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Dirección General de Epidemiología

Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”

lineamientos para la vigilancia epidemiológicade rabia por laboratorio

Rabia-RNLSP/InDRE Página 1 de 96

Versión 01

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA POR LABORATORIO

DGE-InDRE–RNLSP 2015

Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos


Versión 01

PRIMERA EDICIÓN, 2015 RABIA-RNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE

CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL PARA LA

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY © INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS

PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA POR LABORATORIO”. VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2015. COLECCIÓN DE PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS “DR. MANUEL MARTÍNEZ

BÁEZ”. FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P. 01480, MÉXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO

http://www.indre.salud.gob.mx/


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SECRETARÍA DE SALUD

DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ SECRETARIA DE SALUD

DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER

SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD

DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD

LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ

SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS

DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD

LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA

COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS

DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO

DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS

TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y

HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD

LIC. RODRIGO REINA LICEAGA TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL

DR. NELLY AGUILERA ABURTO

TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO

LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL

DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN

DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL

DE ENFERMEDADES

DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD

DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS

DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA


Versión 01

LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD


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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS

“DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ”

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ

DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS

DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO

LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA

SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN

BIOL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS

M EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA

M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE PRUEBAS

M. EN C. BELÉN TORRES LONGORIA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA

QBP MIGUEL IGUALA VIDALES

JEFE DEL LABORATORIO DE RABIA

COORDINADOR DE LA RED DE LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO DE RABIA


Versión 01

GRUPO DE TRABAJO

QBP MIGUEL IGUALA VIDALES

JEFE DEL LABORATORIO DE RABIA

COORDINADOR DE LA RED DE LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO DE RABIA

M. EN C. BELÉN TORRES LONGORIA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA

DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE PRUEBAS

BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ

DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO

ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE

COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO


Versión 01

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA POR

LABORATORIO

DGE-InDRE–RNLSP 2015


Versión 01

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 9

ANTECEDENTE DE LA RED NACIONAL .................................................................... 10

RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA

EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA ..................................................................................... 10

MARCO LEGAL ............................................................................................................. 11

DEFINICIONES OPERACIONALES ............................................................................. 12

OBJETIVOS .................................................................................................................. 13

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA EL

DIAGNÓSTICO DE RABIA ........................................................................................... 14

ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA ............................................................... 15

FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE RABIA

DIAGNÓSTICO DE RABIA POR LABORATORIO ........................................................ 19

ESTÁNDARES DE CALIDAD ........................................................................................ 35

PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO .................................. 38

CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DE RABIA MEDIANTE

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ............................................................................. 41

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD ................................................................................... 41

BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................. 44

TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ......................................................................................... 47

TITULACIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES DEL CONJUGADO ANTIRRÁBICO

TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD)

TÉCNICA DE INMUNOHISTOQUÍMICA

PRUEBA BIOLÓGICA (PB)

INOCULACIÓN DEL VIRUS DE RABIA EN CÉLULAS DE NEUROBLASTOMA MURINO

CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES (ACMO)

TÉCNICA DE RETRO-TRANSCRIPCIÓN DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(RT-PCR)

LINEAMIENTOS PARA LA SOLICITUD DE INSUMOS DE RABIA ............................. 90


Versión 01

INTRODUCCIÓN

La rabia es una encefalomielitis de curso agudo que afecta a todos los mamíferos.

Entre los animales susceptibles hay especies que desempeñan un papel importante

para el mantenimiento del virus en la naturaleza, las cuales son denominadas

reservorios e incluyen animales silvestres como mapaches, zorrillos, zorros,

coyotes, chacales, mangostas y murciélagos; hematófagos, insectívoros y

frugívoros, y al perro como único reservorio doméstico.

La rabia es la zoonosis viral de mayor importancia en México, en donde la

transmisión de rabia canina ha disminuido drásticamente por la aplicación de

efectivos programas de control, principalmente en las zonas endémicas del país.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que la tasa de mortalidad anual

a nivel mundial es mayor a 55000. Sin embargo, se cree que podría ser hasta 100

veces mayor que la reportada oficialmente. Alrededor del 40% de los individuos

infectados son niños, por lo que la rabia se considera la séptima enfermedad

infecciosa global más importante. Asimismo, la amplia biodiversidad que

caracteriza a nuestro país ha permitido la presencia y el mantenimiento de los

diferentes ciclos enzoóticos de la rabia, presentándose además importantes

desplazamientos de las especies reservorios a otras áreas geográficas del país por la

intervención del ser humano, lo que complica radicalmente su estudio y control.

En México, el Programa Nacional de Zoonosis del Centro Nacional de Programas

Preventivos y Control de Enfermedades (CENAPRECE), la Dirección General de

Epidemiología (DGE) y el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos

“Dr. Manuel Martínez Báez” (InDRE) mantienen la vigilancia epidemiológica a

través de la implementación de diferentes estrategias para la prevención y control

de la rabia, en las que el diagnóstico de laboratorio es una actividad indispensable,

cuyo resultado permite fortalecer la calidad de la vigilancia epidemiológica y

monitoreo del virus rábico en las diferentes especies.

El presente documento establece los lineamientos de operación para la vigilancia

epidemiológica de rabia basada en el laboratorio e incluye: las funciones por

niveles; la toma, manejo y envío de muestras; la metodología para el análisis de

muestras (métodos tradicionales y métodos moleculares); la evaluación del

desempeño del personal así como el establecimiento de los estándares de calidad

en el diagnóstico.


Versión 01

ANTECEDENTE DE LA RED NACIONAL

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública

La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de

laboratorios para la vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han

permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de

resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de

recursos humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia

epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de

decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de

laboratorio en muestras biológicas.

La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el InDRE su órgano rector en el

área de vigilancia epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial

Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está

conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32

entidades federativas del país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).

El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en

16 redes de vigilancia específica.

RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA

EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA

Desde 1991, el laboratorio de rabia del InDRE, laboratorio nacional de referencia,

realiza el aseguramiento de la calidad a diferentes entidades federativas para la

técnica de inmunofluorescencia directa (IFD), con un criterio del envío de muestras

positivas y negativas de acuerdo a su concordancia y desempeño dentro de la Red

Nacional de Laboratorios para la vigilancia epidemiológica de rabia, la cual está

conformada por 24 entidades (Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Chihuahua,

Coahuila, Durango, Edo de México, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco,

Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí,

Sonora, Tamaulipas, Tabasco, Tlaxcala, Veracruz, y Zacatecas).

Existen otras instituciones que realizan el diagnóstico de rabia como son:

Secretaría de Agricultura, Ganadería, desarrollo Rural, Pesca y Alimentación

(SAGARPA), asociaciones ganaderas y escuelas de veterinaria.

En el año de 2006 la Red de rabia se incorporó al programa Caminando a la

Excelencia para evaluar el desempeño de las entidades respecto a los programas

prioritarios de la salud y fomentar su desarrollo mediante tres indicadores:

concordancia, cumplimiento y evaluación del desempeño.


Versión 01

En 2007 se prepararon y enviaron a cada laboratorio de la red dos paneles de

eficiencia por año para medir el indicador de evaluación del desempeño; estos

consistieron en el envío de material biológico previamente analizado en el

laboratorio de rabia del InDRE: muestras en fresco, laminillas previamente fijadas

y conjugado antirrábico.

Debido a los resultados obtenidos en el primer panel se realizó el primer curso de

actualización en IFD para el diagnóstico de rabia en el InDRE, lo que repercutió en

el mejoramiento de calificaciones para el segundo panel. En el segundo curso, que

desde entonces es anual, se establecieron los criterios y parámetros de evaluación

de competencia técnica, así como aclaración de dudas técnicas por parte de los

analistas. Es de suma importancia la asistencia de los especialistas en el

diagnóstico de rabia procedentes de cada entidad que conforman la red.

El laboratorio de rabia del InDRE ofrece a todo el personal involucrado con el

diagnóstico, cursos de capacitación, apoyo con reactivos y envío de muestras

control para los diferentes procesos de la metodología durante todo el año, tal

como lo indica el Manual para la Toma, Envío, y Recepción de Muestras para

Diagnóstico (REMU-MA-01).

El programa de salud pública veterinaria de la Organización Panamericana de la

Salud y la Organización Mundial de la Salud (OPS/OMS) recomienda realizar la

caracterización monoclonal de todos los casos de rabia que se registran en la

región, con la finalidad de fortalecer la vigilancia epidemiológica. En México, esta

actividad se realiza en colaboración con los Centros para el Control y Prevención de

Enfermedades (Centers for Disease Control and Prevention, CDC, por sus siglas en

inglés) de los Estados Unidos de América mediante la transferencia de tecnología y

la dotación de insumos necesarios no disponibles a nivel comercial.

MARCO LEGAL

1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF

05/02/1917, Última Reforma DOF: 15/02/2012.

2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y

141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF: 07/06/2012.

3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la vigilancia

Epidemiológica. DOF: 19/02/2013.

4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección

ambiental -Salud ambiental- Residuos peligrosos biológico-infecciosos -

Clasificación y especificaciones de manejo. DOF: 17/02/2003.


Versión 01

5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las

características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados

de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.

6. Norma Oficial Mexicana NOM-022-SSA2-2012. Para la prevención y control

de la brucelosis en el ser humano. DOF: 11/07/2012.

7. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y

funcionamiento de los laboratorios clínicos. DOF: 27/03/2012.

8. Lineamientos para los Programas de Evaluación Externa del Desempeño de

la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE-Secretaría de

Salud, 2014.

9. Criterios de Operación para la Red nacional de Laboratorios de Salud

Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2013.

10. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial

de la Federación. DOF: 12/12/2013.

11. Presidencia de la República. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario

Oficial de la Federación, DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx

12. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema

Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.

13. Norma Oficial Mexicana NOM-011-SSA2-2011. Para la prevención y control

de la rabia humana y en los perros y gatos. DOF: 08/12/2011.

DEFINICIONES OPERACIONALES

En el continente americano circula únicamente el serotipo I de los IV existentes, el

cual incluye 11 diferentes variantes antigénicas del virus de la rabia. Conforme a las

clases de notificación de enfermedades de la OMS, la rabia está considerada como

clase 2, es decir, enfermedad cuya notificación se exige de manera inmediata donde

quiera que se presente, de conformidad con las disposiciones jurídicas aplicables.

Asimismo, todo caso de rabia humana debe ser registrado en los establecimientos

para atención médica y notificarlo oportunamente al Sistema Nacional de

Vigilancia Epidemiológica (SiNaVE), estableciéndose las siguientes definiciones

operativas:

Rabia: Enfermedad infectocontagiosa, aguda y mortal que afecta al sistema

nervioso central, causada por un virus del género Lyssavirus y de la familia

Rhabdoviridae, presente en los fluidos de personas o animales susceptibles de

transmitir la enfermedad como son el perro, gato, murciélago, zorrillo u otro

animal.

Agresión: Acción por la cual una persona es atacada por un animal de forma

espontánea o provocada.

http://www.dof.gob.mx/


Versión 01

Animal silvestre: al animal que vive y proviene de hábitats naturales o en

cautiverio tales como quiróptero, zorro, zorrillo, mapache, coyote y otros

carnívoros.

Reservorio: A cualquier animal donde vive normalmente un agente infeccioso y

cuya presencia puede constituir un riesgo para la salud pública.

Diagnóstico: A los procedimientos encaminados a la identificación del virus

rábico mediante datos clínicos y pruebas de laboratorio.

Control: A la aplicación de medidas para una vigilancia epidemiológica estrecha

así como acciones encaminadas a disminuir la aparición de casos de rabia.

Exposición: A la acción por la cual una persona o animal susceptible entra en

contacto directo con un ambiente donde existe virus activo de la rabia.

OBJETIVOS

Objetivo general

Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico de

rabia así como el manejo adecuado de la información generada por laboratorio, a

través de la RNLSP, en apoyo a la vigilancia epidemiológica de esta enfermedad.

Objetivos específicos

Detectar la circulación del virus rábico en los diferentes especímenes

diagnosticados por la técnica de inmunofluorescencia directa (IFD).

Informar de manera inmediata por vía telefónica, electrónica y/o en papel a

las autoridades locales, estatales y al laboratorio de rabia del InDRE los

casos positivos.

Obtener calificaciones satisfactorias en los dos paneles de eficiencia que

reciben anualmente los laboratorios de la Red de rabia.


Versión 01

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE RABIA

Figura 1. Conformación de la red para el diagnóstico de rabia en México

LESP formalmente integrados a la red (24)

Entidades sin infraestructura para el diagnóstico en los LESP cuyas muestras son analizadas por el InDRE (BC, BCS, SIN, NAY, MICH, DF)

Estados con mínimo contacto con el InDRE (COL, YUC)


Versión 01

ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA

La Red Nacional de Laboratorios para la vigilancia epidemiológica de rabia está

encabezada por el laboratorio de rabia del InDRE, adscrito al departamento de

virología, e integrada por 24 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) a

través del diagnóstico por IFD.

Laboratorio de rabia, InDRE

(Laboratorio Nacional de Referencia)

Muestras para referencia Resultados

Laboratorios de diagnóstico de rabia (LESP), Comité Estatal para el Fomento y

Protección Pecuaria del Estado de Querétaro, San Luis Potosí, Campeche y

Yucatán, SAGARPA, (Redes Estatales de Diagnóstico).

Figura 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el Diagnóstico

de Rabia

Funciones de los integrantes de la Red de rabia

Funciones del Laboratorio Nacional de Referencia

Con el propósito de apoyar en la prevención o limitar la aparición de brotes rábicos

que tengan consecuencias de muy alto costo, el laboratorio de rabia del InDRE

realiza las siguientes funciones:

a) Coordinar la RNLSP del Sistema Nacional de Salud para la vigilancia

epidemiológica de rabia.

b) Realizar diagnóstico, aseguramiento de calidad y referencia a la Red Nacional

de Laboratorios para el Diagnóstico de Rabia, a través de una evaluación del

desempeño para IFD y caracterización antigénica.

c) Desarrollar la implementación de tecnología de vanguardia para el diagnóstico

de rabia en salud pública.

d) Proporcionar información epidemiológica en apoyo a los programas prioritarios

de salud para la toma de acciones y decisiones.

e) Tipificación antigénica y genética de las cepas circulantes en México.

f) Capacitar a los LESP en las diferentes técnicas utilizadas en el diagnóstico y

caracterización antigénica de rabia.

g) Realizar la captura de resultados en la base de datos INFOLAB de las muestras

que lleguen directamente al laboratorio de rabia.


Versión 01

h) Apoyar a los LESP que no cuenten con un laboratorio regional. Las muestras

biológicas; médula espinal, cerebelo y asta de Ammón deberán ser enviadas al

laboratorio de rabia del InDRE junto con el formato de envío, ver Anexo 1.

i) Todo el personal involucrado en el diagnóstico de rabia debe recibir

actualizaciones anuales, las cuales son impartidas en el marco del Foro

Nacional de Rabia.

El marco analítico del laboratorio de rabia del InDRE, tanto para el diagnóstico

como para la referencia es:

Técnica de IFD, prueba de fácil interpretación con más del 99% de

sensibilidad y especificidad. En la actualidad, es la prueba estándar para el

diagnóstico de rabia, según el manual de Meslin F. X.

Prueba Biológica (PB) para aumentar el título viral y reproducir la

enfermedad en muestras encefálicas como: encéfalo, líquido cefalorraquídeo

(LCR), saliva, biopsia de cuero cabelludo (BCC).

Caracterización antigénica con anticuerpos monoclonales (AcMo) para

confirmar la fuente de infección, para el control de brotes rábicos.

Inoculación del virus de rabia en células de neuroblastoma murino:

a. Ratificación de un diagnóstico negativo en casos en los que existan

agredidos.

b. Apoyo al diagnóstico en casos de humano y caracterización antigénica,

acortando el tiempo de 40 a 10 días con respecto a las pruebas in vivo.

c. Estandarización de la determinación de anticuerpos neutralizantes.

Titulación de anticuerpos neutralizantes. La determinación de estos

anticuerpos puede llevarse a cabo por la técnica de Inhibición de Focos

Fluorescentes (RFFIT) o por el Ensayo Inmunoenzimático (ELISA). Es

indispensable para el personal que labora en un área expuesta a rabia,

realizarse monitoreo de inmunidad cada 6 meses después de un esquema

preexposición, con un refuerzo anual de ser necesario, como lo establece la

guía actualizada de la OMS de profilaxis antirrábica pre y posexposición en

humanos.

La técnica de Retrotranscripción de la Reacción en Cadena de la Polimerasa

(RT-PCR) es la prueba base para el estudio molecular de cepas circulantes

en el país que ayuda a realizar una vigilancia tanto epidemiológica como

virológica.

o La secuenciación nucleotídica identifica con precisión al animal

reservorio responsable de mantener el ciclo enzoótico de la

enfermedad. El laboratorio de rabia del InDRE reportará al programa

de zoonosis la tipificación genética de las cepas circulantes en México

de un fragmento no menor a 400 pares de bases de esta región.


Versión 01

La técnica de inmunohistoquímica dRIT (Direct Rapid

Immunohistochemistry Test) está diseñada para fortalecer la vigilancia de

campo entre fauna sospechosa, particularmente apoya los programas de

vacunación nacionales, regionales, estatales o locales. El centro de

colaboración internacional, CDC, recomienda esta técnica para ser utilizada

como diagnóstico de rabia en campo, donde el territorio es accidentado y

lejano al laboratorio. Otra ventaja adicional de ésta prueba es el uso del

microscopio de luz blanca, la muestra es inactivada inicialmente al ser

sometida en formaldehído; pueden procesarse tejidos previamente inmersos

en este reactivo y el costo de esta técnica es económico.

Propuesta de actividades para los laboratorios regionales

Los laboratorios regionales con capacidad instalada para aislamiento viral en

células de neuroblastoma murino y/o ratones albinos CD1 destetados, recibirán de

los LESP asignados el 100% de las muestras positivas a rabia (médula espinal,

cerebelo y asta de Ammón), para su respectiva inoculación y caracterización

antigénica, así como un porcentaje de muestras negativas, establecidas por el

InDRE, con el objetivo de conocer a los reservorios y su distribución para

establecer tendencias y patrones de diseminación de la enfermedad, e implantar

sistemas de control de la rabia en reservorios silvestres.

Conformación de los laboratorios regionales:

Nuevo León (en proceso de implementación): Baja California, Baja

California Sur, Sonora, Chihuahua, Coahuila y Tamaulipas, Sinaloa, Durango

Zacatecas y San Luis Potosí.

Hidalgo: Guanajuato, Aguascalientes, Querétaro, Jalisco, Nayarit, Colima.

InDRE: Edo. de México, Michoacán, Guerrero, Morelos, Puebla, Veracruz y

Tlaxcala.

Chiapas: Campeche, Oaxaca, Tabasco, Yucatán y Quintana Roo.

1. Enviar el 100% de las muestras amplificadas y/o caracterizadas al InDRE

para realizar su respectiva genotipificación a través del secuenciamiento

nucleotídico. Se sugiere que el envío se realice el día martes de cada semana.

2. Tener una capacidad instalada para 50 muestras semanales, y contar con

dos personas para realizar el aislamiento viral.

3. El estándar del servicio para envío al InDRE debe ser del 100% de muestras

amplificadas y/o caracterizadas, que no rebasen los 30 días a partir de la

fecha de haberse recibido en el LESP.


Versión 01

Para la implementación de la técnica de inmunohistoquímica se seleccionaron

cinco entidades de la frontera norte del país: Sonora, Chihuahua, Coahuila,

Nuevo León y Tamaulipas, con la finalidad de fortalecer la vigilancia

epidemiológica binacional en campo.

Funciones de los Laboratorios Estatales de Salud Pública que realizan

el diagnóstico

Son 24 los LESP que llevan a cabo el diagnóstico de rabia, están ubicados en

Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Durango, Estado de

México, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Morelos, Nuevo León, Oaxaca,

Puebla, Querétaro, Quintana Roo, Sonora, San Luis Potosí, Tabasco, Tamaulipas,

Tlaxcala, Veracruz, Zacatecas y sus funciones son:

1. Realizar el diagnóstico de rabia utilizando un conjugado antirrábico que esté

validado comercialmente, de acuerdo con la técnica de IFD, indicada en el

manual de Meslin F. X., acerca de la cual el personal de los LESP ha recibido

capacitación en el InDRE.

2. Capacidad instalada de 20 a 30 muestras diarias en una jornada laboral de 8

horas, estándar del servicio de 24 a 48 horas, contando con dos personas para

realizar la técnica.

3. Capacitar al personal que llevará a cabo el manejo de la muestra y del

diagnóstico de rabia en la entidad, previa notificación al InDRE para que

también se programe su entrenamiento en la institución.

4. Para Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Durango,

Estado de México Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, Nuevo León, Puebla,

Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sonora, Tabasco, Tamaulipas,

Tlaxcala, Veracruz y Zacatecas se ha decidido la suspensión del control de

calidad para el diagnóstico de rabia por IFD a partir del 15 de abril del presente

año, así como la liberación del diagnóstico de rabia.

Es importante recalcar que la referencia de las muestras positivas seguirá

siendo del 100%.

5. Únicamente las entidades de Guerrero, Morelos y Oaxaca deberán enviar el

100% de sus muestras positivas y el 10% de muestras negativas.

6. Cualquier muestra de interés epidemiológico internacional, el InDRE será la

única institución nacional responsable de su envío, previa solicitud oficial de la

institución interesada.

Cada LESP deberá realizar la titulación de anticuerpos neutralizantes mediante

ELISA. Es indispensable para el personal que labora en un área expuesta a rabia,

realizarse monitoreo de inmunidad cada 6 meses después de un esquema

preexposición, con un refuerzo anual de ser necesario, como lo establece la guía

actualizada de la OMS de profilaxis antirrábica pre y posexposición en humanos.


Versión 01

Funciones del resto de los Laboratorios Estatales de Salud Pública

Existen siete entidades federativas que carecen de infraestructura para realizar este

diagnóstico; Baja California, Baja California Sur, Sinaloa, Nayarit, Colima,

Michoacán y Distrito Federal, lo que las obliga a depender directamente del

InDRE; en otras entidades el diagnóstico de laboratorio se realiza en laboratorios

de otras instituciones como, la SAGARPA, asociaciones ganaderas o escuelas de

veterinaria, por ejemplo Yucatán y Campeche, ello determina que en parte de las

muestras con resultado de diagnóstico presuntivo no se realice la tipificación

antigénica y genética correspondiente, lo que limita conocer con exactitud el tipo

de virus rábico circulante.

Como parte de las funciones de coordinación de la Red de rabia se notifica a todos

los LESP que el diagnóstico no puede ser subrogado a un tercero sin la notificación

por escrito y la autorización oficial por parte del laboratorio de rabia del InDRE.

DIAGNÓSTICO DE RABIA POR LABORATORIO Toma, manejo y envío de muestras biológicas para diagnóstico de rabia La toma y el envío de muestras para el diagnóstico de rabia debe realizarse como lo

indica el REMU-MA-01, dentro del paquete no se deben enviar muestras para otro

diagnóstico diferente a rabia, en caso de alguna duda comunicarse al laboratorio de

rabia del InDRE: teléfono 53427550, extensión 259.

Cuadro 1. Toma y envío de muestras para el diagnóstico de rabia

Muestra Toma de la muestra Condiciones para su

conservación

Biopsia de

cuero

cabelludo

Para el diagnóstico de rabia se debe tomar

una muestra de 5 mm3 proveniente del

cuero cabelludo en la región de la nuca.

Colocar en un recipiente hermético sin

ninguna solución.

Es indispensable enviar historia clínica

detallada y completa.

Mantener en refrigeración

de 4 a 8 °C y enviar de

inmediato.

Encéfalo

La toma de la muestra debe efectuarse por

personal médico capacitado, el cual seguirá

en forma rigurosa las condiciones de

asepsia. Para diagnóstico de rabia se

recomienda enviar los dos hemisferios

cerebrales o de lo contrario las regiones de

la médula espinal, cerebelo, asta de

Ammón y corteza cerebral de inmediato,

posterior al fallecimiento.

Los fragmentos no deben pesar menos de 5

g. En los casos en que no se autorice la

autopsia, la muestra debe tomarse de

El tejido debe enviarse

dentro de las primeras 24

h después de su extracción

manteniéndolo a

temperatura entre 4 y 8

°C. De no ser así se debe

mandar congelado y de

inmediato.

En el caso de especies

silvestres pequeñas enviar

el espécimen completo.

Nota: por ningún motivo


Versión 01

inmediato por punción retrorbital o a

través del orificio occipital esta técnica se

aplica igual en el caso de animales

domésticos o silvestres en los que se

sospeche encefalitis por virus de rabia. Es

indispensable enviar historia clínica

detallada y completa.

debe sumergirse el

encéfalo en solventes

como por ejemplo;

formaldehido, fenol,

alcohol.

Se debe mantener y enviar

en congelación y de

inmediato.

Hisopo

sublingual

Para el diagnóstico del virus de la rabia,

con hisopo de dacrón preferentemente o

en su defecto de algodón, tomar la muestra

introduciendo la punta del hisopo debajo

de la lengua, realizando un raspado suave

y suficiente en las glándulas salivales,

extraer el hisopo y sumergirlo en 2.0 mL

de solución salina o medio de transporte

estéril. Es indispensable enviar historia

clínica detallada y completa.

Para el diagnóstico del

virus de la rabia, se debe

enviar en un tubo con

tapón de rosca a una

temperatura de 4 a 8 °C.

Impronta de

córnea

Se deben tomar dos impresiones de la

córnea de cada ojo, utilizar un portaobjetos

previamente desengrasados con una

mezcla de etanol-éter (v/v). El material

debe ser suficiente para circunscribir dos

campos con el lápiz graso. Los

portaobjetos se deben secar al medio

ambiente por 30 min y colocarse en un

portalaminillas, si es posible fijar las

improntas con una solución de acetona fría

(-20 °C). Es indispensable enviar historia

clínica detallada y completa.

Para el diagnóstico del

virus de la rabia: los

portaobjetos se colocan en

un portalaminillas. No hay

que refrigerar el paquete,

pero sí protegerlo de la

humedad, la luz solar o del

calor excesivo.

Es importante evitar que

las improntas se froten

entre sí.

Líquido

cefalorraquídeo

(LCR)

Para el diagnóstico de rabia la toma de

muestra se debe efectuar en un hospital

por personal médico capacitado, el cual

debe seguir en forma rigurosa las

condiciones de asepsia. Obtener de 3.0 a

5.0 mL del LCR y colocarlos en un tubo

estéril con tapón de rosca.

De inmediato enviar la

muestra al laboratorio,

transportarla a


°C.

Saliva

Extraer con una jeringa sin aguja de la

región sublingual un volumen de 1.0 a 3.0

mL de saliva y recolectarla en un tubo

estéril con tapón de rosca.

De inmediato enviar la

muestra al laboratorio,

transportarla a


°C.


Versión 01

Suero

Esta muestra no es de valor diagnóstico,

únicamente se utiliza para el monitoreo de

la concentración de anticuerpos

protectores en las personas involucradas

laboralmente con el virus. Utilizar un tubo

sin anticoagulante, y enviar únicamente de

3.0 a 5.0 mL de suero que no debe estar

hemolizado, ni lipémico y se debe

conservar en refrigeración o congelado, a

menos que se dé otra indicación.

El suero se debe trasvasar

a un tubo estéril y enviarse

de inmediato al

laboratorio a temperatura

entre 4 y 8 °C.

Mamíferos

pequeños

Encéfalo, médula espinal, asta de Ammón

y cerebelo, en el caso de quirópteros se

debe enviar el espécimen completo

congelado y de ser posible para el caso de

zorrillos, zorros, lobos, coatís, gato montés,

puma, tlacuache, etc. acompañado de fotos

en formato electrónico y en papel, así

como su clasificación taxonómica, en caso

contrario, esta deberá ser realizada en el

InDRE.

Los especímenes deben

enviarse congelados

Cuando el personal de la RNLSP procese muestras de alta importancia

epidemiológica; como las de seres humanos en aquellas áreas sin presencia de

rabia en los últimos tres meses, o de especies silvestres en estado de

descomposición será necesario notificarlo por escrito al laboratorio de rabia del

InDRE, corroborándose dicha información con la fecha de procesamiento de origen

de la muestra.

Las muestras de encéfalo que se envíen para aseguramiento de calidad deberán

estar congeladas y contener las regiones anatómicas idóneas: médula espinal, asta

de Ammón y cerebelo, que hayan sido procesadas previamente por personal del

LESP. En muestras procedentes de quirópteros que envíen escasa cantidad es

necesario lo comuniquen por vía correo electrónico al jefe del laboratorio: QBP

Miguel Iguala Vidales [email protected], [email protected], para

evitar que las muestras sean rechazadas, se intentarán recuperar a través de la

técnica de cultivo celular en un lapso de tiempo máximo de 30 días.

En el caso de que algún laboratorio estatal pierda la liberación del aseguramiento

de la calidad por una mala calificación repetida en el panel de eficiencia, enviará el

100% de muestras positivas y el 5% de muestras negativas; debe enviar su

paquetería correspondiente los días lunes y martes de cada semana al laboratorio

de rabia del InDRE, de no ser posible se debe notificar oficialmente y de manera

inmediata su fecha de envío antes de 30 días de haber procesado las muestras

mailto:[email protected]



Versión 01

enviadas, estas deben venir acompañadas de su respectiva historia clínica y

formato de envío (anexos), cuidar que las muestras no vayan a derramarse y

manchar la papelería, porque serán rechazadas. La emisión de los resultados de las

muestras de control de calidad que se procesen en InDRE se realizará en un tiempo

de 4 días.


Versión 01

Figura 3. Toma de muestra de impronta de córnea

Figura 4. Toma de muestra de biopsia de cuero cabelludo

PORTALAMINILLA

MUESTRAS

NERVIO OPTICO

Se colocan en portalaminillas de plástico


Versión 01

Figura 5. Toma de muestra de hisopo sublingual

Figura 6. Toma de muestra de líquido cefalorraquídeo

ENVÍAR DE 3 A 5 mL EN CONDICIONES DE

REFRIGERACIÓN (ENTRE 4 Y 8 °C)

LA MUESTRA DEBERÁ SER TOMADA POR UN

ESPECIALISTA

LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO

HISOPO SUBLINGUAL

EL HISOPO SE COLOCA DENTRO DE UN TUBO DE ENSAYE CON 2.0 mL DE SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA Y/O SE RECOLECTAN DE 1.0 A 3.0 ML DE SALIVA CON UNA JERINGA SIN AGUJA EN UN TUBO ESTÉRIL CON TAPÓN DE ROSCA.

GUARDAR ENTRE 4 Y 8°C.


Versión 01

Figura 7. Toma de muestra de suero

Figura 8. Toma de muestra de cerebro

MUESTRA SIN VALOR DIAGNÓSTICO SOLO SIRVE PARA CONOCER EL GRADO DE PROTECCIÓN CONTRA INFECCIÓN DEL VIRUS

3.0 a 5.0 mL REFRIGERACION (ENTRE 4 Y 8 °C)

SUERO

CEREBRO

Axis

POR PUNCION RETRORBITAL En caso de no aprobarse

la necropsia

ENCÉFALO: MÉDULA ESPINAL CEREBELO ASTA DE AMMÓN

CORTEZA CEREBRAL

POR EL ORIFICIO OCCIPITAL

ENVIAR AL LABORATORIO DE RABIA DEL InDRE PARA DIAGNÓSTICO CEREBRO COMPLETO, PARA MUESTRAS PROCEDENTES DE ANIMALES ENVIAR MEDIO CEREBRO AL LABORATORIO DE REFERENCIA


Versión 01

Formato para el etiquetado de contenedores primarios y exteriores 1

Figura 9. Etiqueta del contenedor primario

Figura 10. Etiquetas “a, b, c y d” para el contenedor exterior

1 El Sistema Básico de Triple Embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C, si el tipo de muestra y ensayo lo requiere. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete.

FECHA: (toma de la muestra) No. DE MUESTRA: ______________________ ESPECIE: _____________________________ LOCALIDAD: __________________________ MUNICIPIO: __________________________ ESTADO: _____________________________

a)

b)

(d)

UN3373

(a)

Remitente: _________________

____________________________ ____________________________

TEL: _______________________

(b)

Destinatario: ________________

_____________________________ _____________________________

TEL: ________________________

(c) Persona responsable: _______

____________________________ ___________________________

TEL: _______________________


Versión 01

Figura 11. Etiquetas de orientación del contenedor exterior (2)

Figura 12. Contenedores primarios

Nombre: Orientación del paquete Dimensiones mínimas: 74x105 mm Para paquetes pequeños: 37x52.5 mm Color: negro y blanco, o bien rojo y blanco


Versión 01

Figura 13. Sistema de embalaje y contenedor para transporte en frío o en congelación

Contenedor primario

Hielera

Tapa de hielera

Etiqueta de orientación

B C

D

Caja de cartón

Certificado de calidad

A


Versión 01

Algoritmo diagnóstico

Figura 14. Algoritmo diagnóstico de rabia

Clave de tabulador para algoritmo diagnóstico. 1A7526001, identificación del virus

rábico en material encefálico e improntas de córnea por IFD.


Versión 01

Algoritmo para la inoculación intracerebral del líquido cefalorraquídeo, saliva e

hisopo sublingual de humano en ratón por PB clave del tabulador: 1A7526016 y

1A7526008


Versión 01

En el caso de que algún LESP pierda la liberación del aseguramiento de la calidad por una mala calificación repetida en el panel de eficiencia, enviará el 100% de muestras positivas y el 5% de muestras negativas y se aplicará el siguiente algoritmo:

Figura 15. Algoritmo de aseguramiento de calidad de rabia

Clave del tabulador para el algoritmo de aseguramiento de calidad 1A7526001 e

identificación del virus rábico en material encefálico e improntas de córnea por IFD


Versión 01

Figura 16. Algoritmo de referencia de rabia

Claves del tabulador para el algoritmo de referencia. 1A7526008; algoritmo para la

inoculación intracerebral de tejido encefálico y biopsia de cuero cabelludo en ratón

por PB, 1A7526010; algoritmo para la identificación de la variante antigénica del

virus de la rabia (ACMO),1A7526011; algoritmo para cultivo celular como prueba

confirmatoria para el virus rábico,1A7526012; algoritmo para identificación del

virus de la rabia por RT-PCR.


Versión 01

1A7526009; algoritmo de titulación de anti-IgG del virus rábico por ELISA.

Criterios de aceptación y rechazo

Criterios de aceptación

1. Se aceptarán las siguientes muestras biológicas:

a) Humanos (antemortem): Biopsia de cuero cabelludo, hisopo sublingual,

saliva, impronta de córnea, LCR y suero (solo para titulación de anticuerpos);

post mortem: Encéfalo, médula espinal, asta de Ammón y cerebelo.

b) Animales: encéfalo, médula espinal, asta de Ammón y cerebelo. En el caso de

quirópteros se debe enviar el espécimen completo congelado; de ser posible,

para el caso de zorrillos, zorros, lobos, coatís, gato montés, puma, tlacuache,

etc., acompañado de fotos en formato electrónico y en papel, así como su

clasificación taxonómica, en caso contrario esta deberá ser efectuada en el

InDRE.

2. Todas las estructuras del encéfalo deben ser enviadas en un frasco de plástico

con tapa de rosca, envuelta con Parafilm® alrededor de la tapa y perfectamente

etiquetadas.

3. Las muestras de encéfalo con más de 48 horas de haber sido obtenidas deberán

mantenerse congeladas hasta su arribo al laboratorio.

4. Las muestras de encéfalo con menos de 48 horas de haberse obtenido pueden

mantenerse almacenadas entre 4 y 8 °C hasta su llegada al laboratorio.


Versión 01

Criterios de rechazo

1. Muestras inadecuadas (diferentes a las establecidas)

2. Muestras derramadas

3. Muestra insuficiente

4. Muestras en estado de descomposición

5. Muestras no identificadas

6. Muestras sin oficio de petición, formato de envío (indispensable llenar el rubro

de vacunación) e historia clínica

7. Muestras para referencia o aseguramiento de la calidad que no cuenten con

resultado escrito y la firma del responsable del diagnóstico en la historia clínica

8. Muestras en formaldehído, fenol o alcohol

9. Tiempo de evolución, la muestra enviada al InDRE para diagnóstico de rabia

no debe rebasar los 30 días después de la muerte del ser humano o del animal.

Catálogo de rechazos

Cuadro 3. Catálogo de rechazos

Clave de rechazo Descripción

SHC Sin historia clínica

MC Mal capturadas

TV Tubo vacío

NLL No llegó muestra

MI Muestra inadecuada

TR Tubo roto

MIN Muestra insuficiente

SI Sin identificación

MD Muestras derramadas

TE Tiempo de evolución

MM Muestras mezcladas

NODOC No llegó información requerida

DE Datos erróneos

DI Datos de muestra ilegibles

FI Falta de información

MDM Muestra derramada y mezclada

MEE Muestra enviada por error

MH Muestra hemolizada

MPI Muestra para investigación interna


Versión 01

ESTÁNDARES DE CALIDAD

La funcionalidad de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnóstico de rabia

puede evaluarse en tres fases: 1) Preanalítica, 2) Analítica y 3) Postanalítica.

Fase pre-analítica

En la fase preanalítica se evalúa la oportunidad en la obtención de las muestras y

calidad de las mismas, hasta su llegada al laboratorio.

Indicador 1 (semestral)

Se habla de una muestra adecuada si esta cumple con los requerimientos de este

lineamiento en su sección de criterios de aceptación y rechazo, dependiendo del

tipo de muestra, en relación con la, cantidad de muestra biológica (suficiente),

temperatura de conservación y embalaje para el transporte.

Un indicador para evaluar esta fase es el índice de rechazo (IR) de muestras. El

punto de corte del mismo es que no rebase el 10%. El cumplimiento de este

indicador es indispensable para mantener la adecuada sensibilidad de la prueba.

Este indicador forma parte de los paneles de eficiencia.

El cálculo del indicador es el siguiente:

IR = X 100


El objetivo del diagnóstico es confirmar en una muestra representativa la presencia

del virus de la rabia, es decir la vigilancia virológica.

El número de muestras enviadas para aseguramiento de la calidad al InDRE deben

cubrir el 85% de las unidades antirrábicas u otra unidad de salud en cada entidad.

Para la determinación de este indicador en el InDRE se debe enviar en formato

electrónico, de forma mensual, la base de rabia (ver cuadro en Anexo 1) al siguiente

correo: [email protected]

Índice de

rechazo

0.5 a 1% Alarma, enviar documento de advertencia al área con

solicitud de respuesta inmediata con medidas correctivas

>2% No cumple, acción de corrección del centro antirrábico u

otra unidad de salud que envía la muestra y mediante

correo electrónico, oficio paralelo al director del

Laboratorio Estatal de Salud Pública. Se espera que esta

medida sea corregida en las 2 semanas siguientes



Versión 01

Se notificará por oficio cuando la entidad rebase la meta establecida por el

programa nacional de zoonosis nacional en cuanto al número de muestras de perro

procesadas por laboratorio para diagnóstico de rabia.

% de muestreo de centro antirrábico /unidad de salud =

Criterios de evaluación

Porcentaje de

muestreo de algún

centro antirrábico u

otra unidad de

salud

>85%

Evaluar la correlación con la presencia de casos

positivos en centros antirrábicos u otras unidades

de salud. Cobertura de meta adecuada

60-85%

Llamar y enviar oficio al LESP del estado para

discutir problemática y definir proceso para

corrección de mejora, la cual debe implementarse

y demostrar corrección en 2 semanas

<60%

Visita inmediata de auditoria al LESP para

discutir problemática y definir proceso de

discusión y firma con el director o subsecretario

de los servicios de salud, así como con el

responsable del programa de zoonosis en el

estado y se documentará mediante oficio

Fase analítica

Comprende todo el flujo de muestra dentro del proceso analítico y se utilizarán dos

indicadores: 1) desempeño técnico y 2) oportunidad del proceso analítico.

El indicador de desempeño técnico se obtiene mediante el envío de paneles de

eficiencia (dos veces por año), el cumplimiento de la cédula de verificación en

visitas de supervisión (una vez al año), la concordancia con las muestras enviadas

para secuenciación y el cumplimiento con las bases del sistema vectorial de

caminando a la excelencia.


Índice de desempeño técnico

Concordancia=

Solo aplica para los laboratorios que no tiene liberado el aseguramiento de la

calidad.


Versión 01

Evaluación del desempeño = x 100

Supervisión

= X100


Índice de

desempeño

ponderación

>90% Sobresaliente

70 a 89%

Satisfactorio: Se indican medidas correctivas para

mejora, que se deberán cumplir en un tiempo mínimo

de 2 meses y se observan con continuidad del

diagnóstico.

50 a 69%

Mínimo. Se suspende el diagnóstico por 6 meses y se

dan recomendaciones a cumplir. Se evalúa de nuevo al

término de ese tiempo para saber si se reincorpora a la

red de diagnóstico. Se envía oficio al director del LESP

correspondiente.

<50%

Precario. No se incorpora a la red de diagnóstico o se

suspende el diagnóstico por un año hasta llegar al nivel

satisfactorio. Se envía oficio al director del LESP

correspondiente.

Fase postanalítica

El indicador de fase postanalítica, emisión de resultado, el cual medirá el tiempo

transcurrido entre el término del análisis por IFD y el reporte de resultados. Todos

los laboratorios que realizan el diagnóstico de rabia para esta red deben informar el

tiempo entre la recepción de la muestra, procesamiento, captura y envío de

resultados dentro de las primeras 24 horas de terminado el proceso.


Para la determinación de este indicador en el InDRE se debe enviar mensualmente

en formato electrónico la base de rabia (ver cuadro en anexo 1) a la siguiente

dirección de correo electrónico: [email protected]

Oportunidad en la emisión de resultados = Fecha de emisión del resultado

de la muestra − Fecha de recepción de la muestra en el laboratorio



Versión 01


Oportunidad en

la emisión de

resultados

0 a 1 día Adecuado

2 a 3 días

Alarma, se solicita informe y medida de corrección al

director del LESP, por escrito, para cumplir en

tiempo y forma en una semana. Si persiste el

problema, se suspende el diagnóstico por 2 semanas

y se notifica por escrito al director del LESP

>3 días

Crítico, se revisa el área y se otorga un período de

una semana para corrección y de continuar, se

suspende el diagnóstico y se notifica por escrito al

director del LESP

El seguimiento de los indicadores en el InDRE se lleva a cabo por la Dirección de

Servicios de Apoyo en coordinación con el área coordinadora de la RNLSP y serán

revisados semanalmente, excepto el de desempeño técnico que se evalúa

semestralmente.

Captura de datos y resultados Los tiempos establecidos para la emisión de los resultados por parte del laboratorio

de rabia del InDRE serán los establecidos en el programa de INFOLAB y son los

siguientes:

a) IFD 3 días hábiles.

b) Caracterización antigénica (se mantienen en observación a los ratones por un

lapso de 30 días), tipificación genética, inmunohistoquímica, cultivo celular,

RT-PCR y secuenciamiento genética, 30 días naturales. Titulación de

anticuerpos mínimo 30 días.

PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO Para la evaluación del desempeño se establecieron los ensayos de aptitudes, que

constituyen una herramienta de aseguramiento de la calidad, la cual permite a los

laboratorios monitorear su desempeño, comparar sus resultados con laboratorios

similares, evaluar la competencia en el desarrollo de sus pruebas e identificar áreas

de oportunidad.

Dentro de los ensayos de aptitud se encuentran los Programas de Evaluación

Externa del Desempeño (PEED), herramienta que utiliza el InDRE para la

evaluación continua de la competencia técnica y la identificación de necesidades de

fortalecimiento de un individuo, de un grupo de laboratorios o de las redes de

diagnóstico específico mediante el envío a intervalos regulares continuos de

paneles de muestras caracterizadas.

El tiempo de envío de los resultados contará a partir del día en que sea recibido el

paquete en el LESP de cada entidad (el lapso de tiempo máximo para recoger sus


Versión 01

paquetes en nuestras instalaciones será de 24 horas), por lo que se solicita enviar

junto con el formato de resultados, la copia de la guía con la fecha de recepción del

paquete a su LESP, o notificar al laboratorio de rabia por vía telefónica o por correo

electrónico cuando sea recibido dicho panel. La fecha límite máxima para recibir

resultados será de una semana a partir de la fecha de envío del panel, siempre y

cuando establezcan comunicación previa con el laboratorio de rabia del InDRE, de

lo contrario se emitirá una calificación reprobatoria

Reprobatoria

Los criterios están basados en la de Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012,

Para la vigilancia epidemiológica y la Norma Oficial Mexicana NOM-011-SSA2-

2011, Para la prevención y control de la rabia humana y en los perros y gatos.

El laboratorio de rabia del InDRE guarda hasta 15 días las muestras a partir de la

fecha de envío del panel de resguardo que se envía en forma simultánea a la red,

para cualquier aclaración posterior.

Paneles de eficiencia para IFD, aplica en la red de los laboratorios

estatales, y la caracterización antigénica que aplica en los

laboratorios estatales que funcionarían como regionales para esta

técnica

Los laboratorios de la red de rabia recibirán semestralmente un panel de eficiencia

y con base en los resultados obtenidos se evaluará su desempeño y se definirá si se

libera el diagnóstico, por lo menos deben obtener el 85% en la calificación.

Concordancia entre 85 y 100%, se mantiene este tipo de evaluación.

Concordancia menor al 85%, se requiere comprar un nuevo panel.

Concordancia no aceptable en el segundo panel, se requiere de capacitación

y establecer nuevamente el envío de muestras para realizar diagnóstico en el

InDRE.

En la actualidad el LESP del estado de Hidalgo es el único que realiza la técnica de

caracterización antigénica desde el año 2006. A partir del mes de febrero del 2010

emite los resultados de caracterización antigénica de manera oficial a sus

respectivas autoridades estatales.

El LESP Hidalgo debe enviar trimestralmente al laboratorio de rabia del InDRE sus

resultados de caracterización antigénica así como el 100% de sus muestras para

referencia.

Es importante señalar que las muestras enviadas para referencia deberán ser

remitidas junto con su respectiva muestra aislada en cerebro de ratón (aquellas

donde sea posible el aislamiento) en un solo envío y no por separado.


Versión 01

En el envío del segundo panel de IFD se enviará simultáneamente otro panel para

caracterización antigénica dando un lapso de dos días más para enviar sus

resultados oficiales (de la fecha establecida para enviar resultados de IFD se

prolonga dos días más).

Criterios para la liberación del diagnóstico de rabia mediante

inmunofluorescencia directa

La liberación del diagnóstico será otorgada a los LESP que cumplan con cada uno

de los siguientes criterios:

1. Comprobar que se cuenta con la infraestructura necesaria para implementar

y mantener el diagnóstico.

2. Obtener una calificación promedio anual de los dos Paneles de Evaluación

Externa del Desempeño (PEED) mínima de 8.5.

3. Tener constancia de capacitación o actualización en IFD emitida por el

InDRE, con un máximo de 5 años de vigencia; cursos anuales o asistencia al

InDRE, con una calificación final mínimo de 9.0 durante la capacitación o

curso.

4. A los LESP que aplique (Guerrero, Morelos y Oaxaca), obtener como mínimo

el 90% de concordancia en el control de calidad mensual enviado al InDRE,

completando un total de envío de 300 muestras a partir de la vigencia de

estos lineamientos.

La liberación del diagnóstico de rabia otorgada por el InDRE se puede

suspender si el LESP:

1. Obtiene una calificación menor a 80% en los paneles de eficiencia en dos

ocasiones consecutivas (incluyendo el panel que compre el LESP). El LESP

tendrá la responsabilidad de enviar al laboratorio de rabia del InDRE su

plan de acción. El InDRE solicitará al LESP implemente de nuevo el control

de calidad, enviando el 5% de las muestras negativas y el 100% de las

positivas durante 6 meses, también se programará una visita al LESP para

evaluar sus instalaciones, equipo y metodología; finalmente solicitará se

recapacite al personal responsable del diagnóstico de rabia en el InDRE por

un lapso de una semana.

2. A los LESP que aplique (Guerrero, Morelos y Oaxaca), si obtienen una

calificación menor a 90% en el control de calidad mensual enviado al

InDRE, se programará una visita al LESP para evaluar sus instalaciones,

equipo y metodología; finalmente solicitará se recapacite al personal

responsable del diagnóstico de rabia en el InDRE por un lapso de una

semana.


Versión 01

Banco de material biológico

El objetivo del banco de muestras biológicas es mantener todos los especímenes

recibidos en el laboratorio, dentro de un orden y conservación, a través de un

etiquetado que incluye el número asignado en el laboratorio, su origen,

procedencia, especie y año; estas se resguardan en ultracongeladores a -70 °C para

su control interno, el etiquetado facilita el manejo e identificación cuando son

solicitadas por el resto de las áreas internas del laboratorio.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Actividad ene feb mar abr may jun jul ago sep oct nov dic

Envío del primer

panel a la RNLSP - - - - XX - - - - - - -

Recepción de

resultados en el

InDRE

- - - - XX - - - - - - -

Envío de resultados

a la RNLSP - - - - XX - - - - - - -

Curso InDRE Rabia - - - - - - - XX - - - -

Envío del segundo

panel a la RNLSP - - - - - - - - - - XX -

Recepción de

resultados en el

InDRE

- - - - - - - - - - XX -

Envío de resultados

a la RNLSP - - - - - - - - - - XX -

El envío de los paneles, la recepción de información y resultados se enviará por

medio de correo electrónico y por paquetería.

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Las medidas de bioseguridad, deben seguirse obligatoriamente, en virtud del riesgo

de infección durante la manipulación del animal o de las muestras tomadas.

Incluso, se deben extremar precauciones cuando se intenta aislar el virus por

inoculación en animales de experimentación o en cultivos celulares, ya que durante

el desempeño de estas metodologías, existe el riesgo de la generación de aerosoles.

Así mismo, no debe omitirse el peligro de infección con objetos punzocortantes que

contienen material biológico potencialmente infeccioso, ni por salpicaduras en las

mucosas ocular u oral, o en la piel con lesiones. Además, se debe considerar que las

muestras procesadas durante la rutina pueden contener otros agentes patógenos

que atacan el sistema nervioso central. Por lo tanto, se debe:


Versión 01

Trabajar en un laboratorio exclusivo para el diagnóstico de rabia.

Usar batas de manga larga, guantes gruesos, careta y cubrebocas.

Descontaminar las mesas antes, durante y al final de la jornada, con una

combinación de por lo menos dos de las siguientes soluciones: detergente al

1%, yodo al 7%, alcohol al 70%, sales cuaternarias de amonio diluidas 1:500

o benzal.

No usar cristalería, materiales de plástico e instrumental que se encuentre

rayado o roto.

Sumergir durante 12 horas en alguna de las soluciones citadas en el punto 3

y esterilizar en autoclave a 15 libras/pulg2 durante 30 minutos todo el

material reutilizable empleado para la manipulación o procesamiento de

tejidos.

Descontaminar el suelo por lo menos una vez al día.

Desechar tejidos y material contaminado dentro de bolsas amarillas

etiquetadas con el símbolo de peligro biológico infeccioso, que de acuerdo

con la norma SEMANART-087 se deben incinerar no después de 48 horas

de almacenamiento.

Colocar en bolsas del mismo tipo pero de color rojo, guantes, cubrebocas y

gasas previamente desinfectados.

Al medir el volumen de cualquier solución con una pipeta, nunca se debe de

succionar con la boca.

Dentro del laboratorio queda estrictamente prohibido fumar, aplicarse

cosméticos, beber, conservar o consumir alimentos.

Lavarse siempre las manos y quitarse la bata al salir del laboratorio.

La preparación de la suspensión viral para la prueba biológica, la infección

de cultivos celulares y el manejo de cultivos celulares infectados, debe

realizarse en un gabinete de bioseguridad nivel II.

Cualquier herida causada por un accidente de laboratorio debe ser lavada

suavemente con agua y jabón, evitando traumatizar los tejidos.

Aplicar alguno de los desinfectantes antes mencionados excepto benzal. Si el

accidente involucró algún material u objeto contaminado con tejido

potencialmente infectado, inmediatamente aplicar un refuerzo de la vacuna

antirrábica para humanos. El número de dosis dependerá de la gravedad de

la lesión. Cualquier duda puede consultarse con los encargados del

Programa Nacional de Zoonosis a los teléfonos 26 14 64 68 y 26 14 64 70 de

la Coordinación de Vigilancia Epidemiológica o en la Norma Oficial

Mexicana NOM-011-SSA2-2011, Para la prevención y control de la rabia

humana y en los perros y gatos. Debe considerarse que la aplicación de

gamma globulina está contraindicada en las personas que han recibido

tratamiento pre o postexposición, ya que bajo estas circunstancias puede


Versión 01

retardarse e incluso inhibirse la producción de anticuerpos.

De acuerdo con las recomendaciones para la inmunización profiláctica

preexposición, propuestas en el sexto informe de expertos en rabia de la

OMS en 1973, la protección se logrará con la aplicación de tres dosis de

vacuna antirrábica a intervalos de 7 días: 0, 7 y 21 o 28 días según el

fabricante. La determinación de anticuerpos se hará después de 3 semanas.

Si la concentración de anticuerpos es menor de 0.5 UI/mL se aplicará un

refuerzo y los anticuerpos nuevamente se determinarán después de 3

semanas. Según la OMS, la determinación de anticuerpos debe efectuarse

cada 6 meses aun cuando las vacunas de cultivo celular inducen protección

que puede durar de 1 a 3 años. El riesgo y la variabilidad del estado inmune

de cada persona hacen necesaria la determinación de anticuerpos,

continuamente.

La manipulación de sueros humanos se debe realizar con todas las medidas de

bioseguridad para el manejo de material potencialmente infectado con el virus de la

inmunodeficiencia humana (HIV) o con el de hepatitis B. Bioseguridad en

Laboratorios, Manual de Bioseguridad.

Infraestructura y bioseguridad para los Laboratorios Estatales de

Salud Pública miembros de la Red de Rabia

Los LESP deben contar con la infraestructura necesaria para la realización del

diagnóstico de rabia, así como con un área exclusiva destinada a este fin con un

nivel de contención tipo II y el siguiente, equipo para este fin: gabinete de

bioseguridad tipo II, un microscopio de epifluorescencia, incubadora, refrigerador

y ultracongelador. Los sistemas de suministro de aire pueden ser instalados,

siempre y cuando no interfieran con los flujos de aire de los gabinetes de

bioseguridad, además de instalarse lejos de puertas y ventanas. Considerar

sistemas con flujo interno sin recirculación a espacios fuera del laboratorio.


Versión 01

BIBLIOGRAFÍA

1. Baer M. G. The natural history of rabies, 2a. Ed. CRC, Press. Boca Raton, Fla.

1991.

2. Beltrán FJ, Dohmen FG, Del Pietro H, Cisterna DM. Diagnosis and molecular

typing of rabies virus in simples stored inadequate conditions. J Infect Dev

Ctries 2014; 8(8):1016-1021 doi:10.3855/jidc.4136.

3. Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Biomedicina 4ª. Ed. CDC –

NIH 2006.

4. Blenden D., Creech W., Torres-Anjel M. Use of immunofluorescence

examination to detect rabies virus antigen in the skin of humans with clinical

encephalitis. J. Infect. Dis. 1986.154: 698-701.

5. Bourhy H., Sureau P. Métodos de laboratorio para el diagnóstico de la rabia.

Instituto Pasteur. Paris. 1993.

6. Pathak S, Horton DL, Lucas S, Brown D, Quaderi S, Polhill S, Walker D,

Nastouli E, Núñez A, Wise EL, Fooks AR, Brown M. Diagnosis, management

and post-mortem findings of a human case of rabies imported into the United

Kingdom from India: a case report. Virol J. 2014; 7:11:63 doi: 10.11861743-

422X-11-63.

7. Dean D.J., M. K. Abelseth, P. Atanasiu. The Fluorescent Antibody Test. 1996

p.88-95.

8. De Mattos Carlos. De Mattos Cecilia. Técnicas moleculares para caracterización

del virus rábico. OPS y OMS, 1996.

9. Jackson Alan and Wunner W.H. Rabies. Second Edition. Associates Press.

2007.

10. Manual de Bioseguridad en Laboratorio 3a. Edición. OMS. 2005.

11. Manual para la Toma, Envío y Recepción de Muestras para Diagnóstico

(REMU-MA-01) editado por el InDRE, México 2014.

12. Meslin F. X., M. M. Kaplan and H. Koprowsky. Laboratory Techniques in

Rabies. 4th ed. World Health Organization. Geneva; 1996.

13. Weir DL, Annand EJ, Reid PA, and Broder CC. Recent Observations on

Australian Bat Lyssavirus tropism and viral entry. Viruses 2014; 6:909-926;

doi: 10.3390/v6020909.

14. Rupprecht C. E., Glickman L. T., Spencer P. A., Wiktor T. J. Epidemiology of

rabies virus variants. Differentiation using monoclonal antibodies and

discriminant analysis. Am. J. of Epidemiol. 1987.126:298-309.

15. Velasco-Villa, A., Orciari, y col. Molecular Epizootiology of rabies associated

with terrestrial carnivores in México. Virus Research 2005. 111: 13-27.

16. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal

medical diagnostic laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012.


Versión 01

17. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement/Vol. 60;

2011.

18. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of

Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.

19. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical

Laboratories – 5th ed. CDC-NIH; 2009.

20. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk

management standard. Brussels: CEN; 2011.

21. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual – 3rd ed. Geneva:

WHO Press; 2004.


Versión 01

ANEXOS


Versión 01

TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

Titulación de anticuerpos neutralizantes del conjugado antirrábico

La titulación del conjugado antirrábico tiene como propósito determinar la dilución

de trabajo del producto biológico.

Esto se logra al encontrar una buena sensibilidad de 4+ a la dilución máxima del

conjugado, en la cual se puede detectar sin posibilidad de error cualquier forma en

la que se encuentre el antígeno del virus de la rabia: cuerpos obloides (acúmulo de

proteína N), polvo antigénico. Así mismo, en dicha dilución la inespecificidad del

conjugado debe ser nula sobre la impronta negativa.

Procedimiento

1. Limpiar la mesa con una solución de etanol-benzal v/v colocar papel estraza.

2. Marcar 7 portaobjetos con 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64 y 1:128 y

desengrasarlos con una solución de éter/alcohol etílico 1:2.

3. Preparar el encéfalo de un roedor con positividad de 4+.

4. Hacer una impronta de aproximadamente 1.0 cm de diámetro en el

portaobjetos rotulado con la dilución 1:2, hacer lo mismo hasta el marcado

con 1:128; hacer lo mismo con una muestra de cerebro negativa.

5. Colocar los portaobjetos en una rejilla y después en una caja para tinción

con acetona a -5 o -10 °C durante 10 minutos, secar al medio ambiente.

6. Circunscribir las improntas con un lápiz graso de color o marcador de

pintura permanente de color blanco y de secado rápido.

7. Colocar dos series de 7 tubos rotulados con 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64 y

1:128.

8. Agregar a cada tubo 100 µL de agua destilada estéril.

9. Reconstituir el conjugado con el volumen de agua destilada estéril que

indique el fabricante.

10. Agregar al primer tubo de cada serie (marcado como 1:2) 100 µL de

conjugado, homogenizar y pasar al siguiente tubo (marcado como 1:4) 100

µL de esa dilución. Este proceso se repite hasta el tubo marcado como 1:128.

11. Colocar una gota de la dilución 1:2 en una de las improntas positivas y hacer

lo mismo con la dilución 1:2 en la otra impronta negativa. La gota debe

cubrir toda la superficie de la impronta circunscrita con el marcador; los

pasos se repiten hasta la dilución 1:128.

12. Incubar las preparaciones a 37 °C durante 30 minutos en una cámara

húmeda.

13. Colocar los portaobjetos en una rejilla y lavar rápidamente 3 veces con

regulador de fosfatos (PBS) pH 7.4. Colocar nuevamente en una caja de

tinción con PBS pH 7.4 limpio y lavar agitando manualmente durante 3 min.

14. Hacer otro lavado con agua destilada, agitando manualmente durante 3 min.


Versión 01

15. Repetir una vez más los dos pasos anteriores.

16. Colocar las preparaciones en la caja de tinción con Azul de Evans al 0.02%,

teñir durante 5 min, algunos conjugados ya contienen el colorante por lo que

se suprimiría este paso.

17. Tirar el agua con el colorante y colocar agua limpia en la caja de tinción.

Enjuagar agitando durante 40 segundos y secar al aire.

18. Agregar una gota de glicerina amortiguada a pH 8.4 sobre cada impronta y

colocar un cubreobjetos.

19. Leer en un microscopio de epifluorescencia a 400 aumentos; objetivo 40X y

ocular 10X, comenzando por la dilución 1:2 de las improntas, si se observa

exceso de fluoresceína en el tejido se procede a observar la siguiente

dilución.

20. La dilución óptima del biológico es aquella donde se observa una

fluorescencia específica 4+ (90 % de afinidad específica), polvo antigénico e

hilos a una intensidad verde manzana muy brillante 4+ en el fluorocromo,

mientras que en la correspondiente negativa no se debe de observar

fluorescencia alguna. El color rojizo del fondo sirve como colorante de

contraste a la fluorescencia emitida por el fluorocromo.

21. Una vez que se determinó la dilución óptima, el conjugado se debe

almacenar en alícuotas para evitar congelar y descongelar el reactivo ya que

esto provoca baja afinidad específica del mismo.

Interpretación de resultados

Las muestras evaluadas con este conjugado muestran que en una dilución 1/32 las

lecturas se mantienen con los parámetros de 4+ para la fluorescencia específica y

4+ para la intensidad del fluorocromo, mientras que en la dilución 1/64 la

intensidad del fluorocromo baja, aunado a que no existe fluorescencia inespecífica

en el control negativo, esto indica que la dilución óptima del reactivo es 1/32.


Versión 01

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/512

1-09

(negativo) - - - - - - - -

25-09-VAg-8 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ -

334-09-VAg-

11* 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ 2+/1+

8374-08-

VAg-8 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ 2+/1+

1767-08-VAg-

9 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ 2+/1+

1770-08-VAg-

9 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ -

9022-07-

VAg-9 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ -

Fluorescencia específica/intensidad de fluorocromo

Aquellas diluciones donde no se observaron células, son debido al desprendimiento

en los lavados ya que la adherencia de la membrana celular al cristal es débil.

Técnica de inmunofluorescencia directa (IFD)

Principio del método

Detectar por medio de IFD epítopos de la proteína N del virus de la rabia por

interacciones inmunoenzimáticas mediante mezclas de anticuerpos monoclonales

conjugados a fluoresceína.

Sistema de muestra primaria

Postmortem

1. Encéfalo completo

2. Asta de Ammón

3. Hipocampo

4. Cerebelo

5. Bulbo raquídeo

6. Médula espinal

Antemortem

1. Biopsia de cuero cabelludo

2. Hisopo sublingual

3. Líquido cefalorraquídeo


Versión 01

Para obtener el encéfalo de las muestras primarias antemortem se someten a un

método de aislamiento del virus de la rabia en ratón lactante antes de realizar la

IFD.

En casos muy particulares, las muestras de improntas de córnea que no pertenecen

a encéfalo como el método lo indica en sistema de muestra primaria, previamente

fijadas en acetona a -5 o -20 °C durante 10 min, se integran al paso 14 del

desarrollo de la técnica de IFD que se describe a continuación.

Tipo de contenedor y aditivos

Todas las muestras deben ser enviadas conforme al manual de toma y envío de

muestras (REMU-MA-01) 2012, apartado “Manual para la Toma, Envío y

Recepción de Muestras para Diagnóstico”

www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html

Objetivo

Identificar antígenos proteicos del virus mediante mezclas de anticuerpos

monoclonales conjugados a fluoresceína de todo el sistema de muestras primarias.

Especificaciones de desempeño

Parámetro Criterio Resultado Cumple

Sensibilidad 99.9%

100% Sí

Especificidad 99.9%

100% Sí

VPP 100% Sí

VPN 100% Sí

Índice de correlación 1 Sí

Incertidumbre En métodos cualitativos

no aplica (Conjugado)

-------

Equipo e instrumentos de medición

Micropipeta de 50-1000µL

Micropipeta de 2-20 µL

Micropipeta de 20-200 µL

Balanza granataria

Incubadora

Refrigerador

http://www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html


Versión 01

Ultracongelador -20 °C

Ultracongelador -70 °C

Microscopio de epifluorescencia

Potenciómetro

Materiales

Tijeras y pinzas de disección

Tubo con tapa de rosca de 1.8 mm de diámetro y capacidad de 4.0 mL

Portaobjetos biselados

Cubreobjetos

Abatelenguas de madera

Algodón

Guantes de exploración (látex)

Matraz Erlenmeyer de 4.0 L

Vasos de precipitados 2.0 L

Espátulas

Gradilla

Gasas

Marcador indeleble sin alcohol

Papel absorbente

Puntas para micro-pipeta de 20 µL, 200 µL y 1000 µL

Contenedores con porta laminillas para tinción

Cámara húmeda para laminillas

Pizetas de 250 mL

Jarra de pastico de 2.0 L

Lápiz graso

Lápiz punta de diamante

Reactivos y materiales biológicos

Alcohol etílico (C2H6O)

Éter etílico

Agua destilada

Acetona (CH3)2CO

Solución germicida de uso quirúrgico; cloruro de benzalconio

Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4•H2O)

Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4•12 H2O)

Cloruro de sodio (NaCl)

Hidróxido de sodio (NaOH)

Ácido clorhídrico (HCl)


Versión 01

Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)

Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)

Glicerina para microscopía de fluorescencia

Anticuerpos monoclonales conjugados a fluoresceína, 1 vial, FITC, Anti-

Rabies Monoclonal Globulin (lyophilized, reconstitute with 5.0 mL destiled

water), FDI, FUJIREBIO DIAGNÓSTICS, Inc.

Mezcla de tres anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína N del

virus de la Rabia conjugados a fluoresceína, 1 vial, RABIES DFA REAGENT

(CONCENTRATE) 5.0 mL. LIGHT DIAGNOSTICS.

Preparación de soluciones

a) Solución amortiguadora de fosfatos (PBS) pH 7.4

Pesar: 0.157 g de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 H2O), 1.98 g de fosfato de

sodio dibásico (Na2HPO4 12 H2O) y 8.1 g de cloruro de sodio (NaCl), para tener el

NaH2PO4 H2O a 1.5 mM, el Na2HPO4 12H2O a 14 mM y el NaCl al 0.85%.

1. Disolver los reactivos en 700 mL de agua destilada.

2. Ajustar el pH a 7.6 con NaOH o HCl concentrados según se requiera y aforar

a un litro.

3. Si sólo se dispone de Na2HPO4 7H2O entonces se pesarán 1.48 g para un litro

y 5.92 g para 4 litros.

b) Medio de glicerina para montaje, pH 8.4

Solución I: 0.879 g de KH2PO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL con agua

bidestilada.

Solución II: 1.149 g de K2HPO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL con agua

bidestilada.

1. Mezclar 1.0 mL de la solución I y 10 mL de la solución II.

2. Tomar 10 mL de la mezcla y colocarlos en un matraz aforado de 100 mL para

ajustar el pH a 8.4.

3. Aforar con glicerina neutra (Chemicon Ligth Diagnostics No. Catálogo 5013)

agitar y dejar reposar 24 h antes de utilizarse.

c) Azul de Evans al 2% (colorante de contraste)

Pesar 2 g de Azul de Evans, disolver y aforar a 100 mL con agua bidestilada.

Mantener ésta solución en frasco ámbar a temperatura ambiente.

d) Solución desinfectante de etanol al 70% en benzal

Medir 700 mL de alcohol absoluto o 729.16 mL de etanol al 96%

Aforar a 1.0 L con benzal comercial.


Versión 01

Procedimiento del método de IFD

1. Encender el gabinete de bioseguridad como indica el instructivo.

2. Desinfectar la base interna del gabinete de bioseguridad con la solución

desinfectante y colocar un papel absorbente sobre la superficie de trabajo.

3. Etiquetar las muestras que se van a analizar y los viales para almacenar

muestras, marcar un portaobjetos por espécimen a analizar. Si las muestras

son humanas, etiquetar tres viales uno para prueba biológica, otro para

aislar y propagar el virus y poder realizar su caracterización con anticuerpos

monoclonales y un tercero para el banco de muestras del laboratorio.

4. Preparar un vaso de precipitado de 50 mL con solución desinfectante y un

recipiente con torundas de algodón.

5. Preparar abatelenguas para colocar los cortes de tejido y cortar papel

absorbente para quitar el exceso de tejido de las improntas.

6. Sacar el encéfalo del recipiente y colocarlo de forma tal, que se identifiquen

claramente las circunvoluciones de ambos hemisferios.

7. Hacer un corte profundo a lo largo de la primera circunvolución. Separar la

corteza e identificar el asta de Ammón hacia la base. Esta región del encéfalo

se observa de color blanco nacarado y al hacer un corte transversal sobre ella

se descubre un centro rosado o rojo, colocar el corte de canto en un

abatelenguas.

8. Realizar cortes del cerebelo y de la médula seleccionando porciones de la

región central colocándolos sobre el abatelenguas.

9. Limpiar las pinzas y tijeras de disección con algodón impregnado de

solución desinfectante entre muestra y muestra. Esperar hasta que se seque

el exceso de solución desinfectante y procesar la siguiente muestra.

Nota: El algodón en torunda utilizado se desecha en bolsa amarilla por

contener tejido patológico infeccioso.

10. Hacer una impresión del canto interno del tejido (de aproximadamente 0.5

cm de diámetro) de cada región anatómica seleccionada (médula, cerebelo y

asta de Ammón).

11. Quitar el exceso de tejido con un pedazo de papel absorbente, presionando la

impronta y dejar secar al aire.

12. Llevar a cabo los pasos del 5 al 11 para preparar el testigo positivo. Este debe

tener una cantidad de antígeno de 4+ (90% de antígeno por campo).

13. Colocar los portaobjetos en la rejilla de una caja de tinción con acetona a -5 o

-20 ºC durante 10 minutos.


Versión 01

14. Reconstituir el conjugado a la dilución de trabajo previamente descrito. En

esta etapa el conjugado debe haber sido previamente titulado y almacenado

en alícuotas.

15. Sacar los portaobjetos en acetona de la caja de tinción y dejar secar.

16. Circunscribir las improntas con un lápiz graso de color o tinta indeleble para

delimitar las áreas de las improntas.

17. Agregar a las tres improntas 15 µL de conjugado de manera que cubra toda

la impronta.

18. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda por 30 min a 37 °C.

19. Colocar los portaobjetos en una rejilla y lavar con PBS pH 7.6, agitando

manualmente por 1 min, si son de 1-15 laminillas y 3 min si son de 16-30

laminillas.

20. Repetir el paso anterior cambiando el PBS, dependiendo de la cantidad de

muestras procesadas es decir un minuto para 1-15 laminillas y 3 min si son

de 16 a 30 laminillas.

21. Repetir los pasos 19 y 20 colocando agua destilada.

22. Colocar las preparaciones en una caja de tinción y agregar Azul de Evans

hasta una concentración final de 0.02%. Teñir las preparaciones en esta

solución durante 2 min, en caso de usar conjugados con Azul de Evans

omitir este punto.

23. Descartar el agua con el colorante y añadir agua destilada limpia, enjuagar

agitando durante 40 segundos.

24. Dejar secar las preparaciones y agregar una gota de glicerina tamponada pH

8.4 sobre cada impronta y colocar un cubreobjetos para cubrir todas las

improntas.

25. Leer en un microscopio de epifluorescencia con el objetivo 40X, revisando

primero el testigo positivo, donde debe observarse fluorescencia específica

en un 90% de los campos, mientras que en el testigo negativo se debe

observar únicamente un fondo rojizo obscuro (esto depende de la cantidad

de colorante de contraste usado), si los testigos positivo y negativo dan la

reacción esperada, es indicio de que la actividad del conjugado se encuentra

en condiciones óptimas.

26. Después de la lectura colocar los portaobjetos en el recipiente de desechos

punzó-cortantes. El papel estraza se desecha en la bolsa amarilla.

27. Desinfectar el gabinete de bioseguridad con la solución desinfectante.

Interferencias

Los anticuerpos monoclonales de los que consta el conjugado antirrábico para la

IFD, son generados por hibridomas productores de anticuerpos específicos contra

la proteína N del virus de la rabia, la muestra biológica utilizada para la prueba es

encéfalo, esto hace prácticamente nula la interferencia o reacción cruzada en el


Versión 01

método y la titulación del conjugado asegura captar muestras con baja cantidad de

antígeno RAB-M-3/0.

Intervalo biológico de referencia

El conjugado antirrábico ya titulado debe de tener un intervalo de aceptación el

cual no debe ser menor de 4+ en la dilución 1:2 del biológico concentrado.

Intervalo reportable

Negativo o positivo.

Valores de alerta críticos

La obtención de una prueba positiva en un intervalo de 1+/4+ es de notificación de

manera inmediata a la institución solicitante del servicio.

Interpretación por el laboratorio

En una muestra declarada como positiva observamos la presencia de cuerpos

ovoides de color fluorescente verde manzana intenso en su perímetro y

fluorescencia débil en el centro del cuerpo ovoide, el polvo antigénico se puede

manifestar en una cantidad que va de 1+/4+ de antígeno por campo. Por lo tanto,

una muestra es declarada como negativa en ausencia de formas de color

fluorescente verde manzana.

Cuando se observan estructuras pequeñas circulares con forma de cocos o en fila,

un contorno redondo definido y una fluorescencia intensa color verde manzana con

un patrón regular sin coloración en el centro, es posible que la muestra esté

contaminada con bacterias, principalmente Staphylococcus aureus; esta bacteria

produce una proteína que tiene afinidad por la región cristalizable (Fc) de cualquier

anticuerpo (proteína A del Staphylococcus aureus), por lo que el conjugado se pega

en toda su superficie definiendo claramente el contorno de la misma, esta muestra

se declara como inadecuada.

Se puede llegar a observar otro tipo de luminosidad, por ejemplo: en animales con

moquillo se observan inclusiones amorfas y abundantes de color amarillo, la

acumulación de insecticidas neurotrópicos se observan como cristales de

coloración que varía de rojos a amarillos.


Versión 01


Figura 17. Resultados positivos por inmunofluorescencia directa

Figura 18 Resultado negativo por inmunofluorescencia directa


Versión 01

Figura 19. Imágenes de los cortes representativos indicados en el diagnóstico por

IFD


Versión 01

Técnica de inmunohistoquímica


La prueba directa rápida inmunohistoquímica (dRIT) es un procedimiento

diseñado como una técnica presuntiva para la IFD, de acuerdo al procedimiento

operativo estándar nacional para el diagnóstico de la rabia en animales.

Puede ser utilizada para fortalecer la vigilancia de campo entre fauna sospechosa,

particularmente apoyando los programas de vacunación nacionales, regionales,

estatales o locales.

La dRIT no debe ser usada para vigilancia en salud pública, en aquellas situaciones

en las que exista exposición humana o veterinaria, se debe contactar

inmediatamente a las autoridades estatales en salud pública.

Procedimiento para la recolección de cerebro o médula espinal para la

prueba de dRIT

1. Hacer una línea media ventral desde la sínfisis de la mandíbula a varios

centímetros caudalmente más allá de la laringe.

2. Separar la musculatura de la lengua rostralmente en ambos sentidos,

procediendo caudalmente para liberar la laringe, tráquea, pulmones y

corazón en una pieza (como si se preparara para remover el tirón o lengua,

esófago, tráquea, pulmones y corazón en una pieza) y exponer retraída la

superficie ventral de la columna vertebral y musculatura asociada.

3. Palpar para identificar la articulación Atlanta-occipital y disecar para

exponer el tejido conectivo duro localizado en la superficie ventral de la

articulación. A pesar de ser duro, el tejido conectivo es delgado y cubre

directamente el tejido cerebroespinal y la médula espinal.

4. Con la punta de la hoja de bisturí, cortar cuidadosamente a través del tejido

conectivo, pero no la médula espinal y trabaje con la punta del bisturí hacia

abajo ambos lados de la articulación, mientras dobla la misma para tener un

mejor acceso. El tejido cerebral y espinal puede luego ser separado caudal y

rostralmente tanto como sea posible para producir un tejido nervioso

adecuado para la realización de las pruebas de rabia.

5. Las muestras deben ser colocadas en viales de tapa rosca, de preferencia

irrompibles (no vidrio) u otros contenedores disponibles, como latas de

ungüento.

6. Debe ser indicada, muy bien, la información de la muestra (como tipo de

especies, número único de identificación, ubicación del animal, etc.).

7. Las muestras deben ser refrigeradas o congeladas durante su

almacenamiento y transporte hasta que sean analizadas.


Versión 01

Para evitar contaminación cruzada de la muestra, cada uno de los especímenes

deben ser manipulados en un área de trabajo limpia y con guantes desechables y

nuevos. Todos los instrumentos utilizados en la necropsia, disección y preparación

de las láminas deben de ser eliminados adecuadamente. Los instrumentos que no

van a ser usados deben de estar en un almacén cerrado, y solo los instrumentos que

van a ser utilizados en el procesamiento de cada una de las muestras deben ser

abiertos. Todas las muestras cerebrales positivas deben ser enviadas al InDRE

como control de calidad y para su posterior referencia.

El laboratorio de rabia del InDRE, estableció los formatos de llenado de resultados

de dRIT de las muestras que se procesen por esta técnica: informe trimestral y

formato de envío.

Estructura de la bandeja de tinción Tissue-Tek y recambio de reactivos

Platos de tinción: I II III IV V VI VII VIII IX y X

Formalina TPBS al 3% TPBS dH2O hematoxilina dH2O

Peróxido de hidrógeno

Número de plato de tinción:

I. Cambio de formalina después de 2 corridas o una semana

II. Cambio de TPBS con cada prueba

III. Cambio de peróxido de hidrógeno al 3% con cada prueba

IV. Cambio de TPBS con cada prueba

V. Cambio de TPBS con cada prueba

VI. Cambio de agua destilada y desionizada (dH2O) con cada prueba

VII. Cambio de hematoxilina una vez por semana

VIII. Cambio de agua destilada y desionizada (dH2O) con cada prueba

IX. Cambio de agua destilada y desionizada (dH2O) con cada prueba

X. Cambio de agua destilada y desionizada (dH2O) con cada prueba

Preparación de reactivos para tinción

I. Formalina al 10% amortiguada; listo para usar.

II. Fosfato salino amortiguado con Tween-80 (TPBS) al 1%. TPBS (PBS con 1%

Tween-80) = 990 mL de PBS + 10 mL Tween-80. Agitar hasta que Tween-80

esté completamente disuelto.

III. Peróxido de hidrógeno 3% listo para usar.

IV. TPBS.

V. TPBS.

VI. Agua destilada y desionizada dH2O; lista para usar

VII. Hematoxilina. Formulación Gills #2 diluida 1:2 con agua destilada. El plato de

tinción debe contener 250 mL de solución; 125 mL hematoxilina + 125 mL agua

desionizada.


Versión 01

VIII. Agua destilada y desionizada (dH2O)

IX. Agua destilada y desionizada (dH2O)

X. Agua destilada y desionizada (dH2O)

Técnica de tinción streptavidin-biotin peroxidasa para el diagnóstico

del virus de la rabia.

Soluciones

a) Sustrato peroxidasa: amino-etilcarbizol (AEC) solución stock

Reactivos

Sustrato AEC, SIGMA no. A6926

N, N Dimetil formamida GR, EM Science

Materiales

Pipeta de vidrio Pyrex de 5.0 mL

Jarra Wheaton 8.0 mL

1. Disolver una tableta de 20 mg de 3-amino 9-etil carbazol (AEC) en 5 mL de

N, N dimetil formamida en la jarra Wheaton de vidrio (marcar “AEC stock” y

fechar).

2. La solución AEC Stock debe ser almacenada en el refrigerador de 4 a 8 °C

hasta por 2 meses.

Solución de trabajo: preparar fresca con cada prueba justo antes de teñir las

láminas.

b) Dilución de AEC de trabajo

Reactivos

Amortiguador acetato 0.1 M, pH 5.2

AEC Stock (ver arriba)

Peróxido hidrógeno al 3%

Materiales

Pipeta Pyrex de 1.0 mL

Pipeta plástica de10 mL

Pipettor (200 Fl)

Puntas de pipeta (200 Fl)

Filtro de jeringa de 0.45 Fm


Versión 01

Jeringa de 10 mL

Tubo de centrífuga (2) de 15 mL

1. Añadir 7.0 mL de amortiguador acetato al tubo de centrífuga de 15 mL

usando una pipeta plástica de 10 mL.

2. Añadir 0.5 mL de solución stock AEC (arriba) usando la pipeta de vidrio

Pyrex de 1.0 mL.

3. Añadir 0.075 mL (75 fl) de peróxido de hidrógeno al 3.0%.

4. Filtrar la mezcla usando la jeringa de 10 mL con el filtro de jeringa (0.45 fm)

dentro del tubo de centrífuga de 15 mL por separado. Una vez hecha la

mezcla, ésta solo es estable por 2 a 3 horas.

Procedimiento

1. Efectuar impresiones por toque de rutina en tejido nervioso sospechoso en

láminas de vidrio para microscopio marcadas; incluidos estándares positivos

y controles negativos.

2. Secar las láminas por 5 min a temperatura ambiente.

3. Sumergir las láminas en formalina amortiguada al 10% a temperatura

ambiente, Plato I.

4. Remover y enjuagar las láminas de 5 a 10 veces para eliminar cualquier

exceso fijado de amortiguador TPBS; PBS con Tween 80 al 1%, Plato II.

5. Sumergir las láminas en peróxido de hidrógeno al 3% por 10 minutos, Plato

III.

6. Remover el exceso de peróxido de hidrógeno enjuagando las láminas en

TPBS, Plato IV.

7. Transferir las láminas al siguiente enjuague, Plato V; después de sumergir,

sacudir el exceso de amortiguador y secar los excesos de los bordes de la

lámina, bordeando la impresión, trabajar con una lámina a la vez, dejar las

demás sumergidas en el TPBS.

8. Incubar las láminas en una cámara de humedad. Por ejemplo, puede utilizar

la tapa de plástico a 96-pozos u otra cobertura simple sobre las láminas, en

una toalla de papel humedecida, sobre un banco de laboratorio a

temperatura ambiente con anticuerpo-biotinilado primario antirrábico mAb

por 10 minutos, añadir suficiente cantidad del anticuerpo primario por

goteo hasta cubrir la impresión.

9. Después de la incubación agitar para eliminar el conjugado excedente.

Sumergir y enjuagar las láminas con TPBS, Plato V, sacudir el exceso de

amortiguador y secar los excesos de los bordes de la lámina, bordeando la

impresión. Puede usar el mismo amortiguador para lavar.

10. Incubar las láminas con el complejo streptavidina-peroxidasa, añadir

suficiente complejo a la lámina por goteo hasta cubrir la impresión en una


Versión 01

cámara de humedad a temperatura ambiente por 10 minutos. Después de la

incubación eliminar el exceso sacudiendo.

11. Sumergir-enjuagar las láminas con TPBS, Plato V, sacudir el exceso de

amortiguador y secar los excesos de los bordes de la lámina, bordeando la

impresión.

12. Incubar las láminas con sustrato peroxidasa, amino-etilcarbizole (AEC),

preparar la dilución de trabajo justo antes de usar, ver preparación de

sustrato peroxidasa AEC solución STOCK más abajo en el documento.

13. Añadir suficiente sustrato a la lámina por goteo hasta cubrir la impresión, en

una cámara de humedad a temperatura ambiente por 10 minutos. Después

de la incubación eliminar el exceso sacudiendo.

14. Sumergir-enjuagar las láminas en agua desionizada y destilada, Plato VI.

15. Contra-teñir con hematoxilina Gills; diluido 1:2 con agua desionizada y

destilada por 2 minutos, Plato VII.

16. Inmediatamente sumergir-enjuagar la tinción con agua desionizada y

destilada, Plato VIII.

17. Hacer una segunda ronda de sumergir-enjuagar con agua desionizada y

destilada, Plato IX para asegurar remover el exceso de tinción.

18. Transferir las láminas a agua fresca destilada, Plato X. Montar las láminas

con medio cobertor soluble en agua y cubrir-deslizar, trabajar con una

lámina a la vez, eliminar el exceso de agua destilada y desionizada

sacudiendo y secar los excesos de los bordes de la lámina respetando la

impresión. No permitir que las láminas se sequen al aire antes de cubrir-

deslizar. Si se tiñen múltiples láminas, ellas deben permanecer en el agua

desionizada y destilada antes de cubrir-deslizar.

19. Observar las láminas con un microscopio de luz usando un objetivo 20X

para barrer el campo y con objetivo 40X para inspección de alto poder, el

antígeno del virus de la rabia aparece como inclusiones rojas contra el fondo

azul neuronal.

20. Registrar resultados.

Lectura y registro de resultados

Una prueba puede ser considerada negativa para rabia cuando el tejido

cerebral o medular es observado más allá de 40 campos con un aumento de

aproximadamente 200X o mayor para inclusiones.

Resultados de la prueba intensidad de la tinción/distribución antigénica. El

virus de la rabia en el cerebro de animales infectados produce inclusiones

intracitoplasmáticas de varias formas ver figuras 17 y 18.

Un solo campo de microscopio puede contener numerosas masas y cuerdas

ovales o circulares.


Versión 01

Cuando se tiñen específicamente con anticuerpo biotinilado, el sustrato

AEC, una vez oxidado, forma un producto final rosa-rojo. La contra-tinción

hematoxilina produce un tejido azul y fondo nuclear. El AEC es susceptible a

la luz excesiva y puede decolorarse en intensidad, por lo que debe

almacenarse en la oscuridad.

Las observaciones efectuadas en cada lámina de prueba son registradas en

una hoja de resultados según su intensidad/distribución antigénica.

La intensidad de tinción se gradúo de +4 a +1. Las láminas control positivas

en todas las pruebas deben contener óptimamente tinciones de intensidad

+4. Una intensidad escasamente disminuida, una leve pérdida de color se

gradúa como +3 y puede ocurrir en láminas positivas para rabia cuando la

manipulación de las láminas no ha sido la adecuada.

Una tinción notablemente deslustrada se clasifica como +2 a +1 y no puede

ser considerada como diagnóstica de infección por rabia sin una

confirmación específica. Así como la disminución de la intensidad de la

tinción puede ser resultado de la desnaturalización del antígeno del virus de

la rabia, también puede ser resultado de una unión no-específica del

anticuerpo a los componentes del tejido inflamado o artefactos de la

descomposición del tejido.

Distribución antigénica

Para cada cerebro examinado, la tinción se clasifica dependiendo de la carga de

antígeno presente como sigue:

a) +4 infiltraciones masivas de inclusiones largas y pequeñas que varían en

forma, en casi toda el área de impresión.

b) +3 inclusiones de tamaño y forma variable son encontrados en casi todo el

campo microscópico, el número de inclusiones por campo varía, pero son

numerosas en todos los campos.

c) +2 inclusiones de tamaño y forma variable están presentes en el 10 al 50%

de los campos microscópicos y algunos contienen solo algunas inclusiones.

d) +1 inclusiones de tamaño y forma variable están presentes en menos del 10%

de los campos microscópicos y sólo se encuentran algunas inclusiones por

campo, usualmente 1-2 por campo.

Interpretación de la prueba

Si la muestra de tejido fue adecuada para el diagnóstico de rabia, los resultados

para un animal analizado son reportados como positivo o negativo para rabia:

a) Prueba completa o no diagnóstico.

b) Prueba indeterminada basada en patrones de tinción observados en las

láminas de prueba y control.


Versión 01

a) Prueba completa/resultado reportable:

Los resultados de la prueba son reportados si las siguientes observaciones fueron

realizadas.

Controles de la prueba: Tanto acumulaciones de antígeno grandes y

pequeñas en láminas control positivas con intensidad +4 y distribución de

antígeno +3 a +4. No está presente la tinción en láminas control negativas.

Muestras de la prueba: No se notó deterioro de tejido o alteración cuando las

láminas fueron preparadas. Las muestras son claramente negativas; tinción

no específica en láminas de prueba o claramente positivas; al menos +3 a +4

de intensidad y +2 a +4 de distribución de antígeno en láminas hechas de

puente cerebral y médula espinal.

Todas las muestras positivas de virus de rabia deberán ser enviadas al InDRE para

su control de calidad y posterior referencia.

Figura 20. Improntas de muestras de cerebro infectadas con el virus de la rabia,

sometidas a la técnica de dRIT, con diferentes intensidades del virus: A) impronta

con intensidad: 1+, B) impronta con intensidad: 2+, C) impronta con intensidad:

3+, D) impronta con intensidad: 4+.

A B

C D


Versión 01

Figura 21. Impronta negativa al virus de la rabia

Prueba biológica (PB)


Ésta prueba se aplica en todas las muestras de seres humanos donde se refiere

encefalitis y en los que exista el antecedentes de posible infección por el virus

rábico. Otro aspecto importante ligado a lo anterior que debe de considerarse para

realizar ésta prueba, es que la muestra analizada por IFD haya sido negativa. La

condición anterior sugiere, que la cantidad de virus rábico presente en este tipo de

muestras pudiera estar por debajo de los límites inferiores de detección de la

prueba. Por lo que al inocular una suspensión de estas muestras en el encéfalo de

los ratones lactantes, se incrementará la cantidad de virus que originalmente

estaba presente, debido a la replicación del virus dentro de las neuronas del ratón,

lográndose su detección mediante IFD.

El procedimiento de la PB involucra la inoculación del virus por vía intracerebral a

ratones albinos, suizos de tres días de edad. A los 28 días en promedio, aunque

puede ser hasta los 40 días de vida, se debe observar parálisis; pelo erizado y

encorvamiento. Cuando estos signos se presentan, los ratones se sacrifican y se

realiza la prueba de IFD en el encéfalo del ratón.

En la actualidad, el aislamiento viral a partir de cultivos de células del

neuroblastoma murino es una buena alternativa para realizar la prueba biológica,

ya que estas células son más susceptibles a la infección y el resultado se pude

obtener en 48 horas (Kaplan y Meslin 1996).

Materiales

Algodón

Aplicadores de madera

Botellas para cultivo de tejidos de 25 cm2

Botellas para cultivo de tejidos de 75 cm2


Versión 01

Cámara de Neubauer

Cámara húmeda para laminillas

Contenedores con porta laminillas para tinción

Crio-tubos de polipropileno de 5.0 mL con tapón de rosca

Cubreobjetos

Espátulas

Gasas

Gradillas

Gradillas para crio-tubos

Guantes de látex para exploración

Jarra de plástico de 2.0 L

Jeringas de 3.0 mL


Papel absorbente

Pipetas desechables de 2, 5, 10 y 25 mL

Pizetas de 250 mL

Portaobjetos con teflón de 2, 4, 8 y 12 pozos

Puntas para micro-pipeta de 20 µL, 200 µL y 1000 µL

Tijeras y pinzas de disección

Tubo eppendorf de 2.0 mL

Unidades de filtración de 500 y 1000 mL

Vasos de precipitados 2.0 L


Acetona (CH3)2CO


Agua destilada

Alcohol etílico (C2H6O)

Antibiótico y antimicótico 100X, frasco 100 mL

Anticuerpos monoclonales conjugados a fluoresceína, 1 vial, FITC, Anti-

Rabies Monoclonal Globulin (lyophilized, reconstitute with 5.0 mL destiled

water), FDI, FUJIREBIO. DIAGNÓSTICS, Inc. Este biológico debe titularse

previamente RAB-M-003/0

Bicarbonato de sodio al 7.5%, frasco con 100 mL

Cloruro de sodio (NaCl)

D-MEM en sales EARLE, con L-Glutamina sin piruvato ni bicarbonato de

sodio, frasco: 1 X 10 L

Éter etílico

Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)


Versión 01

Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)

Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4 12 H2O)

Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 H2O)

Glicerina para microscopia de fluorescencia


L-Glutamina 200 mM100X, frasco con 100 mL

Solución de vitaminas MEM100X frasco con 100 mL

Solución germicida de uso quirúrgico (cloruro de benzalconio)

Suero fetal bovino

Tripsina al 2.5%, frasco con100 mL

Versenato de sodio al 0.05%, frasco con 500 mL

Desarrollo

Diluyente para las suspensiones virales

3.0 g de albúmina sérica bovina fracción V

5.0 mL de penicilina-estreptomicina; 100,000 U/mL-50 g/mL

respectivamente, en 100 mL de agua bidestilada estéril.

Preparación de la muestra

1. Tomar un fragmento de tejido de encéfalo o biopsia de 0.5 g de peso y

colocarlo en un tubo con 2.5 mL del diluyente para suspensión viral y

mezclar perfectamente.

2. Centrifugar la suspensión a 2500 rpm durante 15 min a 5 °C.

3. Separar el sobrenadante y usarlo para la inoculación intracerebral de los

ratones lactantes de tres días.

4. El volumen restante se guarda a -70 °C en un vial bien sellado e identificado

con una etiqueta que contenga el número de registro de la muestra, la fecha

de preparación de la suspensión y la naturaleza del tejido utilizado (encéfalo

o biopsia).

Llenado de las jeringas

1. Cargar una jeringa de tuberculina de 1.0 mL, con la suspensión viral.

2. Colocar la jeringa dentro de un tubo de ensayo que contenga algodón en el

fondo e insertar la aguja penetrando el algodón. Sacar las burbujas de aire

que estén atrapadas con golpes muy suaves y empujando el émbolo con el

dedo índice sobre el cuerpo de la jeringa.

Técnica para sujetar al ratón

El procedimiento requiere de habilidad manual que se obtiene con la práctica.

1. Tomar el ratón por la parte distal de la cola con los dedos índice y pulgar.


Versión 01

2. Posterior a ello tomar al ratón por la base de la cola con la articulación de la

primera y la segunda falanges del dedo anular o meñique liberando el dedo

índice y pulgar los que sujetarán de las orejas al ratón inmovilizando la

cabeza y el cuello.

Procedimiento de inoculación intracerebral del ratón

1. Tomar al ratón como se describió en la técnica de sujeción, con la mano libre

sostener la jeringa manteniendo el bisel hacia arriba.

2. Inocular en el punto medio de una línea imaginaria trazada mentalmente del

ojo a la oreja.

3. Introducir la aguja dentro del cráneo en ángulo recto, entre la mitad y la

base de este. Inocular aproximadamente 0.03 mL de la suspensión.

4. Inocular a 6 ratones por muestra. Si una vez inoculada la camada con más de

seis miembros, se mueren dos o tres antes de los siete días, la muestra se

debe inocular de nuevo.

5. Depositar la jeringa junto con la aguja en el contenedor de punzocortantes

con hipoclorito.

6. Mantener en observación a los ratones durante 21 días como mínimo;

aquellos que mueren dentro de las primeras 24 a 48 horas se consideran

fuera de la prueba, ya que éstos pudieron haber muerto por traumatismo.

7. Extraer la masa encefálica de los ratones que mueren entre 7 y 21 días si

presentan los siguientes signos: temblores, incoordinación, pelo erizado,

parálisis y postración.

8. Efectuar la prueba de IFD, buscando la presencia de antígenos del virus

rábico.


Versión 01

Figura 22. Prueba biológica

Inoculación del virus de rabia en células de neuroblastoma murino


Replicar el virus de la rabia en línea celular (neuroblastoma murino) de muestras

en donde el virus es insuficiente para detectarse por IFD o difícil de amplificar en

PB.

Desarrollo

A. Preparación de la muestra

1. Preparar una suspensión al 20% de cada muestra problema con medio

mínimo esencial modificado por Dulbeco (D-MEM) al 10% como sigue:

Rotular un tubo para crioconservación de 5.0 mL con tapón de rosca, con el

número de muestra, estado de procedencia, especie del animal infectado y la

fecha de procesamiento.

2. Agregar 4.0 mL de medio D-MEM al 10% al tubo.

Nota: Si la muestra es escasa agregar al menos 2.0 mL de medio D-MEM


Versión 01

3. Colocar un fragmento del tejido, disgregarlo con el uso de 2 aplicadores.

4. Centrifugar el tubo a 2500 rpm. durante 15 minutos a 4 °C y colectar el

sobrenadante

5. El sobrenadante puede ser usado inmediatamente o puede ser congelado a -

70 °C hasta su uso.

B. Preparación de la suspensión celular para ser infectada con la

muestra

1. Tripsinizar la monocapa completa de células de una botella de cultivo, de 25

cm2

2. Resuspender las células con 5.0 mL de D-MEM al 10%. Una botella de 25

cm2, contiene aproximadamente 6x106 células.

3. Transferir 2.0 mL de esta suspensión a una botella de cultivo de 25 cm2 que

contiene 5.0 mL de medio D-MEM al 10%, aproximadamente 2x106 células

por mL.

C. Inoculación de la muestra

1. Inocular la suspensión celular obtenida en el paso 3.B agregándole todo el

sobrenadante del centrifugado obtenido en el paso A5, pasándola a través de

un filtro tipo perinola de 0.22 micras de diámetro

2. Colocar la botella de cultivo de 25 cm2 en una estufa a 37 °C en una

atmósfera de CO2 al 0.5% durante 48 a 72 horas

D. Monitoreo de infección viral

1. Preparación de laminillas teflonadas a partir de la botella de 25 cm2

inoculada, rotular las laminillas con el número de la muestra y la fecha.

Nota: La laminilla de 8 pozos sirve para monitorear 4 muestras, 2 pozos por

muestra.

2. Tripsinizar la monocapa de células de una botella de cultivo de 25 cm2

inoculada.

3. Resuspender las células con 5.0 mL de D-MEM al 10%. Una botella de 25

cm2 contiene aproximadamente 6 x 106 células.

4. Transferir 2.0 mL de esta suspensión a una botella de cultivo, de 25 cm2 que

contiene 5.0 mL de medio D-MEM al 10%, aproximadamente 2x106 células

por mL.

5. Agregar 100 µL de la suspensión (D4) en cada pozo con una micropipeta

6. Colocar las laminillas en cámara húmeda e incubar a 37 °C en una atmósfera

de CO2 al 0.5% durante 24 horas.


Versión 01

7. Enjuagar la monocapa celular infectada de la laminilla con PBS (pH 7.4) y

dejar secar.

8. Fijar la monocapa sumergiendo la laminilla en acetona durante 30 min a –

20 °C.

9. Retirar las laminillas de la acetona y secarlas al aire durante 10 min a

temperatura ambiente.

10. Realizar la técnica de IFD.

11. Usar los 6.0 mL restantes de la suspensión celular infectada obtenidos en el

paso D4 para que continúe creciendo la monocapa celular en la botella de 25

cm2.

Criterios para descartar una muestra problema como negativa

Si las laminillas iniciales fueron positivos a la IFD, la botella puede ser

descartada en ese momento y las laminillas restantes serán utilizadas para la

caracterización antigénica.

Si las laminillas iniciales son negativas incubar la botella a 37 °C por otros 3

días.

Descartar el medio, tripsinizar y colectar todas les células resuspendiéndolas

en 6.0 mL de MEM al 10%.

Proceder a la preparación, incubación, fijación y ejecución de la IFD.

Si la IFD es negativa, la muestra es considerada negativa.

Caracterización antigénica con anticuerpos monoclonales (AcMo)


Solución de D-MEM al 10%

Reactivos para preparar 500 mL Volumen en mL

Agua destilada 370

Solución de vitaminas 100X MEM 10

D-MEM 10X 50

SFB 50

Glutamina 100X 10

Antibiótico y antimicótico 5.0

Bicarbonato de sodio al 7.5% 5.0


Versión 01

Tripsina Verseno 0.025%

Reactivos para preparar 50 mL Volumen en

mL

Tripsina al 2.5% 0.5

Versenato de sodio al 0.05% 45.5

Solución amortiguadora de fosfatos (PBS), pH 7.4

Pesar 0.157 g. de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 H2O); 1.98 g de fosfato de



1. Disolver los reactivos en 700 mL de agua destilada.

2. Ajustar el pH a 7.6 con NaOH o HCl concentrados según se requiera y aforar

a un litro.

Medio de glicerina para montaje pH 8.4

Solución I: 0.879 g de KH2PO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL con agua

bidestilada.

Solución II: 1.149 g de K2HPO4 y 0.85g de NaCl. Aforar a 100 mL con agua

bidestilada.


2. Tomar 10 mL de la mezcla anterior y colocarlos en un matraz aforado de 100

mL para ajustar el pH a 8.4.

3. Aforar con glicerina neutra, agitar y dejar reposar 24 h antes de usar.

Solución desinfectante de etanol al 70% en benzal

Medir 700 mL de alcohol absoluto o 729.16 mL de etanol al 96%.

Aforar a 1.0 L con benzal comercial

Diluyente para suspensiones virales

D-MEM 10%

Suero Fetal Bovino (SFB)


Los anticuerpos monoclonales (AcMo) son moléculas producidas por híbridos

producto de la fusión de un mieloma y un esplenocito hiperinmune. En la

actualidad y para propósitos de caracterización antigénica del virus de la rabia se

utilizan del serotipo uno y están dirigidos contra la proteína N.

Cuando estos AcMo se emplearon para analizar su reactividad contra los virus

aislados de diferentes reservorios; perro, zorrillo, mapache, zorro, murciélago

hematófago e insectívoro, se encontró que algunos reconocían todas las cepas

virales, pero otros poseían una reactividad específica para un solo tipo de


Versión 01

reservorio. De esta manera al utilizar un grupo o panel de anticuerpos se pueden

determinar patrones de reacción también denominados patrones antigénicos, los

cuales son específicos dependiendo de la especie animal (reservorio) de la cual se

han aislado el virus. Esto se pudo determinar gracias al estudio de un gran número

de cepas virales, aisladas de diferentes especies de animales en todo el continente

Americano.

Al inicio éste panel estaba constituido por más de 100 anticuerpos. Sin embargo,

estudios conjuntos entre el CDC de Atlanta Georgia y el Instituto Nacional Para la

Protección de Alimentos y Zoonosis de Buenos Aires Argentina (INPPAZ)

permitieron la reducción a ocho del número de anticuerpos utilizados. Con éste

panel se pudo determinar la existencia de variantes antigénicas del virus de la rabia

dentro del serotipo uno, además de la asociación específica existente entre las

variantes antigénicas y algunas especies de animales en América.

La técnica de caracterización con anticuerpos monoclonales (AcMo) se utiliza

exclusivamente para investigaciones epidemiológicas. Su utilidad se hace evidente

donde la información es limitada, dudosa o inexistente. Actualmente se usa para

confirmar la fuente de infección en cualquier caso de rabia.

Para obtener resultados oportunos es importante disponer de una muestra de

encéfalo fresca y en buen estado de conservación, lo cual garantiza la presencia del

virus viable y permite el desarrollo rápido de la técnica.

Procedimiento

Realizar la técnica de IFD en cada cerebro de los ratones inoculados con las

suspensiones virales, para corroborar una positividad 4+.

Desarrollo

Titulación de los anticuerpos monoclonales

1. Propagar en ratones lactantes una cepa positiva que mantenga sus

características entre pase y pase al inocular en el ratón.

2. Utilizar exclusivamente cerebros de ratones inoculados con virus de la rabia,

en los que se observe una intensidad de fluorescencia específica de 4+.

3. Realizar ocho improntas en dos portaobjetos de teflón con los cerebros del

punto anterior. Considerar que en cada pozo se probará un anticuerpo

monoclonal, por lo que se necesitarán ocho improntas. Solo se probarán las

diluciones 1:100 y 1:1000.

4. Fijar con acetona fría a -20 °C durante 30 min, dejar secar al medio

ambiente.

5. El antígeno rábico en estas improntas debe encontrarse de un 90 a 100%

por cada campo en forma de inclusiones o polvo antigénico.

6. Preparar tres diluciones seriadas de cada AcMo; 1:100, 1:1000, 1.10000 en

E-MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 25 mM de


Versión 01

amortiguador Hepes y 1 mM de azida sódica. Las diluciones anteriores son

estables por un año a 4 °C. Las diluciones 1:10 y 1:100 pueden durar aún

más tiempo almacenadas a -70 °C.

Titulación del conjugado anti-IgG de ratón

La dilución de trabajo del anti-IgG se determina por diluciones seriadas 1:10,

1:100, 1:1000, utilizando los AcMo, en los procedimientos antes descritos. Este

reactivo por lo general da un título de 1:100.

Caracterización antigénica del virus rábico mediante AcMo

1. Preparar 1.0 mL de la dilución de trabajo de cada AcMo (1:100).

2. Rotular cada tubo claramente con la descripción de cada AcMo.

3. Efectuar improntas en los portaobjetos de 8 pozos cubiertos de teflón, a

partir de cerebro de ratón infectado con la muestra problema.

4. Secar las improntas al medio ambiente durante 10 min.

5. Fijar en acetona a -20 °C durante 4 horas. Estos portaobjetos con las

improntas ya fijadas, pueden ser mantenidos a -20 o -70 °C hasta por 2

meses.

6. Agregar 15 μL de cada AcMo a las improntas respectivas sin derramar

anticuerpo al siguiente pozo e incubar 30 min a -20 °C.

Nota: Este es un paso crítico, si los anticuerpos monoclonales se llegan a

mezclar se puede tener reacciones falsas positivas.

7. Efectuar el primer lavado cuidadosamente para evitar la transferencia de

AcMo de un pozo a otro, utilizando una pizeta de 250 mL con PBS 0.01 M

pH 7.4, lavar cada pozo tres veces por goteo.

8. Repetir la operación pero con agua destilada con pH 7.

9. Agregar 15 μL de conjugado en cada pozo.

10. Incubar a 37 °C por 30 min en cámara húmeda.

11. Realizar dos lavados alternando PBS 0.01 M pH 7.4 y agua pH 7, como se

indica en los pasos 7 y 8.

12. Colocar las preparaciones en una caja de tinción y agregar azul de Evans

hasta una concentración final de 0.02% por 2 minutos, enjuagar y secar al

medio ambiente.

13. Colocar una gota de glicerina amortiguada en cada impronta.

14. Leer en el microscopio de epifluorescencia a 400 aumentos.

15. Repetir las lecturas débilmente positivas en donde se descarte

contaminación por reacción con otro anticuerpo por contaminación de pozo

a pozo al momento de lavar o incubar, usando el panel de anticuerpos


Versión 01

monoclonales sin diluir (1:10), en improntas por separado. Interpretar los

resultados.


a) Reacción positiva:

Cuando la intensidad de fluorescencia y la cantidad de antígeno observada

es idéntica al testigo positivo (3+ o 4+).

Puede haber aislamientos en un campo en los que se observen intensidades

de fluorescencia hasta 1+, con algún o algunos de los anticuerpos

monoclonales, los que se corroborarían como positivos si se vuelven a

probar por separado con cada anticuerpo monoclonal (probar también lo

sugerido en el punto 15 del procedimiento anterior).

b) Reacción Negativa:

Cuando no se observa fluorescencia (fondo verde obscuro o rojo).

c) Testigo Positivo

Mezcla de cepas del virus de la rabia CVS/SAD/ERA/PAST, con la cual los 8

anticuerpos monoclonales dan reacción positiva 3+ o 4+.

Interpretación de la reacción con anticuerpos monoclonales

Figura 13. Patrones antigénicos con panel de 8 anticuerpos monoclonales


Versión 01

Técnica de Retro-transcripción de la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (RT-PCR)

Soluciones

Solución amortiguadora de fosfatos (PBS), pH 7.4 para lavado de las

preparaciones

Pesar 0.157 g. de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 H2O), 1.98 g de fosfato de



Disolver los reactivos en 700 mL de agua destilada.

Ajustar el pH a 7.6 con NaOH o HCl concentrados según se requiera y aforar a un

litro.

Si sólo se dispone de Na2HPO4 7H2O entonces se pesarán 1.48 g para un litro y 5.92

g para 4 litros.

Medio de glicerina para montaje pH 8.4

Solución I: 0.879 g de KH2PO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL de agua

bidestilada.

Solución II: 1.149 g de K2HPO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL de agua

bidestilada.


2. Tomar 10 mL de la mezcla anterior y colocarlos en un matraz aforado de 100

mL para ajustar el pH a 8.4.

3. Aforar con glicerina neutra (Chemicon Ligth Diagnostics No. Catálogo

5013), agitar y dejar reposar 24 horas antes de usarse.

Azul de Evans al 2% (colorante de contraste)

Pesar 2.0 g de azul de Evans, disolver y aforar a 100 mL con agua bidestilada.

Mantener ésta solución en frasco ámbar a temperatura ambiente.

Solución desinfectante de etanol al 70% en benzal

Medir 700 mL de alcohol absoluto o 729.16 mL de etanol al 96%.

Aforar a 1.0 L con benzal comercial.

Solución de hipoclorito de sodio al 5%

Medir 384.6 mL de hipoclorito de sodio al 13%.

Aforar a 1.0 L con agua destilada y desionizada, homogeneizar

perfectamente.


Versión 01

Diluyente para suspensiones virales

3.0 g de albúmina sérica bovina fracción V.

5.0 mL de penicilina-estreptomicina (100,000 U/mL-50 g/mL).

100 mL de agua bidestilada estéril.

Capacidad instalada para 50 muestras semanales. Estándar de servicio 60 días,

según algoritmo menor a 700 muestras recibidas.

Extracción y purificación del ARN

La extracción y purificación del ARN del virus de la rabia se lleva a cabo mediante

la utilización de agentes caotrópicos que permiten la eliminación de material

orgánico, así como también de las diferentes cápsides que conforman al virus de la

rabia, dejando libre al ARN el cual puede ser solubilizado en agua grado PCR,

quedando listo para su posterior utilización en las diferentes técnicas de biología

molecular.

Procesamiento por trizol

1. Encender y desinfectar la base interna del gabinete de bioseguridad con

alcohol/benzal al 70%.

2. Descongelar las muestras a temperatura ambiente dentro del gabinete de

bioseguridad.

3. Etiquetar los tubos eppendorff de 1.5 mL, uno por cada muestra y ponerlos a

enfriar en hielo.

4. A cada tubo adicionar 100 µL del amortiguador de lisis frío.

5. Con un aplicador de madera estéril, homogeneizar la muestra de encéfalo,

tomar una cantidad aproximada de 50 mg y ponerla en el amortiguador de

lisis frío.

6. Homogeneizar manualmente por 30 segundos.

7. Adicionar 1.0 mL de trizol grado biología molecular.

8. Homogeneizar manualmente durante 30 segundos.

9. Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente.

10. Adicionar 200 µL de cloroformo frío y homogeneizar vigorosamente por 30

segundos.

11. Incubar a temperatura ambiente por 2-3 minutos.

12. Centrifugar a 12000 rpm por 15 minutos a 4 °C.

13. Pasar la capa superior (transparente e incolora) a otro tubo, previamente

enfriado a 4 °C y que contenga 0.5 mL de isopropanol.

14. Agitar en vórtex por 30 segundos.

15. Incubar por 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.


Versión 01

16. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos a 4 °C.

17. Eliminar el sobrenadante y poner los tubos en hielo.

18. Adicionar 1.0 mL de etanol frío al 75%.

19. Centrifugar a 7500 rpm durante 5 minutos a 4 °C.

20. Decantar el etanol, tratando de eliminar la mayor cantidad posible.

21. Poner los tubos en hielo y adicionar de 80 a 100 µL de agua fría grado

biología molecular.

22. Agitar en vórtex a bajas revoluciones por 2 minutos.

23. Incubar a 56 °C en platina por 10 minutos para disolver el botón de ARN.

24. El ARN obtenido puede ser utilizado inmediatamente o bien guardarlo a -70

°C.

Materiales

Guantes de nitrilo

Vasos de precipitados de 100 y 200 mL

Matraces aforados de 100 mL

Espátulas

Tubos tipo eppendorf de 1.5 mL

Aplicadores de madera estériles

Gradilla

Puntas para micropipeta de 20 µL, 200 µL y 1000 µL

Gasas

Marcador indeleble sin alcohol




NP40

Agua grado PCR

Trizol

Isopropanol

Cloroformo

a) Tris HCl pH 7.5

Pesar 15.7 g de tris-HCl y aforar a 100 mL, medir el pH y ajustar a 7.5 con hidróxido

de sodio o ácido clorhídrico.

b) Cloruro de sodio 5M

Pesar 29.2 g de NaCl y aforar a 100 mL


Versión 01

c) Cloruro de Magnesio 0.5M

Pesar 4.76 g de MgCl2 y aforar a 100 mL

d) Amortiguador de lisis

Tris HCl 1M, pH 7.5 1.0 mL

NaCl 5M 3.33 mL

MgCl2 0.5M 0.33 mL

NP40 0.65 mL

Aforar con agua bidestilada a 100 mL

e) Etanol al 75%

Medir 75 mL de etanol grado biología molecular y aforar a 100 mL con agua

bidestilada.

f) Solución desinfectante de etanol al 70% en benzal

Medir 700 mL de alcohol absoluto o 729.16 mL de etanol al 96%.Aforar a 1.0 L con

benzal comercial.

Procesamiento por estuche comercial QIAGEN (QIAamp Viral

ARN Mini Handbook) a partir del sobrenadante de células de

neuroblastoma murino infectadas con el virus y líquido

cefalorraquídeo de humanos

1. Adicionar 310 µL de amortiguador AVL (amortiguador de lisis que contiene

sales cautrópicas más detergentes al cual se le adiciona un acarreador de ARN)

al tubo donde está contenido el acarreador de ARN y disolver perfectamente.

2. Agregar los 310 µL de la suspensión del acarreador al amortiguador de lisis.

Una vez complementado el amortiguador se almacena a 4 °C por un lapso de 30

días.

3. En tubos de centrífuga de 1.5 mL colocar 560 µL de amortiguador de lisis más

140 µL de suspensión de la muestra.

4. Mezclar la muestra en vórtex.

5. Incubar por 10 min a temperatura ambiente.

6. Añadir 560 µL de etanol absoluto.

7. Mezclar y centrifugar a 6000 g a 4 °C por un minuto.

8. Agregar 630 µL de la mezcla a la columna.

9. Centrifugar a 6000 g a 4 °C por un minuto.

10. Pasar la columna a un tubo colector nuevo, añadir el resto de la muestra a la

columna.

11. Centrifugar a 6000 g a 4 °C por un minuto.

12. Nuevamente se cambia el tubo colector.


Versión 01

13. Se agregan 500 µL de amortiguador AW1 (amortiguador de lavado al cual se le

añaden 125 mL de etanol antes de su uso) a la columna.

14. Centrifugar a 6000 g a 4 °C durante un minuto.

15. Cambiar el tubo colector.

16. Añadir 500 µL de amortiguador AW2 (segundo amortiguador de lavado al cual

se le agregan 160 mL de etanol antes de su uso).

17. Centrifugar a 20000 g y 4 °C durante nueve minutos.

18. Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.

19. Añadir 50 µL de amortiguador AVE (amortiguador de elución que contiene

0.04 de azida de sodio para evitar la contaminación de la muestra extraída).

20. Centrifugar a 6000 g y 4 °C por un minuto.

21. Almacenar el ARN a -20 °C.

Materiales


Gasas

Tubos de microcentrífuga de 1.5 mL

Reactivos

Equipo QIAGEN (QIAamp Viral ARN Mini Handbook)

Etanol (96-100%) grado biología molecular

Amplificación del virus de la rabia por RT-PCR

El propósito de esta técnica es la identificación de un fragmento de 1500 pares de

bases que pertenece a la proteína N del virus rábico, el cual es secuenciado para la

identificación específica de la variable antigénica del virus.

La RT-PCR se efectúa en dos etapas, en la primera se utiliza la transcriptasa reversa

para obtener cADN. La segunda etapa se lleva a cabo con la enzima Taq polimerasa

para obtener ADN de doble cadena y se realiza en tres etapas:

Desnaturalización: la muestra se somete a una temperatura de ebullición

de 94 °C, en donde la doble cadena de ADN se separa.

Alineación: al bajar la temperatura a 55 °C se incorporan los iniciadores y

se alinean en los extremos 5’ y 3’ terminal del fragmento que se desea

amplificar.

Extensión: Se lleva a cabo a 72 °C, temperatura óptima en que la enzima Taq

polimerasa junto con el cofactor catiónico MgCl2 incorpora a los desoxinucleótidos;

dTTP, dGTP, dATP, dCTP, para formar la nueva cadena.

Así se completa un ciclo de amplificación y en lugar de tener dos cadenas iniciales

tenemos cuatro, por lo tanto después de 28 ciclos habrá 1x106 copias de fragmentos


Versión 01

específicos de ADN. Como consecuencia, se puede utilizar para detectar moléculas

aun cuando su concentración en una muestra biológica sea muy baja. En teoría una

sola molécula de ADN puede iniciar una reacción de amplificación de PCR.

Equipo

Termociclador

Agitador tipo vórtex

Micropipetas 0.2 a 2.0, 10, 100, 200 µL

Congelador -20 °C

Gabinete de Bioseguridad tipo II

Materiales

Guantes de exploración

Tubo tipo eppendorf de 200, 500 y 1,500 µL

Gradilla

Gasas

Puntas para micropipeta de 10, 100 y 200 µL

Marcador indeleble


Titan One Tube RT-PCR System

VERORAB (Vacuna antirrábica para uso humano preparada en cultivos

celulares inactivada)

Inhibidor de ARNsa

Agua grado PCR

Desoxynucleótidos trifosfatados Iniciador 1- 550 FW o Ly001 (80000 pmol)

Iniciador 2- 304 bd (80000 pmol)

Cloruro de benzalconio (solución germicida)

Alcohol etílico

Procedimiento

1. Encender el gabinete de bioseguridad, y desinfectar la mesa interna del

gabinete con solución germicida y colocar papel absorbente para trabajar.

2. Sacar los reactivos del congelador a -20 °C para descongelar.

3. Registrar las claves de las muestras en la hoja correspondiente, y colocar en

una gradilla en frío los tubos de 200 L.

4. Preparar la mezcla de reacción para el número de muestras a trabajar, según

el protocolo y considerar el control positivo y negativo.


Versión 01

Mezcla de reacción

Reactivos Volumen en µL rxn

Iniciador 1, 50 pmol/L 1.0

Iniciador 2, 50 pmol/L 1.0

DTT 100 mM 1.0

dNTP’s 10 mM 1.0

Regulador (amortiguador mix)5X 5.0

MgCl2 25 mM 2.0

DMSO 2.0

H2O PCR 11.3

Enzima TITAN 0.4

ARNsa 0.3

5. Colocar 20 µL de la mezcla anterior en cada tubo eppendorf.

6. Agregar 5.0 µL del extracto de ARN en el tubo correspondiente, mantener en

frío hasta colocarlos en el termociclador.

7. Encender el termociclador y programar los tiempos de acuerdo al protocolo

de amplificación a realizar:

Retrotranscripción

1 ciclo 42 °C 60 min

94 °C 5 min

PCR

30 ciclos

94 °C 30 segundos

55 °C 30 segundos

72 °C 1 minuto

Extensión final

1 ciclo 72 °C 5 min

4 °C infinito

8. Colocar los tubos en el termociclador y ejecutar la corrida.

9. Guardar los tubos en refrigeración hasta realizar la electroforesis.

Nota: Las condiciones de trabajo y volúmenes requeridos para la RT-PCR

es particular para cada marca de reactivo, verificar el inserto

correspondiente para ajustar las condiciones.


Versión 01

Soluciones

Iniciador 1: Ly001, 550FW: 80,000 pmol. Hacer una dilución a 50 pmol/µL

Iniciador 2: 304bd 80,000 pmol. Hacer una dilución a 50 pmol/µL

dNTP’s 25mmol. Hacer una dilución 10mM

Corrimiento electroforético

Los geles de agarosa al 1.5%, son utilizados para observar los productos de cADN

obtenidos de la Transcripción Reversa Acoplada a la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (RT-PCR) como una banda diagnóstica del virus de la rabia. Los geles

forman un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de

su tamaño y forma. Así, moléculas de ADN o ARN de diferente tamaño van a

emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa.

Material



Matraz Erlenmeyer de 250 mL

Espátulas

Gasas

Marcador indeleble

Puntas para micropipeta de 10 a 20 µL

Puntas para micropipeta de 0.5 a 10 µL

Pizetas de 250 mL

Jarra de plástico de 2.0 L

Probeta de 100 mL

Placas de 96 pozos desechables no estériles

Reactivos, todos estos deben ser de grado biología molecular

Agua destilada

Trizma base

Ácido bórico

Ácido etilen diamino tetracetico (EDTA)

Bromuro de etidio (BrET)

Agarosa ultrapura

Orange G

Sacarosa

Marcador de peso molecular


Versión 01


Gel al 1.5% de agarosa

Agarosa ultrapura 1.5 g

TBE 1X 100 mL

Solución de BrEt 5 µL

Nota: tapar el frasco para no inhalar los vapores

Los geles se guardar a 4 °C por un período no mayor de 3 días sumergidos en

solución de TBE.

Solución amortiguadora Tris-borato-EDTA (TBE10X)

Trizma-base 108 g

Ácido bórico 27.5 g

EDTA 6.8 g

Agua destilada 1.0 L

Cuando se utiliza por períodos de 30 días, esterilizar por filtración con membrana

de 0.22 µ para impedir que se precipiten las sales y almacenar a 4 °C.

Solución amortiguadora Tris-borato-EDTA (TBE1X)

TBE 10X 100 mL

Agua destilada 1.0 L

Almacenar a 4 °C por un período de 30 días.

Solución de Orange-G

Orange-G 250 mg

Sacarosa 10 g

Agua destilada 25 mL

Fraccionar en viales de 2.0 mL y almacenar a -20 °C, cuando se utiliza un vial se

debe de mantener en refrigeración entre 4 a 8 °C.

Solución de bromuro de etidio (BrET) a 10mg/mL

Bromuro de etidio 1.0 g

Agua destilada 100 mL

Fraccionar en viales de 1.0 mL y protegerlos de la luz con papel aluminio y

almacenar a temperatura ambiente en un lugar seco.

Procedimiento

1. Mezclar la agarosa con el TBE en las proporciones indicadas en la

preparación de reactivos y colocarla en el termoagitador a 250 °C durante 20

min en agitación constante para disolver la agarosa, se deja enfriar y se le


Versión 01

agregan 5.0 µL el BrET, mezclando perfectamente cuidando que no queden

grumos. Evitar la inhalación de los vapores al momento de agregar el

bromuro ya que este reactivo es altamente carcinogénico.

2. Una vez preparada la mezcla para el gel se deja enfriar por 2 min, se vierte la

mezcla inmediatamente en un soporte para contener el gel, cuidando de que

no aparezcan burbujas, en caso contrario retirarlas con una punta sin

perforar el gel.

3. Colocar el peine de acuerdo al número de muestras que se requiera, dejar

que se solidifique a temperatura ambiente aproximadamente por 20 min.

4. Retirar el peine y transferir el gel en la cámara de electroforesis con solución

amortiguadora TBE1X.

5. Las muestras se preparan diluyendo 5.0 µL de muestra con 3.0 µL de la

solución de orange G, se colocan los 8.0 µL en el pocito.

6. Correr en el mismo gel de manera simultánea marcadores de peso molecular

para determinar el peso del fragmento obtenido.

7. Se tapa la cámara y se conectan los electrodos a la fuente de poder de

acuerdo al polo que corresponda.

8. Se corre el gel a 100 v. 180 mA por 30 min.

9. Al finalizar el tiempo de corrimiento se coloca el gel en un transiluminador

de luz ultravioleta (UV) para observar las bandas.

10. Finalmente se toma una impresión del gel en un fotodocumentador de UV.

Secuenciación nucleotídica automática

Secuenciación automática de ADN de un producto de PCR de 900 pb

del gen N del virus de la rabia

La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos cuya finalidad es la

determinación del orden de los nucleótidos; A, C, G y T, en un fragmento de ADN.

Cuantificación de productos de PCR

A. Densitometría de imagen

1. En un gel de poliacrilamida al 5%, cargar 2.5 µL y 5.0 µL del marcador de

pesos moleculares X174 a una concentración de 10 ng/µL en el primer y

último pozo respectivamente.

2. Cargar 2.0 µL de cada producto de PCR a cuantificar en los pozos restantes.

3. Realizar la electroforesis.

4. Teñir el gel con bromuro de etidio.

5. Observar el gel en el fotodocumentador.

6. Determinar la concentración del ADN del producto por comparación de la

intensidad de la banda con respecto a la de las bandas del marcador.

7. Determinar la cantidad de ADN a emplear en la reacción de secuenciación

de acuerdo al tamaño del fragmento, 900 pb = 5 a 20 ng

http://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9todo

http://es.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tido

http://es.wikipedia.org/wiki/Adenina

http://es.wikipedia.org/wiki/Citosina

http://es.wikipedia.org/wiki/Guanina

http://es.wikipedia.org/wiki/Timina

http://es.wikipedia.org/wiki/Oligonucle%C3%B3tido

http://es.wikipedia.org/wiki/ADN


Versión 01

B. Cuantificación por ADN Chip

1. Encender la computadora y el bioanalizador.

2. Abrir el programa “2100 expert”, que se encuentra en la pantalla de la

computadora.

3. Preparar el ADN Chip de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

4. Colocar 9.0 µL del gel-colorante en cada uno de los dos pozos de la letra “G”

restantes.

5. Colocar 5.0 µL de marcador (vial verde) de “ADN Markers” en cada una de

los 12 pozos y en el pozo marcado con el símbolo de la escalera.

6. Colocar 1.0 µL de marcador (vial amarillo) “ADN ladder” en el pozo que está

marcado con el símbolo de la escalera.

7. Colocar 1.0 μL de muestra en cada uno de los 12 pozos.

8. Poner el chip horizontalmente en el agitador “IKA” y agitar durante 60

segundos a 2400 rpm.

9. Colocar el chip en el bioanalizador y checar que el cartucho del electrodo

este insertado correctamente y cerrar cuidadosamente la tapa.

10. Verificar que el bioanalizador detecte el chip.

11. Presionar con el cursor el icono de “START” y esperar a que el bioanalizador

muestre el resultado de las muestras asignadas.

12. Determinar la cantidad de ADN a emplear en la reacción de secuenciación

de acuerdo al tamaño del fragmento; 900 pb = 5 a 20 ng.

13. Realizar limpieza del equipo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

14. Apagar el bioanalizador y la computadora.

1. Purificación enzimática (Exosapit) de productos de PCR

1. Agregar por cada 5.0 µL de producto de PCR, 0.5 µL de la enzima ExoSAP-

IT (realizar la reacción en frio).

2. Incubar a 37 °C por 15 min en el termociclador.

3. Inactivar la enzima a 80 °C por 15 min y mantener el producto 4 °C.

2. Reacción de secuenciación

a. Etiquetar los tubos de PCR a utilizar, indicando el nombre del producto y el

primer a utilizar. Agregar por cada tubo de reacción los siguientes reactivos:

Reactivo Cantidad en µL

Terminator Ready Reaction Mix (BigDye 3.1v) 2.0

Primer (3.3 pmol/µL) 1.0

Amortiguador de secuenciación 5x 3.0

Producto de PCR purificado de 900 pb 5-20 ng

H2O grado biología molecular Ajustar a 20

b. Mezclar vigorosamente con el agitador tipo vórtex cuidando que el producto

quede en el fondo del tubo.


Versión 01

c. Colocar los tubos en un termociclador y llevar a cabo la reacción de

secuenciación por 40 ciclos de acuerdo con las siguientes condiciones:

Desnaturalización a 96 °C por 10 segundos

Alineación a 50 °C por 5 segundos

Extensión a 60 °C por 4 min

Mantener a 4 °C hasta que se lleve a cabo la purificación de los productos.

Purificación de los productos de secuenciación

Purificación por columnas Centrisep

1. Hidratar cada columna a utilizar con 800 µL de agua grado HPLC,

homogenizando perfectamente y cuidando de que no queden burbujas a lo

largo de la columna y dejar reposar a temperatura ambiente por lo menos

tres horas antes de su uso.

2. Etiquetar las columnas y los tubos de colección.

3. Eliminar el agua de la columna quitando la tapa inferior, colocarla en un

tubo recolector y centrifugar a 6500 rpm durante 3 min para eliminar el

exceso de agua. Si es necesario repetir este paso.

4. Adicionar los 20 µL de producto de extensión en el centro de la columna sin

tocarla, ni tampoco tocar las paredes del tubo.

5. Colocar la columna en un tubo eppendorf, cuidando de que el pico formado

en la columna se oriente hacia la pared de la centrífuga.

6. Centrifugar a 6500 rpm durante 5 min.

7. Colocar los tubos eppendorf con los productos purificados en la centrífuga

evaporadora y centrifugar con calor a 80 °C por 15 min para evaporar el

agua de las muestras en oscuridad.

8. Resuspender cada producto en 16 µL de formamida y colocarlo en el pozo

asignado en la placa óptica de 96 pozos.

9. Desnaturalizar los productos purificados a 95 °C por 5 min e

inmediatamente colocar la placa en hielo por 2 min.

10. Colocar la placa en el secuenciador 3130 xl.

Purificación por placa de 96 pozos CentriSep. (16 a 96 muestras)

1. Sacar del refrigerador la placa de purificación una hora antes de su uso.

2. Remover el papel protector de la placa, primero el superior y luego el

inferior.

3. Centrifugar la placa a 3000 rpm durante 3 min a temperatura ambiente para

eliminar el líquido de hidratación (no olvidar nivelar).

4. Colocar la placa sobre la placa óptica de 96 pozos para secuenciador 3130xl.

5. Colocar cada una de las muestras en el centro del pozo correspondiente de la

placa sin tocar la silica, de acuerdo al formato de secuenciación (ver formato

de reacción de secuenciación).


Versión 01

6. Centrifugar la placa por 3 min a 3000 rpm a temperatura ambiente para

eluir.

7. Tapar la placa con la septa.

8. Colocar la placa óptica en el termociclador durante 5 min a 95 °C para abrir

cadenas.

9. Colocar la placa en hielo durante 2 min para mantener las cadenas abiertas.

10. Verificar que no haya burbujas en el fondo de los pozos, en su caso quitarlas.

11. Colocar la placa en el secuenciador 3130xl.

Purificación por columnas DyeEx 2.0 QUIAGEN (1 a 16 muestras)

1. Etiquetar las columnas y los tubos de colección.

2. Homogeneizar la silica de cada columna agitando con un agitador tipo

vórtex, cuidando que no se formen burbujas.

3. Aflojar la tapa de cada columna y romper la punta de plástico.

4. Colocar cada columna en su tubo colector.

5. Centrifugar las columnas a 3500 rpm durante 3 min a temperatura

ambiente, para eliminar el líquido de hidratación.

6. Colocar las columnas en el tubo de colección correspondiente.

7. Colocar en el centro de cada columna (sin tocar la silica) cada una de las

muestras según corresponda.

8. Centrifugar las columnas 3500 rpm durante 3 min a temperatura ambiente,

colocando el pico de silica formado hacia la pared de la centrífuga.

9. Colocar los tubos de recolección en la centrífuga evaporadora y centrifugar

con calor a 80 °C por 15 min para evaporar el agua de las muestras en la

oscuridad.

10. Agregar 16 µL de formamida a cada tubo de colección para suspender el

producto y agitar vigorosamente con el agitador tipo vórtex (evitar que el

producto se quede en las paredes del tubo).

11. Colocar cada una de las muestras en el pozo correspondiente de la placa

óptica de acuerdo al formato de secuenciación (ver formato de reacción de

secuenciación).

12. Tapar la placa con la septa.

13. Colocar la placa con los productos purificados en el termociclador para abrir

cadenas durante 5 min a 95 °C.

14. Colocar la placa en hielo durante 2 min para mantener las cadenas abiertas.

15. Verificar que no haya burbujas en el fondo de los pozos, en su caso quitarlas.

16. Colocar la placa en el secuenciador 3130xl.

Secuenciación automática en el 3130 xl

1. Una vez desnaturalizados los fragmentos en la placa, sellar la placa con la

septa de 96 pozos.


Versión 01

2. Ensamblar la placa en su soporte y asegurarla con su sujetador.

3. Colocar la placa en la posición A o B del autosampler del secuenciador.

4. Preparar el instrumento 3130xl para iniciar la secuenciación automática de

acuerdo al instructivo de operación del equipo GNM-I-17-00.

5. Iniciar la corrida.

6. Esperar a que termine de leer el instrumento los productos colocados.

Nota: la longitud del arreglo capilar que se utiliza en éste equipo es de 36

cm, por lo tanto la longitud máxima de lectura por reacción de secuencia es

de 500-600 pb.

Obtención de electroferogramas

1. Abrir el icono del “Sequencing Analysis Software” y generar los

electroferogramas de cada producto de PCR secuenciado.

2. Verificar el electroferograma y el “Raw Data” de cada producto secuenciado.

3. Salvar el análisis de las secuencias.

Análisis de datos moleculares

a) Edición de los electroferogramas

1. Recuperar los archivos generados por el secuenciador ABIprism 3130xl, los

cuales presentan una extensión *.abi, estos archivos pueden leerse en los

programas CHROMAS y Sequence Scanner para su posterior edición.

2. Abrir simultáneamente los archivos generados para la cadena sentido y la

antisentido.

3. Convertir el electroferograma obtenido para la cadena antisentido en reversa

complementaria. De esta forma ambas secuencias presentan la misma

lectura.

4. Corroborar las dos secuencias para verificar que los datos sean correctos.

5. Si existe discrepancia entre las dos secuencias, repetir la reacción de

secuenciación.

6. Convertir el electroferograma en archivo de texto el cual será útil en los

análisis de alineación y filogenéticos

b) Búsqueda de identidades en las bases de datos

1. Ingresar a la página del NCBI (National Center of Biotechnology

Information).

2. Ingresar al programa “BLAST”

3. Realizar la búsqueda de homólogos con la herramienta BlastN

(correspondiente a la base de datos de nucleótidos).

4. Ingresar la secuencia obtenida en formato de texto.

5. Utilizar los parámetros de búsqueda del programa.


Versión 01

6. Iniciar la búsqueda.

7. El programa emite los resultados para su posterior análisis.

LINEAMIENTOS PARA LA SOLICITUD DE INSUMOS DE RABIA

Política para la solicitud de insumos de rabia

La Coordinación de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (CRNLSP)

del InDRE, tiene como política, proporcionar un servicio de calidad y respuestas

oportunas para los laboratorios integrantes de la Red, así como de los particulares

que requieren de los servicios que proporciona el InDRE. La red está integrada

dentro del sistema de gestión de calidad y observa los procedimientos vigentes y

busca la mejora continua de su servicio. Para cumplir con este propósito se

observarán con los siguientes lineamientos:

Los laboratorios estatales de salud pública:

1. Solicitar por escrito sus insumos para el diagnóstico de rabia a través de un

oficio dirigido a el/la Director General Adjunto del InDRE; con atención al

Coordinador de la Red Nacional de Salud Pública de rabia.

2. Deberán enviar su solicitud a más tardar el día jueves de la semana anterior

al envío.

3. Deben enviar su solicitud por correo ordinario, para poder darle trámite de

forma oficial sin embargo, para asegurar una respuesta oportuna se les

solicita hacer el envío de sus oficios de solicitud escaneados (con número de

folio ya asignado y rubricados) por e-mail al correo electrónico

[email protected] o bien por vía fax al teléfono (01 55) 5342-

6942.

4. Deberán indicar de forma explícita los insumos que requieren.

5. Tendrán que asegurar que sus mensajerías tengan un tiempo de entrega de

24 horas para las solicitudes de reactivos.

6. Deben asegurarse que los envíos sean en no más de 48 horas.

7. En caso de tener solicitudes expeditas justificadas y que planee venir por los

insumos al Instituto debido a la premura de tenerlos en existencia en el

laboratorio de la entidad deberá enviar su solicitud, con 24 horas de

antelación y en horario laboral de 8:00 a 16:00 horas, para que se puedan

gestionar sus requerimientos.

8. Será responsable de sancionar a la mensajería contratada y si fuera el caso

recuperar el costo de los daños ocasionados, en caso de retraso y/o extravío

del insumo solicitado.

9. Deben indicar a la coordinación de la Red, el o los correo(s) electrónicos del

contacto con el que se mantendrá comunicación permanente para atender

sus necesidades de insumos para el diagnóstico de rabia.



Versión 01

10. Debe informar al InDRE de los problemas que pudieran tener con el sistema

de diagnóstico implementado por descompostura o falta de calibración, con

la finalidad de darle seguimiento a su problemática.

11. Hacer los envíos los días martes y miércoles de cada semana, para lo cual

deberemos de contar con su solicitud a más tardar el día jueves de la semana

anterior al envío.

12. El InDRE informará al laboratorio estatal vía correo electrónico, el número

de guía, hora y servicio de mensajería, inmediatamente después de que el

paquete haya sido enviado. Con la finalidad de que el laboratorio estatal este

enterado que su solicitud ya fue atendida.

13. El InDRE proporcionará la información técnica y la de los posibles

proveedores de los insumos con los que no cuente (en caso de que cuenten

con ella), para que el laboratorio estatal pueda solventar sus necesidades de

forma directa. Esta información se le enviará vía correo electrónico y por

oficio en caso de ser necesario.

14. El InDRE a través de la CRNLSP hará el contacto con las áreas técnicas

correspondientes para la información de cursos de capacitación.

El área técnica del INDRE

1. Deberá de tener un tiempo de respuesta no mayor a 24 horas una vez que se

ha recibido la solicitud de insumos por parte de la coordinación de la

RNLSP.

2. Deberá tener los materiales previamente autorizados, de las solicitudes

respectivas, los cuales deberán estar debidamente embalados en cajas de

cartón.

3. Deberá rotular las cajas de envío con los datos del remitente y del lugar a

donde se manda.

4. Deberá entregar sus paquetes a la CRNLSP a la hora acordada, esto

dependerá de cada mensajería.

5. Tendrán que hacer los envíos de reactivos para IFD y caracterización

antigénica utilizando una hielera, con suficientes refrigerantes para asegurar

que el envío llegue en buenas condiciones. En caso de que la hielera se envíe

como un solo envío esta deberá ir a su vez en una caja de cartón para

asegurar la integridad de la misma y por tanto de cada uno de los reactivos.

6. Debe asegurar el contar con suficiente material de empaque para sus envíos;

cajas de 60 cm x 90 cm x 60 cm; 90 cm x 150 cm x 150 cm; hielera con caja

de 20 cm x 30 cm x 30 cm y hieleras con caja de cartón de 15 cm x 22 cm x

20 cm; así como cinta canela.

7. Proporcionará la información solicitada a la CRNLSP sobre las

capacitaciones, así como dudas técnicas de este diagnóstico en un tiempo no


Versión 01

mayor de 24 horas. Para poder hacer las respuestas a los laboratorios

estatales en tiempo y forma.


Versión 01

Formato único para el envío de muestras

INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

EPIDEMIOLÓGICOS

LABORATORIO DE RABIA

clave/revisión

LRAB-F-01/0

emisión:

24/Enero/2012

Página 93 de 96

Formato Único para el Envío de Muestras Biológicas de

Rabia FOLIO

NOMBRE DE LA COMPAÑÍA DE MENSAJERIA_____________________________ NUM. DE GUIA: _____________________ FECHA DE ENVÍO: ____/____/____ FECHA DE RECEPCIÓN: ____/____/____ INSTITUCIÓN:___________________________________________________________________________________________________________ CALLE:______________________________________________________COLONIA:___________________________________________________ MUNICIPIO:_________________________________________________ESTADO:_____________________________C.P.___________________ TEL.:_______________________________FAX:(indispensable)________________________________E-mail :______________________________ MÉDICO SOLICITANTE:_____________________________________________________________________________________ ESTUDIO SOLICITADO:___________________/__________________________________________________________________________________ Clave Descripción

INFORMACION DE LA MUESTRA NOMBRE (HUMANOS) O ESPECIE (ANIMALES):________________________________________________________________________________ Nombre(s) Apellido Paterno Apellido Materno NO. DE CASO O CLAVE:_______________________________ JURISDICCION SANITARIA:___________________________________ DOMICILIO DEL PACIENTE___________________________________________ COLONIA:_____________________________________________ MUNICIPIO:_________________________________________________ ESTADO:____________________________________________ EDAD: ____AÑOS____MESES____DIAS SEXO: M F HOSPITALIZACIÓN: SI NO SITUACIÓN DEL PACIENTE: VIVO MUERTO JUSTIFICACIÓN DEL ENVÍO: DIAGNÓSTICO REFERENCIA ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD TIPO DE MUESTRA: PLASMA SUERO LCR SALIVA HISOPO SUBLINGUAL BIOPSIA DE CUERO CABELLUDO

IMPRONTA DE CORNEA TEJIDO CEREBRAL (MEDULA ESPINAL, ASTA DE AMMON, CEREBELO) FECHA DE TOMA: ______/______/_____ FECHA DE INICIO DE SINTOMAS: ______/______/______ EN CASO DE SOSPECHA DE RABIA CONTESTE LO SIGUIENTE: ¿SUFRIO AGRESIÓN POR PARTE DE ALGUN ANIMAL? SÍ NO MENCIONE LA ESPECIE:___________________________________

SITIO ANATÓMICO DE LA LESIÓN:___________________NÚMERO DE PERSONAS QUE ESTUVIERON EN CONTACTO CON EL ANIMAL_____

EDAD DEL ANIMAL:________________FECHA DE MUERTE DEL ANIMAL:____/____/____ CAUSA DE LA MUERTE________________________ (día mes año) VACUNA ANTIRRABICA: SI NO SE IGNORA FECHA DE ÚLTIMA DOSIS ____/____/____ (día mes año) DATOS CLÍNICOS: AGRESIVIDAD FOTOFOBIA AEROFOBIA HIDROFOBIA SALIVACIÓN PROFUSA INCOORDINACIÓN

PARÁLISIS CAMBIOS DE CONDUCTA ALUCINACIONES HIPERTENSIÓN ENDOCRANEAL COMA RESULTADOS DE ORIGEN: NEGATIVO POSITIVO+ POSITIVO++ POSITIVO+++ POSITIVO++++ VARIANTE ANTIGENICA:__________________________

FECHA DEL RESULTADO:____/____/____ NOTAS ADICIONALES Y OBSERVACION


Versión 01

Cuadro de variables para la base de rabia la cual debe enviarse al correo electrónico

[email protected] de forma mensual:

Estado: ___________

Mes: _______________

Número

de

muestra

Especie Localidad Municipio Centro

antirrábico

Fecha de

recepción

en el

laboratorio

Fecha de

emisión del

resultado de la

muestra.

Resultado



Versión 01

Formato único para envío de reporte de resultados de dRIT

INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

EPIDEMIOLÓGICOS


clave/revisión

LRAB-F-20/0

emisión:

14/Sept/2012

Página 95 de 96

Formato de reporte de resultados del envío de la

muestra para la técnica de dRIT FOLIO

No de

caso

Fecha del

proceso Especie

Tipo de

muestra

Dx. IFD

Positividad

Dx. DRIT

Positividad Observaciones

Nombre y Firma del Responsable de Diagnóstico__________________________________


Versión 01

Formato de reporte de resultados trimestral para la técnica de dRIT

Nombre y firma del responsable de diagnóstico: ________________________

INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS


clave/revisión

LRAB-F-19/0

emisión:

14/Sept/2012

Página 96 de

96

Formato de reporte de resultados trimestral para la técnica de

dRIT FOLIO

RESULTADO

DE: FOLIO

No.

DE

CASO

No.

DEL

InDRE

INSTITUCIÓN MUNICIPIO JURISDICCIÓN

FECHA

DEL

PROCESO

ESPECIE TIPO DE

MUESTRA

DX IFD

Positividad

DX DRIT

Positividad

OBSERVA-

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