur dan pengukur

tekanan. Pompa memasok solven pada tekanan konstan hingga tekanan +

4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter permenit. Rekorder

menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel

(Yustisiani, 2012). Dibawah ini merupakan contoh kromatogram hasil

pemisahan dengan HPLC.

D. Kelebihan dan kelemahan HPLC

1. Kelebihan HPLC adalah :

a. mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

b. mudah melaksanakannya

c. kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

d. dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang

dianalisis

e. Resolusi yang baik 

f. dapat digunakan bermacam-macam detektor 

g. Kolom dapat digunakan kembali

h. mudah melakukan "sample recovery"

2. Kelemahan HPLC adalah :

a. Membutuhkan proses preparasi yang lama

b. Tingkat kemurnian sampel harus tinggi sehingga dibutuhkan proses

pemurnian

c. Reagen yang digunakan harus memiliki tingkat kemurnian yang

tinggi

d. Alatnya mahal

e. Hanya bisa dilakukan oleh operator yang terlatih saja

(Yustisiani, 2012).

E. Keuntungan HPLC

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG).

Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek

pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG,

namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk

zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan

utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan

memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium.

Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat

digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya

digunakan (Putra, 2004).

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan

kromatografi cair klasik, antara lain:

1. Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang

dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit

(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

2. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa

dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir

sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya

dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif

dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter

tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

3. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan

dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9

gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan

Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).

Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi,

Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT

4. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom

kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) .

Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum

dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven

yang digunakan.

5. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak

bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya

diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe

eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

6. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam

KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel

yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan

mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat

dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion

memerlukan prosedur khusus.

(Putra, 2004).

BAB IIIPENUTUP

1) Kesimpulan

Pada umumnya, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) memiliki

prinsip kerja yang sama dengan jenis kromatografi yang lain, namun yang

membedakannya adalah pada proses pengerjaan serta peralatan yang

digunakan. KCKT memiliki keunggulan yaitu dalam hal teknik pengerjaan

yang relatif lebih cepat dibandingkan serta hasil yang didapatkan lebih

akurat.

2) Saran Kepada mahasiswa agar dapat lebih mempelajari prinsip kerja

jenis-jenis teknik pemisahan dengan kromatografi.

DAFTAR PUSTAKA

Putra, Effendy De Lux. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. USU : Medan

Yustisiani, Emi. 2012. High performance liquid chromatography(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). UNM : Malang.