MAKALAH

DNA VEKTOR

DISUSUN OLEH :

Siti Marfuah 260110120006

Tazyinul Qoriah Alfauziah 260110120027

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2014

Vektor DNA

Vektor kloning adalah molekul pembawa DNA. Terdapat empat sifat penting dari semua vektor cloning, yaitu: (i) secara independen dapat mereplikasi diri dan segmen DNA asing yang mereka bawa; (ii) berisi sejumlah situs pembelahan restriksi endonuklease unik yang hadir hanya sekali dalam vektor; (iii) membawa penanda yang dapat dipilih (biasanya dalam bentuk gen resistensi antibiotik atau gen untuk enzim yang hilang di sel inang) untuk membedakan sel inang yang membawa vektor dari sel host yang tidak mengandung vektor; dan (iv) relatif mudah untuk pulih dari sel inang. Ada banyak pilihan yang mungkin dari vektor tergantung pada tujuan kloning. Berbagai macam vektor kloning telah dikembangkan untuk digunakan dalam inang bakteri E. coli.

Pemilihan vektor tergantung pada ukuran insert dan aplikasi

Tabel 1. Sifat utama dan aplikasi dari sistem vektor kloning yang berbeda.

1. BakteriofagBakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vektor kloning. Dua di antaranya akan dijelaskan berikut ini.a. Bakteriofag l

Bakteriofag atau fag l merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E. coli. Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya sebagai vektor kloning semenjak masa-masa awal perkembangan rekayasa genetika. DNA l yang diisolasi dari partikel

fag ini mempunyai konformasi linier untai ganda dengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang 12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA l untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos.Seluruh urutan basa DNA l telah diketahui. Secara alami terdapat lebih dari satu tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh karena itu, DNA l tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA l yang memenuhi syarat sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA l, yaitu vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing, vektor substitusi, yang untuk membawa fragmen DNA asing harus membuang sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.Di antara kedua macam vektor l tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb. Salah satu contohnya adalah vektor WES, yang mempunyai mutasi pada tiga gen esensial, yaitu gen W, E, dan S. Vektor ini hanya dapat digunakan pada sel inang yang dapat menekan mutasi tersebut.Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. Jika suatu enzim restrisksi memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA l di antara kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmen DNA asing. Jika pembuangan segmen DNA l tidak diikuti oleh substitusi fragmen DNA asing, maka akan terjadi religasi vektor DNA l yang kehilangan sebagian segmen pada daerah nonesensial. Vektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi automatis yang dapat membedakan antara sel inang dengan vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi.Bakteriofag l mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik. Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah transformasi untuk DNA fag) dimulai dengan masuknya DNA l yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalami replikasi secara independen atau tidak bergantung kepada kromosom sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA l sirkuler, masing-masing

DNA ini akan melakukan transkripsi dan translasi membentuk protein kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas (packaged) dalam kapsid sehingga dihasilkan partikel l baru yang akan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase lisogenik DNA l akan terintegrasi ke dalam kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang. Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang.Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak (plaque) berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak tersebut.

b. Bakteriofag M13Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi E. coli. Berbeda dengan l yang mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini mempunyai struktur berupa filamen. Contoh yang paling penting adalah M13, yang mempunyai genom berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408 basa. Infeksinya pada sel inang berlangsung melalui pili, suatu penonjolan pada permukaan sitoplasma.Ketika berada di dalam sel inang genom M13 berubah menjadi untai ganda sirkuler yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100 salinan. Salinan-salinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke permukaan sel inang. Dengan cara seperti ini DNA M13 akan terselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa menyebabkan lisis. Oleh karena fag M13 terselubungi dengan cara pembentukan kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang dapat disisipkan kepadanya. Inilah salah satu keuntungan penggunaan M13 sebagai vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan l. Keuntungan lainnya adalah bahwa M13 dapat digunakan untuk sekuensing (penentuan urutan basa) DNA dan mutagenesis tapak terarah (site directed mutagenesis) karena untai tunggal DNA M13 dapat dijadikan cetakan (templat) di dalam kedua proses tersebut.Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada DNAnya yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan restriksinya pun sangat sedikit. Namun, sejumlah derivat M13 telah dikonstruksi untuk mengatasi masalah tersebut.

2. Cosmids3. Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)4. Yeast Artificial Chromosomes (YACs)

a. Definisi

Kromosom ragi buatan; sistem kloning dalam ragi yang terdiri dari vektor

linear yang bereplikasi secara otonom dimana terjadi di dalamnya

penyisipan DNA eksogen, yang diapit oleh sentromer ragi dan dua urutan

penyemaian telomer.

Atau dalam istilah lain disebutkan sebagai pembuatan molekul DNA

manusia melalui pengkloningan urutan DNA dalam organisme ragi.

b. Bentuk

c. Penggunaan

Dapat menanpung ribuan kilobasa DNA yang disispkan dan stabil

dalam pelestarian DNA eukariotik kloning karena kompatibilitas

dengan mekanisme replikasi ragi.

Memiliki skala besar amplifikasi plasmid pada bakteri dan pembuatan

perubahan genetik yang tepat dalam urutan DNA eksogen dengan

menggunakan mekanisme ragi dan rekombinasi homolog terorganisir

dengan baik.

Dapat digunakan untuk pembelajaran genom eukariotik dan untuk

mobilisasi unsur genetik besar di antara bakteri dan eukariota.

Kromosom translokasi (kelainan kromosom yang terjadi akibat

penataan ulang bagian kromosom non homolog) dapat dipelajari

dengan cara YACs yang tidak mengandung informasi genetik yang

diperlukan untuk fungsi sel.

Pemetaan genom dan pemosisian proyek cloning

YACs digunakan secara luas untuk memetakan sejumlah kromosom.

Penggunaan kromosom buatan ini telah berhasil dalam menargetkan

Xq24 - qter, sebuah wilayah kromosom X yang diinginkan karena

mengandung dua situs fragil (FRAXA dan FRAXE) dan memiliki

kepadatan gen yang tinggi di Xq28. Menggunakan kombinasi dari

seluruh genom YAC dan YACs manusia berasal dari hibrida sel-

somatik mengandung wilayah ini, hampir cakupan lengkap Xq24-qter

telah dicapai oleh pemeriksaan hibridisasi dengan probe dan kromosom

berjalan. Akhir-akhir ini, dua kromosom manusia (21q dan euchromatic

Y) telah diatasi oleh YAC menggunakan genomik total YAC dan

polymerase chain reaction (PCR) berbasis skrining dengan spesifik

kromosom situs urutan-tag (STSs).

Pemetaan secara fisik dari genom manusia digunakan secara luas untuk

mengisolasi genom yang bertanggung jawab terhadap pewarisan

penyakit setelah sebelumnya diketahui ada protein yang rusak. Proses

ini disebut positional cloning karena posisi cacat gen dalam genom

sangat penting untuk diisolasi dan dikarakterisasi. YACs telah terbukti

sebagai alat penting untuk mengisolasi daerah besar DNA sekitar posisi

terkait pemetaan penyakit warisan. Terlebih ketika kelainan struktur

kromosom dikaitkan dengan beberapa kasus penyakit (misalnya, situs

fragil, trans-lokasi atau penghapusan).

Fluoresensi hibridisasi in situ (ikan) dari klon YAC pada spread

metafase kromosom pasien telah memungkinkan menentukan lokasi

dan menemukan beberapa gen yang secara struktural terganggu

sehingga menimbulkan penyakit secara tepat. Ketika klon YAC telah

diisolasi dekat dengan posisi gen yang rusak pada kromosom, gen yang

diinginkan tersebut kemudian diisolasi dengan menggunakan berbagai

teknik posisi-kloning.

5. Human Artificial Chromosomes (HACs)

a. Definisi

HACs dapat didefinisikan sebagai mikrosom yag dapat berperan sebagai

kromosom baru di dalam sel manusia dimana kromosom tersebut

mengandung beberapa gen baru untuk menimbulkan fungsi yang variatif

umumnya untuk menekan suatu penyakit.

b. Bentuk

HACs terdiri dari ori, sentromer, telomer (pelindung pada saat

pengulangan potongan DNA di bagian ujung kromosom agar terhindar

dari pemendekan selama mitosis), dan histon yang tersedia dari sel inang.

c. Penggunaan

Digunakan untuk membuat hewan transgenic sebagai model hewan

untuk penyakit manusia dan memproduksi produk terapetik.

Menggunakan kromosom 21HAC, peneliti mampu memasukkan virus

herpes simpleks –pengkode gen timidin kinase ke dalam sel tumor. gen

bunuh diri ini diperlukan untuk mengaktifkan banyak obat antivirus.

Sel-sel tumor yang ditargetkan ini sukses, dan selektif, diakhiri dengan

obat antivirus gansiklovir pada populasi termasuk sel-sel sehat.

Penelitian ini membuka berbagai peluang untuk menggunakan HACs

dalam terapi gen

Menggunakan kromosom 14 dengan menghilangkan telomere dan

urutan sub telomer dapat mengamplifikasi gen pengkode eritripoietin,

lebih dari 1000 kali lipat. Dapat digunakan sebagai terapi gen utuk

mengontrol eritripoietin pembentuk sel darah merah.

6. Ti Plasmid

a. Definisi

Tumor inducing plasmid (Ti plasmid) adalah DNA double stranded yang

ada pada Agrobacterium tumefaciens.

Ti plasmid adalah vektor alamiah yang digunakan untuk mentransfer DNA

ke dalam sel tanaman. Umumnya dapat menyebabkan tumor pada

tanaman yang disebut crown gall, terutama tanaman dikotil. Pada

sebagian besar Ti plasmid, terdapat lima kompleks gen, yaitu T-DNA

(bagian yang ditransfer dan menyatu dengan genom tanaman sehingga),

gen virulen (vir) yang terdiri dari 50 kilo-basa untuk mengatur proses

transfer T-DNA ke dalam DNA tanaman, gen tra/trb yang mengatur

perpindahan plasmid Ti antarbakteri, bagian yang mengatur sistem

replikasi plasmid, dan bagian gen yang mengkodekan molekul opin.

Molekul opin ini akan dihasilkan oleh jaringan tanaman yang terinfeksi

bakteri pembawa plasmid Ti.

b. Bentuk

c. Penggunaan

Vaksinasi menggunakan produk tanaman

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2014. Yeast Artificila Chromosomes and Their Applications. Available online at http://www.biotecharticles.com/Biotech-Research-Article/Yeast-Artifical-Chromosomes-YACs-and-their-Applications-158.html. [diakses pada tanggal 29 September 2014].

Gregory, Phillips., and Barbara, E. Funnell. 2004. Plasmid biology. ASM Press.

Ishani. 2014. Tumor Inducing Plasmids (Ti plasmid) of Agrobacterium. Available online at http://www.biotechnologyforums.com/thread1757.html. [diakses pada tanggal 28 September 2014].

Kakeda, M., et al. 2011. A new chromosome 14-based human artificial chromosome (HAC) vector system for efficient transgene expression in human primary cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 415 (3): 439–44.

Kazuki, Y., et al. 2011. Refined human artificial chromosome vectors for gene therapy and animal transgenesis. Gene therapy. 18 (4): 384–393.

Mejia, Jose et al. 2001. Functional Complementation of a Genetic Deficiency with Human Artificial Chromosomes. AJHG. 69 (2): 315–326.

Monaco, Anthony P., and Larin, Zoia. 1994. YACs, eACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools . BTECH. 1 (12): 280-282.

P. Zambryskit, et al. 1983. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. The EMBO Joumal. 2 (12): 2143–2150.