LKP Prak Biotek 2007

LEMBAR KERJA PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI TERPADU

NAMA

: Annisa ArlisyahNIM

: 115100500111022KELAS

: AKELOMPOK: 7JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIANUNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG2014Nama

NIM

Kelas

Kelompok

PRE-LAB

1. Apa yang anda ketahui tentang enzim? Jelaskan jenis-jenis enzim berdasarkan tipe reaksi yang dikatalisis!

2. Apa perbedaan enzim dengan protein yang lain? Jelaskan!

3. Mikroorganisme apa saja yang dapat menghasilkan amilase?

4. Mikroorganisme apa saja yang dapat menghasilkan protease?

5. Mikroorganisme apa saja yang dapat menghasilkan lipase?

TanggalNilaiParaf Asisten

LAPORAN PRAKTIKUM

Praktikum 1.Isolasi Mikroorganisme Penghasil Enzim (Amilase, Protease, Lipase)A. Isolasi Mikroorganisme Penghasil Enzim Amilase

No.Jenis SampelHasil Pengamatan Warna yang TerbentukLuas Koloni

(mm2) Luas Zona Hidrolitik

(mm2)Keterangan

1Kelompok A (kontrol +)Putih283 332

2Kelompok B (kontrol +)Putih3215 2255

3Kelompok C (kontrol +)Putih82 306

4Kelompok D (kontrol +)putih491 829

B. Isolasi Mikroorganisme Penghasil Enzim Protease



(mm2)Keterangan

1Kelompok A (kontrol +)Putih262215,6

2Kelompok B (kontrol -)Putih28339-

3Kelompok C (kontrol +)Putih82158

4Kelompok D (kontrol -)Putih60668-

C. Isolasi Mikroorganisme Penghasil Enzim Lipase



(mm2)Keterangan

1Kelompok A (kontrol -)Putih1662-

2Kelompok B (kontrol -)Putih6079-

3Kelompok C (kontrol -)Putih207-

4Kelompok D (kontrol -)Putih346-

Pertanyaan:

1. Jelaskan prinsip kerja isolasi mikroorganisme penghasil enzim! Prinsip kerja isolasi mikroorganisme penghasil enzim adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Sedangka untuk isolasi bakteri penghasil selullose menggunakan metode isolasi pada medium cair. Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar (Winarni, 1997).

2. Mengapa isolat yang dapat menghasilkan enzim amylase, protease, dan lipase mampu membentuk zona hidrolitik pada media agar? Jelaskan!

3. Bagaimana mekanisme kerja enzim amilase hasil praktikum Anda? Jelaskan!Amilase adalah kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Hasil hidrolisis atau pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil. Tiap isolat bakteri yang tumbuh pada media pati ditetesi dengan larutan iodin untuk melihat kemampuan daya amilolitiknya. Isolat yang menghasilkan enzim amilase menghasilkan zona bening pada agar di sekitar koloninya jika ditetesi dengan larutan iodin.Aktivitas enzim amilase dideterminasi lewat metode DNS dengan menggunakan pati sebagai substrat. . Supernatan dari kultur enzim amilase kasar digunakan sebagai sampel enzim. Aktivitas enzim amilase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai mg glukosa yang dihasilkan oleh 1 ml filtrat kasar amilase. Satu Unit aktifitas enzim didefenisikan

sebagai banyaknya mol glukosa yang dihasilkan dari hidrolisa pati oleh 1 ml

ekstrak kasar enzim amilase selama masa inkubasi.

4. Bagaimana mekanisme kerja enzim protease hasil praktikum Anda? Jelaskan!Protease, disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim golongan hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih sederhana, seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, dengan reaksi hidrolisis pada ikatan peptida. Enzim ini diperlukan oleh semua makhluk hidup karena bersifat esensial dalam metabolisme protein. Peranannya dalam tubuh antara lain membantu pencernaan protein dalam makanan, menggunakan kembali protein-protein intraseluler, koagulasi sel darah, dan akivasi berbagai jenis protein, enzim, hormon, serta neurotransmiter.Enzim proteolitik yaitu enzim yang dapat mengurai atau memecah protein. Enzim proteolitik digolongkan menjadi dua kelompok besar yaitu golongan eksopeptidase dan endopeptidase. Golongan eksopeptidase dibagi menjadi karboksi peptidase dan amino peptidase yang berturut-turut memotong peptide dari arah gugus karboksil terminal dan gugus amino terminal. Endopeptidase memecah protein atau ikatan peptide dari dalam.

5. Bagaimana mekanisme kerja enzim lipase hasil praktikum Anda? Jelaskan!Enzim lipase berfungsi mengkatalisis trigliserida menjadi digliserida dan asam lemak. Kerja lipase mempunyai spesifitas terhadap lokasi atau posisi ester. Keaktifan lipase dapat diketahui dengan mengikuti habisnya substrat atau timbulnya produk hidrolisis asam lemak bebas.

6. Bandingkan luasan zona hidrolitik dari tiap isolat hasil praktikum Anda! Jelaskan mengapa demikian!Pada isolasi mikroorganisme penghasil enzim amylase, semua kelompok memiliki jenis sampel dengan kontrol positif. Luas zona hidrolitik yang terbentuk pada kelompok A,B,C dan D secara berurutan yaitu 332 mm, 2255 mm, 306 mm dan 829 mm. pada isolasi mikroorganisme penghasil enzim amylase yang zona hidrolitiknya paling luas adalah pada kelompok B yaitu 2255 mm. Setiap kelompok memiliki hasil luas zona hidrolitik yang berbeda-beda karena.Pada isolasi mikroorganisme penghasil enzim protease, hanya kelompok yang jenis sampel nya kontrol positif yang dapat menghasilkan luasan zona hidrolitik. Sedangkan pada kelompok yang jenis sampel nya control negative tidak memiliki luasan zona hidrolitik. Pada kelompok A dengan control positif dihasilkan luasan zona hidrolitik 215,6 mm dan pada kelompok C dengan control positif dihasilkan luasan zona hidrolitik 158 mm.Pada isolasi mikroorganisme penghasil enzim lipase dari semua kelompok tidak ada yang memiliki luasan zona hidrolitik.

7. Jelaskan aplikasi dari enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme dalam bidang pangan!Dalam industri pangan, enzim protease dimanfaatkan untuk pengolahan susu, roti,

biskuit, proses pematangan keju, pengempukan daging, dan pembuatan produk

dari kedelai. Selain itu, enzim protease juga digunakan pada beberapa aplikasi

industri seperti deterjen, farmasi, produk-produk kulit, produk-produk makanan,

dan proses pengolahan limbah industri.Enzim amilase dapat digunakan untuk menghilangkan kanji dalam buah-buahan dan cocoa semasa pemprosesan jus buah-buahan dan coklat, dan sebagai bahan tambahan dalam proses pencairan kanji sebelum penambahan malt dalam industri alkohol.

Enzim lipase dapat digunakan untuk menghasilkan emulsifier, surfaktant, mentega, coklat tiruan, protease untuk membantu pengempukan daging, mencegah kekeruhan bir, naringinase untuk menghilangkan rasa pahit pada juice jeruk, glukosa oksidase untuk mencegah reaksi pencoklatan pada produk tepung telur dan lain-lain.Enzim selulase dapat digunakan untuk melembutkan sayur-sayuran dengan mencernakan sebahagian selulosa sayur itu, mengeluarkan kulit dari biji-bijian seperti gandum, mengasingkan agar-agar daripada rumput laut dengan menguraikan dinding sel daun rumput dan membebaskan agar-agar yang terkandung dalamnya.

KesimpulanPrinsip kerja isolasi mikroorganisme penghasil enzim adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Sedangka untuk isolasi bakteri penghasil selullose menggunakan metode isolasi pada medium cair. Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar

Daftar Pustaka


Nama

NIM

Kelas

Kelompok

PRE-LAB

1. Jelaskan prinsip dari teknik imobilisasi sel dan enzim !

2. Jelaskan metode-metode imobilisasi sel dan enzim yang Anda ketahui!1.Adsorbsi

Metode ini didasarkan pada adsorbsi sel ke permukaan matriks. Adsorbsi didasarkan pada kekuatan non kovalen, interaksi bersifat ionic.

2.Ikatan Kovalen

Mekanisme metode ini didasarkan pada formasi ikatan kovalen antara sel dan pendukung. Modifikasi kimia pada permukaan sangat penting untuk metode ikatan kovalen.

3.Ikatan Silang

Sel mikroba dapat diimobilisasi dengan ikatan silang satu sama lain dengan bahan reaksi bi atau multifungsi seperti glutaraldehide dan tolunedilsosianat.

4.Penjebakan

Metode penjebakan didasarkan pada pemasukan sel di dalam suatu jaringan kaku untuk mencegah sel menghambur ke dalam medium untuk membiarkan penetrasi substrat. Matriks yang biasa digunakan adalah agar, alginate, dan karagenan.

3. Apa perbedaan antara imobilisasi sel dan enzim?Imobilisasi enzim : Enzim yang secara fisik ditempatkan di dalam suatu daerah/ruang tertentu, sehingga dapat menahan aktivitas katalitiknya serta dapat digunakan secara berulang-ulang dan kontinyu.

Imobilisasi sel : suatu proses untuk menghentikan pergerakan dari molekul sel dengan menahannya pada suatu matriks.

4. Jelaskan tujuan dan keuntungan dilakukannya imobilisasi enzim dan sel!Tujuan : untuk memproduksi asam laktat karena imobilisasi sel dapat mempertahankan konsentrasi sel tetap tinggi di dalam bioreactor dan untuk melindungi sel dari gangguan lingkungan.

Keuntungan dari teknik imobilisasi :

a.Proses dapat dioperasikan

b.produk mudah dipisahkan

c.meminimalisir masalah dan penanganan bahan

d.menyediakan kemurnian dan yield produk dalam jumlah tinggi

e.stabilitas umumnya lebih baik

f.lebih murah

g.efisiensi proses, yaitu dengan sel imobilisasi proses fermentasi dapat berlangsung optimal, dengan arti sel dapat tumbuh secara optimal sehingga diperoleh hasil yang diinginkan secara maksimal.


LAPORAN PRAKTIKUM

Praktikum 2. Imobilisasi sel dan enzim

A. Imobilisasi L.LactisJumlah sel terimobilisasi :.(sel/g bead) = (sel/mL)

1. Apa fungsi Na-Alginat pada percobaan ini?

2. Mengapa pada teknik imobilisasi diperlukan larutan CaCl2 dingin?

3. Sebut dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan imobilisasi sel pada percobaan ini!

B. Analisa pH

1. Tuliskan data pengamatan Anda pada tabel berikut ini :

ParameterSel Bebas (tanpa imobilisasi)Sel terimobilisasi

pH awal :pH awal :

pHSetelah

5 jamSetelah

10 jamSetelah

15 jamSetelah

20 jamSetelah

5 jamSetelah

10 jamSetelah

15 jamSetelah

20 jam

2. Apa yang menyebabkan terjadinya perubahan pH selama fermentasi?

3. Bandingkan perubahan pH selama fermentasi oleh sel L.Lactis bebas dan sel L.Lactis terimobilisasi! Jelaskan apa yang menyebabkan perbedaan tersebut!

C. Analisis Total Gula Reduksi



Kadar gula reduksi awal : ..Kadar gula reduksi awal : ..

Kadar gula reduksiSetelah

5 jamSetelah

10 jamSetelah

15 jamSetelah

20 jamSetelah

5 jamSetelah

10 jamSetelah

15 jamSetelah

20 jam

2. Apa yang menyebabkan terjadinya perubahan kadar gula reduksi selama fermentasi?

3. Bandingkan perubahan kadar gula reduksi selama fermentasi oleh aktivitas sel L.Lactis bebas dan sel L.Lactis terimobilisasi! Jelaskan apa yang menyebabkan perbedaan tersebut!

D. Penentuan kadar L-Asam Laktat



Kadar asam laktat awal : ..Kadar asam laktat awal : ..

Kadar asam laktatSetelah

5 jamSetelah

10 jamSetelah

15 jamSetelah

20 jamSetelah

5 jamSetelah

10 jamSetelah

15 jamSetelah

20 jam

2. Apa yang menyebabkan terjadinya perubahan kadar asam laktat selama fermentasi?

3. Bandingkan perubahan kadar asam laktat selama fermentasi oleh karena aktivitas sel L.Lactis bebas dan sel L.Lactis terimobilisasi! Jelaskan apa yang menyebabkan perbedaan tersebut!

Kesimpulan

Daftar Pustaka


Nama

NIM

Kelas

Kelompok

PRE-LAB

1. Sebutkan beberapa bahan baku yang dapat dipergunakan dalam produksi etanol!

2. Sebutkan kelebihan Saccharomyces cerevisiae dalam memproduksi etanol!

3. Jelaskan pada fase pertumbuhan apakah mikroba mulai menghasilkan etanol!

4. Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi hasil fermentasi etanol!


LAPORAN PRAKTIKUM

Praktikum 3. Produksi Etanol1. Lengkapi tabel hasil pengamatan fermentasi etanol berikut ini! Perlakuan berbagai konsentrasi gulaKonsentrasi gula (v/v)Waktu pengamatan (jam)Hasil Pengamatan

ODpHTotal gula reduksiKadar etanol

10%0

24

48

72

15%0

24

48

72

20%0

24

48

72

Pembahasan :

Perlakuan berbagai konsentrasi inokulumKonsentrasi inokulumWaktu pengamatan (jam)Hasil Pengamatan

ODpHTotal gula reduksiKadar etanol

5%0

24

48

72

10%0

24

48

72

15%0

24

48

72

Pembahasan :

2. Merujuk pada data di atas, tentukan kondisi optimal fermentasi etanol berdasarkan kinetika fermentasi dengan menghitung specific growth rate (), yield sel (YX/S) dan yield produk (YP/S)! Perlakuan berbagai konsentrasi gulaKonsentrasi gula (v/v)Waktu pengamatan (jam)Specific growth rate ()Yield sel (YX/S)yield sel (YP/S)

10%0

24

48

72

15%0

24

48

72

20%0

24

48

72

Pembahasan :

Perlakuan berbagai konentrasi inokulumKonsentrasi inokulumWaktu pengamatan (jam)Specific growth rate ()Yield sel (YX/S)yield sel (YP/S)

5%0

24

48

72

10%0

24

48

72

15%0

24

48

72

Pembahasan :

Kesimpulan

Daftar Pustaka


Nama

NIM

Kelas

Kelompok

PRE-LAB

1. Jelaskan apa yang anda ketahui tentang DNA kromosom!

2. Jelaskan prinsip dari teknik isolasi DNA kromosom!

3. Jelaskan perbedaan antara DNA plasmid dengan DNA kromosom!

4. Jelaskan prinsip isolasi DNA plasmid!


LAPORAN PRAKTIKUM

Praktikum 4. Isolasi DNA Kromosom dan Plasmid

1. Tulislah data hasil absorbansi dari larutan standar DNA (calf thymus)!

Konsentrasi DNA standar (g/ml)Absorbansi pada panjang gelombang

280 nm260 nm

1,0

5,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

Keterangan :

Nilai absorbansi 1,0 pada panjang gelombang 260 nm setara dengan konsentrasi 50 g DNA per ml.

2. Buatlah kurva standar, nilai regresi, slope, dan intercept untuk menentukan konsentrasi DNA kromosom dan plasmid!

3. Tulilslah data hasil absorbansi sampel DNA kromosom dan plasmid dengan metode spektrofotometri!

Pengenceran (DNA : ddH2O)Absorbansi DNA KromosomAbsorbansi DNA Plasmid

A ((280 nm)A ((260 nm)A ((280 nm)A ((260 nm)

Konsentrasi awal

1 : 2

1 : 5

1 : 10

1 : 20

4. Tentukan konsentrasi sampel DNA kromosom dan plasmid pada tiap pengenceran dengan menggunakan ekstrapolasi dari kurva standar DNA!

Konsentrasi DNA Kromosom :

Konsentrasi DNA Plasmid :

5. Tentukan berapa rasio A260/A280 untuk tiap sampel hasil pengenceran!

Pengenceran

(DNA : ddH2O)Rasio A(260/A(280

DNA KromosomDNA Plasmid

Konsentrasi awal

1 : 2

1 : 5

1 : 10

1 : 20

6. Jelaskan definisi dari nilai rasio A(260/A(280 ? Bahaslah nilai rasio tiap sampel DNA kromosom dan plasmid!

7. Jelaskan peranan dari penambahan lisosim pada teknik isolasi DNA kromosom!

Fungsi lisosim adalah melisiskan sel bakteri sebagai pertahanan konstitutif melawan bakteri pathogen. Beberapa bakteri gram positif sangat sensitive terhadap lisosim meskipun dalam konsentrasi yang sangat rendah. Bakteri gram negative kurang rentan untuk diserang lisozim karena peptidoglikannya dilindungi oleh membrane luar.

8. Jelaskan peranan proteinase-K pada isolasi DNA kromosom!

Fungsi dari penambahan proteinase K ini adalah untuk memotong-motong atau memutus ikatan peptida dari protein-protein sel bakteri tersebut, lalu campuran tersebut dikocok menggunakan vortex agar pemutusan ikatan-ikatan peptida tersebut lebih cepat terjadi.

9. Apa peranan etanol absolut pada teknik isolasi DNA kromosom?

Fungsi pemberian etanol absolut dingin adalah agar DNA terpisah dari zat lainnya dan tidak menghancurkan DNA.

10. Mengapa pada tahapan isolasi DNA kromosom ditambahkan larutan chloroform-isoamil alkohol?

Fungsi dari penambahan larutan chloroform isoamil alcohol adalah untuk membuang protein yang masih terkandung dalam sampel. Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA (Ningrum, 2008). Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi

11. Jelaskan peranan ampisilin pada isolasi DNA plasmid!

Ampisilin berperan sebagai marka seleksi,yaitu gen yang member kharakteristik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Jadi biakan yang sudah mengandung DNA rekombinan berupa suatu gen yang menyandi ampisilin tersebut akan tetap hidup dalam media LB yang sudah ditambah ampisilin, sedangkan biakan yang tidak mengandung ampisilin maka akan mati. Ampisilin merupakan senyawa antibiotic yang bersifat toksik. Biakan akan mati karena ketoksikan ampisilin jika dalam DNA nya tidak mengandung suatu gen untuk mendegradasi ampisilin. Fungsi ini membuat ampisilin sering digunakan untuk menyeleksi DNA plasmid karena ampisilin dapat bersifat selektif

12. Apa fungsi dari larutan II (NaOH dan SDS) pada teknik isolasi DNA plasmid?

Fungsi dari larutan II (SDS dan NaOH) berfungsi sebagai larutan pelisis pada teknik isolasi DNA plasmd. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein.

13. Jelaskan fungsi dari alkohol 95% dan 70% dingin!

Alkohol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif.Alkohol 95% dingin dalam proses isolasi berfungsi sebagai campuran untuk menghomogenkan larutan.

14. Apa peranan RNAse pada teknik isolasi DNA plasmid?

Peran dari RNase pada teknik isolasi DNA plasmid adalah untuk mendegradasi RNA sehingga yang tinggal adalah DNA.

KesimpulanPrinsipnya dari teknik isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.Prinsip dari teknik isolasi DNA plasmid adalah mengekstrak plasmid dan memisahkannya dari berbagai komponen selular bakteri lainnya seperti protein, lemak, RNA dan DNA kromosomal. Prinsip isolasi DNA plasmid ada 3 tahap, yaitu :

1.Solution I : mengkondisikan DNA

2.Solution II : denaturasi dan lisis

3.Solution III : Renaturasi

Daftar Pustaka


Nama

NIM

Kelas

Kelompok

PRE-LAB

1. Jelaskan apa yang anda ketahui tentang PCR!

2. Jelaskan prinsip dari teknik amplifikasi DNA menggunakan PCR!

3. Jelaskan perbedaan antara PCR dengan real time PCR!

4. Faktor-faktor apa saja yang mempengaruhi hasil amplifikasi DNA metode PCR!


LAPORAN PRAKTIKUM

Praktikum 5. Amplifikasi DNA Metode PCR1. Tempelkan gambar elektroforesis DNA hasil amplifikasi! Jelaskan pula hasil praktikum anda!

2. Apa peranan dari sampel DNA pada proses amplifikasi DNA metode PCR ?

3. Apa peranan primer pada proses amplifikasi PCR ?

Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat.

4. Mengapa pada proses amplifikasi digunakan primer forward dan reverse ?

5. Apa peranan buffer mix pada proses amplifikasi PCR ?Peranan buffer mix adalah menjaga agar pH tetap stabil pada proses amplifikasi PCR.

6. Sebut dan jelaskan masing-masing komponen yang terkandung pada buffer mix PCR!

1. ddHO : fungsi dari ddHO adalah sebagai pelarut DNA2. buffer PCR : fungsi buffer PCR adalah menjamin agar pH medium. Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl sesuai yang diperlukan.3. MgCl : sebagai kofaktor, untuk menstimulasi aktivitas DNA polymerase. Dengan adanya MgCl ini akan meningkatkan interaksi primer dengan template yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses.4. dNTPs : dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan5. Taq polymerase : Taq polimerase (disingkat Taq pol) merupakan enzim DNA polimerase (EC 2.7.7.7) stabil suhu pertama yang berhasil dipurifikasi dari bakteri termofil ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik

7. Mengapa pada proses amplifikasi ditambahkan Taq polimerase ?

Taq polimerase (disingkat Taq pol) merupakan enzim DNA polimerase (EC 2.7.7.7) stabil suhu pertama yang berhasil dipurifikasi dari bakteri termofil ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Enzim ini mempunyai kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3 5.Enzim ini tahan terhadap suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi disbanding dengan fragmen Klenow.

8. Jelaskan peranan dari tiap tahapan PCR (denaturasi, primer annealing, elongasi)!

1. Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 95 oC. Denaturasi awal dilakukan selama 1 3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase.2. Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi. Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70740C bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak.3. Extension merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA.

Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target.

9. Mengapa diakhir proses amplifikasi dilakukan teknik elektroforesis?

Untuk melihat hasil dari proses amplifikasi DNA. Elektroforesis merupakan teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Tujuan elektroforesis yaitu untuk identifikasi, pemisahan, dan purifikasi DNA.

KesimpulanPrinsip PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short target product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier (Handoyo, 2000).Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA (Handoyo, 2000).

Daftar Pustaka


NamaCITRA ANGGRAENI

NIM115100500111024

KelasA

Kelompok7

PRE-LAB

1. Jelaskan prinsip transformasi plasmid!Prinsip transformasi adalah penyisipan gen asing ke dalam gen mahluk hidup melalui suatu proses khusus, salah satunya adalah heat shock yaitu perubahan permeabilitas dinding sel secara cepat untuk memaksa plasmid masuk ke dalam sel baru dan terekspresikan.

2. Ada berapa jenis metode transformasi plasmid? Sebutkan dan Jelaskan!

Ada 5 jenis metode transformasi plasmid.1.Kejutan panas (heatshock)

Teknik ini dilakukan dengan cara pemberian CaCl pada sel bakteri sehingga sel bakteri menjadi kompeten. Sel bakteri yang kompeten akan mudah dimasukkan ke dalam DNA rekombinan setelah diberi kejutan panas.

2.Elektroporasi

Elektroporasi merupakan salah satu cara melakukan transformasi dengan menggunakan aliran listrik. Elektroporasi berperan untuk meningkatkan efisiensi integrasi DNA pada sel inang.3.Polyethylen glycol (PEG)

Teknik transfer gen yang termasuk dalam transfer gen secara langsung diantaranya adalah transformasi protoplas. Teknik ini disebut teknik transfer gen secara langsung karena proses introduksi DNA dilakukan tanpa melalui perantara. Keberhasilan teknik PEG masih rendah karena regenerasi protoplas sangat bergantung pada jenis genotype yang dipakai.

4.Particle Bombardment (Biolistic)

Merupakan metode transfer gen yang digunakan untuk melakukan transformasi pada sel secara in situ. DNA target akan diletakkan di atas permukaan emas sekitar 0.5-1.5 m. kemudian akan dilakukan penembakan dengan menggunakan alat gene gun yang akan menembak dengan tekanan yang tinggi.

5.Agrobacterium tumefaciens

Merupakan bakteri gram positif yang bersifat fitopatogen pada tanaman dikotil. Bakteri tersebut secara alami memiliki kemampuan untuk mentransfer potongan DNA yang kemudian dikenal dengan nama T-DNA ke dalam genom tanaman dan akan menyebabkan tumor (crown gall).


LAPORAN PRAKTIKUM

Praktikum 6. Transformasi Plasmid

1. Mengapa pada LB agar ditambahkan ampisilin konsentrasi 100 g/ml?Ampisilin berperan sebagai marka seleksi,yaitu gen yang member kharakteristik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Jadi biakan yang sudah mengandung DNA rekombinan berupa suatu gen yang menyandi ampisilin tersebut akan tetap hidup dalam media LB yang sudah ditambah ampisilin, sedangkan biakan yang tidak mengandung ampisilin maka akan mati. Ampisilin merupakan senyawa antibiotic yang bersifat toksik. Biakan akan mati karena ketoksikan ampisilin jika dalam DNA nya tidak mengandung suatu gen untuk mendegradasi ampisilin. Fungsi ini membuat ampisilin sering digunakan untuk menyeleksi DNA plasmid karena ampisilin dapat bersifat selektif

2. Apa peranan dari sel Escherichia coli DH5?Strain DH5a adalah salah satu jenis yang paling umum digunakan untuk teknonolgi DNA rekombinan. Berikut adalah mutasi dari strain DH5a yang berguna untuk teknik DNA rekombinan: endA1, recA1, deoR, gyrA96 dan lacZM15

3. Apa yang dimaksud dengan sel kompeten?Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. Praktikum ini menggunakan selE. colisebagai sel kompeten. Sel tersebut kemudian digunakan untuk transformasi yaitu disisipkannya plasmid ke dalam sel tersebut. Sel yang telah ditransformasi disebut transforman(Lodishet al.) sehingga dapat diperoleh koloniE. colidalam cawan

4. Apakah sel Escherichia coli DH5 dapat diganti dengan sel mikroorganisme yang lain? Jelaskan alasan anda!

5. Pada metode transformasi heat shock, mengapa dilakukan penambahan larutan CaCl2? Jelaskan!

Fungsi penambahan CaCl2 pada transformasi heat shock mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Perlakukan dengan CaCl2 menyebabkan dinding sel menjadi lebih permeabel dan bermuatan positif, sehingga dapat menarik DNA yang bermuatan negatif.

6. Apa peranan dari inkubasi pada suhu 4oC dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 42oC?Peran dari inkubasi pada suhu 4oC dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 42oC adalah untuk kejut panas, yaitu dikenal dengan metode Heat Shock.Prinsip dari proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu dari 0C ke 42C terhadap sel yang telah diberi perlakuan CaCl2. Perlakuan CaCl2 ini dilakukan dalam pembuatan sel kompeten. Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi dapat masuk ke dalam sel. Sel kemudian dikultur dalam media tumbuh LB dengan penambahan glukosa selama 1.5 jam untuk memperbanyak jumlah sel dan memberi kesempatan kepada sel untuk mengekspresikan marka seleksi dari plasmid yang dibawanya.

7. Jelaskan faktor yang mempengaruhi keberhasilan proses transformasi plasmid!

8. Bagaimana cara membedakan koloni transforman dengan koloni satelit setelah proses transformasi?

9. Apa yang dimaksud dengan efisiensi transformasi?

Nilai efisiensi transformasi ditentukan dengan menghitung jumlah koloni transforman yang tumbuh dan konsentrasi plasmid yang ditransformasi, kemudian dimasukkan dalam rumus efisiensi trasnformasi.

10. Bagaimana cara menghitung efisiensi transformasi?

Jumlah koloni x pengenceran x volume kultur total

Volume kultur yang disebar x jumlah vector yang ditransformasi

KesimpulanPrinsip transformasi adalah penyisipan gen asing ke dalam gen mahluk hidup melalui suatu proses khusus, salah satunya adalah heat shock yaitu perubahan permeabilitas dinding sel secara cepat untuk memaksa plasmid masuk ke dalam sel baru dan terekspresikan.

Daftar Pustaka


Nama

NIM

Kelas

Kelompok

PRE-LAB

1. Apa yang dimaksud dengan elektroforesis?

2. Jelaskan perbedaan elektroforesis DNA dengan elektroforesis protein?

3. Apa tujuan analisis DNA dengan metode elektroforesis?

4. Jelaskan fungsi dari agarosa?

5. Bagaimana cara mengatur ukuran pori gel agarosa?


LAPORAN PRAKTIKUM

Praktikum 7. Analisis Restriksi dan Elektroforesis DNA

1. Tempelkan gambar gel agarosa hasil elektroforesis DNA kromosom dan plasmid!

2. Jelaskan tahapan pembuatan gel agarosa!Tentukan konsentrasi atau presentase agarose yang dibutuhkan dan hal ini tergantung dari ukuran fragmen DNA yang dianalisis. Presentase gel agarose yang direkomendasikan, adalah sebagai berikut:

a. 0,5% agarose untuk fragmen DNA berukuran 1000-30.000pb

b. 0,7% agarose untuk fragmen DNA berukuran 800-12.000pb

c. 1,5% agarose untuk fragmen DNA berukuran 200-3.000pb

d. 2,0% agarose untik fragmen DNA berukuran 50-20.000pb

e. Pilih tipe agarose yang digunakan. Kebanyakan tipe yang digunakan adalah standart agarose. Misalnya telah ditentukan akan dibuat 2% gel agarose dalam volume 200 ml 1x buffer TAE, maka jumlah agarose yang akan ditimbang yaitu: 2 gram/100ml x 200ml=4 gram.

f. Tempatkan 4 gram agarose ke dalam labu erlenmeyer dan isi dengan larutan 1X Buffer TAE sampai volume 200ml, kemudian kocok sampai merata.

g. Panaskan dalam microwave sampai mendidih sampai larutan menjadi jernih.

h. Didinginkan agarose kira-kira sampai 600C dan tambahkan 5l ethidium bromide (10mg/ml) dan campur hingga merata.

i. Setelah itu larutan dituang ke dalam tray dan pasang well-forming combs, tunggu kurang lebih 30 menit atau sampai gel mengeras. Lepaskan well-forming combs secara perlahan-lahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.

3. Jelaskan fungsi larutan tris acetic EDTA (TAE) atau tris boric EDTA (TBE) pada pembuatan gel agarosa!

4. Jelaskan fungsi etidium bromida dalam elektroforesis DNA!

Etidium bromide akan menginterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan etidium bromide dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena etidium bromide akan memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah, maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis.

5. Ada berapa pita / band yang terbentuk pada elektroforesis DNA kromosom dan DNA plasmid? Hitunglah ukuran DNA hasil isolasi anda dengan metode ekstrapolasi?

6. Apakah ketebalan pita / band berkaitan dengan konsentrasi DNA hasil isolasi? Jelaskan alasan anda!

7. Faktor apa saja yang mempengaruhi pergerakan DNA dalam elektroforesis DNA menggunakan gel agarosa? Jelaskan!

KesimpulanElektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya

Daftar Pustaka


ISOLASI MIKROORGANISME PENGHASIL ENZIM

(AMILASE, PROTEASE, LIPASE)

1

2

IMOBILISASI SEL DAN ENZIM

3

PRODUKSI ETANOL

4

ISOLASI DNA KROMOSOM & PLASMID

AMPLIFIKASI DNA METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

5

6

TRANSFORMASI PLASMID

7

ANALISIS RESTRIKSI & ELEKTROFORESIS DNA

Lembar Kerja Praktikum Bioteknologi Terpadu 2014

12

LKP Prak Biotek 2007

Documents

Transcript of LKP Prak Biotek 2007