MAKALAH PENGANTAR BIOTEKNOLOGI AMPLIFIKASI GEN

Disusun Oleh: Nama : Yusuf Aditya NIM : 1101070054 Semester: VIII

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGIFAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKANUNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO2015BAB IPENDAHULUANA. LatarbelakangBioteknologi secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi. Aplikasi teknologi tersebut dapat memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut.Pada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisalrekayasa genetika,kultur jaringan,DNA rekombinan, pengembangbiakansel induk,kloning, dan lain-lain. Teknologi ini memungkinkan kita untuk memperoleh penyembuhan penyakit-penyakit genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan, sepertikankerataupunAIDS. Kemajuan di bidang bioteknologi tak lepas dari berbagai kontroversi yang melingkupi perkembangan teknologinya. Sebagai contoh, teknologi kloningdanrekayasa genetikaterhadap tanaman pangan mendapat kecaman dari bermacam-macam golongan.Rekayasa genetik adalah mengubah susunan gen untuk mengubah sifat organisme sehingga memiliki kemampuan yang diinginkan. Perubahan sifat Biologis melalui rekayasa genetika tersebut menyebabkan "lahirnya organisme baru" produk bioteknologi dengan sifat - sifat yang menguntungkan bagi manusia. Teknik dalam rekayasa genitika yaitu fusi genetik, fusi protoplasma, amplifikasi gen, teknologi rekombinasi gen (DNA), dan pembuatan hibridoma. Sebagai bagian dari kajian rekayasa genetik, pada penulisan makalah ini akan dibahas secara lebih mendalam mengenai amplifikasi gen meliputi teknik dan penerapan amplifikasi gen tersebut.

B. Rumusan Masalah1. Apa yang dimasksud dengan amplifikasi gen?2. Bagaimana teknik amplifikasi DNA menggunakan metode Polymerase Chain Reaction(PCR)?3. Apa saja tahapan-tahapan dalam PCR?4. Apa saja komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR?5. Apa saja aplikasi teknik PCR?C. Tujuan1. Untuk mengetahui amplifikasi gen.2. Untuk mengetahui teknik amplifikasi DNA menggunakan metode Polymerase Chain Reaction(PCR).3. Untuk mengetahui tahapan-tahapan dalam PCR.4. Untuk mengetahui komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR.5. Untuk mengetahui aplikasi teknik PCR

BAB IIISIA. Amplifikasi Gen Amplifikasi gen adalah proses dimana plasmid atau bakteriofag (virus penyerang bakteri) yang diinduk-sikan ke dalam sel dan kemudian berkembang dengan cepat. Amplifikasi gen sering dilakukan pada sel-sel yang berfungsi untuk menghasilkan suatu senyawa, seperti: enzim, asam amino, vitamin, dan antibiotik.Salah satu penggunaan amplifikasi gen yaitu pengembangan obat anti retrovirus HIV-1. Munfarida, 2012 dalam jurnalnya mengatakan tahap awal untuk mewujudkan hal tersebut adalah malekukan amplifikasi gen gag p7 (nukleokapsid) HIV-1 subtipe CRF01_AE menggunakan pasangan primer AE_p7F dan AE_p7R dan sumber cetakan DNA berasal dari RNA virus yang diekstrasi dari serum penderita HIV. Hasilnya adalah cetakan DNA(template) yang berasal dari RNA virus yang diambil dari serum pasien penderita HIV-1 di indonesia melalui visualisasi pada gel poliakrilamida 10% menunjukkan bahwa fragmen gen gag p7 (nukleokapsid) berhasil teramplifikasi dengan ukuran 210 pb.B. Teknik Amplifikasi GenAmplifikasi DNA Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction(PCR)Polymerase Chain Reactionatau yang dikenal dengan PCR merupakan sebuah inovasi besar dalam perkembangan biologi molekuler. PCR telah menjadi suatu metode yang telah merevolusionerisasi berbagai cabang ilmu biologi dan terapannya dalam penelitian biologi molekuler mulai antara lain cloning gen, isolasi gen spesifik, analisis ekspresi gen, identifikasi mikroba, diagnosis penyakit, dan rekayasa mutasi gen. PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. Prinsip PCR merupakan amplifikasi (perbanyakan) segmen tertentu dari DNA yang dibatasi oleh sepasang primer oleh enzim DNA polymerase yang mengkatalisis reaksi polimerisasi deoxynucleotida trifosfat (dNTP) dari arah 5-3.PCR menggunakan prinsip dari replikasi DNA, namun berbeda dengan replikasi DNA bahwa PCR hanya mengamplifikasi daerah tertentu (sekuens) dari gen spesifik atau gen spesifik tertentu yang dikenali dan dibatasi oleh sepasang primer, yaitu primer forward dan primer reverse.PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari C. Berikut adalah tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR yaitu :1. Inisiasi/ DenaturasiPada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu C yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

Gambar 1.1 Untai DNA mengalami denaturasi2. Penempelan (Annealing) Annealing yaitu proses pelekatan primer pada cetakan DNA. Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar C selama 30-60 detik.

Gambar 2 Penempelan primer dengan untai DNA yang telah terdenaturasi3. Pemanjangan (Ektension) Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.

Gambar 3 Perpanjangan DNA secara semi-konservatifKetika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial (Marks Dawn, et al., 2000).

Gambar 4 Proses amplifikasi DNA target

Komponen-komponen untuk reaksi PCRBerikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu:1. DNA cetakan / DNA target Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA target.2. PrimerPrimer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Primer akan melekat pada sekuen yang komplemen dan mengapit sekuen spesifik yang akan diamplifikasi. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Primer yang umum digunakan adalah primer forward dan reverse. Forward primer bergerak dengan arah 5 > 3 untai DNA template. Sementara reverse primer bergerak dengan arah 3 > 5 untai DNA template. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu :a. Panjang primer : 15-30 pbb. Kandungan GC sekitar 50%c. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbedad. Urutan nukleotida yang sama harus dihindarie. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin3. DNA Polimerase Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air.4. Buffer / Dapar Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase.5. dNTPS dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target (Innis M. and Gelfand D. in White Thomas, 1990).Aplikasi teknik PCRPCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:1.Isolasi GenFungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.2.DNA SequencingUrutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.4.Diagnosa PenyakitPenyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).

BAB IIIPENUTUP

KESIMPULAN1. Amplifikasi gen adalah proses dimana plasmid atau bakteriofag (virus penyerang bakteri) yang diinduk-sikan ke dalam sel dan kemudian berkembang dengan cepat.2. Polymerase Chain Reaction(PCR) merupakan salah satu teknik amplifikasi gen.3. PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri.4. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari C. 5. Tahap-tahap dalam PCR, yaitu denaturasi, Penempelan (Annealing), dan Pemanjangan (Ektension).6. Komponen-komponen untuk reaksi PCR meliputi DNA cetakan / DNA target, primer, DNA polimerase, buffer/ dapar dan dNTPS.

DAFTAR PUSTAKAMunfarida. 2012. Amplifikasi Gen gag p7 (Nukleokapsid) Human ImmunodeficiencyVirus Type 1 (HIV-1) Subtipe CRF01_AE Isolat Indonesia. Depok: UniversitasIndonesia

http://chyrun.blogspot.com/2013/12/ilmiah-polymerase-chain-reaction-pcr.html

http://ridzky_thermusaquaticus-fst09.web.unair.ac.id/artikel_detail-50379-Umum-Polymerase%20Chain%20Reaction.html