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¿ QUÉ SON LOS BIOSENSORES Y PARA QUÉ LOS PODEMOS UTILIZAR?

Conceptos y aplicaciones

ÁNGEL MAQUIEIRA

Universidad Politécnica de ValenciaInstituto de Reconocimiento Molecular y des…..(IDM)

Departamento de Química46022 Valencia, Españ[email protected]

Biosensores. Conceptos y aplicaciones29 Octubre, 2010

Índice

- Concepto de biosensor. Perspectiva histórica

- Características de los biosensores

- Clasificación de los biosensores

- Aplicaciones y Desarrollo

- Retos


Innovación y desarrollo en la industria y servicios:• Seguridad• Calidad• Desarrollo Tecnología Propia

NECESIDAD DE MÉTODOS DE ANALISIS EFICIENTES:•Información: Exacta, Reproducible, Rápida, Estable. •Sistemas: Automatizables, gran capacidad de trabajo,

mantenimiento mínimo, facilidad de uso….

SENSORES Y BIOSENSORESEl mercado relacionado con diagnostico clínico tiene un volumen de 1 billón de euros/año y crece hasta un 20% anual.


A biosensor is a self-contained integrated device which is capable of providing specific quantitative or semi-quantitative analytical information using a biological recognition element (biochemical receptor) which is in direct spatial contact with a transduction element.*International Union of Pure and Applied Chemistry Physical Chemistry Division, Steering Committee on Biophysical Chemistry, Analytical Chemistry Division, Commission V.5

Definición de Biosensor (IUPAC *)

Objetivo general

Obtener señales (información), discretas o continuas, relacionadas con la naturaleza de un analito/s o su concentración.


Biosensor

�

�

�

�Monitor

Superficie bioactiva Transductor

Muestra

Receptor

Registro señal


Funcionamiento


�� Clark y Lyon (1962) - Primer biosensor para la determinación de glucosa en sangre. Receptor biológico (GOX) depositado sobre la superficie de un electrodo de oxígeno, de modo que la disminución de la concentración de oxígeno era proporcional a la de glucosa.

�� Guilbault y Montalbo (1969) - Primer electrodo enzimático potenciométrico basado en la inmovilización de la enzima ureasa sobre un electrodo selectivo de amonio.

�� Yellow Spring Instruments Company (1975) - Comercializa el primer biosensor para determinación de glucosa en sangre (detección amperométrica de peróxido de hidrógeno).

�� La Roche (1976) - Primer biosensor enzimático para lactato que utilizaba un mediador �� nueva generación de “mediated-biosensors”

� 1977 - Primer dispositivo que usaba microorganismos vivos inmovilizados en la superficie de un electrodo selectivo de amonio. Este dispositivo se utilizaba para detectar arginina y lo denominaron “sensor bio-selectivo”

��

Perspectiva histórica

BIOSENSORES


Reconocimiento molecular:Bioespecificidad

• Interacción basada en la complementariedad química y estérica

• Fenómeno general muy asociado a reacciones y sustanciasde origen biológico

• Ocurre en ambientes químicos muy definidos, similares a los de los fluidos biológicos (pH fisiológico, fuerza iónica moderada, etc.)

•Diferente comportamiento in-vivo e in-vitro


Biológico Sintético- Enzimas - PIMs- Anticuerpos - Aptameros- Receptores - ANPs - Ácidos nucleicos- Células- Tejidos


Elementos de reconocimiento

ElectroquímicasMásicasÓpticas TRANSDUCTORMagnéticasOtras

Propiedades físico-químicas

Biosensores. Conceptos y aplicacionesJornada Técnica29 Octubre, 2010


Enzima sustrato

Genosensores Inmunosensores Sensores enzimáticos

TIPO de INTERACCIÓN

Hebras de ADN Anticuerpo antígeno

EnzimasVentajas InconvenientesElevada sensibilidadRespuesta genérica/especificaAuto-regenerablesTiempo se ensayo reducido Gran variedad Manejo sencillo

Estabilidad dependiente del medioRequieren cofactoresInhibición (Envenenamiento)Variabilidad respuesta según origenVida limitada

AnticuerposVentajas InconvenientesElevada sensibilidadElevada selectividadAplicación multitud de sustanciasPreparación sistemática y a la cartaAdmite muy variados sistemas de transducción

Detección unianalitoRequieren marcaje*Intervalo de trabajo estrechoOperan en medios acuosos*Vida limitada

Ácidos nucleicosVentajas InconvenientesDetección de material genéticoBuena sensibilidad (PCR) Excelente selectividad (SNPs)MultianalitoGran capacidad de trabajo (microarraying)Precio reactivos moderado/ bajo

Ámbito de aplicación reducido (ANs) Tratamiento de muestra importanteDuración de ensayo prolongadoManejo especialistasContaminación muestrasMarcaje condicionado

Características de los receptores más utilizados en biosensores


Analíticas Operacionales Diseño- Sensibilidad elevada- Especificidad- Trat. muestra reducido- Gran capacidad de trabajo- Screening (Barrido)- Multiparamétrico

- Respuesta rápida- Manejo sencillo- Mantenimiento bajo- Fiabilidad - Vida útil aceptable- Coste reducido- Estabilidad reactivos

- Integrado- Robusto- Miniaturizado- Desechable/

Reutilizable -Automatizable- Portátil

Propiedades tipo de los biosensores


Biosensores enzimáticos

Sustrato Enzima Estabilidad Tiempo de respuesta

Intervalo de trabajo

Alcohol Alcohol oxidasa

120 días 30 seg. 0,1 – 2.10-5 M

Colesterol Col. oxidasa/Col. esterasa

30 días 2 min. 10-2-3·10-5 M

Ácido úrico

Uricasa 120 días 30 seg. 5·10-3-5·10-5 M

Sacarosa Invertasa 14 días 6 min. 2·10-3-10-2 M

Glucosa Glucosa oxidasa

50-100 días

10 seg. 3·10-6-2·10-3 M


Biosensores microbianos para el control de procesos de fermentaciónSensor para Microorganismo Tiempo de

respuestaEspecie activa Estabilidad

(días)Rango

Nutriente Brevibacterium lacto-fermentum

1-10 O2 10 Lineal ~ 1 mM

Cefalosporina Citrobacter freundii 10 pH 28 < 22,5 mg L-1

Etanol Trichosporon brassicae

10 O2 21 < 50 µg mL-1

Biosensores microbianos para el control medioambientalDBO Trichosporon

cutaneum30 O2 17 1-41 mg L-1

NO3-, NO2-

hidroxilaminaAzobacter vinelandii

5-10 NH3 14 10-5-8·10-4 M

Metano Methylomonas flagellata

1 O2 20 < 6,6 mM

Búsqueda de mutágenos

B. Subtilis 90-120 O2 - 1,6 mg L-1

Biosensores microbianos


Ejemplos de aplicación de los inmunosensores a la determinación de plaguicidas

Plaguicida Detector Marcador Límite DetecciónAtrazinaClorsulfuronGlifosatoIsoproturonSimazinaMesotriona2,4-D2,4-DAtrazinaAtrazinaClorpirifosDDTTrifluralina

FluorescenteAmperométricoFluorescenteFluorescentePotenciométricoFluorescenteImpedimétricoSPRImpedimétricoPiezoeléctricoSPRNanomecánicoÓpticoguía de ondas

APGlucose oxidasaGlyphosate-peroxidasaFluoresceinaHRPFluoresceina

SIN

MARCA

Similar a ELISA0.01–1 ng/mL0.021 ng/mL0.1 ng/mL3 ng/mL0.04 ng/mL45 nmol/L0.1 ng/mL20 ng/mL1.5 ng/mL 45–64 ng/L< nM 100 ng/mL


�� Células completas• Receptores moleculares de membrana • La unión del ligando dispara respuestas fisiológicas amplificadas• Afinidad por compuestos relacionados estructuralmente

• Ejemplo: biosensor formado por un membrana de vejiga de rana Utiliza la medida del bloqueo de los canales de sodio para determinar la cantidad de toxinas

BIOAFINIDAD

�� Lectinas• Proteínas que se unen a distintos sacáridos• Fácilmente disponibles y muy económicas

• Ejemplo: biosensor para el screening de bacterias patógenas Helicobacter pylori y Campylobacter jejuni


�� Ácidos nucleicos• Se basan en un proceso de hibridación • Suelen utilizar marcaje

• Se usan para el reconocimiento y cuantificación de ADNs diana • Detección del daño provocado por el analito • Detección de un microorganismo por hibridación a una secuencia específica

�� Detección de GMOs o microorganismos patógenos

BIOAFINIDAD

Ejemplo

Identificación en 45 min de las 4 bacterias principales causantes de las infecciones urinarias.

Ensayado basado en cultivo en placa 48 h


Sistemas de detecciónTransductor Tipo de medidaElectroquímico Conductimétrico

PotenciométricoAmperométricoImpedimétrico

Óptico UV/V; IR; Luminiscencia; Refracción, Dispersión Fibra ópticaResonancia de plasmón de superficie (SPR)Onda evanescente (EW)Interferometría (DPI)

Piezoeléctrico Onda acústica en masa (BW) o Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM)Onda acústica superficial

Namométrico Mecánico FotónicoEléctrico

Otros EntalpimétricoMagnetométrico


TRANSDUCTORES ELECTROQUÍMICOS

Transductor electroquímico

Tipo de medida Ventajas Inconvenientes

Conductimétrico Variación de la conductividad del medio

Respuesta generalEconómicosFiablesAutomatización sencilla

Falta de selectividad

Potenciométrico Diferencia de potencial eléctrico

Simplicidad de operaciónPequeño tamañoEconómicosVersatilidad

Menor sensibilidad que amperométricosUnión inespecífica a otros iones presentes en la muestra

Amperométrico Corriente generada por reacciones redox de especies electroactiva

Pequeños y robustosSensiblesRápidosEconómicosFácil uso en campoAutomatización sencilla

Sensible a interferencias de matriz

Biosensor para glutamato acoplado a un microcultivo celular


APLICACIONES: Evaluación de calidad

Analito Matriz Elemento de reconocimiento Sistema de transducción

Glucosa Mosto, vino, zumo, bebidas refrescantes, miel, leche y yogur

Glucosa oxidasa Amperométrico

Fructosa Zumo, miel, leche, gelatina y edulcorantes artificiales

Fructosa deshidrogenasa Amperométrico

Lactosa Leche β-galactosidasa Amperométrico

Lactato Sidra y vino Transaminasa y lactato deshidrogenasa

Amperométrico

Almidón Harina de trigo α-amilasa y amilglucosidasa y glucosa oxidasa

Amperométrico

L-aminoácidos Leche y zumo de frutas Aminoácido oxidasa Amperométrico

Etanol Cerveza, vino y otras bebidas alcohólicas

Alcohol oxidasa Amperométrico

Catecol Cerveza Polifenol oxidasa Amperométrico

Colesterol Mantequilla, manteca y huevo

Colesterol oxidasa y peroxidasa Amperométrico

Ácido cítrico Zumo y bebidas para deportistas

Citrato liasa Amperométrico

Biotina y folatos Fórmulas infantiles y leche Anticuerpos SPR


APLICACIONES: Evaluación de vida útil

Analito Matriz Elemento de reconocimiento Sistema de transducción

Evaluación del enranciamiento

Polifenoles Aceite de oliva

Tirosina Amperométrico

Ácidos grasos de cadena corta

Leche y derivados

Lipasa Electroquímico

Índice de frescura

Orinitina Gambas Ornitina carbanil transferasa, nucleósido fosforilasa y xantina oxidasa

Amperométrico

Aminas Pescado Diamina oxidasa Amperométrico

Aminas biógenas Pescado Amina oxidasa y peroxidasa Amperométrico

Aminas Carne Xantina oxidasa Amperométrico

Ácido láctico Carne Enzimático Amperométrico

Evaluación de la madurez

Glucosa Frutas Glucosa oxidasa Amperométrico

Sacarosa Frutas Invertasa, mutarotasa y glucosa oxidasa

Amperométrico

Evaluación del deterioro

2,4,6-tricloroanisol Vino anticuerpos Amperométrico


Biosensores. Conceptos y aplicaciones

APLICACIONES ALIMENTARIAS Patogenos

Biosensor para detección y cuantificación de patógenosE. coli 0157:H7 y Salmonella) en un matadero avícola.

Transductores ópticos

• Clásicos (Absorciometría, luminiscencia, refractometría, …)

• Fibra óptica• Plasmón (SPR, …)

• Onda Evanescente (TIR, Mach-Zender,….)

• Interferometría (DPI)

• Fenómenos nanofotónicos (Slot wide guide; porous silicon, ring resonators, etc.)


Características de los transductores ópticosTransductor Ventajas InconvenientesOptrodos (fibra óptica)

•Flexibilidad•Bajo costo•Aplicación remota •Análisis en tiempo real•Miniturizables•Robustos

•Requieren marcaje•Mantenimiento del sensor•Perdida de actividad.•Deriva del bioreceptor.

Resonancia de plasmón de superficie (SPR)

•Fácil uso•Detección directa sin marcaje•Sensibilidad buena•Maneja muestras sin purificar•Miniaturizable

•Deriva térmica (Sensibles a la T)•Coste elevado•Presenta problemas para analitos pequeños,•Coste muy elevado

Onda evanescente (EW)

•Detección directa•Opera en tiempo real•Buena selectividad

•Requiere marcaje


TRANSDUCTORES ÓPTICOS

Generación producto fotoactivo: FluoroforoCambio en la respuesta del sensor: Índice de refracciónCambio en las propiedades de la radiación: Polarización

[Chlorpyrifos]olive oil (ng/mL)

1e-3 1e-2 1e-1 1e+0 1e+1 1e+2 1e+3 1e+4 1e+5 1e+6

Nor

mal

ized

sig

nal (

A/A

0)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Interacción bioreceptor/ muestra

Transducción

Resultado


Biosensores de fibra ópticaFibra óptica para determinación enzimática de penicilina en vena –sangre.

Optrodo. Operativo en batch y en línea


time

S

surface

immobilisation

no surfaceinteraction

surface regeneration

specific Interaction

time

S

surface

immobilisation

no surfaceinteraction

surface regeneration

specific Interaction

Información sobre la biointeracción:

- Afinidad (Intensidad de la interacción) - Especificidad - Cinética de la interacción en tiempo real- Datos termodinámicos (Ctes. Equilibrio)- Concentración efectiva- Espesor

Resonancia de plasmón de superficie SPR

Aplicable a:Sustancias MM reducidaSustancias MM elevada:- Proteínas- Ácidos nucleicos- Hidratos de carbono- Lípidos VirusCélulas- Células completas- Bacterias


Características

Señal fluorescenteRequieren marcajeReceptores: Anticuerpos, enzimas, ANsAlta sensibilidadResolución espacial: MultianalitoSistemas compactosOperativos en laboratorio y en campo

Detectores de onda evanescente


Transductor piezoeléctrico. Microbalanza

Características de los sistemas piezoeléctricosVentajas Inconvenientes•Detección directa, sin marcaje•Sensibilidad buena•Sistema portátil de dimensiones reducidas•Compatible con diferentes formatos ensayo•Manejo sencillo•Sistemas robustos•Coste reducido

•Escasa selectividad•Tiempo de ensayo medio/largo (20 – 30 min)•Requieren regeneración•Regeneración problemática•Requieren calibrado de cada cristal sensor•Interferencias de matriz en ensayos con muestras líquidas


�� Control de metabolitos críticos durante las operaci ones quirúrgicas�� Consultas y Urgencias Hospitalarias

» �� Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centr ales» �� Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento» �� Menor riesgo de deterioro de la muestra

�� Diagnóstico Doméstico� Ensayos de Embarazos � Control de Glucosa en diabéticos

�� Aplicaciones in vivo� Páncreas artificial � Corrección de niveles de metabolitos

�� Aplicaciones Industriales, militares y medio ambie ntales» �� Alimentación, Cosmética, Control de Calidad» �� Control de Fermentaciones » �� Control de la contaminación» �� Detección de Explosivos» �� Detección de gases y/o toxinas biológicas

CAMPOS DE APLICACIÓN. EJEMPLOS


Antibióticos en leche: Inmunopotenciometría


Cortesia de: Farfield Sensors Ltd. UK

Biosensor DPI


Sensor para ensayo clínico de patógenos.

Inmuno/Fibra óptica/ Quimioluminiscencia

Desarrollo de biosensoresEtapas y operaciones

• Selección del formato y modo de transducción• Selección de los bioreactivos• Síntesis y purificación de trazadores (optativo)• Inmovilización del bioreceptor (optativo según el formato)• Integración del:

Generador de señales (p.e. fuente láser)Soporte o medio biosensorSistema de transducciónSistema hidráulico para:

Dispensación de reactivos y muestraRegeneración/ lavado y conservación

• Puesta a punto físico-química• Calibración y ensayo• Validación


Soporte cromatográfico de acceso restringido- Mecanismo: Exclusión molecular y fase reversa- Formato homogéneo-heterogéneo

External surface(Diol)

Internal surface alkyl (C4, C8 and C18)

Immunocomplexes

Tracers

Analyte

Tratamiento de muestra y determinación simultanea


Trazadores específicos para formato HH

F = Fluoresceina, Cy5, Rhodamina X= -SH, -NH2, -COOH, -OH, -Biotina

XF

Fluoresceina T G CN

N

N

Cl

NN

HH

N

O

H


Inmunosensor Homogéneo-Heterogéneo

Soporte C18 Alkyl-diol silica Columna (25 mm)

Trazador

Condiciones Caudal 0.5 mL/min Volumen de muestra: 20 µL

Sensibilidad IC50 7.5 µg/L

LOD 0.8 µg/L

Tiempo de ensayo 120 segundos

No regeneración Capacidad de columna >1.000 inyecciones

N

N

N

Cl

NN

HH

N

O

H

Fluoresceina T G C


5 10 15 20 25 30 35

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

1000

B01

3

10

30

100

300FLU

OR

ES

CE

NC

E IN

TE

NS

ITY

(A

.U.)

TIME (min)

5 10 15 20 25 30 35

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

1000

B01

3

10

30

100

300FLU

OR

ES

CE

NC

E IN

TE

NS

ITY

(A

.U.)

TIME (min)

Results of the analysis of atrazine-spiked water samples SPE extracted

Sample Level found (µg/L)

Recovery (%)

Sample Level found (µg/L)

Recovery (%)

1 0.45 90 6 0.42 842 0.45 90 7 0.51 1023 0.48 96 8 0.49 984 0.54 108 9 0.42 845 0.43 86 10 0.48 96

Spiking level: 0.5 µg/L

0,1 1 10 100 10000

20

40

60

80

100 No modifierMethanol 15% 2-propanol 15%Acetonitrile 15%

[ATRAZINE] (µg/L)

NO

RM

ALI

ZE

D S

IGN

AL

(%)

No modifierMethanol 15% Isopropanol 15%Acetonitrile 15%

0,1 1 10 100 10000

20

40

60

80


[ATRAZINE] (µg/L)

0,1 1 10 100 10000

20

40

60

80


0,1 1 10 100 10000

20

40

60

80


[ATRAZINE] (µg/L)

NO

RM

ALI

ZE

D S

IGN

AL

(%)


NO

RM

ALI

ZE

D S

IGN

AL

(%)



Resultados*

*Jornet, D., González-Martínez, M.A., Maquieira, A. , Puchades, R. Rapid homogeneous-heterogeneous immu nosensing employing restricted acceschroamtography principles. Anal. Chem., 79, 9331, 2007.


Biosensores y Tratamiento de muestra: ¿El Problema?

¿Incorporación a metodologías ya desarrolladas?

¿Desarrollo de nuevas metodologías analíticas?


¿Lab on a chip? ¿Chip on a lab?

Lab on a chip


Sistema multianalito para diagnóstico clínico de rutinaUtiliza receptores proteicos y ácidos nucleícos.

Aplicado a detección de:- Virus, patógenos, alérgenos, - Enfermedades hereditarias, - Incompatibilidades debidas a medicación y transplantes.

El mercado relacionado con diagnostico tiene un volumen de 1 billón de euros/año y crece hasta un 20% anual.

Quicklab


Sistema de extracción de Ácidos Nucleicos. DEMO

Disco metálico

Imán


demo compressed.lnk

Extracción de Ácidos Nucleicos de TejidosEtapa 1: Lisado mecánico. Centrifugado, 120 seg.


Extracción de Ácidos Nucleicos de TejidosEtapa 2. Filtración


Extracción de Ácidos Nucleicos de TejidosEtapa 3. Clarificación. Centrifugación, 30 seg.


Extracción de Ácidos Nucleicos de TejidosEtapa 4. Inversión del sentido de giro. Cebado del sifón (10seg.)

Cebado del sifón


Sistema de extracción de Ácidos NucleicosEtapa 5. Transferencia del extracto

Transferencia


Extracción de Ácidos Nucleicos de TejidosEtapa 6. Extracto final.


Extractor de Ac. Nucleicos de tejidos

Azul: Entrada muestraAmarillo: Cavidades de

a) Lisado (500 µL, 1,4 mm profundidad)

b) Clarificaciónc) Separación

Rojo: Canales transferencia y purga. (Φ i 0,3 mm)

Verde: Disco metálico

Gris: Partículas abrasivas

a

b

cDuración del ensayo: 170 segundosMuestras procesadas simultáneamente: 12


TENDENCIAS EN LAS TECNOLOGÍAS DE BIOSENSORES

NECESIDADES y RETOS •Miniaturización e integración•Reutilización•Investigación sobre nuevos bioreceptores

- Mejora estabilidad; reducción costos, productos semisintéticos, Desarrollo de materiales con propiedades mejoradas

- Inmovilización, baja adsorción inespecífica,…•Nuevos formatos, p.e. sin marcaje, desplazamiento; pre-calibrado•Integración del proceso analítico (Preparación muestra y análisis)•Mejora de prestaciones: Compatibilidad con disolventes orgánicos, …•Ensayos multiparamétricos, screening, …•Evaluación de índices (calidad, toxicidad, ......)•Validación de sistemas y metodologías•Reducción de costes


Ángel Maquieira

Diazinon Fenthion Malathion ChlorpyrifosIC50 (ng/mL) 22 4 10 0.4LD (ng/mL) 1 0.02 0.09 0.04DR (ng/mL) 3-422 0.14-1,850 0.5-800 0.12-130

[Chlorpyrifos]olive oil (ng/mL)

1e-3 1e-2 1e-1 1e+0 1e+1 1e+2 1e+3 1e+4 1e+5 1e+6

Nor

mal

ized

sig

nal (

A/A

0)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0100,000

10,000

1,000

100

10

1

0.1

0

ng/mL Chlorpirifos en aceite de oliva

MRL

Tiras reactivasBiosensores. Conceptos y aplicaciones29 Octubre, 2010

Comparación del consumo de reactivos y costes para inmunoensayos desarrollados en formato Microarray vs placa ELISA

Ensayos multianalito: Microarraying

Datos: Elaboración propia


Sección transversal de un CD

A SerigrafíaB Protección C Capa reflectante (Al, Au)D PolicarbonatoE 0 (bump o land) F 1 (pit)

Disco Compacto (CD)

� Gran superficie (90 cm2)� 300.000 spots de100 µm Ø� Costo reducido� Integra tanto información numérica como química� Uso de los lectores de CD/DVD como detectores

químicos


CD como sistema analítico

• Motor: Velocidad de giro (> 1000 rpm)• Pick-up: Laser de diodo (λem 780, 650, 403 nm)

• Mecanismo de barrido del CD: Enfoca el láser sobre el disco, corrige defectos, obtiene la información.

40.000-80.000 €

50-300 €


Estrategia

1) Desarrollo de un ensayo en formato microarray basado en tecnologia de CDs (disco y lector)

2) Estudio de formato, selección de bioreceptores y modos de inmovilización

3) Selección de trazadores y modos de lectura

4) Desarrollo del sistema de detección para leer los resultados de los ensayos

5) Integrar todo en un biosensor simple y competitivo

Laser diode

photo-diode

detectionboard

Laser diode

photo-diode

detectionboarddetectionboard

Biosensores. Conceptos y aplicaciones

Marcadores y modos de detección

TMB spot Azul

Detección por absorción/ dispersión/ reflexión del haz incidente, λ 780, 650, 405 nm

A) Enzimas: producción de un precipito del sustrato. - HRP- TMB, Sólido azul, verde, …- Fosfatasa alcalina - BCIP, …. Sólido rojizo

B) Partículas: Oro, Grafito, Magnéticas, Látex

C) Autometalografía: Nanopartículas de oro/ sal de plata: depósito sólido


ResultadosConsumo de reactivos, CD array vs placa ELISA

- Menos de 2% de conjugado de tapizado

- Alrededor de 0,05% de anticuerpo específico

- 2.6% de anticuerpo secundario

- Tiempo total de ensayo 30 min

20 X = 1


O

O

O*

* O

O

O*

*

NO2 NO2

n n

HNO3/H2SO4O

O

O*

*

NH2 NH2n

10 min 65 ºC 6 h RT

DCC, NHS

O

O

O*

*

NHn

ONH

O

Hapten Hapten

1 2 3

6

1. Polycarbonate (PC)

2. Nitro-Polycarbonate

3. Amino-Polycarbonate

4. Carboxylated Hapten

5. Active Ester of the Hapten

6. Hapten-coupled Amino-Polycarbonate

Hapten O

O

5

N

O

O

Hapten OH

O

4

NaBH4

Policarbonato

DVD Tratamiento directo: Nitración, reducción y anclaje de sonda vía glutaraldehído. Cuantificación de virus influenza en saliva.

CD

Y

Y

Paso 3: anticuerpo de detección: (mAb (H1N1, H3N2)-BT)

Paso 2: Virus inactivos (cepas: ...)

Paso 4: Estreptavidina -HRP

Paso 1: Anticuerpo de captura (mAb (H1N1, H3N2))

TMB

(a)

C+mAb (H1N1, H3N2)-BT

C-GAR

Anal. Chem., 82, 1954, 2010


- Demostradores basados en tecnología de disco compacto- GMOs. Detección de soja transgénica Roundup Ready

-

Inmunoensayos Anal. Chem., 81, 5646, 2009 Multidetección de residuos Microcistinas

ES&T 2010 (En prensa)

CONTROL NEGATIVOIMPRESIÓN

CONTROL NEGATIVOHIBRIDACIÓN

ESTRATEGIA 1STP+BT-SONDA

CONTROL POSITIVOIMPRESIÓN

CONTROL POSITIVOIMPRESIÓN

ESTRATEGIA 2antiDIG+DIG-SONDA

secuencia

objetivo

sonda

bio-receptor

CD o DVD

secuencia

objetivo marcadasonda

bio-receptor

CD o DVD

secuencia

objetivo

sonda

bio-receptor

CD o DVD

oligo marcadoroligo marcador

secuencia

objetivo

sonda

bio-receptor

CD o DVD

secuencia

objetivo marcadasonda

bio-receptor

CD o DVD

secuencia

objetivo

sonda

bio-receptor

CD o DVD

oligo marcadoroligo marcador


Resultados de ensayos multianalito

Valores expresados en ng/mL. LD: Límite de detección, IC50: sensitivity, RD: Rango dinámico.* Reactivos y formatos diferentes

Disco: L-CDSuperficie: policarbonatoDetector: Lector de CDs estándar con fotodiodo

CD array ELISAAnalite LD IC50 DR LD IC50 DR2,4,5-TP 0,03a 0,78 0,15-6,33 0,05 0,80 0,14-5,54Atrazine*e 0,12 9,32 0,66-40 0,08 0,83 0,14-4,50Carbaryl 0,43 26,62 2,25-276 0,23 3,55 0,82-40Chlorpyriphos 0,39 2,51 0,62-9,85 7x10-5 7x10-3 4x10-4-0,34Fenthion 5,31 28,28 12,34-287 0,03 0,5 0,05-1,13Irgarol* 0,32 14,32 0,83-80 16x10-3 0,08 0,03-0,20Metolachlor 0,62 2,57 0,28-134 0,06 0,7 0,11-4,20Sulfathiazole 4,79 31,23 8,29-250 0,03 1,6 0,12-6,71

Video 1 Video 2


Hay demanda de sistemas que resuelvan problemáticas y exigencias nuevas no cubiertas por otras vías. El mercado mundial de biosensores a finales de 2007 alcanzó los 10.000 millones de dólares, con una tasa de crecimiento anual del 10 %.

Potencialidades:

•Prestaciones analíticas excelentes (sensibilidad, selectividad, …)

•Manejo sencillo e integrado

•Tiempo de ensayo corto

•Screening / Cuantificación

•Portabilidad

•Fabricación a gran escala -coste reducido-

•Desarrollo a la carta

Conclusiones


Retos:• Utilización de dispositivos idóneos según:

• Prestaciones y diseño del biosensor• Muestra y analitos manejados• Condiciones de uso• Normativa legal

• Transferencia de tecnología: conocimientos y experiencias

• Desarrollar sistemas teniendo en cuenta las necesidades del usuario

• Validar sistemas y métodos• Considerar entre los objetivos el desarrollo de

tecnología propia.

“Los biosensores no son una tecnología de sustitución”

Conclusiones


Gracias por su atenciónQuedan invitados a visitar nuestro centro de investigación

Ángel MaquieiraUniversidad Politécnica de ValenciaEmail: [email protected]://www.upv.es/iqma

¿ QUÉ SON LOS BIOSENSORES Y PARA QUÉ LOS ...©...Índice - Concepto de biosensor. Perspectiva...

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