Analisis Kualitatif dengan KCKT

30
LAPORAN PRAKTIKUM METODE ANALISIS INSTRUMEN PERCOBAAN 3.1 ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF BAHAN BAKU DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI Disusun oleh : KELOMPOK 3B YENI SARI (10060312046) MARSHA BETARI A (10060312047) IMAS ZAKIAH (10060312048) WIDYA (10060312090) FAJRI ZAKIYYATU S (10060312091) ACEP SOMANTRI (10060312092) Tanggal Praktikum : 25 Februari 2015 Tanggal Laporan : 4 Maret 2015 Asisten : Shanti Wilandari, S.Farm LABORATORIUM FARMASI INSTRUMEN

description

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau yang sering disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang penggunaannya paling luas.

Transcript of Analisis Kualitatif dengan KCKT

Page 1: Analisis Kualitatif dengan KCKT

LAPORAN PRAKTIKUM METODE ANALISIS INSTRUMEN

PERCOBAAN 3.1

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF BAHAN BAKU DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Disusun oleh :

KELOMPOK 3B

YENI SARI (10060312046)

MARSHA BETARI A (10060312047)

IMAS ZAKIAH (10060312048)

WIDYA (10060312090)

FAJRI ZAKIYYATU S (10060312091)

ACEP SOMANTRI (10060312092)

Tanggal Praktikum : 25 Februari 2015

Tanggal Laporan : 4 Maret 2015

Asisten : Shanti Wilandari, S.Farm

LABORATORIUM FARMASI INSTRUMEN

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG

2015

Page 2: Analisis Kualitatif dengan KCKT

PERCOBAAN 3.1

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF BAHAN BAKU DENGAN

METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I. Tujuan

a. Melakukan analisis kualitatif bahan baku dengan metode kromatografi cair

kinerja tinggi

b. Melakukan analisis kuantitatif bahan baku dengan metode kromatografi

cair kinerja tinggi

c. Menyimpulkan mutu bahan baku dengan data kromatogram dan hasil

penetapan kadar

II. Teori Dasar

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau yang sering

disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi

yang penggunaannya paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk

pemisahan dan oemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif

senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga

digunakan untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada

parameter waktu retensi senyawa obat standar serta senyawa obat dalam

sampel (Gandjar dan Rohman, 2012). Menurut Gandjar dan Rohman, 2007,

Kegunaan HPLC antara lain :

1. Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa

biologis

2. Analisis ketidakmurnian

3. Analisis senyawa – senyawa tidak mudah menguap

4. Penentuan molekul – molekul netral, ionik, maupun zwitter ion

5. Isolasi dan pemurnian senyawa

6. Pemisahan senyawa – senyawa yang strukturnya hampir sama

7. Pemisahan senyawa – senyawa dalam jumlah yang sekelumit dalam

jumlah banyak dan dalam skala proses industri

Jenis – jenis kromatografi, yaitu :

1. Kromatografi padatan cair (LSC)

Page 3: Analisis Kualitatif dengan KCKT

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben

yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis

(TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati

atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular

(berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat

untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ .

Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam

pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat

untuk pemisahan isomer-isomer.

2. Kromatografi partisi

Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang

tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam

dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi

cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung

pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada

suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa

gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut

kromatografi cair cair (LLC).

Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan

lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara

kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut

kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC

dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT.

Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam

lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar

dari pada fase diam.

3. Kromatografi penukar ion (IEC)

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase

gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin

berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya

telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin

pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah

digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan

Page 4: Analisis Kualitatif dengan KCKT

dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai

untuk keduanya kation dan anion.

4. Kromatografi eksklusi

Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran

molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan

berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil

dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang

menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar,

tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa

ditahan.

Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum

disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya,

mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu Cross-

linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan

semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT.

Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer.

Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan

biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.

5. Kromatografi pasangan ion (IPC)

Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT

termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970.

Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill

dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-

kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan

suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap

teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.

Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari

sukanya menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC

lainnya (seperti senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi

secara kompleks dan senyawa basa kuat).

IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase

balik. Fase diam dari rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak

silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari

Page 5: Analisis Kualitatif dengan KCKT

suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak

dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai

adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan

bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau asetonitril

untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang

muatannya berlawanan dengan molekul sampel.

Menurut Crawford pada tahun 2011, Parameter yang dapat digunakan

untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram adalah resolusi (Rs), faktor

retensi (k), faktor selektifitas ( ), efisiensi dan jumlah teoritis (N)

- Resolusi (Rs)

Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam

waktu yang minimum. Nilai resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua

puncak akan memberikan pemisahan yang baik. Resolusi dipengaruhi

oleh beberapa parameter.

- Faktor retensi (k)

Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar

suatu komponen dari dalam kolom kromatografi. Nilai k yang tinggi

mengindikasikan sampel memerlukan waktu dalam berinteraksi

dengan fase diam terlebih dahulu hingga keluar dari kolom saat tepat

dalam konsentrasi maksimum.

- Faktor selektifitas ( )

Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali

senyawa-senyawa dalam campuran untuk mendapat selektifitas yang

maksimum diperlukan interaksi yang sesuai (partisi, adsorpsi, size

exclusion atau ion exchange). Apabila kedua senyawa memiliki k atau

nilai α = 1 kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. Akibat waktu

retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai

selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai

α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah

dengan cara, mengubah fasa gerak (misalnya dengan memperbesar

polaritas), mengubah fasa diam, mengubah temperatur karena pada

Page 6: Analisis Kualitatif dengan KCKT

umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi,

dan mengubah bentuk komponen.

- Efisiensi

Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil

yang diinginkan dengan memuaskan dan dalam waktu yang singkat.

Hasil yang ideal kolom yang efisien akan menghasilkan puncak yang

tajam. Efisiensi sangat dipengaruhi oleh kapasitas dari kolom.

- jumlah teoritis (N)

Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi.

Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada

setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi. Dimana semakin

besar harga N akan memberikan puncak yang lebih efisien.

Instrumen HPLC

a. Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui

kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan

(constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement).

Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua,

yaitu : pompa reciprocating dan pompa syringe.

Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut

teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau

peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor

yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya

ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran

yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas (Putra, 2004).

b. Injektor (Injector )

Page 7: Analisis Kualitatif dengan KCKT

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

1. Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja

atmosfir,sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa

digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak

dipengaruhi.

2. Septum : Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan

yangdigunakan pada Kromatografi Gas. Injektor ini dapat

digunakan padakinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini

tidak tahan dengan semua pelarut – pelarut kromatografi cair.

Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum

injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

3. Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk

menginjeksi volume lebih besar dari 10 μL dan dilakukan dengan

cara otomatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume

yang lebih kecildapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi

load, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfer, bila valve

difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom (Putra,

2004).

c. Kolom (Column)

Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok, yaitu :

1. Kolom analitik : Diameter dalam 2 - 6 mm.

Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom.

Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 - 100

cm. Untuk kemasan porosmikro partikulat, 10 - 30 cm. Dewasa ini

ada yang 5 cm.

2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih

besar dan panjang kolom 25 -100 cm (Putra, 2004).

d. Detektor

Detektor dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu sebagai berikut :

1. Detektor spektrofotometri UV – Vis.

Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak

digunakan dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi

karena kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat

Page 8: Analisis Kualitatif dengan KCKT

menyerap sinar UV – Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya

penyerapan radiasi UV dan sinar tampak pada kisaran panjang

gelombang 190 – 800 nm oleh spesies solut yang mempunyai

struktur atau gugus kromoforik. Seldetektor umumnya berupa

tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya 10

mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan

pengaruh indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang

terukur.

2. Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu

detektor universal yang memberi tanggap pada setiap zat terlarut,

asalkan indeks biasnya jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak.

Kelemahanutamanya adalah bahwa indeks bias ini peka terhadap

suhu. Karena itu suhu fase gerak, kolom, dan detektor harus

dikendalikan dengan seksama, bila pengukuran yang cermat

dilakukan pada kepekaan tinggi.

3. Detektor Elektrokimia

Banyak molekul organik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau

direduksi secara elektrokimia pada elektrode yang cocok. Arus

yang dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat untuk

menghasilkan tenaga yang sesuai. Meskipun detektor elektrokimia

cukup peka, namun ada pula kelemahannya. Adanya timbrungan

listrik dan goncangan arus juga harus diperhatikan.

4. Detektor Photodiode – Array (PDA)

Detektor PDA merupakan detektor UV – Vis dengan berbagai

keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan

kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang

berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan,

suatu kromatogram

pada panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190 –

400) dapat ditampilkan. Dengan demikian, PDA memberikan

banyak lebih banyak informasi komposisi sampel dibanding

dengan detector UV – Vis.Dengan detektor ini, juga diperoleh

Page 9: Analisis Kualitatif dengan KCKT

spectrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan

sebagai alat yang penting untuk memilih panjang gelombang

maksimal untuk sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya

dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak

dengan membandingkan antara spectra analit dengan spectra

senyawa yang sudah diketahui.

Keuntungan KCKT

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG).

Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh

efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada

KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis.

Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT

adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT

menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi

para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT

karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor

UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan

kromatografi cair klasik, antara lain :

a. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis

yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak

rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

b. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua

rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang

mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama

dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi

secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT

memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang

diinginkan.

c. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan

dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10 – 9

gram) dari bermacam - macam zat. Detektor – detektor Fluoresensi

dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10 – 12

Page 10: Analisis Kualitatif dengan KCKT

gram). Detektor – detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks

Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT

d. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom

kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali

(reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang

sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven

dan jenis solven yang digunakan

e. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak

bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya

diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe

eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat

tersebut.

f. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam

KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen

sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut

dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.

Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan kecuali untuk

kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

III. Alat dan Bahan

a. Alat

- HPLC Agillent

- Vial

- Pipet

- Labu takar

- Injekasi filter

- Gelas ukur

- Pipet ukur

- Spatel

b. Bahan dan MSDS

- Baku pembanding paracetamol

Parcetamol mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari

101,0 %

Page 11: Analisis Kualitatif dengan KCKT

Pemerian : hablur atau serbuk hablur putih ; tidak berbau ;

rasa pahit.

Kelarutan : larut dalam 70 bagian air, dalam 7 bagian etanol,

dalam 13 bagian aseton dan 40 bagian griserol dan

dalam 9 bagian propilengkliol.

Suhu lebur : 169 – 172 ◦C

Timbal : tidak lebih dari 10 bpj.

Penyimpanan : dalam wadah tertutup baik dan terlindungi dari

cahaya.

Khasiat : analgetik, antipiretik

- Methanol pro HPLC

Pemerian : cairan tidak berwarna, jernih bau khas.

Kelarutan : dapat bercampur dengan air, membentuk cairan

jernih tidak berwarna.

Bobot jenis : 0,796- 0.798.

Titik didih : 64,5oC – 65oC

Indeks bias : 1,328 samapai 1,329.

- Air bidestilasi

Pemerian : cairan jernih , tidak berwarna , tidak berbau, tidak

mempunyai rasa.

Sisa penguapan : tidak lebih dari 0.001 %b/v , penguapan dilakukan

diatas tangas air hingga kering.

Penyimpanan : dalam wadah tertutup baik.

- Kolom HPLC C18

Octadecyl silica (C18) berupa padatan berwarna putih, tidak larut

dalam air.

IV. Prosedur

System Kromatografi

Fase diam : ODS, packing L1

Fase gerak : air : methanol = 3:1

Laju alir : 1.5 ml/menit

Lempeng teoritis : 1000

Page 12: Analisis Kualitatif dengan KCKT

Tailing factor : maksimal 2

Detector : UV 243 nm

1. Uji Kesesuaian Sistem Untuk melihat apakah system kroatografi yang diset sudah memenuhi

syarat atau tidak, maka dilakukan uji kesesuaian system. Uji dilakukan dengan

menginjeksikan berturut-turut sebanyak 7 kali larutan standar ke dalam instrument

KCKT. Selanjutnya luas area standar, waktu retensi, factor ilutan dihitung nilai

simpangan baku relative (SBR) . uji kesesuaian system dinyatakan memenuhi

syrat apabila nilai SBR <2.0%.

2. Uji Kualitatif

a. Larutan Standar

Ditimbang 25 mg baku pembanding paracetamol dimasukan ke dalam labu

takar 50 mL. diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Dikocok larutan

hingga homogen. Dipipet 1,0 mL dilarutan ke dalam labu takar 10 mL. diencerkan

dengan fase gerak hingga batas. Disaring larutan dengan membrane filter PTFE

ukuran 0,45 µm. larutan siap untuk diinjeksikan ke dalam alat KCKT.

b. Larutan Uji

Ditimbang 25 mg bahan baku paracetamol dimasukan ke dalam labu takar

50 mL, diencerkan dengan fase gerak hingga sampai batas. Dipipet 1.0 mL larutan

ke dalam labu takar 10 mL. diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas.

Disaring larutan dengan membrane filter PTFE ukuran 0.45 µm. larutan siap

untuk diinjeksikan ke dalam alat KCKT. Diinjeksikan masing-masing larutan

standard an larutan uji ke dalam alat KCKT. Rekam kromatogram yang terbentuk.

Dibandingkan kromatogram larutan uji dan larutan standar. Waktu retensi puncak

larutan uji harus sama dengan waktu retensi puncak larutan standar.

3. Analisis Kuantitatif

a. Larutan Standar

Ditimbang 25 mg baku paracetamol ke dimasukan kedalam labu takar 50

mL. diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Dikocok larutan hingga

homogeny (larutan stok baku pembanding parasetmol). Buat serngkaian

pengenceran larutan standar untuk pembuatan kurva kalibrasi. Di Pipet masing-

masing 0,2; 0,4; 0.6;0.8;1.0; dan 1,5 mL larutan stok pembanding ke dalam labu

takar 10 mL. diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Disaring larutan

Page 13: Analisis Kualitatif dengan KCKT

dengan membrane filter PTFE ukuran 0.45 µm. larutan siap diinjeksikan ke dalam

alat KCKT. Dihitung konsentrasi masing-masing larutan kurva kalibrasi.

b. Larutan Uji

Ditimbang 25 ng bahan baku parasetamol kedalam labu takar 50 mL.

diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Dikocok larutan hingga

homogeny . dipipet 1,0 mL larutan kedalam labu takar 10 mL. diencerkan dengan

menggunakan fase gerak hingga tanda batas. Disaring larutan dengan membrane

filter nilon ukuran 0,45 µm . larutan siap untuk diinjeksikan kedalam alat KCKT.

4. Cara Kurva Kalibrasi

Diinjeksikan masing masing konsentrasi larutan standard an larutan uji. Di

catat luas area kromatogram masing-masing larutan standard an larutan uji.

Dengan menggunakan kurva kalibrasi atau persaman garis. Dihitung kadar larutan

sampel.

5. Cara one point

Diambil luas area kromatogram salah satu larutan pembandingan

kemudian digunakan untuk menghitung kadar larutan sampel dengan

menggunakan metode “one point”

V. Hasil Pengamatan dan Perhitungan

- Air : ¾ x 100 = 75ml

- Metanol : 100 – 75 = 25ml

- Bahan baku Paracetamol : 25,5 mg dalam 50 ml

50 ml = 0,05 L

ppm = = 510 ppm

Pengenceran bahan baku paracetamol

V1. N1 = V2. N2

1 ml . 510 ppm = 10 ml . N2

Page 14: Analisis Kualitatif dengan KCKT

N2 = 51 ppm

- Larutan Standar paracetamol 25,38 mg dalam 50 mL

50 ml = 0,05 L

ppm = = 507,6 ppm

Pengenceran larutan standar paracetamol

V1. N1 = V2. N2

1 ml . 507,6 ppm = 10 ml . N2

N2 = 50,76 ppm

Tabel Uji Kesesuaian Sistem

Penyuntikan TR Luas Area

1 3,743 39969151

2 3,683 39479879

3 3,567 38873839

4 3,647 38731850

5 3.67 39079502

6 3,653 39041732

7 3,637 39247650

Rata-rata 3.67 39204237.57

SD 0.035529331 415770.5416

SBR 0.968101651 106,054,768

Pengenceran Kurva larutan Standart Paracetamol

V1. N1 = V2. N2

0,2 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2

N2 = 10,125 ppm

V1. N1 = V2. N2

Page 15: Analisis Kualitatif dengan KCKT

0,4 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2

N2 = 20,304 ppm

V1. N1 = V2. N2

0,6 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2

N2 = 30,456 ppm

V1. N1 = V2. N2

0,8 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2

N2 = 40,608 ppm

V1. N1 = V2. N2

1,0 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2

N2 = 50,76 ppm

V1. N1 = V2. N2

1,2 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2

N2 = 60,912 ppm

Tabel Kurva Kalibrasi

Konsentrasi

(x)

Luas Area

(y)

10,152 8735425

20,304 14526645

30,456 21527997

40,608 29153395

50.76 37106445

60,912 446122556

Page 16: Analisis Kualitatif dengan KCKT

y = bx + a

44612256 = 716956,4139x + 468798,5333

716956,4139x = 44612256 - 468798,5333

x = 61,57 ppm

Kadar Paracetamol dengan Metode Kurva Kalibrasi

Larutan Uji

RT = 3,613

Luas Area = 66021219

% kadar paracetamol = x 100 % = 120,72 %

Kadar Paracetamol dengan Metode ‘One Point’

Cu = x Cs

= x 51

Page 17: Analisis Kualitatif dengan KCKT

=75,474 ppm

% kadar = x 100 % = 147,98 %

VI. Pembahasan

Prinsip kerja dari KCKT adalah pemisahan komponen analit berdasarkan

kepolarannya, artinya komponen pada suatu analit (sampel) akan terpisah

berdasarkan sifat kepolaran masing-masing komponen dalam sampel, apakah

kepolarannya lebih mirip dengan fasa diam, maka dia akan tertinggal di fasa

diam atau bergerak lebih lambat, ataukah kepolarannya lebih mirip dengan

fasa gerak sehingga dia akan bergerak terdistribusi lebih jauh dan lebih cepat.

Sedangkan untuk prinsip kerja dari alat KCT tersebut adalah ketika suatu

sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut

kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit )

sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Cairan yang akan dipisahkan merupakan

fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner).

Fasa gerak dalam KCKT adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen

atau pelarut. Fasa gerak yang digunakan adalah air dan metanol dengan

perbandingan 3:1 yang bersifat lebih polar, sedangkan fase diamnya berupa

kolom C18 besifat lebih nonpolar. Hal ini disebabkan karena senyawa yang

dianalisis yaitu paracetamol bersifat lebih polar. Molekul polar dalam

campuran itu akan menghabiskan sebagian besar waktu mereka bergerak

dengan pelarut. Senyawa non-polar dalam campuran akan cenderung

membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena gaya dispersi van der

Waals. Mereka juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan

pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya di antara molekul-molekul air

atau metanol. Maka jenis teknik kromatografi yang digunakan adalah

kromatografi fase balik.

Pada KCKT fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen

campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut.

Page 18: Analisis Kualitatif dengan KCKT

Oleh karena itu, fasa gerak dalam KCKT merupakan salah satu faktor penentu

keberhasilan proses pemisahan. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring

terlebih dahulu untuk menghindari adanya partikel-partikel kecil . Selain itu,

adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan

berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga

akan mengacaukan analisis.

Sebelum melakukan analisis setiap hari, seorang analis harus memastikan

bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data

yang dapat diterima. Hal ini dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem

yang didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode

tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Uji

kesesuaian system ditujukan utk memastikan efektivitas sistem operasional

dari sistem kromatografi sebelum digunakan utk analisis (terutama analisis

kuantitatif).

Farmakope Amerika (United States Pharmacopeia, USP) menentukan

parameter-parameter yang dapat digunakan untuk menetapkan kesesuaian

sistem sebelum dianalisis. Parameter-parameter yang dapat digunakan

meliputi: bilangan lempeng teori (N), factor tailing, kapasitas (k’ atau α) dan

nilai standar deviasi relative (RSD) tinggi puncak dan luas puncak dari

serangkaian injeksi. Uji kesesuaian system dinyatakan memenuhi syarat

apabila nilai Simpangan Baku Relatif (SBR) < 2,0%. Dalam pengujian yang

kami lakukan diperoleh nilai SBR 0,968% dan 1,06% menunjukan bahwa

system yang digunakan telah memenuhi syarat.

Analisis yang dilakukan dalam percobaan ini adalah analisis kualitatif dan

analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan

waktu retensi larutan uji dengan waktu retensi larutan standar. Waktu retensi

adalah waktu yang diperlukan sampel untuk keluar kolom. Sedangkan,

analisis kuantitatif dilakukan dengan menghitung konsentrasi sampel

berdasarkan luas area puncak kromatogram dengan menggunakan metode

kurva yang menghitungan konsentrasi dengan menggunakan persamaan garis

y = bx + a serta metode one point.

Page 19: Analisis Kualitatif dengan KCKT

Pengujian kualitatif parasetamol menggunakan teknik HPLC, dalam

proses analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan

menginjeksikan sampel uji dan standar yaitu larutan yang sebelumnya telah

disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC dengan injektor

khusus yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini

dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan

gas dari pelarutnya. Larutan didorong cepat saat melalui kolom dengan

bantuan pompa bertekanan tinggi. Komponen akan keluar dari kolom dengan

kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan

adalah detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang

dapat menyerap sinar UV karena memiliki gugus kromofor pada strukturnya.

Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan

mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu

190 nm. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra

berupa kromatogram. Kromatogram merupakan grafik antara intensitas

komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi . Tampilan

kromatogram yang baik berupa grafik lurus, lancip, dan simetris.

Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu yang

terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk

melewati kolom ini disebut waktu retensi. Kromatogram yang dihasilkan dari

setiap konsentrasi larutan standar diperoleh waktu retensi dan luas area

kromatogram. Analisis kualitatif dilakukan dengan menentukan waktu retensi

dan luas area kromatogram larutan sampel/uji. Waktu retensi larutan uji

adalah 3.613 dengan luas area 66021219. Kemudian dibaningkan dengan

waktu retensi pada larutan standar. Adanya kesamaan waktu retensi yaitu pada

3,613 menunjukan larutan uji benar mengandung paracetamol.

Setelah analisis kualitatif, selanjutnya dilakukan analisis kuantitatif yang

bertujuan untuk menentukan kadar dari paracetamol dengan cara kurva

kalibrasi dan cara one point. Untuk cara kurva kalibrasi perhitungan kadar

dilakukan dengan persamaan garis y = bx + a.

y : luas area yang didapat setelah sampel diinjeksikan ke alat KCKT, y

yang dipilih adalah y pada konsentrasi 60.912 ppm yaitu 44612256

b : didapat dari persamaan regresi yaitu 716956.4139

Page 20: Analisis Kualitatif dengan KCKT

x : konsentrasi dari larutan standar yaitu 60.912

a : didapat dari persamaan regresi yaitu 468798.5333

dari data diatas didapat x adalah 61.57 ppm. Setelah data x didapat maka

dapat dihitung kadar dari paracetamol adalah 120.72%. Untuk penentuan

kadar paracetamol dengan cara one point kadar yang didapat adalah 147.98%.

Berdasarkan literature dari farmakope, Parcetamol mengandung tidak kurang

dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0 %. Dari kedua cara diatas, metode kurva

kalibrasi lebih baik daripada metode one point. Dapat dilihat dari hasil

perhitungan kadar, dimana cara kurva kalibrasi hasilnya lebih mendekati

konsentrasi sesuai literatur dibandingkan dengan cara one point.

VII. Kesimpulan

- Analisis kualitatif bahan baku dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

dilakukan berdasarkan nilai TR (waktu retensi) dan luas area kromatogram

yang dibandingkan dengan larutan standar.

- Analisis kuantitatif bahan baku dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

dilakukan dengan Metode Kurva Kalibrasi dan Metode One Point

- Kadar paracetamol yang terkandung dalam sampel dengan metode kurva

kalibrasi yaitu 120,72% sedangkan dengan menggunakan metode One

Point yaitu 147,98%

VIII. Daftar Pustaka

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. 1979. Farmakope

Indonesia Edisi III. Departemen Kesehatan R.I Jakarta

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. 1995. Farmakope

Indonesia Edisi IV. Departemen Kesehatan R.I Jakarta

Gandjar, Gholib., dan Rohman, 2009. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka

Pelajar: Yogyakarta.Johnson, E. L. and Steven son, R. 1978. Basic liquid chromatography. Varian,

California

Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy second edition,

John Wiley &Sons, Chischer, New York, Brisbane, Toronto, Singapore

Page 21: Analisis Kualitatif dengan KCKT

Rucker, G .1988. Instrumentelle pharmazeutische Analytik : lehbuch zu

spektroskop, chrotograph.u. elektrochem.Analysemethoden/von G.

Rucker. M. Neugebauer ; G.G. Wilems . Stuttgart : Wiss. Verl – Ges.,

Germany

Snyder, L. R and Kirkland J.J. 1979. Introduktion to modern liquid

chromatography. second edition. John Wiley & Sons.Inc NewYork,

Chihester, Briebane, Toronto, Singapore