Dirección General de Epidemiología
Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”
lineamientos para la vigilancia epidemiológicade rabia por laboratorio
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA POR LABORATORIO
DGE-InDRE–RNLSP 2015
Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos
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PRIMERA EDICIÓN, 2015 RABIA-RNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL PARA LA
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY © INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS
PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA POR LABORATORIO”. VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2015. COLECCIÓN DE PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS “DR. MANUEL MARTÍNEZ
BÁEZ”. FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P. 01480, MÉXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
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SECRETARÍA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ SECRETARIA DE SALUD
DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER
SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD
DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ
SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS
DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD
LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA
COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS
DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO
DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS
TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y
HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD
LIC. RODRIGO REINA LICEAGA TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL
DR. NELLY AGUILERA ABURTO
TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO
LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL
DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN
DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL
DE ENFERMEDADES
DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
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LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD
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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
“DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ”
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA
SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN
BIOL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS
M EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE PRUEBAS
M. EN C. BELÉN TORRES LONGORIA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
QBP MIGUEL IGUALA VIDALES
JEFE DEL LABORATORIO DE RABIA
COORDINADOR DE LA RED DE LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO DE RABIA
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GRUPO DE TRABAJO
QBP MIGUEL IGUALA VIDALES
JEFE DEL LABORATORIO DE RABIA
COORDINADOR DE LA RED DE LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO DE RABIA
M. EN C. BELÉN TORRES LONGORIA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE PRUEBAS
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO
ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE
COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA POR
LABORATORIO
DGE-InDRE–RNLSP 2015
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 9
ANTECEDENTE DE LA RED NACIONAL .................................................................... 10
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA ..................................................................................... 10
MARCO LEGAL ............................................................................................................. 11
DEFINICIONES OPERACIONALES ............................................................................. 12
OBJETIVOS .................................................................................................................. 13
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA EL
DIAGNÓSTICO DE RABIA ........................................................................................... 14
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA ............................................................... 15
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE RABIA
DIAGNÓSTICO DE RABIA POR LABORATORIO ........................................................ 19
ESTÁNDARES DE CALIDAD ........................................................................................ 35
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO .................................. 38
CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DE RABIA MEDIANTE
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ............................................................................. 41
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD ................................................................................... 41
BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................. 44
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ......................................................................................... 47
TITULACIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES DEL CONJUGADO ANTIRRÁBICO
TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD)
TÉCNICA DE INMUNOHISTOQUÍMICA
PRUEBA BIOLÓGICA (PB)
INOCULACIÓN DEL VIRUS DE RABIA EN CÉLULAS DE NEUROBLASTOMA MURINO
CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES (ACMO)
TÉCNICA DE RETRO-TRANSCRIPCIÓN DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(RT-PCR)
LINEAMIENTOS PARA LA SOLICITUD DE INSUMOS DE RABIA ............................. 90
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INTRODUCCIÓN
La rabia es una encefalomielitis de curso agudo que afecta a todos los mamíferos.
Entre los animales susceptibles hay especies que desempeñan un papel importante
para el mantenimiento del virus en la naturaleza, las cuales son denominadas
reservorios e incluyen animales silvestres como mapaches, zorrillos, zorros,
coyotes, chacales, mangostas y murciélagos; hematófagos, insectívoros y
frugívoros, y al perro como único reservorio doméstico.
La rabia es la zoonosis viral de mayor importancia en México, en donde la
transmisión de rabia canina ha disminuido drásticamente por la aplicación de
efectivos programas de control, principalmente en las zonas endémicas del país.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que la tasa de mortalidad anual
a nivel mundial es mayor a 55000. Sin embargo, se cree que podría ser hasta 100
veces mayor que la reportada oficialmente. Alrededor del 40% de los individuos
infectados son niños, por lo que la rabia se considera la séptima enfermedad
infecciosa global más importante. Asimismo, la amplia biodiversidad que
caracteriza a nuestro país ha permitido la presencia y el mantenimiento de los
diferentes ciclos enzoóticos de la rabia, presentándose además importantes
desplazamientos de las especies reservorios a otras áreas geográficas del país por la
intervención del ser humano, lo que complica radicalmente su estudio y control.
En México, el Programa Nacional de Zoonosis del Centro Nacional de Programas
Preventivos y Control de Enfermedades (CENAPRECE), la Dirección General de
Epidemiología (DGE) y el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos
“Dr. Manuel Martínez Báez” (InDRE) mantienen la vigilancia epidemiológica a
través de la implementación de diferentes estrategias para la prevención y control
de la rabia, en las que el diagnóstico de laboratorio es una actividad indispensable,
cuyo resultado permite fortalecer la calidad de la vigilancia epidemiológica y
monitoreo del virus rábico en las diferentes especies.
El presente documento establece los lineamientos de operación para la vigilancia
epidemiológica de rabia basada en el laboratorio e incluye: las funciones por
niveles; la toma, manejo y envío de muestras; la metodología para el análisis de
muestras (métodos tradicionales y métodos moleculares); la evaluación del
desempeño del personal así como el establecimiento de los estándares de calidad
en el diagnóstico.
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ANTECEDENTE DE LA RED NACIONAL
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública
La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de
laboratorios para la vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han
permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de
resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de
recursos humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia
epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de
decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de
laboratorio en muestras biológicas.
La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el InDRE su órgano rector en el
área de vigilancia epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial
Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está
conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32
entidades federativas del país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).
El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en
16 redes de vigilancia específica.
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA
Desde 1991, el laboratorio de rabia del InDRE, laboratorio nacional de referencia,
realiza el aseguramiento de la calidad a diferentes entidades federativas para la
técnica de inmunofluorescencia directa (IFD), con un criterio del envío de muestras
positivas y negativas de acuerdo a su concordancia y desempeño dentro de la Red
Nacional de Laboratorios para la vigilancia epidemiológica de rabia, la cual está
conformada por 24 entidades (Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Chihuahua,
Coahuila, Durango, Edo de México, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco,
Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí,
Sonora, Tamaulipas, Tabasco, Tlaxcala, Veracruz, y Zacatecas).
Existen otras instituciones que realizan el diagnóstico de rabia como son:
Secretaría de Agricultura, Ganadería, desarrollo Rural, Pesca y Alimentación
(SAGARPA), asociaciones ganaderas y escuelas de veterinaria.
En el año de 2006 la Red de rabia se incorporó al programa Caminando a la
Excelencia para evaluar el desempeño de las entidades respecto a los programas
prioritarios de la salud y fomentar su desarrollo mediante tres indicadores:
concordancia, cumplimiento y evaluación del desempeño.
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En 2007 se prepararon y enviaron a cada laboratorio de la red dos paneles de
eficiencia por año para medir el indicador de evaluación del desempeño; estos
consistieron en el envío de material biológico previamente analizado en el
laboratorio de rabia del InDRE: muestras en fresco, laminillas previamente fijadas
y conjugado antirrábico.
Debido a los resultados obtenidos en el primer panel se realizó el primer curso de
actualización en IFD para el diagnóstico de rabia en el InDRE, lo que repercutió en
el mejoramiento de calificaciones para el segundo panel. En el segundo curso, que
desde entonces es anual, se establecieron los criterios y parámetros de evaluación
de competencia técnica, así como aclaración de dudas técnicas por parte de los
analistas. Es de suma importancia la asistencia de los especialistas en el
diagnóstico de rabia procedentes de cada entidad que conforman la red.
El laboratorio de rabia del InDRE ofrece a todo el personal involucrado con el
diagnóstico, cursos de capacitación, apoyo con reactivos y envío de muestras
control para los diferentes procesos de la metodología durante todo el año, tal
como lo indica el Manual para la Toma, Envío, y Recepción de Muestras para
Diagnóstico (REMU-MA-01).
El programa de salud pública veterinaria de la Organización Panamericana de la
Salud y la Organización Mundial de la Salud (OPS/OMS) recomienda realizar la
caracterización monoclonal de todos los casos de rabia que se registran en la
región, con la finalidad de fortalecer la vigilancia epidemiológica. En México, esta
actividad se realiza en colaboración con los Centros para el Control y Prevención de
Enfermedades (Centers for Disease Control and Prevention, CDC, por sus siglas en
inglés) de los Estados Unidos de América mediante la transferencia de tecnología y
la dotación de insumos necesarios no disponibles a nivel comercial.
MARCO LEGAL
1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF
05/02/1917, Última Reforma DOF: 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y
141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF: 07/06/2012.
3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la vigilancia
Epidemiológica. DOF: 19/02/2013.
4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección
ambiental -Salud ambiental- Residuos peligrosos biológico-infecciosos -
Clasificación y especificaciones de manejo. DOF: 17/02/2003.
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5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las
características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados
de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.
6. Norma Oficial Mexicana NOM-022-SSA2-2012. Para la prevención y control
de la brucelosis en el ser humano. DOF: 11/07/2012.
7. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y
funcionamiento de los laboratorios clínicos. DOF: 27/03/2012.
8. Lineamientos para los Programas de Evaluación Externa del Desempeño de
la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE-Secretaría de
Salud, 2014.
9. Criterios de Operación para la Red nacional de Laboratorios de Salud
Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2013.
10. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial
de la Federación. DOF: 12/12/2013.
11. Presidencia de la República. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario
Oficial de la Federación, DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx
12. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema
Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.
13. Norma Oficial Mexicana NOM-011-SSA2-2011. Para la prevención y control
de la rabia humana y en los perros y gatos. DOF: 08/12/2011.
DEFINICIONES OPERACIONALES
En el continente americano circula únicamente el serotipo I de los IV existentes, el
cual incluye 11 diferentes variantes antigénicas del virus de la rabia. Conforme a las
clases de notificación de enfermedades de la OMS, la rabia está considerada como
clase 2, es decir, enfermedad cuya notificación se exige de manera inmediata donde
quiera que se presente, de conformidad con las disposiciones jurídicas aplicables.
Asimismo, todo caso de rabia humana debe ser registrado en los establecimientos
para atención médica y notificarlo oportunamente al Sistema Nacional de
Vigilancia Epidemiológica (SiNaVE), estableciéndose las siguientes definiciones
operativas:
Rabia: Enfermedad infectocontagiosa, aguda y mortal que afecta al sistema
nervioso central, causada por un virus del género Lyssavirus y de la familia
Rhabdoviridae, presente en los fluidos de personas o animales susceptibles de
transmitir la enfermedad como son el perro, gato, murciélago, zorrillo u otro
animal.
Agresión: Acción por la cual una persona es atacada por un animal de forma
espontánea o provocada.
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Animal silvestre: al animal que vive y proviene de hábitats naturales o en
cautiverio tales como quiróptero, zorro, zorrillo, mapache, coyote y otros
carnívoros.
Reservorio: A cualquier animal donde vive normalmente un agente infeccioso y
cuya presencia puede constituir un riesgo para la salud pública.
Diagnóstico: A los procedimientos encaminados a la identificación del virus
rábico mediante datos clínicos y pruebas de laboratorio.
Control: A la aplicación de medidas para una vigilancia epidemiológica estrecha
así como acciones encaminadas a disminuir la aparición de casos de rabia.
Exposición: A la acción por la cual una persona o animal susceptible entra en
contacto directo con un ambiente donde existe virus activo de la rabia.
OBJETIVOS
Objetivo general
Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico de
rabia así como el manejo adecuado de la información generada por laboratorio, a
través de la RNLSP, en apoyo a la vigilancia epidemiológica de esta enfermedad.
Objetivos específicos
Detectar la circulación del virus rábico en los diferentes especímenes
diagnosticados por la técnica de inmunofluorescencia directa (IFD).
Informar de manera inmediata por vía telefónica, electrónica y/o en papel a
las autoridades locales, estatales y al laboratorio de rabia del InDRE los
casos positivos.
Obtener calificaciones satisfactorias en los dos paneles de eficiencia que
reciben anualmente los laboratorios de la Red de rabia.
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RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE RABIA
Figura 1. Conformación de la red para el diagnóstico de rabia en México
LESP formalmente integrados a la red (24)
Entidades sin infraestructura para el diagnóstico en los LESP cuyas muestras son analizadas por el InDRE (BC, BCS, SIN, NAY, MICH, DF)
Estados con mínimo contacto con el InDRE (COL, YUC)
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ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE RABIA
La Red Nacional de Laboratorios para la vigilancia epidemiológica de rabia está
encabezada por el laboratorio de rabia del InDRE, adscrito al departamento de
virología, e integrada por 24 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) a
través del diagnóstico por IFD.
Laboratorio de rabia, InDRE
(Laboratorio Nacional de Referencia)
Muestras para referencia Resultados
Laboratorios de diagnóstico de rabia (LESP), Comité Estatal para el Fomento y
Protección Pecuaria del Estado de Querétaro, San Luis Potosí, Campeche y
Yucatán, SAGARPA, (Redes Estatales de Diagnóstico).
Figura 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el Diagnóstico
de Rabia
Funciones de los integrantes de la Red de rabia
Funciones del Laboratorio Nacional de Referencia
Con el propósito de apoyar en la prevención o limitar la aparición de brotes rábicos
que tengan consecuencias de muy alto costo, el laboratorio de rabia del InDRE
realiza las siguientes funciones:
a) Coordinar la RNLSP del Sistema Nacional de Salud para la vigilancia
epidemiológica de rabia.
b) Realizar diagnóstico, aseguramiento de calidad y referencia a la Red Nacional
de Laboratorios para el Diagnóstico de Rabia, a través de una evaluación del
desempeño para IFD y caracterización antigénica.
c) Desarrollar la implementación de tecnología de vanguardia para el diagnóstico
de rabia en salud pública.
d) Proporcionar información epidemiológica en apoyo a los programas prioritarios
de salud para la toma de acciones y decisiones.
e) Tipificación antigénica y genética de las cepas circulantes en México.
f) Capacitar a los LESP en las diferentes técnicas utilizadas en el diagnóstico y
caracterización antigénica de rabia.
g) Realizar la captura de resultados en la base de datos INFOLAB de las muestras
que lleguen directamente al laboratorio de rabia.
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h) Apoyar a los LESP que no cuenten con un laboratorio regional. Las muestras
biológicas; médula espinal, cerebelo y asta de Ammón deberán ser enviadas al
laboratorio de rabia del InDRE junto con el formato de envío, ver Anexo 1.
i) Todo el personal involucrado en el diagnóstico de rabia debe recibir
actualizaciones anuales, las cuales son impartidas en el marco del Foro
Nacional de Rabia.
El marco analítico del laboratorio de rabia del InDRE, tanto para el diagnóstico
como para la referencia es:
Técnica de IFD, prueba de fácil interpretación con más del 99% de
sensibilidad y especificidad. En la actualidad, es la prueba estándar para el
diagnóstico de rabia, según el manual de Meslin F. X.
Prueba Biológica (PB) para aumentar el título viral y reproducir la
enfermedad en muestras encefálicas como: encéfalo, líquido cefalorraquídeo
(LCR), saliva, biopsia de cuero cabelludo (BCC).
Caracterización antigénica con anticuerpos monoclonales (AcMo) para
confirmar la fuente de infección, para el control de brotes rábicos.
Inoculación del virus de rabia en células de neuroblastoma murino:
a. Ratificación de un diagnóstico negativo en casos en los que existan
agredidos.
b. Apoyo al diagnóstico en casos de humano y caracterización antigénica,
acortando el tiempo de 40 a 10 días con respecto a las pruebas in vivo.
c. Estandarización de la determinación de anticuerpos neutralizantes.
Titulación de anticuerpos neutralizantes. La determinación de estos
anticuerpos puede llevarse a cabo por la técnica de Inhibición de Focos
Fluorescentes (RFFIT) o por el Ensayo Inmunoenzimático (ELISA). Es
indispensable para el personal que labora en un área expuesta a rabia,
realizarse monitoreo de inmunidad cada 6 meses después de un esquema
preexposición, con un refuerzo anual de ser necesario, como lo establece la
guía actualizada de la OMS de profilaxis antirrábica pre y posexposición en
humanos.
La técnica de Retrotranscripción de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(RT-PCR) es la prueba base para el estudio molecular de cepas circulantes
en el país que ayuda a realizar una vigilancia tanto epidemiológica como
virológica.
o La secuenciación nucleotídica identifica con precisión al animal
reservorio responsable de mantener el ciclo enzoótico de la
enfermedad. El laboratorio de rabia del InDRE reportará al programa
de zoonosis la tipificación genética de las cepas circulantes en México
de un fragmento no menor a 400 pares de bases de esta región.
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La técnica de inmunohistoquímica dRIT (Direct Rapid
Immunohistochemistry Test) está diseñada para fortalecer la vigilancia de
campo entre fauna sospechosa, particularmente apoya los programas de
vacunación nacionales, regionales, estatales o locales. El centro de
colaboración internacional, CDC, recomienda esta técnica para ser utilizada
como diagnóstico de rabia en campo, donde el territorio es accidentado y
lejano al laboratorio. Otra ventaja adicional de ésta prueba es el uso del
microscopio de luz blanca, la muestra es inactivada inicialmente al ser
sometida en formaldehído; pueden procesarse tejidos previamente inmersos
en este reactivo y el costo de esta técnica es económico.
Propuesta de actividades para los laboratorios regionales
Los laboratorios regionales con capacidad instalada para aislamiento viral en
células de neuroblastoma murino y/o ratones albinos CD1 destetados, recibirán de
los LESP asignados el 100% de las muestras positivas a rabia (médula espinal,
cerebelo y asta de Ammón), para su respectiva inoculación y caracterización
antigénica, así como un porcentaje de muestras negativas, establecidas por el
InDRE, con el objetivo de conocer a los reservorios y su distribución para
establecer tendencias y patrones de diseminación de la enfermedad, e implantar
sistemas de control de la rabia en reservorios silvestres.
Conformación de los laboratorios regionales:
Nuevo León (en proceso de implementación): Baja California, Baja
California Sur, Sonora, Chihuahua, Coahuila y Tamaulipas, Sinaloa, Durango
Zacatecas y San Luis Potosí.
Hidalgo: Guanajuato, Aguascalientes, Querétaro, Jalisco, Nayarit, Colima.
InDRE: Edo. de México, Michoacán, Guerrero, Morelos, Puebla, Veracruz y
Tlaxcala.
Chiapas: Campeche, Oaxaca, Tabasco, Yucatán y Quintana Roo.
1. Enviar el 100% de las muestras amplificadas y/o caracterizadas al InDRE
para realizar su respectiva genotipificación a través del secuenciamiento
nucleotídico. Se sugiere que el envío se realice el día martes de cada semana.
2. Tener una capacidad instalada para 50 muestras semanales, y contar con
dos personas para realizar el aislamiento viral.
3. El estándar del servicio para envío al InDRE debe ser del 100% de muestras
amplificadas y/o caracterizadas, que no rebasen los 30 días a partir de la
fecha de haberse recibido en el LESP.
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Para la implementación de la técnica de inmunohistoquímica se seleccionaron
cinco entidades de la frontera norte del país: Sonora, Chihuahua, Coahuila,
Nuevo León y Tamaulipas, con la finalidad de fortalecer la vigilancia
epidemiológica binacional en campo.
Funciones de los Laboratorios Estatales de Salud Pública que realizan
el diagnóstico
Son 24 los LESP que llevan a cabo el diagnóstico de rabia, están ubicados en
Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Durango, Estado de
México, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Morelos, Nuevo León, Oaxaca,
Puebla, Querétaro, Quintana Roo, Sonora, San Luis Potosí, Tabasco, Tamaulipas,
Tlaxcala, Veracruz, Zacatecas y sus funciones son:
1. Realizar el diagnóstico de rabia utilizando un conjugado antirrábico que esté
validado comercialmente, de acuerdo con la técnica de IFD, indicada en el
manual de Meslin F. X., acerca de la cual el personal de los LESP ha recibido
capacitación en el InDRE.
2. Capacidad instalada de 20 a 30 muestras diarias en una jornada laboral de 8
horas, estándar del servicio de 24 a 48 horas, contando con dos personas para
realizar la técnica.
3. Capacitar al personal que llevará a cabo el manejo de la muestra y del
diagnóstico de rabia en la entidad, previa notificación al InDRE para que
también se programe su entrenamiento en la institución.
4. Para Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Durango,
Estado de México Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, Nuevo León, Puebla,
Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sonora, Tabasco, Tamaulipas,
Tlaxcala, Veracruz y Zacatecas se ha decidido la suspensión del control de
calidad para el diagnóstico de rabia por IFD a partir del 15 de abril del presente
año, así como la liberación del diagnóstico de rabia.
Es importante recalcar que la referencia de las muestras positivas seguirá
siendo del 100%.
5. Únicamente las entidades de Guerrero, Morelos y Oaxaca deberán enviar el
100% de sus muestras positivas y el 10% de muestras negativas.
6. Cualquier muestra de interés epidemiológico internacional, el InDRE será la
única institución nacional responsable de su envío, previa solicitud oficial de la
institución interesada.
Cada LESP deberá realizar la titulación de anticuerpos neutralizantes mediante
ELISA. Es indispensable para el personal que labora en un área expuesta a rabia,
realizarse monitoreo de inmunidad cada 6 meses después de un esquema
preexposición, con un refuerzo anual de ser necesario, como lo establece la guía
actualizada de la OMS de profilaxis antirrábica pre y posexposición en humanos.
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Funciones del resto de los Laboratorios Estatales de Salud Pública
Existen siete entidades federativas que carecen de infraestructura para realizar este
diagnóstico; Baja California, Baja California Sur, Sinaloa, Nayarit, Colima,
Michoacán y Distrito Federal, lo que las obliga a depender directamente del
InDRE; en otras entidades el diagnóstico de laboratorio se realiza en laboratorios
de otras instituciones como, la SAGARPA, asociaciones ganaderas o escuelas de
veterinaria, por ejemplo Yucatán y Campeche, ello determina que en parte de las
muestras con resultado de diagnóstico presuntivo no se realice la tipificación
antigénica y genética correspondiente, lo que limita conocer con exactitud el tipo
de virus rábico circulante.
Como parte de las funciones de coordinación de la Red de rabia se notifica a todos
los LESP que el diagnóstico no puede ser subrogado a un tercero sin la notificación
por escrito y la autorización oficial por parte del laboratorio de rabia del InDRE.
DIAGNÓSTICO DE RABIA POR LABORATORIO Toma, manejo y envío de muestras biológicas para diagnóstico de rabia La toma y el envío de muestras para el diagnóstico de rabia debe realizarse como lo
indica el REMU-MA-01, dentro del paquete no se deben enviar muestras para otro
diagnóstico diferente a rabia, en caso de alguna duda comunicarse al laboratorio de
rabia del InDRE: teléfono 53427550, extensión 259.
Cuadro 1. Toma y envío de muestras para el diagnóstico de rabia
Muestra Toma de la muestra Condiciones para su
conservación
Biopsia de
cuero
cabelludo
Para el diagnóstico de rabia se debe tomar
una muestra de 5 mm3 proveniente del
cuero cabelludo en la región de la nuca.
Colocar en un recipiente hermético sin
ninguna solución.
Es indispensable enviar historia clínica
detallada y completa.
Mantener en refrigeración
de 4 a 8 °C y enviar de
inmediato.
Encéfalo
La toma de la muestra debe efectuarse por
personal médico capacitado, el cual seguirá
en forma rigurosa las condiciones de
asepsia. Para diagnóstico de rabia se
recomienda enviar los dos hemisferios
cerebrales o de lo contrario las regiones de
la médula espinal, cerebelo, asta de
Ammón y corteza cerebral de inmediato,
posterior al fallecimiento.
Los fragmentos no deben pesar menos de 5
g. En los casos en que no se autorice la
autopsia, la muestra debe tomarse de
El tejido debe enviarse
dentro de las primeras 24
h después de su extracción
manteniéndolo a
temperatura entre 4 y 8
°C. De no ser así se debe
mandar congelado y de
inmediato.
En el caso de especies
silvestres pequeñas enviar
el espécimen completo.
Nota: por ningún motivo
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Versión 01
inmediato por punción retrorbital o a
través del orificio occipital esta técnica se
aplica igual en el caso de animales
domésticos o silvestres en los que se
sospeche encefalitis por virus de rabia. Es
indispensable enviar historia clínica
detallada y completa.
debe sumergirse el
encéfalo en solventes
como por ejemplo;
formaldehido, fenol,
alcohol.
Se debe mantener y enviar
en congelación y de
inmediato.
Hisopo
sublingual
Para el diagnóstico del virus de la rabia,
con hisopo de dacrón preferentemente o
en su defecto de algodón, tomar la muestra
introduciendo la punta del hisopo debajo
de la lengua, realizando un raspado suave
y suficiente en las glándulas salivales,
extraer el hisopo y sumergirlo en 2.0 mL
de solución salina o medio de transporte
estéril. Es indispensable enviar historia
clínica detallada y completa.
Para el diagnóstico del
virus de la rabia, se debe
enviar en un tubo con
tapón de rosca a una
temperatura de 4 a 8 °C.
Impronta de
córnea
Se deben tomar dos impresiones de la
córnea de cada ojo, utilizar un portaobjetos
previamente desengrasados con una
mezcla de etanol-éter (v/v). El material
debe ser suficiente para circunscribir dos
campos con el lápiz graso. Los
portaobjetos se deben secar al medio
ambiente por 30 min y colocarse en un
portalaminillas, si es posible fijar las
improntas con una solución de acetona fría
(-20 °C). Es indispensable enviar historia
clínica detallada y completa.
Para el diagnóstico del
virus de la rabia: los
portaobjetos se colocan en
un portalaminillas. No hay
que refrigerar el paquete,
pero sí protegerlo de la
humedad, la luz solar o del
calor excesivo.
Es importante evitar que
las improntas se froten
entre sí.
Líquido
cefalorraquídeo
(LCR)
Para el diagnóstico de rabia la toma de
muestra se debe efectuar en un hospital
por personal médico capacitado, el cual
debe seguir en forma rigurosa las
condiciones de asepsia. Obtener de 3.0 a
5.0 mL del LCR y colocarlos en un tubo
estéril con tapón de rosca.
De inmediato enviar la
muestra al laboratorio,
transportarla a
temperatura entre 4 y 8
°C.
Saliva
Extraer con una jeringa sin aguja de la
región sublingual un volumen de 1.0 a 3.0
mL de saliva y recolectarla en un tubo
estéril con tapón de rosca.
De inmediato enviar la
muestra al laboratorio,
transportarla a
temperatura entre 4 y 8
°C.
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Versión 01
Suero
Esta muestra no es de valor diagnóstico,
únicamente se utiliza para el monitoreo de
la concentración de anticuerpos
protectores en las personas involucradas
laboralmente con el virus. Utilizar un tubo
sin anticoagulante, y enviar únicamente de
3.0 a 5.0 mL de suero que no debe estar
hemolizado, ni lipémico y se debe
conservar en refrigeración o congelado, a
menos que se dé otra indicación.
El suero se debe trasvasar
a un tubo estéril y enviarse
de inmediato al
laboratorio a temperatura
entre 4 y 8 °C.
Mamíferos
pequeños
Encéfalo, médula espinal, asta de Ammón
y cerebelo, en el caso de quirópteros se
debe enviar el espécimen completo
congelado y de ser posible para el caso de
zorrillos, zorros, lobos, coatís, gato montés,
puma, tlacuache, etc. acompañado de fotos
en formato electrónico y en papel, así
como su clasificación taxonómica, en caso
contrario, esta deberá ser realizada en el
InDRE.
Los especímenes deben
enviarse congelados
Cuando el personal de la RNLSP procese muestras de alta importancia
epidemiológica; como las de seres humanos en aquellas áreas sin presencia de
rabia en los últimos tres meses, o de especies silvestres en estado de
descomposición será necesario notificarlo por escrito al laboratorio de rabia del
InDRE, corroborándose dicha información con la fecha de procesamiento de origen
de la muestra.
Las muestras de encéfalo que se envíen para aseguramiento de calidad deberán
estar congeladas y contener las regiones anatómicas idóneas: médula espinal, asta
de Ammón y cerebelo, que hayan sido procesadas previamente por personal del
LESP. En muestras procedentes de quirópteros que envíen escasa cantidad es
necesario lo comuniquen por vía correo electrónico al jefe del laboratorio: QBP
Miguel Iguala Vidales [email protected], [email protected], para
evitar que las muestras sean rechazadas, se intentarán recuperar a través de la
técnica de cultivo celular en un lapso de tiempo máximo de 30 días.
En el caso de que algún laboratorio estatal pierda la liberación del aseguramiento
de la calidad por una mala calificación repetida en el panel de eficiencia, enviará el
100% de muestras positivas y el 5% de muestras negativas; debe enviar su
paquetería correspondiente los días lunes y martes de cada semana al laboratorio
de rabia del InDRE, de no ser posible se debe notificar oficialmente y de manera
inmediata su fecha de envío antes de 30 días de haber procesado las muestras
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Versión 01
enviadas, estas deben venir acompañadas de su respectiva historia clínica y
formato de envío (anexos), cuidar que las muestras no vayan a derramarse y
manchar la papelería, porque serán rechazadas. La emisión de los resultados de las
muestras de control de calidad que se procesen en InDRE se realizará en un tiempo
de 4 días.
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Versión 01
Figura 3. Toma de muestra de impronta de córnea
Figura 4. Toma de muestra de biopsia de cuero cabelludo
PORTALAMINILLA
MUESTRAS
NERVIO OPTICO
Se colocan en portalaminillas de plástico
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Versión 01
Figura 5. Toma de muestra de hisopo sublingual
Figura 6. Toma de muestra de líquido cefalorraquídeo
ENVÍAR DE 3 A 5 mL EN CONDICIONES DE
REFRIGERACIÓN (ENTRE 4 Y 8 °C)
LA MUESTRA DEBERÁ SER TOMADA POR UN
ESPECIALISTA
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
HISOPO SUBLINGUAL
EL HISOPO SE COLOCA DENTRO DE UN TUBO DE ENSAYE CON 2.0 mL DE SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA Y/O SE RECOLECTAN DE 1.0 A 3.0 ML DE SALIVA CON UNA JERINGA SIN AGUJA EN UN TUBO ESTÉRIL CON TAPÓN DE ROSCA.
GUARDAR ENTRE 4 Y 8°C.
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Versión 01
Figura 7. Toma de muestra de suero
Figura 8. Toma de muestra de cerebro
MUESTRA SIN VALOR DIAGNÓSTICO SOLO SIRVE PARA CONOCER EL GRADO DE PROTECCIÓN CONTRA INFECCIÓN DEL VIRUS
3.0 a 5.0 mL REFRIGERACION (ENTRE 4 Y 8 °C)
SUERO
CEREBRO
Axis
POR PUNCION RETRORBITAL En caso de no aprobarse
la necropsia
ENCÉFALO: MÉDULA ESPINAL CEREBELO ASTA DE AMMÓN
CORTEZA CEREBRAL
POR EL ORIFICIO OCCIPITAL
ENVIAR AL LABORATORIO DE RABIA DEL InDRE PARA DIAGNÓSTICO CEREBRO COMPLETO, PARA MUESTRAS PROCEDENTES DE ANIMALES ENVIAR MEDIO CEREBRO AL LABORATORIO DE REFERENCIA
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Versión 01
Formato para el etiquetado de contenedores primarios y exteriores 1
Figura 9. Etiqueta del contenedor primario
Figura 10. Etiquetas “a, b, c y d” para el contenedor exterior
1 El Sistema Básico de Triple Embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C, si el tipo de muestra y ensayo lo requiere. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete.
FECHA: (toma de la muestra) No. DE MUESTRA: ______________________ ESPECIE: _____________________________ LOCALIDAD: __________________________ MUNICIPIO: __________________________ ESTADO: _____________________________
a)
b)
(d)
UN3373
(a)
Remitente: _________________
____________________________ ____________________________
TEL: _______________________
(b)
Destinatario: ________________
_____________________________ _____________________________
TEL: ________________________
(c) Persona responsable: _______
____________________________ ___________________________
TEL: _______________________
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Versión 01
Figura 11. Etiquetas de orientación del contenedor exterior (2)
Figura 12. Contenedores primarios
Nombre: Orientación del paquete Dimensiones mínimas: 74x105 mm Para paquetes pequeños: 37x52.5 mm Color: negro y blanco, o bien rojo y blanco
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Versión 01
Figura 13. Sistema de embalaje y contenedor para transporte en frío o en congelación
Contenedor primario
Hielera
Tapa de hielera
Etiqueta de orientación
B C
D
Caja de cartón
Certificado de calidad
A
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Versión 01
Algoritmo diagnóstico
Figura 14. Algoritmo diagnóstico de rabia
Clave de tabulador para algoritmo diagnóstico. 1A7526001, identificación del virus
rábico en material encefálico e improntas de córnea por IFD.
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Versión 01
Algoritmo para la inoculación intracerebral del líquido cefalorraquídeo, saliva e
hisopo sublingual de humano en ratón por PB clave del tabulador: 1A7526016 y
1A7526008
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Versión 01
En el caso de que algún LESP pierda la liberación del aseguramiento de la calidad por una mala calificación repetida en el panel de eficiencia, enviará el 100% de muestras positivas y el 5% de muestras negativas y se aplicará el siguiente algoritmo:
Figura 15. Algoritmo de aseguramiento de calidad de rabia
Clave del tabulador para el algoritmo de aseguramiento de calidad 1A7526001 e
identificación del virus rábico en material encefálico e improntas de córnea por IFD
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Versión 01
Figura 16. Algoritmo de referencia de rabia
Claves del tabulador para el algoritmo de referencia. 1A7526008; algoritmo para la
inoculación intracerebral de tejido encefálico y biopsia de cuero cabelludo en ratón
por PB, 1A7526010; algoritmo para la identificación de la variante antigénica del
virus de la rabia (ACMO),1A7526011; algoritmo para cultivo celular como prueba
confirmatoria para el virus rábico,1A7526012; algoritmo para identificación del
virus de la rabia por RT-PCR.
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Versión 01
1A7526009; algoritmo de titulación de anti-IgG del virus rábico por ELISA.
Criterios de aceptación y rechazo
Criterios de aceptación
1. Se aceptarán las siguientes muestras biológicas:
a) Humanos (antemortem): Biopsia de cuero cabelludo, hisopo sublingual,
saliva, impronta de córnea, LCR y suero (solo para titulación de anticuerpos);
post mortem: Encéfalo, médula espinal, asta de Ammón y cerebelo.
b) Animales: encéfalo, médula espinal, asta de Ammón y cerebelo. En el caso de
quirópteros se debe enviar el espécimen completo congelado; de ser posible,
para el caso de zorrillos, zorros, lobos, coatís, gato montés, puma, tlacuache,
etc., acompañado de fotos en formato electrónico y en papel, así como su
clasificación taxonómica, en caso contrario esta deberá ser efectuada en el
InDRE.
2. Todas las estructuras del encéfalo deben ser enviadas en un frasco de plástico
con tapa de rosca, envuelta con Parafilm® alrededor de la tapa y perfectamente
etiquetadas.
3. Las muestras de encéfalo con más de 48 horas de haber sido obtenidas deberán
mantenerse congeladas hasta su arribo al laboratorio.
4. Las muestras de encéfalo con menos de 48 horas de haberse obtenido pueden
mantenerse almacenadas entre 4 y 8 °C hasta su llegada al laboratorio.
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Versión 01
Criterios de rechazo
1. Muestras inadecuadas (diferentes a las establecidas)
2. Muestras derramadas
3. Muestra insuficiente
4. Muestras en estado de descomposición
5. Muestras no identificadas
6. Muestras sin oficio de petición, formato de envío (indispensable llenar el rubro
de vacunación) e historia clínica
7. Muestras para referencia o aseguramiento de la calidad que no cuenten con
resultado escrito y la firma del responsable del diagnóstico en la historia clínica
8. Muestras en formaldehído, fenol o alcohol
9. Tiempo de evolución, la muestra enviada al InDRE para diagnóstico de rabia
no debe rebasar los 30 días después de la muerte del ser humano o del animal.
Catálogo de rechazos
Cuadro 3. Catálogo de rechazos
Clave de rechazo Descripción
SHC Sin historia clínica
MC Mal capturadas
TV Tubo vacío
NLL No llegó muestra
MI Muestra inadecuada
TR Tubo roto
MIN Muestra insuficiente
SI Sin identificación
MD Muestras derramadas
TE Tiempo de evolución
MM Muestras mezcladas
NODOC No llegó información requerida
DE Datos erróneos
DI Datos de muestra ilegibles
FI Falta de información
MDM Muestra derramada y mezclada
MEE Muestra enviada por error
MH Muestra hemolizada
MPI Muestra para investigación interna
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Versión 01
ESTÁNDARES DE CALIDAD
La funcionalidad de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnóstico de rabia
puede evaluarse en tres fases: 1) Preanalítica, 2) Analítica y 3) Postanalítica.
Fase pre-analítica
En la fase preanalítica se evalúa la oportunidad en la obtención de las muestras y
calidad de las mismas, hasta su llegada al laboratorio.
Indicador 1 (semestral)
Se habla de una muestra adecuada si esta cumple con los requerimientos de este
lineamiento en su sección de criterios de aceptación y rechazo, dependiendo del
tipo de muestra, en relación con la, cantidad de muestra biológica (suficiente),
temperatura de conservación y embalaje para el transporte.
Un indicador para evaluar esta fase es el índice de rechazo (IR) de muestras. El
punto de corte del mismo es que no rebase el 10%. El cumplimiento de este
indicador es indispensable para mantener la adecuada sensibilidad de la prueba.
Este indicador forma parte de los paneles de eficiencia.
El cálculo del indicador es el siguiente:
IR = X 100
Indicador 2 (semestral)
El objetivo del diagnóstico es confirmar en una muestra representativa la presencia
del virus de la rabia, es decir la vigilancia virológica.
El número de muestras enviadas para aseguramiento de la calidad al InDRE deben
cubrir el 85% de las unidades antirrábicas u otra unidad de salud en cada entidad.
Para la determinación de este indicador en el InDRE se debe enviar en formato
electrónico, de forma mensual, la base de rabia (ver cuadro en Anexo 1) al siguiente
correo: [email protected]
Índice de
rechazo
0.5 a 1% Alarma, enviar documento de advertencia al área con
solicitud de respuesta inmediata con medidas correctivas
>2% No cumple, acción de corrección del centro antirrábico u
otra unidad de salud que envía la muestra y mediante
correo electrónico, oficio paralelo al director del
Laboratorio Estatal de Salud Pública. Se espera que esta
medida sea corregida en las 2 semanas siguientes
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Versión 01
Se notificará por oficio cuando la entidad rebase la meta establecida por el
programa nacional de zoonosis nacional en cuanto al número de muestras de perro
procesadas por laboratorio para diagnóstico de rabia.
% de muestreo de centro antirrábico /unidad de salud =
Criterios de evaluación
Porcentaje de
muestreo de algún
centro antirrábico u
otra unidad de
salud
>85%
Evaluar la correlación con la presencia de casos
positivos en centros antirrábicos u otras unidades
de salud. Cobertura de meta adecuada
60-85%
Llamar y enviar oficio al LESP del estado para
discutir problemática y definir proceso para
corrección de mejora, la cual debe implementarse
y demostrar corrección en 2 semanas
<60%
Visita inmediata de auditoria al LESP para
discutir problemática y definir proceso de
discusión y firma con el director o subsecretario
de los servicios de salud, así como con el
responsable del programa de zoonosis en el
estado y se documentará mediante oficio
Fase analítica
Comprende todo el flujo de muestra dentro del proceso analítico y se utilizarán dos
indicadores: 1) desempeño técnico y 2) oportunidad del proceso analítico.
El indicador de desempeño técnico se obtiene mediante el envío de paneles de
eficiencia (dos veces por año), el cumplimiento de la cédula de verificación en
visitas de supervisión (una vez al año), la concordancia con las muestras enviadas
para secuenciación y el cumplimiento con las bases del sistema vectorial de
caminando a la excelencia.
Indicador 1 (semestral)
Índice de desempeño técnico
Concordancia=
Solo aplica para los laboratorios que no tiene liberado el aseguramiento de la
calidad.
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Versión 01
Evaluación del desempeño = x 100
Supervisión
= X100
Criterios de evaluación
Índice de
desempeño
ponderación
>90% Sobresaliente
70 a 89%
Satisfactorio: Se indican medidas correctivas para
mejora, que se deberán cumplir en un tiempo mínimo
de 2 meses y se observan con continuidad del
diagnóstico.
50 a 69%
Mínimo. Se suspende el diagnóstico por 6 meses y se
dan recomendaciones a cumplir. Se evalúa de nuevo al
término de ese tiempo para saber si se reincorpora a la
red de diagnóstico. Se envía oficio al director del LESP
correspondiente.
<50%
Precario. No se incorpora a la red de diagnóstico o se
suspende el diagnóstico por un año hasta llegar al nivel
satisfactorio. Se envía oficio al director del LESP
correspondiente.
Fase postanalítica
El indicador de fase postanalítica, emisión de resultado, el cual medirá el tiempo
transcurrido entre el término del análisis por IFD y el reporte de resultados. Todos
los laboratorios que realizan el diagnóstico de rabia para esta red deben informar el
tiempo entre la recepción de la muestra, procesamiento, captura y envío de
resultados dentro de las primeras 24 horas de terminado el proceso.
Indicador 1 (semestral)
Para la determinación de este indicador en el InDRE se debe enviar mensualmente
en formato electrónico la base de rabia (ver cuadro en anexo 1) a la siguiente
dirección de correo electrónico: [email protected]
Oportunidad en la emisión de resultados = Fecha de emisión del resultado
de la muestra − Fecha de recepción de la muestra en el laboratorio
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Versión 01
Criterios de evaluación
Oportunidad en
la emisión de
resultados
0 a 1 día Adecuado
2 a 3 días
Alarma, se solicita informe y medida de corrección al
director del LESP, por escrito, para cumplir en
tiempo y forma en una semana. Si persiste el
problema, se suspende el diagnóstico por 2 semanas
y se notifica por escrito al director del LESP
>3 días
Crítico, se revisa el área y se otorga un período de
una semana para corrección y de continuar, se
suspende el diagnóstico y se notifica por escrito al
director del LESP
El seguimiento de los indicadores en el InDRE se lleva a cabo por la Dirección de
Servicios de Apoyo en coordinación con el área coordinadora de la RNLSP y serán
revisados semanalmente, excepto el de desempeño técnico que se evalúa
semestralmente.
Captura de datos y resultados Los tiempos establecidos para la emisión de los resultados por parte del laboratorio
de rabia del InDRE serán los establecidos en el programa de INFOLAB y son los
siguientes:
a) IFD 3 días hábiles.
b) Caracterización antigénica (se mantienen en observación a los ratones por un
lapso de 30 días), tipificación genética, inmunohistoquímica, cultivo celular,
RT-PCR y secuenciamiento genética, 30 días naturales. Titulación de
anticuerpos mínimo 30 días.
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO Para la evaluación del desempeño se establecieron los ensayos de aptitudes, que
constituyen una herramienta de aseguramiento de la calidad, la cual permite a los
laboratorios monitorear su desempeño, comparar sus resultados con laboratorios
similares, evaluar la competencia en el desarrollo de sus pruebas e identificar áreas
de oportunidad.
Dentro de los ensayos de aptitud se encuentran los Programas de Evaluación
Externa del Desempeño (PEED), herramienta que utiliza el InDRE para la
evaluación continua de la competencia técnica y la identificación de necesidades de
fortalecimiento de un individuo, de un grupo de laboratorios o de las redes de
diagnóstico específico mediante el envío a intervalos regulares continuos de
paneles de muestras caracterizadas.
El tiempo de envío de los resultados contará a partir del día en que sea recibido el
paquete en el LESP de cada entidad (el lapso de tiempo máximo para recoger sus
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Versión 01
paquetes en nuestras instalaciones será de 24 horas), por lo que se solicita enviar
junto con el formato de resultados, la copia de la guía con la fecha de recepción del
paquete a su LESP, o notificar al laboratorio de rabia por vía telefónica o por correo
electrónico cuando sea recibido dicho panel. La fecha límite máxima para recibir
resultados será de una semana a partir de la fecha de envío del panel, siempre y
cuando establezcan comunicación previa con el laboratorio de rabia del InDRE, de
lo contrario se emitirá una calificación reprobatoria
Reprobatoria
Los criterios están basados en la de Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012,
Para la vigilancia epidemiológica y la Norma Oficial Mexicana NOM-011-SSA2-
2011, Para la prevención y control de la rabia humana y en los perros y gatos.
El laboratorio de rabia del InDRE guarda hasta 15 días las muestras a partir de la
fecha de envío del panel de resguardo que se envía en forma simultánea a la red,
para cualquier aclaración posterior.
Paneles de eficiencia para IFD, aplica en la red de los laboratorios
estatales, y la caracterización antigénica que aplica en los
laboratorios estatales que funcionarían como regionales para esta
técnica
Los laboratorios de la red de rabia recibirán semestralmente un panel de eficiencia
y con base en los resultados obtenidos se evaluará su desempeño y se definirá si se
libera el diagnóstico, por lo menos deben obtener el 85% en la calificación.
Concordancia entre 85 y 100%, se mantiene este tipo de evaluación.
Concordancia menor al 85%, se requiere comprar un nuevo panel.
Concordancia no aceptable en el segundo panel, se requiere de capacitación
y establecer nuevamente el envío de muestras para realizar diagnóstico en el
InDRE.
En la actualidad el LESP del estado de Hidalgo es el único que realiza la técnica de
caracterización antigénica desde el año 2006. A partir del mes de febrero del 2010
emite los resultados de caracterización antigénica de manera oficial a sus
respectivas autoridades estatales.
El LESP Hidalgo debe enviar trimestralmente al laboratorio de rabia del InDRE sus
resultados de caracterización antigénica así como el 100% de sus muestras para
referencia.
Es importante señalar que las muestras enviadas para referencia deberán ser
remitidas junto con su respectiva muestra aislada en cerebro de ratón (aquellas
donde sea posible el aislamiento) en un solo envío y no por separado.
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En el envío del segundo panel de IFD se enviará simultáneamente otro panel para
caracterización antigénica dando un lapso de dos días más para enviar sus
resultados oficiales (de la fecha establecida para enviar resultados de IFD se
prolonga dos días más).
Criterios para la liberación del diagnóstico de rabia mediante
inmunofluorescencia directa
La liberación del diagnóstico será otorgada a los LESP que cumplan con cada uno
de los siguientes criterios:
1. Comprobar que se cuenta con la infraestructura necesaria para implementar
y mantener el diagnóstico.
2. Obtener una calificación promedio anual de los dos Paneles de Evaluación
Externa del Desempeño (PEED) mínima de 8.5.
3. Tener constancia de capacitación o actualización en IFD emitida por el
InDRE, con un máximo de 5 años de vigencia; cursos anuales o asistencia al
InDRE, con una calificación final mínimo de 9.0 durante la capacitación o
curso.
4. A los LESP que aplique (Guerrero, Morelos y Oaxaca), obtener como mínimo
el 90% de concordancia en el control de calidad mensual enviado al InDRE,
completando un total de envío de 300 muestras a partir de la vigencia de
estos lineamientos.
La liberación del diagnóstico de rabia otorgada por el InDRE se puede
suspender si el LESP:
1. Obtiene una calificación menor a 80% en los paneles de eficiencia en dos
ocasiones consecutivas (incluyendo el panel que compre el LESP). El LESP
tendrá la responsabilidad de enviar al laboratorio de rabia del InDRE su
plan de acción. El InDRE solicitará al LESP implemente de nuevo el control
de calidad, enviando el 5% de las muestras negativas y el 100% de las
positivas durante 6 meses, también se programará una visita al LESP para
evaluar sus instalaciones, equipo y metodología; finalmente solicitará se
recapacite al personal responsable del diagnóstico de rabia en el InDRE por
un lapso de una semana.
2. A los LESP que aplique (Guerrero, Morelos y Oaxaca), si obtienen una
calificación menor a 90% en el control de calidad mensual enviado al
InDRE, se programará una visita al LESP para evaluar sus instalaciones,
equipo y metodología; finalmente solicitará se recapacite al personal
responsable del diagnóstico de rabia en el InDRE por un lapso de una
semana.
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Versión 01
Banco de material biológico
El objetivo del banco de muestras biológicas es mantener todos los especímenes
recibidos en el laboratorio, dentro de un orden y conservación, a través de un
etiquetado que incluye el número asignado en el laboratorio, su origen,
procedencia, especie y año; estas se resguardan en ultracongeladores a -70 °C para
su control interno, el etiquetado facilita el manejo e identificación cuando son
solicitadas por el resto de las áreas internas del laboratorio.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Actividad ene feb mar abr may jun jul ago sep oct nov dic
Envío del primer
panel a la RNLSP - - - - XX - - - - - - -
Recepción de
resultados en el
InDRE
- - - - XX - - - - - - -
Envío de resultados
a la RNLSP - - - - XX - - - - - - -
Curso InDRE Rabia - - - - - - - XX - - - -
Envío del segundo
panel a la RNLSP - - - - - - - - - - XX -
Recepción de
resultados en el
InDRE
- - - - - - - - - - XX -
Envío de resultados
a la RNLSP - - - - - - - - - - XX -
El envío de los paneles, la recepción de información y resultados se enviará por
medio de correo electrónico y por paquetería.
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Las medidas de bioseguridad, deben seguirse obligatoriamente, en virtud del riesgo
de infección durante la manipulación del animal o de las muestras tomadas.
Incluso, se deben extremar precauciones cuando se intenta aislar el virus por
inoculación en animales de experimentación o en cultivos celulares, ya que durante
el desempeño de estas metodologías, existe el riesgo de la generación de aerosoles.
Así mismo, no debe omitirse el peligro de infección con objetos punzocortantes que
contienen material biológico potencialmente infeccioso, ni por salpicaduras en las
mucosas ocular u oral, o en la piel con lesiones. Además, se debe considerar que las
muestras procesadas durante la rutina pueden contener otros agentes patógenos
que atacan el sistema nervioso central. Por lo tanto, se debe:
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Trabajar en un laboratorio exclusivo para el diagnóstico de rabia.
Usar batas de manga larga, guantes gruesos, careta y cubrebocas.
Descontaminar las mesas antes, durante y al final de la jornada, con una
combinación de por lo menos dos de las siguientes soluciones: detergente al
1%, yodo al 7%, alcohol al 70%, sales cuaternarias de amonio diluidas 1:500
o benzal.
No usar cristalería, materiales de plástico e instrumental que se encuentre
rayado o roto.
Sumergir durante 12 horas en alguna de las soluciones citadas en el punto 3
y esterilizar en autoclave a 15 libras/pulg2 durante 30 minutos todo el
material reutilizable empleado para la manipulación o procesamiento de
tejidos.
Descontaminar el suelo por lo menos una vez al día.
Desechar tejidos y material contaminado dentro de bolsas amarillas
etiquetadas con el símbolo de peligro biológico infeccioso, que de acuerdo
con la norma SEMANART-087 se deben incinerar no después de 48 horas
de almacenamiento.
Colocar en bolsas del mismo tipo pero de color rojo, guantes, cubrebocas y
gasas previamente desinfectados.
Al medir el volumen de cualquier solución con una pipeta, nunca se debe de
succionar con la boca.
Dentro del laboratorio queda estrictamente prohibido fumar, aplicarse
cosméticos, beber, conservar o consumir alimentos.
Lavarse siempre las manos y quitarse la bata al salir del laboratorio.
La preparación de la suspensión viral para la prueba biológica, la infección
de cultivos celulares y el manejo de cultivos celulares infectados, debe
realizarse en un gabinete de bioseguridad nivel II.
Cualquier herida causada por un accidente de laboratorio debe ser lavada
suavemente con agua y jabón, evitando traumatizar los tejidos.
Aplicar alguno de los desinfectantes antes mencionados excepto benzal. Si el
accidente involucró algún material u objeto contaminado con tejido
potencialmente infectado, inmediatamente aplicar un refuerzo de la vacuna
antirrábica para humanos. El número de dosis dependerá de la gravedad de
la lesión. Cualquier duda puede consultarse con los encargados del
Programa Nacional de Zoonosis a los teléfonos 26 14 64 68 y 26 14 64 70 de
la Coordinación de Vigilancia Epidemiológica o en la Norma Oficial
Mexicana NOM-011-SSA2-2011, Para la prevención y control de la rabia
humana y en los perros y gatos. Debe considerarse que la aplicación de
gamma globulina está contraindicada en las personas que han recibido
tratamiento pre o postexposición, ya que bajo estas circunstancias puede
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retardarse e incluso inhibirse la producción de anticuerpos.
De acuerdo con las recomendaciones para la inmunización profiláctica
preexposición, propuestas en el sexto informe de expertos en rabia de la
OMS en 1973, la protección se logrará con la aplicación de tres dosis de
vacuna antirrábica a intervalos de 7 días: 0, 7 y 21 o 28 días según el
fabricante. La determinación de anticuerpos se hará después de 3 semanas.
Si la concentración de anticuerpos es menor de 0.5 UI/mL se aplicará un
refuerzo y los anticuerpos nuevamente se determinarán después de 3
semanas. Según la OMS, la determinación de anticuerpos debe efectuarse
cada 6 meses aun cuando las vacunas de cultivo celular inducen protección
que puede durar de 1 a 3 años. El riesgo y la variabilidad del estado inmune
de cada persona hacen necesaria la determinación de anticuerpos,
continuamente.
La manipulación de sueros humanos se debe realizar con todas las medidas de
bioseguridad para el manejo de material potencialmente infectado con el virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) o con el de hepatitis B. Bioseguridad en
Laboratorios, Manual de Bioseguridad.
Infraestructura y bioseguridad para los Laboratorios Estatales de
Salud Pública miembros de la Red de Rabia
Los LESP deben contar con la infraestructura necesaria para la realización del
diagnóstico de rabia, así como con un área exclusiva destinada a este fin con un
nivel de contención tipo II y el siguiente, equipo para este fin: gabinete de
bioseguridad tipo II, un microscopio de epifluorescencia, incubadora, refrigerador
y ultracongelador. Los sistemas de suministro de aire pueden ser instalados,
siempre y cuando no interfieran con los flujos de aire de los gabinetes de
bioseguridad, además de instalarse lejos de puertas y ventanas. Considerar
sistemas con flujo interno sin recirculación a espacios fuera del laboratorio.
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BIBLIOGRAFÍA
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WHO Press; 2004.
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Versión 01
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS
Titulación de anticuerpos neutralizantes del conjugado antirrábico
La titulación del conjugado antirrábico tiene como propósito determinar la dilución
de trabajo del producto biológico.
Esto se logra al encontrar una buena sensibilidad de 4+ a la dilución máxima del
conjugado, en la cual se puede detectar sin posibilidad de error cualquier forma en
la que se encuentre el antígeno del virus de la rabia: cuerpos obloides (acúmulo de
proteína N), polvo antigénico. Así mismo, en dicha dilución la inespecificidad del
conjugado debe ser nula sobre la impronta negativa.
Procedimiento
1. Limpiar la mesa con una solución de etanol-benzal v/v colocar papel estraza.
2. Marcar 7 portaobjetos con 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64 y 1:128 y
desengrasarlos con una solución de éter/alcohol etílico 1:2.
3. Preparar el encéfalo de un roedor con positividad de 4+.
4. Hacer una impronta de aproximadamente 1.0 cm de diámetro en el
portaobjetos rotulado con la dilución 1:2, hacer lo mismo hasta el marcado
con 1:128; hacer lo mismo con una muestra de cerebro negativa.
5. Colocar los portaobjetos en una rejilla y después en una caja para tinción
con acetona a -5 o -10 °C durante 10 minutos, secar al medio ambiente.
6. Circunscribir las improntas con un lápiz graso de color o marcador de
pintura permanente de color blanco y de secado rápido.
7. Colocar dos series de 7 tubos rotulados con 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64 y
1:128.
8. Agregar a cada tubo 100 µL de agua destilada estéril.
9. Reconstituir el conjugado con el volumen de agua destilada estéril que
indique el fabricante.
10. Agregar al primer tubo de cada serie (marcado como 1:2) 100 µL de
conjugado, homogenizar y pasar al siguiente tubo (marcado como 1:4) 100
µL de esa dilución. Este proceso se repite hasta el tubo marcado como 1:128.
11. Colocar una gota de la dilución 1:2 en una de las improntas positivas y hacer
lo mismo con la dilución 1:2 en la otra impronta negativa. La gota debe
cubrir toda la superficie de la impronta circunscrita con el marcador; los
pasos se repiten hasta la dilución 1:128.
12. Incubar las preparaciones a 37 °C durante 30 minutos en una cámara
húmeda.
13. Colocar los portaobjetos en una rejilla y lavar rápidamente 3 veces con
regulador de fosfatos (PBS) pH 7.4. Colocar nuevamente en una caja de
tinción con PBS pH 7.4 limpio y lavar agitando manualmente durante 3 min.
14. Hacer otro lavado con agua destilada, agitando manualmente durante 3 min.
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15. Repetir una vez más los dos pasos anteriores.
16. Colocar las preparaciones en la caja de tinción con Azul de Evans al 0.02%,
teñir durante 5 min, algunos conjugados ya contienen el colorante por lo que
se suprimiría este paso.
17. Tirar el agua con el colorante y colocar agua limpia en la caja de tinción.
Enjuagar agitando durante 40 segundos y secar al aire.
18. Agregar una gota de glicerina amortiguada a pH 8.4 sobre cada impronta y
colocar un cubreobjetos.
19. Leer en un microscopio de epifluorescencia a 400 aumentos; objetivo 40X y
ocular 10X, comenzando por la dilución 1:2 de las improntas, si se observa
exceso de fluoresceína en el tejido se procede a observar la siguiente
dilución.
20. La dilución óptima del biológico es aquella donde se observa una
fluorescencia específica 4+ (90 % de afinidad específica), polvo antigénico e
hilos a una intensidad verde manzana muy brillante 4+ en el fluorocromo,
mientras que en la correspondiente negativa no se debe de observar
fluorescencia alguna. El color rojizo del fondo sirve como colorante de
contraste a la fluorescencia emitida por el fluorocromo.
21. Una vez que se determinó la dilución óptima, el conjugado se debe
almacenar en alícuotas para evitar congelar y descongelar el reactivo ya que
esto provoca baja afinidad específica del mismo.
Interpretación de resultados
Las muestras evaluadas con este conjugado muestran que en una dilución 1/32 las
lecturas se mantienen con los parámetros de 4+ para la fluorescencia específica y
4+ para la intensidad del fluorocromo, mientras que en la dilución 1/64 la
intensidad del fluorocromo baja, aunado a que no existe fluorescencia inespecífica
en el control negativo, esto indica que la dilución óptima del reactivo es 1/32.
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1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/512
1-09
(negativo) - - - - - - - -
25-09-VAg-8 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ -
334-09-VAg-
11* 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ 2+/1+
8374-08-
VAg-8 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ 2+/1+
1767-08-VAg-
9 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ 2+/1+
1770-08-VAg-
9 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ -
9022-07-
VAg-9 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/3+ 3+/2+ -
Fluorescencia específica/intensidad de fluorocromo
Aquellas diluciones donde no se observaron células, son debido al desprendimiento
en los lavados ya que la adherencia de la membrana celular al cristal es débil.
Técnica de inmunofluorescencia directa (IFD)
Principio del método
Detectar por medio de IFD epítopos de la proteína N del virus de la rabia por
interacciones inmunoenzimáticas mediante mezclas de anticuerpos monoclonales
conjugados a fluoresceína.
Sistema de muestra primaria
Postmortem
1. Encéfalo completo
2. Asta de Ammón
3. Hipocampo
4. Cerebelo
5. Bulbo raquídeo
6. Médula espinal
Antemortem
1. Biopsia de cuero cabelludo
2. Hisopo sublingual
3. Líquido cefalorraquídeo
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Versión 01
Para obtener el encéfalo de las muestras primarias antemortem se someten a un
método de aislamiento del virus de la rabia en ratón lactante antes de realizar la
IFD.
En casos muy particulares, las muestras de improntas de córnea que no pertenecen
a encéfalo como el método lo indica en sistema de muestra primaria, previamente
fijadas en acetona a -5 o -20 °C durante 10 min, se integran al paso 14 del
desarrollo de la técnica de IFD que se describe a continuación.
Tipo de contenedor y aditivos
Todas las muestras deben ser enviadas conforme al manual de toma y envío de
muestras (REMU-MA-01) 2012, apartado “Manual para la Toma, Envío y
Recepción de Muestras para Diagnóstico”
www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html
Objetivo
Identificar antígenos proteicos del virus mediante mezclas de anticuerpos
monoclonales conjugados a fluoresceína de todo el sistema de muestras primarias.
Especificaciones de desempeño
Parámetro Criterio Resultado Cumple
Sensibilidad 99.9%
100% Sí
Especificidad 99.9%
100% Sí
VPP 100% Sí
VPN 100% Sí
Índice de correlación 1 Sí
Incertidumbre En métodos cualitativos
no aplica (Conjugado)
-------
Equipo e instrumentos de medición
Micropipeta de 50-1000µL
Micropipeta de 2-20 µL
Micropipeta de 20-200 µL
Balanza granataria
Incubadora
Refrigerador
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Ultracongelador -20 °C
Ultracongelador -70 °C
Microscopio de epifluorescencia
Potenciómetro
Materiales
Tijeras y pinzas de disección
Tubo con tapa de rosca de 1.8 mm de diámetro y capacidad de 4.0 mL
Portaobjetos biselados
Cubreobjetos
Abatelenguas de madera
Algodón
Guantes de exploración (látex)
Matraz Erlenmeyer de 4.0 L
Vasos de precipitados 2.0 L
Espátulas
Gradilla
Gasas
Marcador indeleble sin alcohol
Papel absorbente
Puntas para micro-pipeta de 20 µL, 200 µL y 1000 µL
Contenedores con porta laminillas para tinción
Cámara húmeda para laminillas
Pizetas de 250 mL
Jarra de pastico de 2.0 L
Lápiz graso
Lápiz punta de diamante
Reactivos y materiales biológicos
Alcohol etílico (C2H6O)
Éter etílico
Agua destilada
Acetona (CH3)2CO
Solución germicida de uso quirúrgico; cloruro de benzalconio
Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4•H2O)
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4•12 H2O)
Cloruro de sodio (NaCl)
Hidróxido de sodio (NaOH)
Ácido clorhídrico (HCl)
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Versión 01
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)
Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)
Glicerina para microscopía de fluorescencia
Anticuerpos monoclonales conjugados a fluoresceína, 1 vial, FITC, Anti-
Rabies Monoclonal Globulin (lyophilized, reconstitute with 5.0 mL destiled
water), FDI, FUJIREBIO DIAGNÓSTICS, Inc.
Mezcla de tres anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína N del
virus de la Rabia conjugados a fluoresceína, 1 vial, RABIES DFA REAGENT
(CONCENTRATE) 5.0 mL. LIGHT DIAGNOSTICS.
Preparación de soluciones
a) Solución amortiguadora de fosfatos (PBS) pH 7.4
Pesar: 0.157 g de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 H2O), 1.98 g de fosfato de
sodio dibásico (Na2HPO4 12 H2O) y 8.1 g de cloruro de sodio (NaCl), para tener el
NaH2PO4 H2O a 1.5 mM, el Na2HPO4 12H2O a 14 mM y el NaCl al 0.85%.
1. Disolver los reactivos en 700 mL de agua destilada.
2. Ajustar el pH a 7.6 con NaOH o HCl concentrados según se requiera y aforar
a un litro.
3. Si sólo se dispone de Na2HPO4 7H2O entonces se pesarán 1.48 g para un litro
y 5.92 g para 4 litros.
b) Medio de glicerina para montaje, pH 8.4
Solución I: 0.879 g de KH2PO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL con agua
bidestilada.
Solución II: 1.149 g de K2HPO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL con agua
bidestilada.
1. Mezclar 1.0 mL de la solución I y 10 mL de la solución II.
2. Tomar 10 mL de la mezcla y colocarlos en un matraz aforado de 100 mL para
ajustar el pH a 8.4.
3. Aforar con glicerina neutra (Chemicon Ligth Diagnostics No. Catálogo 5013)
agitar y dejar reposar 24 h antes de utilizarse.
c) Azul de Evans al 2% (colorante de contraste)
Pesar 2 g de Azul de Evans, disolver y aforar a 100 mL con agua bidestilada.
Mantener ésta solución en frasco ámbar a temperatura ambiente.
d) Solución desinfectante de etanol al 70% en benzal
Medir 700 mL de alcohol absoluto o 729.16 mL de etanol al 96%
Aforar a 1.0 L con benzal comercial.
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Versión 01
Procedimiento del método de IFD
1. Encender el gabinete de bioseguridad como indica el instructivo.
2. Desinfectar la base interna del gabinete de bioseguridad con la solución
desinfectante y colocar un papel absorbente sobre la superficie de trabajo.
3. Etiquetar las muestras que se van a analizar y los viales para almacenar
muestras, marcar un portaobjetos por espécimen a analizar. Si las muestras
son humanas, etiquetar tres viales uno para prueba biológica, otro para
aislar y propagar el virus y poder realizar su caracterización con anticuerpos
monoclonales y un tercero para el banco de muestras del laboratorio.
4. Preparar un vaso de precipitado de 50 mL con solución desinfectante y un
recipiente con torundas de algodón.
5. Preparar abatelenguas para colocar los cortes de tejido y cortar papel
absorbente para quitar el exceso de tejido de las improntas.
6. Sacar el encéfalo del recipiente y colocarlo de forma tal, que se identifiquen
claramente las circunvoluciones de ambos hemisferios.
7. Hacer un corte profundo a lo largo de la primera circunvolución. Separar la
corteza e identificar el asta de Ammón hacia la base. Esta región del encéfalo
se observa de color blanco nacarado y al hacer un corte transversal sobre ella
se descubre un centro rosado o rojo, colocar el corte de canto en un
abatelenguas.
8. Realizar cortes del cerebelo y de la médula seleccionando porciones de la
región central colocándolos sobre el abatelenguas.
9. Limpiar las pinzas y tijeras de disección con algodón impregnado de
solución desinfectante entre muestra y muestra. Esperar hasta que se seque
el exceso de solución desinfectante y procesar la siguiente muestra.
Nota: El algodón en torunda utilizado se desecha en bolsa amarilla por
contener tejido patológico infeccioso.
10. Hacer una impresión del canto interno del tejido (de aproximadamente 0.5
cm de diámetro) de cada región anatómica seleccionada (médula, cerebelo y
asta de Ammón).
11. Quitar el exceso de tejido con un pedazo de papel absorbente, presionando la
impronta y dejar secar al aire.
12. Llevar a cabo los pasos del 5 al 11 para preparar el testigo positivo. Este debe
tener una cantidad de antígeno de 4+ (90% de antígeno por campo).
13. Colocar los portaobjetos en la rejilla de una caja de tinción con acetona a -5 o
-20 ºC durante 10 minutos.
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Versión 01
14. Reconstituir el conjugado a la dilución de trabajo previamente descrito. En
esta etapa el conjugado debe haber sido previamente titulado y almacenado
en alícuotas.
15. Sacar los portaobjetos en acetona de la caja de tinción y dejar secar.
16. Circunscribir las improntas con un lápiz graso de color o tinta indeleble para
delimitar las áreas de las improntas.
17. Agregar a las tres improntas 15 µL de conjugado de manera que cubra toda
la impronta.
18. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda por 30 min a 37 °C.
19. Colocar los portaobjetos en una rejilla y lavar con PBS pH 7.6, agitando
manualmente por 1 min, si son de 1-15 laminillas y 3 min si son de 16-30
laminillas.
20. Repetir el paso anterior cambiando el PBS, dependiendo de la cantidad de
muestras procesadas es decir un minuto para 1-15 laminillas y 3 min si son
de 16 a 30 laminillas.
21. Repetir los pasos 19 y 20 colocando agua destilada.
22. Colocar las preparaciones en una caja de tinción y agregar Azul de Evans
hasta una concentración final de 0.02%. Teñir las preparaciones en esta
solución durante 2 min, en caso de usar conjugados con Azul de Evans
omitir este punto.
23. Descartar el agua con el colorante y añadir agua destilada limpia, enjuagar
agitando durante 40 segundos.
24. Dejar secar las preparaciones y agregar una gota de glicerina tamponada pH
8.4 sobre cada impronta y colocar un cubreobjetos para cubrir todas las
improntas.
25. Leer en un microscopio de epifluorescencia con el objetivo 40X, revisando
primero el testigo positivo, donde debe observarse fluorescencia específica
en un 90% de los campos, mientras que en el testigo negativo se debe
observar únicamente un fondo rojizo obscuro (esto depende de la cantidad
de colorante de contraste usado), si los testigos positivo y negativo dan la
reacción esperada, es indicio de que la actividad del conjugado se encuentra
en condiciones óptimas.
26. Después de la lectura colocar los portaobjetos en el recipiente de desechos
punzó-cortantes. El papel estraza se desecha en la bolsa amarilla.
27. Desinfectar el gabinete de bioseguridad con la solución desinfectante.
Interferencias
Los anticuerpos monoclonales de los que consta el conjugado antirrábico para la
IFD, son generados por hibridomas productores de anticuerpos específicos contra
la proteína N del virus de la rabia, la muestra biológica utilizada para la prueba es
encéfalo, esto hace prácticamente nula la interferencia o reacción cruzada en el
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Versión 01
método y la titulación del conjugado asegura captar muestras con baja cantidad de
antígeno RAB-M-3/0.
Intervalo biológico de referencia
El conjugado antirrábico ya titulado debe de tener un intervalo de aceptación el
cual no debe ser menor de 4+ en la dilución 1:2 del biológico concentrado.
Intervalo reportable
Negativo o positivo.
Valores de alerta críticos
La obtención de una prueba positiva en un intervalo de 1+/4+ es de notificación de
manera inmediata a la institución solicitante del servicio.
Interpretación por el laboratorio
En una muestra declarada como positiva observamos la presencia de cuerpos
ovoides de color fluorescente verde manzana intenso en su perímetro y
fluorescencia débil en el centro del cuerpo ovoide, el polvo antigénico se puede
manifestar en una cantidad que va de 1+/4+ de antígeno por campo. Por lo tanto,
una muestra es declarada como negativa en ausencia de formas de color
fluorescente verde manzana.
Cuando se observan estructuras pequeñas circulares con forma de cocos o en fila,
un contorno redondo definido y una fluorescencia intensa color verde manzana con
un patrón regular sin coloración en el centro, es posible que la muestra esté
contaminada con bacterias, principalmente Staphylococcus aureus; esta bacteria
produce una proteína que tiene afinidad por la región cristalizable (Fc) de cualquier
anticuerpo (proteína A del Staphylococcus aureus), por lo que el conjugado se pega
en toda su superficie definiendo claramente el contorno de la misma, esta muestra
se declara como inadecuada.
Se puede llegar a observar otro tipo de luminosidad, por ejemplo: en animales con
moquillo se observan inclusiones amorfas y abundantes de color amarillo, la
acumulación de insecticidas neurotrópicos se observan como cristales de
coloración que varía de rojos a amarillos.
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Interpretación de resultados
Figura 17. Resultados positivos por inmunofluorescencia directa
Figura 18 Resultado negativo por inmunofluorescencia directa
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Figura 19. Imágenes de los cortes representativos indicados en el diagnóstico por
IFD
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Técnica de inmunohistoquímica
Principio del método
La prueba directa rápida inmunohistoquímica (dRIT) es un procedimiento
diseñado como una técnica presuntiva para la IFD, de acuerdo al procedimiento
operativo estándar nacional para el diagnóstico de la rabia en animales.
Puede ser utilizada para fortalecer la vigilancia de campo entre fauna sospechosa,
particularmente apoyando los programas de vacunación nacionales, regionales,
estatales o locales.
La dRIT no debe ser usada para vigilancia en salud pública, en aquellas situaciones
en las que exista exposición humana o veterinaria, se debe contactar
inmediatamente a las autoridades estatales en salud pública.
Procedimiento para la recolección de cerebro o médula espinal para la
prueba de dRIT
1. Hacer una línea media ventral desde la sínfisis de la mandíbula a varios
centímetros caudalmente más allá de la laringe.
2. Separar la musculatura de la lengua rostralmente en ambos sentidos,
procediendo caudalmente para liberar la laringe, tráquea, pulmones y
corazón en una pieza (como si se preparara para remover el tirón o lengua,
esófago, tráquea, pulmones y corazón en una pieza) y exponer retraída la
superficie ventral de la columna vertebral y musculatura asociada.
3. Palpar para identificar la articulación Atlanta-occipital y disecar para
exponer el tejido conectivo duro localizado en la superficie ventral de la
articulación. A pesar de ser duro, el tejido conectivo es delgado y cubre
directamente el tejido cerebroespinal y la médula espinal.
4. Con la punta de la hoja de bisturí, cortar cuidadosamente a través del tejido
conectivo, pero no la médula espinal y trabaje con la punta del bisturí hacia
abajo ambos lados de la articulación, mientras dobla la misma para tener un
mejor acceso. El tejido cerebral y espinal puede luego ser separado caudal y
rostralmente tanto como sea posible para producir un tejido nervioso
adecuado para la realización de las pruebas de rabia.
5. Las muestras deben ser colocadas en viales de tapa rosca, de preferencia
irrompibles (no vidrio) u otros contenedores disponibles, como latas de
ungüento.
6. Debe ser indicada, muy bien, la información de la muestra (como tipo de
especies, número único de identificación, ubicación del animal, etc.).
7. Las muestras deben ser refrigeradas o congeladas durante su
almacenamiento y transporte hasta que sean analizadas.
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Para evitar contaminación cruzada de la muestra, cada uno de los especímenes
deben ser manipulados en un área de trabajo limpia y con guantes desechables y
nuevos. Todos los instrumentos utilizados en la necropsia, disección y preparación
de las láminas deben de ser eliminados adecuadamente. Los instrumentos que no
van a ser usados deben de estar en un almacén cerrado, y solo los instrumentos que
van a ser utilizados en el procesamiento de cada una de las muestras deben ser
abiertos. Todas las muestras cerebrales positivas deben ser enviadas al InDRE
como control de calidad y para su posterior referencia.
El laboratorio de rabia del InDRE, estableció los formatos de llenado de resultados
de dRIT de las muestras que se procesen por esta técnica: informe trimestral y
formato de envío.
Estructura de la bandeja de tinción Tissue-Tek y recambio de reactivos
Platos de tinción: I II III IV V VI VII VIII IX y X
Formalina TPBS al 3% TPBS dH2O hematoxilina dH2O
Peróxido de hidrógeno
Número de plato de tinción:
I. Cambio de formalina después de 2 corridas o una semana
II. Cambio de TPBS con cada prueba
III. Cambio de peróxido de hidrógeno al 3% con cada prueba
IV. Cambio de TPBS con cada prueba
V. Cambio de TPBS con cada prueba
VI. Cambio de agua destilada y desionizada (dH2O) con cada prueba
VII. Cambio de hematoxilina una vez por semana
VIII. Cambio de agua destilada y desionizada (dH2O) con cada prueba
IX. Cambio de agua destilada y desionizada (dH2O) con cada prueba
X. Cambio de agua destilada y desionizada (dH2O) con cada prueba
Preparación de reactivos para tinción
I. Formalina al 10% amortiguada; listo para usar.
II. Fosfato salino amortiguado con Tween-80 (TPBS) al 1%. TPBS (PBS con 1%
Tween-80) = 990 mL de PBS + 10 mL Tween-80. Agitar hasta que Tween-80
esté completamente disuelto.
III. Peróxido de hidrógeno 3% listo para usar.
IV. TPBS.
V. TPBS.
VI. Agua destilada y desionizada dH2O; lista para usar
VII. Hematoxilina. Formulación Gills #2 diluida 1:2 con agua destilada. El plato de
tinción debe contener 250 mL de solución; 125 mL hematoxilina + 125 mL agua
desionizada.
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VIII. Agua destilada y desionizada (dH2O)
IX. Agua destilada y desionizada (dH2O)
X. Agua destilada y desionizada (dH2O)
Técnica de tinción streptavidin-biotin peroxidasa para el diagnóstico
del virus de la rabia.
Soluciones
a) Sustrato peroxidasa: amino-etilcarbizol (AEC) solución stock
Reactivos
Sustrato AEC, SIGMA no. A6926
N, N Dimetil formamida GR, EM Science
Materiales
Pipeta de vidrio Pyrex de 5.0 mL
Jarra Wheaton 8.0 mL
1. Disolver una tableta de 20 mg de 3-amino 9-etil carbazol (AEC) en 5 mL de
N, N dimetil formamida en la jarra Wheaton de vidrio (marcar “AEC stock” y
fechar).
2. La solución AEC Stock debe ser almacenada en el refrigerador de 4 a 8 °C
hasta por 2 meses.
Solución de trabajo: preparar fresca con cada prueba justo antes de teñir las
láminas.
b) Dilución de AEC de trabajo
Reactivos
Amortiguador acetato 0.1 M, pH 5.2
AEC Stock (ver arriba)
Peróxido hidrógeno al 3%
Materiales
Pipeta Pyrex de 1.0 mL
Pipeta plástica de10 mL
Pipettor (200 Fl)
Puntas de pipeta (200 Fl)
Filtro de jeringa de 0.45 Fm
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Jeringa de 10 mL
Tubo de centrífuga (2) de 15 mL
1. Añadir 7.0 mL de amortiguador acetato al tubo de centrífuga de 15 mL
usando una pipeta plástica de 10 mL.
2. Añadir 0.5 mL de solución stock AEC (arriba) usando la pipeta de vidrio
Pyrex de 1.0 mL.
3. Añadir 0.075 mL (75 fl) de peróxido de hidrógeno al 3.0%.
4. Filtrar la mezcla usando la jeringa de 10 mL con el filtro de jeringa (0.45 fm)
dentro del tubo de centrífuga de 15 mL por separado. Una vez hecha la
mezcla, ésta solo es estable por 2 a 3 horas.
Procedimiento
1. Efectuar impresiones por toque de rutina en tejido nervioso sospechoso en
láminas de vidrio para microscopio marcadas; incluidos estándares positivos
y controles negativos.
2. Secar las láminas por 5 min a temperatura ambiente.
3. Sumergir las láminas en formalina amortiguada al 10% a temperatura
ambiente, Plato I.
4. Remover y enjuagar las láminas de 5 a 10 veces para eliminar cualquier
exceso fijado de amortiguador TPBS; PBS con Tween 80 al 1%, Plato II.
5. Sumergir las láminas en peróxido de hidrógeno al 3% por 10 minutos, Plato
III.
6. Remover el exceso de peróxido de hidrógeno enjuagando las láminas en
TPBS, Plato IV.
7. Transferir las láminas al siguiente enjuague, Plato V; después de sumergir,
sacudir el exceso de amortiguador y secar los excesos de los bordes de la
lámina, bordeando la impresión, trabajar con una lámina a la vez, dejar las
demás sumergidas en el TPBS.
8. Incubar las láminas en una cámara de humedad. Por ejemplo, puede utilizar
la tapa de plástico a 96-pozos u otra cobertura simple sobre las láminas, en
una toalla de papel humedecida, sobre un banco de laboratorio a
temperatura ambiente con anticuerpo-biotinilado primario antirrábico mAb
por 10 minutos, añadir suficiente cantidad del anticuerpo primario por
goteo hasta cubrir la impresión.
9. Después de la incubación agitar para eliminar el conjugado excedente.
Sumergir y enjuagar las láminas con TPBS, Plato V, sacudir el exceso de
amortiguador y secar los excesos de los bordes de la lámina, bordeando la
impresión. Puede usar el mismo amortiguador para lavar.
10. Incubar las láminas con el complejo streptavidina-peroxidasa, añadir
suficiente complejo a la lámina por goteo hasta cubrir la impresión en una
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cámara de humedad a temperatura ambiente por 10 minutos. Después de la
incubación eliminar el exceso sacudiendo.
11. Sumergir-enjuagar las láminas con TPBS, Plato V, sacudir el exceso de
amortiguador y secar los excesos de los bordes de la lámina, bordeando la
impresión.
12. Incubar las láminas con sustrato peroxidasa, amino-etilcarbizole (AEC),
preparar la dilución de trabajo justo antes de usar, ver preparación de
sustrato peroxidasa AEC solución STOCK más abajo en el documento.
13. Añadir suficiente sustrato a la lámina por goteo hasta cubrir la impresión, en
una cámara de humedad a temperatura ambiente por 10 minutos. Después
de la incubación eliminar el exceso sacudiendo.
14. Sumergir-enjuagar las láminas en agua desionizada y destilada, Plato VI.
15. Contra-teñir con hematoxilina Gills; diluido 1:2 con agua desionizada y
destilada por 2 minutos, Plato VII.
16. Inmediatamente sumergir-enjuagar la tinción con agua desionizada y
destilada, Plato VIII.
17. Hacer una segunda ronda de sumergir-enjuagar con agua desionizada y
destilada, Plato IX para asegurar remover el exceso de tinción.
18. Transferir las láminas a agua fresca destilada, Plato X. Montar las láminas
con medio cobertor soluble en agua y cubrir-deslizar, trabajar con una
lámina a la vez, eliminar el exceso de agua destilada y desionizada
sacudiendo y secar los excesos de los bordes de la lámina respetando la
impresión. No permitir que las láminas se sequen al aire antes de cubrir-
deslizar. Si se tiñen múltiples láminas, ellas deben permanecer en el agua
desionizada y destilada antes de cubrir-deslizar.
19. Observar las láminas con un microscopio de luz usando un objetivo 20X
para barrer el campo y con objetivo 40X para inspección de alto poder, el
antígeno del virus de la rabia aparece como inclusiones rojas contra el fondo
azul neuronal.
20. Registrar resultados.
Lectura y registro de resultados
Una prueba puede ser considerada negativa para rabia cuando el tejido
cerebral o medular es observado más allá de 40 campos con un aumento de
aproximadamente 200X o mayor para inclusiones.
Resultados de la prueba intensidad de la tinción/distribución antigénica. El
virus de la rabia en el cerebro de animales infectados produce inclusiones
intracitoplasmáticas de varias formas ver figuras 17 y 18.
Un solo campo de microscopio puede contener numerosas masas y cuerdas
ovales o circulares.
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Cuando se tiñen específicamente con anticuerpo biotinilado, el sustrato
AEC, una vez oxidado, forma un producto final rosa-rojo. La contra-tinción
hematoxilina produce un tejido azul y fondo nuclear. El AEC es susceptible a
la luz excesiva y puede decolorarse en intensidad, por lo que debe
almacenarse en la oscuridad.
Las observaciones efectuadas en cada lámina de prueba son registradas en
una hoja de resultados según su intensidad/distribución antigénica.
La intensidad de tinción se gradúo de +4 a +1. Las láminas control positivas
en todas las pruebas deben contener óptimamente tinciones de intensidad
+4. Una intensidad escasamente disminuida, una leve pérdida de color se
gradúa como +3 y puede ocurrir en láminas positivas para rabia cuando la
manipulación de las láminas no ha sido la adecuada.
Una tinción notablemente deslustrada se clasifica como +2 a +1 y no puede
ser considerada como diagnóstica de infección por rabia sin una
confirmación específica. Así como la disminución de la intensidad de la
tinción puede ser resultado de la desnaturalización del antígeno del virus de
la rabia, también puede ser resultado de una unión no-específica del
anticuerpo a los componentes del tejido inflamado o artefactos de la
descomposición del tejido.
Distribución antigénica
Para cada cerebro examinado, la tinción se clasifica dependiendo de la carga de
antígeno presente como sigue:
a) +4 infiltraciones masivas de inclusiones largas y pequeñas que varían en
forma, en casi toda el área de impresión.
b) +3 inclusiones de tamaño y forma variable son encontrados en casi todo el
campo microscópico, el número de inclusiones por campo varía, pero son
numerosas en todos los campos.
c) +2 inclusiones de tamaño y forma variable están presentes en el 10 al 50%
de los campos microscópicos y algunos contienen solo algunas inclusiones.
d) +1 inclusiones de tamaño y forma variable están presentes en menos del 10%
de los campos microscópicos y sólo se encuentran algunas inclusiones por
campo, usualmente 1-2 por campo.
Interpretación de la prueba
Si la muestra de tejido fue adecuada para el diagnóstico de rabia, los resultados
para un animal analizado son reportados como positivo o negativo para rabia:
a) Prueba completa o no diagnóstico.
b) Prueba indeterminada basada en patrones de tinción observados en las
láminas de prueba y control.
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a) Prueba completa/resultado reportable:
Los resultados de la prueba son reportados si las siguientes observaciones fueron
realizadas.
Controles de la prueba: Tanto acumulaciones de antígeno grandes y
pequeñas en láminas control positivas con intensidad +4 y distribución de
antígeno +3 a +4. No está presente la tinción en láminas control negativas.
Muestras de la prueba: No se notó deterioro de tejido o alteración cuando las
láminas fueron preparadas. Las muestras son claramente negativas; tinción
no específica en láminas de prueba o claramente positivas; al menos +3 a +4
de intensidad y +2 a +4 de distribución de antígeno en láminas hechas de
puente cerebral y médula espinal.
Todas las muestras positivas de virus de rabia deberán ser enviadas al InDRE para
su control de calidad y posterior referencia.
Figura 20. Improntas de muestras de cerebro infectadas con el virus de la rabia,
sometidas a la técnica de dRIT, con diferentes intensidades del virus: A) impronta
con intensidad: 1+, B) impronta con intensidad: 2+, C) impronta con intensidad:
3+, D) impronta con intensidad: 4+.
A B
C D
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Figura 21. Impronta negativa al virus de la rabia
Prueba biológica (PB)
Principio del método
Ésta prueba se aplica en todas las muestras de seres humanos donde se refiere
encefalitis y en los que exista el antecedentes de posible infección por el virus
rábico. Otro aspecto importante ligado a lo anterior que debe de considerarse para
realizar ésta prueba, es que la muestra analizada por IFD haya sido negativa. La
condición anterior sugiere, que la cantidad de virus rábico presente en este tipo de
muestras pudiera estar por debajo de los límites inferiores de detección de la
prueba. Por lo que al inocular una suspensión de estas muestras en el encéfalo de
los ratones lactantes, se incrementará la cantidad de virus que originalmente
estaba presente, debido a la replicación del virus dentro de las neuronas del ratón,
lográndose su detección mediante IFD.
El procedimiento de la PB involucra la inoculación del virus por vía intracerebral a
ratones albinos, suizos de tres días de edad. A los 28 días en promedio, aunque
puede ser hasta los 40 días de vida, se debe observar parálisis; pelo erizado y
encorvamiento. Cuando estos signos se presentan, los ratones se sacrifican y se
realiza la prueba de IFD en el encéfalo del ratón.
En la actualidad, el aislamiento viral a partir de cultivos de células del
neuroblastoma murino es una buena alternativa para realizar la prueba biológica,
ya que estas células son más susceptibles a la infección y el resultado se pude
obtener en 48 horas (Kaplan y Meslin 1996).
Materiales
Algodón
Aplicadores de madera
Botellas para cultivo de tejidos de 25 cm2
Botellas para cultivo de tejidos de 75 cm2
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Cámara de Neubauer
Cámara húmeda para laminillas
Contenedores con porta laminillas para tinción
Crio-tubos de polipropileno de 5.0 mL con tapón de rosca
Cubreobjetos
Espátulas
Gasas
Gradillas
Gradillas para crio-tubos
Guantes de látex para exploración
Jarra de plástico de 2.0 L
Jeringas de 3.0 mL
Matraz Erlenmeyer de 4.0 L
Papel absorbente
Pipetas desechables de 2, 5, 10 y 25 mL
Pizetas de 250 mL
Portaobjetos con teflón de 2, 4, 8 y 12 pozos
Puntas para micro-pipeta de 20 µL, 200 µL y 1000 µL
Tijeras y pinzas de disección
Tubo eppendorf de 2.0 mL
Unidades de filtración de 500 y 1000 mL
Vasos de precipitados 2.0 L
Reactivos y materiales biológicos
Acetona (CH3)2CO
Ácido clorhídrico (HCl)
Agua destilada
Alcohol etílico (C2H6O)
Antibiótico y antimicótico 100X, frasco 100 mL
Anticuerpos monoclonales conjugados a fluoresceína, 1 vial, FITC, Anti-
Rabies Monoclonal Globulin (lyophilized, reconstitute with 5.0 mL destiled
water), FDI, FUJIREBIO. DIAGNÓSTICS, Inc. Este biológico debe titularse
previamente RAB-M-003/0
Bicarbonato de sodio al 7.5%, frasco con 100 mL
Cloruro de sodio (NaCl)
D-MEM en sales EARLE, con L-Glutamina sin piruvato ni bicarbonato de
sodio, frasco: 1 X 10 L
Éter etílico
Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)
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Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4 12 H2O)
Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 H2O)
Glicerina para microscopia de fluorescencia
Hidróxido de sodio (NaOH)
L-Glutamina 200 mM100X, frasco con 100 mL
Solución de vitaminas MEM100X frasco con 100 mL
Solución germicida de uso quirúrgico (cloruro de benzalconio)
Suero fetal bovino
Tripsina al 2.5%, frasco con100 mL
Versenato de sodio al 0.05%, frasco con 500 mL
Desarrollo
Diluyente para las suspensiones virales
3.0 g de albúmina sérica bovina fracción V
5.0 mL de penicilina-estreptomicina; 100,000 U/mL-50 g/mL
respectivamente, en 100 mL de agua bidestilada estéril.
Preparación de la muestra
1. Tomar un fragmento de tejido de encéfalo o biopsia de 0.5 g de peso y
colocarlo en un tubo con 2.5 mL del diluyente para suspensión viral y
mezclar perfectamente.
2. Centrifugar la suspensión a 2500 rpm durante 15 min a 5 °C.
3. Separar el sobrenadante y usarlo para la inoculación intracerebral de los
ratones lactantes de tres días.
4. El volumen restante se guarda a -70 °C en un vial bien sellado e identificado
con una etiqueta que contenga el número de registro de la muestra, la fecha
de preparación de la suspensión y la naturaleza del tejido utilizado (encéfalo
o biopsia).
Llenado de las jeringas
1. Cargar una jeringa de tuberculina de 1.0 mL, con la suspensión viral.
2. Colocar la jeringa dentro de un tubo de ensayo que contenga algodón en el
fondo e insertar la aguja penetrando el algodón. Sacar las burbujas de aire
que estén atrapadas con golpes muy suaves y empujando el émbolo con el
dedo índice sobre el cuerpo de la jeringa.
Técnica para sujetar al ratón
El procedimiento requiere de habilidad manual que se obtiene con la práctica.
1. Tomar el ratón por la parte distal de la cola con los dedos índice y pulgar.
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2. Posterior a ello tomar al ratón por la base de la cola con la articulación de la
primera y la segunda falanges del dedo anular o meñique liberando el dedo
índice y pulgar los que sujetarán de las orejas al ratón inmovilizando la
cabeza y el cuello.
Procedimiento de inoculación intracerebral del ratón
1. Tomar al ratón como se describió en la técnica de sujeción, con la mano libre
sostener la jeringa manteniendo el bisel hacia arriba.
2. Inocular en el punto medio de una línea imaginaria trazada mentalmente del
ojo a la oreja.
3. Introducir la aguja dentro del cráneo en ángulo recto, entre la mitad y la
base de este. Inocular aproximadamente 0.03 mL de la suspensión.
4. Inocular a 6 ratones por muestra. Si una vez inoculada la camada con más de
seis miembros, se mueren dos o tres antes de los siete días, la muestra se
debe inocular de nuevo.
5. Depositar la jeringa junto con la aguja en el contenedor de punzocortantes
con hipoclorito.
6. Mantener en observación a los ratones durante 21 días como mínimo;
aquellos que mueren dentro de las primeras 24 a 48 horas se consideran
fuera de la prueba, ya que éstos pudieron haber muerto por traumatismo.
7. Extraer la masa encefálica de los ratones que mueren entre 7 y 21 días si
presentan los siguientes signos: temblores, incoordinación, pelo erizado,
parálisis y postración.
8. Efectuar la prueba de IFD, buscando la presencia de antígenos del virus
rábico.
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Figura 22. Prueba biológica
Inoculación del virus de rabia en células de neuroblastoma murino
Principio del método
Replicar el virus de la rabia en línea celular (neuroblastoma murino) de muestras
en donde el virus es insuficiente para detectarse por IFD o difícil de amplificar en
PB.
Desarrollo
A. Preparación de la muestra
1. Preparar una suspensión al 20% de cada muestra problema con medio
mínimo esencial modificado por Dulbeco (D-MEM) al 10% como sigue:
Rotular un tubo para crioconservación de 5.0 mL con tapón de rosca, con el
número de muestra, estado de procedencia, especie del animal infectado y la
fecha de procesamiento.
2. Agregar 4.0 mL de medio D-MEM al 10% al tubo.
Nota: Si la muestra es escasa agregar al menos 2.0 mL de medio D-MEM
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3. Colocar un fragmento del tejido, disgregarlo con el uso de 2 aplicadores.
4. Centrifugar el tubo a 2500 rpm. durante 15 minutos a 4 °C y colectar el
sobrenadante
5. El sobrenadante puede ser usado inmediatamente o puede ser congelado a -
70 °C hasta su uso.
B. Preparación de la suspensión celular para ser infectada con la
muestra
1. Tripsinizar la monocapa completa de células de una botella de cultivo, de 25
cm2
2. Resuspender las células con 5.0 mL de D-MEM al 10%. Una botella de 25
cm2, contiene aproximadamente 6x106 células.
3. Transferir 2.0 mL de esta suspensión a una botella de cultivo de 25 cm2 que
contiene 5.0 mL de medio D-MEM al 10%, aproximadamente 2x106 células
por mL.
C. Inoculación de la muestra
1. Inocular la suspensión celular obtenida en el paso 3.B agregándole todo el
sobrenadante del centrifugado obtenido en el paso A5, pasándola a través de
un filtro tipo perinola de 0.22 micras de diámetro
2. Colocar la botella de cultivo de 25 cm2 en una estufa a 37 °C en una
atmósfera de CO2 al 0.5% durante 48 a 72 horas
D. Monitoreo de infección viral
1. Preparación de laminillas teflonadas a partir de la botella de 25 cm2
inoculada, rotular las laminillas con el número de la muestra y la fecha.
Nota: La laminilla de 8 pozos sirve para monitorear 4 muestras, 2 pozos por
muestra.
2. Tripsinizar la monocapa de células de una botella de cultivo de 25 cm2
inoculada.
3. Resuspender las células con 5.0 mL de D-MEM al 10%. Una botella de 25
cm2 contiene aproximadamente 6 x 106 células.
4. Transferir 2.0 mL de esta suspensión a una botella de cultivo, de 25 cm2 que
contiene 5.0 mL de medio D-MEM al 10%, aproximadamente 2x106 células
por mL.
5. Agregar 100 µL de la suspensión (D4) en cada pozo con una micropipeta
6. Colocar las laminillas en cámara húmeda e incubar a 37 °C en una atmósfera
de CO2 al 0.5% durante 24 horas.
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7. Enjuagar la monocapa celular infectada de la laminilla con PBS (pH 7.4) y
dejar secar.
8. Fijar la monocapa sumergiendo la laminilla en acetona durante 30 min a –
20 °C.
9. Retirar las laminillas de la acetona y secarlas al aire durante 10 min a
temperatura ambiente.
10. Realizar la técnica de IFD.
11. Usar los 6.0 mL restantes de la suspensión celular infectada obtenidos en el
paso D4 para que continúe creciendo la monocapa celular en la botella de 25
cm2.
Criterios para descartar una muestra problema como negativa
Si las laminillas iniciales fueron positivos a la IFD, la botella puede ser
descartada en ese momento y las laminillas restantes serán utilizadas para la
caracterización antigénica.
Si las laminillas iniciales son negativas incubar la botella a 37 °C por otros 3
días.
Descartar el medio, tripsinizar y colectar todas les células resuspendiéndolas
en 6.0 mL de MEM al 10%.
Proceder a la preparación, incubación, fijación y ejecución de la IFD.
Si la IFD es negativa, la muestra es considerada negativa.
Caracterización antigénica con anticuerpos monoclonales (AcMo)
Preparación de soluciones
Solución de D-MEM al 10%
Reactivos para preparar 500 mL Volumen en mL
Agua destilada 370
Solución de vitaminas 100X MEM 10
D-MEM 10X 50
SFB 50
Glutamina 100X 10
Antibiótico y antimicótico 5.0
Bicarbonato de sodio al 7.5% 5.0
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Tripsina Verseno 0.025%
Reactivos para preparar 50 mL Volumen en
mL
Tripsina al 2.5% 0.5
Versenato de sodio al 0.05% 45.5
Solución amortiguadora de fosfatos (PBS), pH 7.4
Pesar 0.157 g. de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 H2O); 1.98 g de fosfato de
sodio dibásico (Na2HPO4 12 H2O) y 8.1 g de cloruro de sodio (NaCl), para tener el
NaH2PO4 H2O a 1.5 mM, el Na2HPO4 12H2O a 14 mM y el NaCl al 0.85%.
1. Disolver los reactivos en 700 mL de agua destilada.
2. Ajustar el pH a 7.6 con NaOH o HCl concentrados según se requiera y aforar
a un litro.
Medio de glicerina para montaje pH 8.4
Solución I: 0.879 g de KH2PO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL con agua
bidestilada.
Solución II: 1.149 g de K2HPO4 y 0.85g de NaCl. Aforar a 100 mL con agua
bidestilada.
1. Mezclar 1.0 mL de la solución I y 10 mL de la solución II.
2. Tomar 10 mL de la mezcla anterior y colocarlos en un matraz aforado de 100
mL para ajustar el pH a 8.4.
3. Aforar con glicerina neutra, agitar y dejar reposar 24 h antes de usar.
Solución desinfectante de etanol al 70% en benzal
Medir 700 mL de alcohol absoluto o 729.16 mL de etanol al 96%.
Aforar a 1.0 L con benzal comercial
Diluyente para suspensiones virales
D-MEM 10%
Suero Fetal Bovino (SFB)
Principio del método
Los anticuerpos monoclonales (AcMo) son moléculas producidas por híbridos
producto de la fusión de un mieloma y un esplenocito hiperinmune. En la
actualidad y para propósitos de caracterización antigénica del virus de la rabia se
utilizan del serotipo uno y están dirigidos contra la proteína N.
Cuando estos AcMo se emplearon para analizar su reactividad contra los virus
aislados de diferentes reservorios; perro, zorrillo, mapache, zorro, murciélago
hematófago e insectívoro, se encontró que algunos reconocían todas las cepas
virales, pero otros poseían una reactividad específica para un solo tipo de
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reservorio. De esta manera al utilizar un grupo o panel de anticuerpos se pueden
determinar patrones de reacción también denominados patrones antigénicos, los
cuales son específicos dependiendo de la especie animal (reservorio) de la cual se
han aislado el virus. Esto se pudo determinar gracias al estudio de un gran número
de cepas virales, aisladas de diferentes especies de animales en todo el continente
Americano.
Al inicio éste panel estaba constituido por más de 100 anticuerpos. Sin embargo,
estudios conjuntos entre el CDC de Atlanta Georgia y el Instituto Nacional Para la
Protección de Alimentos y Zoonosis de Buenos Aires Argentina (INPPAZ)
permitieron la reducción a ocho del número de anticuerpos utilizados. Con éste
panel se pudo determinar la existencia de variantes antigénicas del virus de la rabia
dentro del serotipo uno, además de la asociación específica existente entre las
variantes antigénicas y algunas especies de animales en América.
La técnica de caracterización con anticuerpos monoclonales (AcMo) se utiliza
exclusivamente para investigaciones epidemiológicas. Su utilidad se hace evidente
donde la información es limitada, dudosa o inexistente. Actualmente se usa para
confirmar la fuente de infección en cualquier caso de rabia.
Para obtener resultados oportunos es importante disponer de una muestra de
encéfalo fresca y en buen estado de conservación, lo cual garantiza la presencia del
virus viable y permite el desarrollo rápido de la técnica.
Procedimiento
Realizar la técnica de IFD en cada cerebro de los ratones inoculados con las
suspensiones virales, para corroborar una positividad 4+.
Desarrollo
Titulación de los anticuerpos monoclonales
1. Propagar en ratones lactantes una cepa positiva que mantenga sus
características entre pase y pase al inocular en el ratón.
2. Utilizar exclusivamente cerebros de ratones inoculados con virus de la rabia,
en los que se observe una intensidad de fluorescencia específica de 4+.
3. Realizar ocho improntas en dos portaobjetos de teflón con los cerebros del
punto anterior. Considerar que en cada pozo se probará un anticuerpo
monoclonal, por lo que se necesitarán ocho improntas. Solo se probarán las
diluciones 1:100 y 1:1000.
4. Fijar con acetona fría a -20 °C durante 30 min, dejar secar al medio
ambiente.
5. El antígeno rábico en estas improntas debe encontrarse de un 90 a 100%
por cada campo en forma de inclusiones o polvo antigénico.
6. Preparar tres diluciones seriadas de cada AcMo; 1:100, 1:1000, 1.10000 en
E-MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 25 mM de
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amortiguador Hepes y 1 mM de azida sódica. Las diluciones anteriores son
estables por un año a 4 °C. Las diluciones 1:10 y 1:100 pueden durar aún
más tiempo almacenadas a -70 °C.
Titulación del conjugado anti-IgG de ratón
La dilución de trabajo del anti-IgG se determina por diluciones seriadas 1:10,
1:100, 1:1000, utilizando los AcMo, en los procedimientos antes descritos. Este
reactivo por lo general da un título de 1:100.
Caracterización antigénica del virus rábico mediante AcMo
1. Preparar 1.0 mL de la dilución de trabajo de cada AcMo (1:100).
2. Rotular cada tubo claramente con la descripción de cada AcMo.
3. Efectuar improntas en los portaobjetos de 8 pozos cubiertos de teflón, a
partir de cerebro de ratón infectado con la muestra problema.
4. Secar las improntas al medio ambiente durante 10 min.
5. Fijar en acetona a -20 °C durante 4 horas. Estos portaobjetos con las
improntas ya fijadas, pueden ser mantenidos a -20 o -70 °C hasta por 2
meses.
6. Agregar 15 μL de cada AcMo a las improntas respectivas sin derramar
anticuerpo al siguiente pozo e incubar 30 min a -20 °C.
Nota: Este es un paso crítico, si los anticuerpos monoclonales se llegan a
mezclar se puede tener reacciones falsas positivas.
7. Efectuar el primer lavado cuidadosamente para evitar la transferencia de
AcMo de un pozo a otro, utilizando una pizeta de 250 mL con PBS 0.01 M
pH 7.4, lavar cada pozo tres veces por goteo.
8. Repetir la operación pero con agua destilada con pH 7.
9. Agregar 15 μL de conjugado en cada pozo.
10. Incubar a 37 °C por 30 min en cámara húmeda.
11. Realizar dos lavados alternando PBS 0.01 M pH 7.4 y agua pH 7, como se
indica en los pasos 7 y 8.
12. Colocar las preparaciones en una caja de tinción y agregar azul de Evans
hasta una concentración final de 0.02% por 2 minutos, enjuagar y secar al
medio ambiente.
13. Colocar una gota de glicerina amortiguada en cada impronta.
14. Leer en el microscopio de epifluorescencia a 400 aumentos.
15. Repetir las lecturas débilmente positivas en donde se descarte
contaminación por reacción con otro anticuerpo por contaminación de pozo
a pozo al momento de lavar o incubar, usando el panel de anticuerpos
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monoclonales sin diluir (1:10), en improntas por separado. Interpretar los
resultados.
Interpretación de resultados
a) Reacción positiva:
Cuando la intensidad de fluorescencia y la cantidad de antígeno observada
es idéntica al testigo positivo (3+ o 4+).
Puede haber aislamientos en un campo en los que se observen intensidades
de fluorescencia hasta 1+, con algún o algunos de los anticuerpos
monoclonales, los que se corroborarían como positivos si se vuelven a
probar por separado con cada anticuerpo monoclonal (probar también lo
sugerido en el punto 15 del procedimiento anterior).
b) Reacción Negativa:
Cuando no se observa fluorescencia (fondo verde obscuro o rojo).
c) Testigo Positivo
Mezcla de cepas del virus de la rabia CVS/SAD/ERA/PAST, con la cual los 8
anticuerpos monoclonales dan reacción positiva 3+ o 4+.
Interpretación de la reacción con anticuerpos monoclonales
Figura 13. Patrones antigénicos con panel de 8 anticuerpos monoclonales
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Técnica de Retro-transcripción de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (RT-PCR)
Soluciones
Solución amortiguadora de fosfatos (PBS), pH 7.4 para lavado de las
preparaciones
Pesar 0.157 g. de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 H2O), 1.98 g de fosfato de
sodio dibásico (Na2HPO4 12 H2O) y 8.1 g de cloruro de sodio (NaCl), para tener el
NaH2PO4 H2O a 1.5 mM, el Na2HPO4 12H2O a 14 mM y el NaCl al 0.85%.
Disolver los reactivos en 700 mL de agua destilada.
Ajustar el pH a 7.6 con NaOH o HCl concentrados según se requiera y aforar a un
litro.
Si sólo se dispone de Na2HPO4 7H2O entonces se pesarán 1.48 g para un litro y 5.92
g para 4 litros.
Medio de glicerina para montaje pH 8.4
Solución I: 0.879 g de KH2PO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL de agua
bidestilada.
Solución II: 1.149 g de K2HPO4 y 0.85 g de NaCl. Aforar a 100 mL de agua
bidestilada.
1. Mezclar 1.0 mL de la solución I y 10 mL de la solución II.
2. Tomar 10 mL de la mezcla anterior y colocarlos en un matraz aforado de 100
mL para ajustar el pH a 8.4.
3. Aforar con glicerina neutra (Chemicon Ligth Diagnostics No. Catálogo
5013), agitar y dejar reposar 24 horas antes de usarse.
Azul de Evans al 2% (colorante de contraste)
Pesar 2.0 g de azul de Evans, disolver y aforar a 100 mL con agua bidestilada.
Mantener ésta solución en frasco ámbar a temperatura ambiente.
Solución desinfectante de etanol al 70% en benzal
Medir 700 mL de alcohol absoluto o 729.16 mL de etanol al 96%.
Aforar a 1.0 L con benzal comercial.
Solución de hipoclorito de sodio al 5%
Medir 384.6 mL de hipoclorito de sodio al 13%.
Aforar a 1.0 L con agua destilada y desionizada, homogeneizar
perfectamente.
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Diluyente para suspensiones virales
3.0 g de albúmina sérica bovina fracción V.
5.0 mL de penicilina-estreptomicina (100,000 U/mL-50 g/mL).
100 mL de agua bidestilada estéril.
Capacidad instalada para 50 muestras semanales. Estándar de servicio 60 días,
según algoritmo menor a 700 muestras recibidas.
Extracción y purificación del ARN
La extracción y purificación del ARN del virus de la rabia se lleva a cabo mediante
la utilización de agentes caotrópicos que permiten la eliminación de material
orgánico, así como también de las diferentes cápsides que conforman al virus de la
rabia, dejando libre al ARN el cual puede ser solubilizado en agua grado PCR,
quedando listo para su posterior utilización en las diferentes técnicas de biología
molecular.
Procesamiento por trizol
1. Encender y desinfectar la base interna del gabinete de bioseguridad con
alcohol/benzal al 70%.
2. Descongelar las muestras a temperatura ambiente dentro del gabinete de
bioseguridad.
3. Etiquetar los tubos eppendorff de 1.5 mL, uno por cada muestra y ponerlos a
enfriar en hielo.
4. A cada tubo adicionar 100 µL del amortiguador de lisis frío.
5. Con un aplicador de madera estéril, homogeneizar la muestra de encéfalo,
tomar una cantidad aproximada de 50 mg y ponerla en el amortiguador de
lisis frío.
6. Homogeneizar manualmente por 30 segundos.
7. Adicionar 1.0 mL de trizol grado biología molecular.
8. Homogeneizar manualmente durante 30 segundos.
9. Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente.
10. Adicionar 200 µL de cloroformo frío y homogeneizar vigorosamente por 30
segundos.
11. Incubar a temperatura ambiente por 2-3 minutos.
12. Centrifugar a 12000 rpm por 15 minutos a 4 °C.
13. Pasar la capa superior (transparente e incolora) a otro tubo, previamente
enfriado a 4 °C y que contenga 0.5 mL de isopropanol.
14. Agitar en vórtex por 30 segundos.
15. Incubar por 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.
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16. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos a 4 °C.
17. Eliminar el sobrenadante y poner los tubos en hielo.
18. Adicionar 1.0 mL de etanol frío al 75%.
19. Centrifugar a 7500 rpm durante 5 minutos a 4 °C.
20. Decantar el etanol, tratando de eliminar la mayor cantidad posible.
21. Poner los tubos en hielo y adicionar de 80 a 100 µL de agua fría grado
biología molecular.
22. Agitar en vórtex a bajas revoluciones por 2 minutos.
23. Incubar a 56 °C en platina por 10 minutos para disolver el botón de ARN.
24. El ARN obtenido puede ser utilizado inmediatamente o bien guardarlo a -70
°C.
Materiales
Guantes de nitrilo
Vasos de precipitados de 100 y 200 mL
Matraces aforados de 100 mL
Espátulas
Tubos tipo eppendorf de 1.5 mL
Aplicadores de madera estériles
Gradilla
Puntas para micropipeta de 20 µL, 200 µL y 1000 µL
Gasas
Marcador indeleble sin alcohol
Reactivos y materiales biológicos
Hidróxido de sodio (NaOH)
Ácido clorhídrico (HCl)
NP40
Agua grado PCR
Trizol
Isopropanol
Cloroformo
a) Tris HCl pH 7.5
Pesar 15.7 g de tris-HCl y aforar a 100 mL, medir el pH y ajustar a 7.5 con hidróxido
de sodio o ácido clorhídrico.
b) Cloruro de sodio 5M
Pesar 29.2 g de NaCl y aforar a 100 mL
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c) Cloruro de Magnesio 0.5M
Pesar 4.76 g de MgCl2 y aforar a 100 mL
d) Amortiguador de lisis
Tris HCl 1M, pH 7.5 1.0 mL
NaCl 5M 3.33 mL
MgCl2 0.5M 0.33 mL
NP40 0.65 mL
Aforar con agua bidestilada a 100 mL
e) Etanol al 75%
Medir 75 mL de etanol grado biología molecular y aforar a 100 mL con agua
bidestilada.
f) Solución desinfectante de etanol al 70% en benzal
Medir 700 mL de alcohol absoluto o 729.16 mL de etanol al 96%.Aforar a 1.0 L con
benzal comercial.
Procesamiento por estuche comercial QIAGEN (QIAamp Viral
ARN Mini Handbook) a partir del sobrenadante de células de
neuroblastoma murino infectadas con el virus y líquido
cefalorraquídeo de humanos
1. Adicionar 310 µL de amortiguador AVL (amortiguador de lisis que contiene
sales cautrópicas más detergentes al cual se le adiciona un acarreador de ARN)
al tubo donde está contenido el acarreador de ARN y disolver perfectamente.
2. Agregar los 310 µL de la suspensión del acarreador al amortiguador de lisis.
Una vez complementado el amortiguador se almacena a 4 °C por un lapso de 30
días.
3. En tubos de centrífuga de 1.5 mL colocar 560 µL de amortiguador de lisis más
140 µL de suspensión de la muestra.
4. Mezclar la muestra en vórtex.
5. Incubar por 10 min a temperatura ambiente.
6. Añadir 560 µL de etanol absoluto.
7. Mezclar y centrifugar a 6000 g a 4 °C por un minuto.
8. Agregar 630 µL de la mezcla a la columna.
9. Centrifugar a 6000 g a 4 °C por un minuto.
10. Pasar la columna a un tubo colector nuevo, añadir el resto de la muestra a la
columna.
11. Centrifugar a 6000 g a 4 °C por un minuto.
12. Nuevamente se cambia el tubo colector.
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13. Se agregan 500 µL de amortiguador AW1 (amortiguador de lavado al cual se le
añaden 125 mL de etanol antes de su uso) a la columna.
14. Centrifugar a 6000 g a 4 °C durante un minuto.
15. Cambiar el tubo colector.
16. Añadir 500 µL de amortiguador AW2 (segundo amortiguador de lavado al cual
se le agregan 160 mL de etanol antes de su uso).
17. Centrifugar a 20000 g y 4 °C durante nueve minutos.
18. Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.
19. Añadir 50 µL de amortiguador AVE (amortiguador de elución que contiene
0.04 de azida de sodio para evitar la contaminación de la muestra extraída).
20. Centrifugar a 6000 g y 4 °C por un minuto.
21. Almacenar el ARN a -20 °C.
Materiales
Guantes de látex para exploración
Gasas
Tubos de microcentrífuga de 1.5 mL
Reactivos
Equipo QIAGEN (QIAamp Viral ARN Mini Handbook)
Etanol (96-100%) grado biología molecular
Amplificación del virus de la rabia por RT-PCR
El propósito de esta técnica es la identificación de un fragmento de 1500 pares de
bases que pertenece a la proteína N del virus rábico, el cual es secuenciado para la
identificación específica de la variable antigénica del virus.
La RT-PCR se efectúa en dos etapas, en la primera se utiliza la transcriptasa reversa
para obtener cADN. La segunda etapa se lleva a cabo con la enzima Taq polimerasa
para obtener ADN de doble cadena y se realiza en tres etapas:
Desnaturalización: la muestra se somete a una temperatura de ebullición
de 94 °C, en donde la doble cadena de ADN se separa.
Alineación: al bajar la temperatura a 55 °C se incorporan los iniciadores y
se alinean en los extremos 5’ y 3’ terminal del fragmento que se desea
amplificar.
Extensión: Se lleva a cabo a 72 °C, temperatura óptima en que la enzima Taq
polimerasa junto con el cofactor catiónico MgCl2 incorpora a los desoxinucleótidos;
dTTP, dGTP, dATP, dCTP, para formar la nueva cadena.
Así se completa un ciclo de amplificación y en lugar de tener dos cadenas iniciales
tenemos cuatro, por lo tanto después de 28 ciclos habrá 1x106 copias de fragmentos
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específicos de ADN. Como consecuencia, se puede utilizar para detectar moléculas
aun cuando su concentración en una muestra biológica sea muy baja. En teoría una
sola molécula de ADN puede iniciar una reacción de amplificación de PCR.
Equipo
Termociclador
Agitador tipo vórtex
Micropipetas 0.2 a 2.0, 10, 100, 200 µL
Congelador -20 °C
Gabinete de Bioseguridad tipo II
Materiales
Guantes de exploración
Tubo tipo eppendorf de 200, 500 y 1,500 µL
Gradilla
Gasas
Puntas para micropipeta de 10, 100 y 200 µL
Marcador indeleble
Reactivos y materiales biológicos
Titan One Tube RT-PCR System
VERORAB (Vacuna antirrábica para uso humano preparada en cultivos
celulares inactivada)
Inhibidor de ARNsa
Agua grado PCR
Desoxynucleótidos trifosfatados Iniciador 1- 550 FW o Ly001 (80000 pmol)
Iniciador 2- 304 bd (80000 pmol)
Cloruro de benzalconio (solución germicida)
Alcohol etílico
Procedimiento
1. Encender el gabinete de bioseguridad, y desinfectar la mesa interna del
gabinete con solución germicida y colocar papel absorbente para trabajar.
2. Sacar los reactivos del congelador a -20 °C para descongelar.
3. Registrar las claves de las muestras en la hoja correspondiente, y colocar en
una gradilla en frío los tubos de 200 L.
4. Preparar la mezcla de reacción para el número de muestras a trabajar, según
el protocolo y considerar el control positivo y negativo.
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Versión 01
Mezcla de reacción
Reactivos Volumen en µL rxn
Iniciador 1, 50 pmol/L 1.0
Iniciador 2, 50 pmol/L 1.0
DTT 100 mM 1.0
dNTP’s 10 mM 1.0
Regulador (amortiguador mix)5X 5.0
MgCl2 25 mM 2.0
DMSO 2.0
H2O PCR 11.3
Enzima TITAN 0.4
ARNsa 0.3
5. Colocar 20 µL de la mezcla anterior en cada tubo eppendorf.
6. Agregar 5.0 µL del extracto de ARN en el tubo correspondiente, mantener en
frío hasta colocarlos en el termociclador.
7. Encender el termociclador y programar los tiempos de acuerdo al protocolo
de amplificación a realizar:
Retrotranscripción
1 ciclo 42 °C 60 min
94 °C 5 min
PCR
30 ciclos
94 °C 30 segundos
55 °C 30 segundos
72 °C 1 minuto
Extensión final
1 ciclo 72 °C 5 min
4 °C infinito
8. Colocar los tubos en el termociclador y ejecutar la corrida.
9. Guardar los tubos en refrigeración hasta realizar la electroforesis.
Nota: Las condiciones de trabajo y volúmenes requeridos para la RT-PCR
es particular para cada marca de reactivo, verificar el inserto
correspondiente para ajustar las condiciones.
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Versión 01
Soluciones
Iniciador 1: Ly001, 550FW: 80,000 pmol. Hacer una dilución a 50 pmol/µL
Iniciador 2: 304bd 80,000 pmol. Hacer una dilución a 50 pmol/µL
dNTP’s 25mmol. Hacer una dilución 10mM
Corrimiento electroforético
Los geles de agarosa al 1.5%, son utilizados para observar los productos de cADN
obtenidos de la Transcripción Reversa Acoplada a la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (RT-PCR) como una banda diagnóstica del virus de la rabia. Los geles
forman un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de
su tamaño y forma. Así, moléculas de ADN o ARN de diferente tamaño van a
emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa.
Material
Guantes de látex para exploración
Matraz Erlenmeyer de 1.0 L
Matraz Erlenmeyer de 250 mL
Espátulas
Gasas
Marcador indeleble
Puntas para micropipeta de 10 a 20 µL
Puntas para micropipeta de 0.5 a 10 µL
Pizetas de 250 mL
Jarra de plástico de 2.0 L
Probeta de 100 mL
Placas de 96 pozos desechables no estériles
Reactivos, todos estos deben ser de grado biología molecular
Agua destilada
Trizma base
Ácido bórico
Ácido etilen diamino tetracetico (EDTA)
Bromuro de etidio (BrET)
Agarosa ultrapura
Orange G
Sacarosa
Marcador de peso molecular
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Versión 01
Preparación de soluciones
Gel al 1.5% de agarosa
Agarosa ultrapura 1.5 g
TBE 1X 100 mL
Solución de BrEt 5 µL
Nota: tapar el frasco para no inhalar los vapores
Los geles se guardar a 4 °C por un período no mayor de 3 días sumergidos en
solución de TBE.
Solución amortiguadora Tris-borato-EDTA (TBE10X)
Trizma-base 108 g
Ácido bórico 27.5 g
EDTA 6.8 g
Agua destilada 1.0 L
Cuando se utiliza por períodos de 30 días, esterilizar por filtración con membrana
de 0.22 µ para impedir que se precipiten las sales y almacenar a 4 °C.
Solución amortiguadora Tris-borato-EDTA (TBE1X)
TBE 10X 100 mL
Agua destilada 1.0 L
Almacenar a 4 °C por un período de 30 días.
Solución de Orange-G
Orange-G 250 mg
Sacarosa 10 g
Agua destilada 25 mL
Fraccionar en viales de 2.0 mL y almacenar a -20 °C, cuando se utiliza un vial se
debe de mantener en refrigeración entre 4 a 8 °C.
Solución de bromuro de etidio (BrET) a 10mg/mL
Bromuro de etidio 1.0 g
Agua destilada 100 mL
Fraccionar en viales de 1.0 mL y protegerlos de la luz con papel aluminio y
almacenar a temperatura ambiente en un lugar seco.
Procedimiento
1. Mezclar la agarosa con el TBE en las proporciones indicadas en la
preparación de reactivos y colocarla en el termoagitador a 250 °C durante 20
min en agitación constante para disolver la agarosa, se deja enfriar y se le
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Versión 01
agregan 5.0 µL el BrET, mezclando perfectamente cuidando que no queden
grumos. Evitar la inhalación de los vapores al momento de agregar el
bromuro ya que este reactivo es altamente carcinogénico.
2. Una vez preparada la mezcla para el gel se deja enfriar por 2 min, se vierte la
mezcla inmediatamente en un soporte para contener el gel, cuidando de que
no aparezcan burbujas, en caso contrario retirarlas con una punta sin
perforar el gel.
3. Colocar el peine de acuerdo al número de muestras que se requiera, dejar
que se solidifique a temperatura ambiente aproximadamente por 20 min.
4. Retirar el peine y transferir el gel en la cámara de electroforesis con solución
amortiguadora TBE1X.
5. Las muestras se preparan diluyendo 5.0 µL de muestra con 3.0 µL de la
solución de orange G, se colocan los 8.0 µL en el pocito.
6. Correr en el mismo gel de manera simultánea marcadores de peso molecular
para determinar el peso del fragmento obtenido.
7. Se tapa la cámara y se conectan los electrodos a la fuente de poder de
acuerdo al polo que corresponda.
8. Se corre el gel a 100 v. 180 mA por 30 min.
9. Al finalizar el tiempo de corrimiento se coloca el gel en un transiluminador
de luz ultravioleta (UV) para observar las bandas.
10. Finalmente se toma una impresión del gel en un fotodocumentador de UV.
Secuenciación nucleotídica automática
Secuenciación automática de ADN de un producto de PCR de 900 pb
del gen N del virus de la rabia
La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos cuya finalidad es la
determinación del orden de los nucleótidos; A, C, G y T, en un fragmento de ADN.
Cuantificación de productos de PCR
A. Densitometría de imagen
1. En un gel de poliacrilamida al 5%, cargar 2.5 µL y 5.0 µL del marcador de
pesos moleculares X174 a una concentración de 10 ng/µL en el primer y
último pozo respectivamente.
2. Cargar 2.0 µL de cada producto de PCR a cuantificar en los pozos restantes.
3. Realizar la electroforesis.
4. Teñir el gel con bromuro de etidio.
5. Observar el gel en el fotodocumentador.
6. Determinar la concentración del ADN del producto por comparación de la
intensidad de la banda con respecto a la de las bandas del marcador.
7. Determinar la cantidad de ADN a emplear en la reacción de secuenciación
de acuerdo al tamaño del fragmento, 900 pb = 5 a 20 ng
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B. Cuantificación por ADN Chip
1. Encender la computadora y el bioanalizador.
2. Abrir el programa “2100 expert”, que se encuentra en la pantalla de la
computadora.
3. Preparar el ADN Chip de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
4. Colocar 9.0 µL del gel-colorante en cada uno de los dos pozos de la letra “G”
restantes.
5. Colocar 5.0 µL de marcador (vial verde) de “ADN Markers” en cada una de
los 12 pozos y en el pozo marcado con el símbolo de la escalera.
6. Colocar 1.0 µL de marcador (vial amarillo) “ADN ladder” en el pozo que está
marcado con el símbolo de la escalera.
7. Colocar 1.0 μL de muestra en cada uno de los 12 pozos.
8. Poner el chip horizontalmente en el agitador “IKA” y agitar durante 60
segundos a 2400 rpm.
9. Colocar el chip en el bioanalizador y checar que el cartucho del electrodo
este insertado correctamente y cerrar cuidadosamente la tapa.
10. Verificar que el bioanalizador detecte el chip.
11. Presionar con el cursor el icono de “START” y esperar a que el bioanalizador
muestre el resultado de las muestras asignadas.
12. Determinar la cantidad de ADN a emplear en la reacción de secuenciación
de acuerdo al tamaño del fragmento; 900 pb = 5 a 20 ng.
13. Realizar limpieza del equipo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
14. Apagar el bioanalizador y la computadora.
1. Purificación enzimática (Exosapit) de productos de PCR
1. Agregar por cada 5.0 µL de producto de PCR, 0.5 µL de la enzima ExoSAP-
IT (realizar la reacción en frio).
2. Incubar a 37 °C por 15 min en el termociclador.
3. Inactivar la enzima a 80 °C por 15 min y mantener el producto 4 °C.
2. Reacción de secuenciación
a. Etiquetar los tubos de PCR a utilizar, indicando el nombre del producto y el
primer a utilizar. Agregar por cada tubo de reacción los siguientes reactivos:
Reactivo Cantidad en µL
Terminator Ready Reaction Mix (BigDye 3.1v) 2.0
Primer (3.3 pmol/µL) 1.0
Amortiguador de secuenciación 5x 3.0
Producto de PCR purificado de 900 pb 5-20 ng
H2O grado biología molecular Ajustar a 20
b. Mezclar vigorosamente con el agitador tipo vórtex cuidando que el producto
quede en el fondo del tubo.
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Versión 01
c. Colocar los tubos en un termociclador y llevar a cabo la reacción de
secuenciación por 40 ciclos de acuerdo con las siguientes condiciones:
Desnaturalización a 96 °C por 10 segundos
Alineación a 50 °C por 5 segundos
Extensión a 60 °C por 4 min
Mantener a 4 °C hasta que se lleve a cabo la purificación de los productos.
Purificación de los productos de secuenciación
Purificación por columnas Centrisep
1. Hidratar cada columna a utilizar con 800 µL de agua grado HPLC,
homogenizando perfectamente y cuidando de que no queden burbujas a lo
largo de la columna y dejar reposar a temperatura ambiente por lo menos
tres horas antes de su uso.
2. Etiquetar las columnas y los tubos de colección.
3. Eliminar el agua de la columna quitando la tapa inferior, colocarla en un
tubo recolector y centrifugar a 6500 rpm durante 3 min para eliminar el
exceso de agua. Si es necesario repetir este paso.
4. Adicionar los 20 µL de producto de extensión en el centro de la columna sin
tocarla, ni tampoco tocar las paredes del tubo.
5. Colocar la columna en un tubo eppendorf, cuidando de que el pico formado
en la columna se oriente hacia la pared de la centrífuga.
6. Centrifugar a 6500 rpm durante 5 min.
7. Colocar los tubos eppendorf con los productos purificados en la centrífuga
evaporadora y centrifugar con calor a 80 °C por 15 min para evaporar el
agua de las muestras en oscuridad.
8. Resuspender cada producto en 16 µL de formamida y colocarlo en el pozo
asignado en la placa óptica de 96 pozos.
9. Desnaturalizar los productos purificados a 95 °C por 5 min e
inmediatamente colocar la placa en hielo por 2 min.
10. Colocar la placa en el secuenciador 3130 xl.
Purificación por placa de 96 pozos CentriSep. (16 a 96 muestras)
1. Sacar del refrigerador la placa de purificación una hora antes de su uso.
2. Remover el papel protector de la placa, primero el superior y luego el
inferior.
3. Centrifugar la placa a 3000 rpm durante 3 min a temperatura ambiente para
eliminar el líquido de hidratación (no olvidar nivelar).
4. Colocar la placa sobre la placa óptica de 96 pozos para secuenciador 3130xl.
5. Colocar cada una de las muestras en el centro del pozo correspondiente de la
placa sin tocar la silica, de acuerdo al formato de secuenciación (ver formato
de reacción de secuenciación).
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Versión 01
6. Centrifugar la placa por 3 min a 3000 rpm a temperatura ambiente para
eluir.
7. Tapar la placa con la septa.
8. Colocar la placa óptica en el termociclador durante 5 min a 95 °C para abrir
cadenas.
9. Colocar la placa en hielo durante 2 min para mantener las cadenas abiertas.
10. Verificar que no haya burbujas en el fondo de los pozos, en su caso quitarlas.
11. Colocar la placa en el secuenciador 3130xl.
Purificación por columnas DyeEx 2.0 QUIAGEN (1 a 16 muestras)
1. Etiquetar las columnas y los tubos de colección.
2. Homogeneizar la silica de cada columna agitando con un agitador tipo
vórtex, cuidando que no se formen burbujas.
3. Aflojar la tapa de cada columna y romper la punta de plástico.
4. Colocar cada columna en su tubo colector.
5. Centrifugar las columnas a 3500 rpm durante 3 min a temperatura
ambiente, para eliminar el líquido de hidratación.
6. Colocar las columnas en el tubo de colección correspondiente.
7. Colocar en el centro de cada columna (sin tocar la silica) cada una de las
muestras según corresponda.
8. Centrifugar las columnas 3500 rpm durante 3 min a temperatura ambiente,
colocando el pico de silica formado hacia la pared de la centrífuga.
9. Colocar los tubos de recolección en la centrífuga evaporadora y centrifugar
con calor a 80 °C por 15 min para evaporar el agua de las muestras en la
oscuridad.
10. Agregar 16 µL de formamida a cada tubo de colección para suspender el
producto y agitar vigorosamente con el agitador tipo vórtex (evitar que el
producto se quede en las paredes del tubo).
11. Colocar cada una de las muestras en el pozo correspondiente de la placa
óptica de acuerdo al formato de secuenciación (ver formato de reacción de
secuenciación).
12. Tapar la placa con la septa.
13. Colocar la placa con los productos purificados en el termociclador para abrir
cadenas durante 5 min a 95 °C.
14. Colocar la placa en hielo durante 2 min para mantener las cadenas abiertas.
15. Verificar que no haya burbujas en el fondo de los pozos, en su caso quitarlas.
16. Colocar la placa en el secuenciador 3130xl.
Secuenciación automática en el 3130 xl
1. Una vez desnaturalizados los fragmentos en la placa, sellar la placa con la
septa de 96 pozos.
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Versión 01
2. Ensamblar la placa en su soporte y asegurarla con su sujetador.
3. Colocar la placa en la posición A o B del autosampler del secuenciador.
4. Preparar el instrumento 3130xl para iniciar la secuenciación automática de
acuerdo al instructivo de operación del equipo GNM-I-17-00.
5. Iniciar la corrida.
6. Esperar a que termine de leer el instrumento los productos colocados.
Nota: la longitud del arreglo capilar que se utiliza en éste equipo es de 36
cm, por lo tanto la longitud máxima de lectura por reacción de secuencia es
de 500-600 pb.
Obtención de electroferogramas
1. Abrir el icono del “Sequencing Analysis Software” y generar los
electroferogramas de cada producto de PCR secuenciado.
2. Verificar el electroferograma y el “Raw Data” de cada producto secuenciado.
3. Salvar el análisis de las secuencias.
Análisis de datos moleculares
a) Edición de los electroferogramas
1. Recuperar los archivos generados por el secuenciador ABIprism 3130xl, los
cuales presentan una extensión *.abi, estos archivos pueden leerse en los
programas CHROMAS y Sequence Scanner para su posterior edición.
2. Abrir simultáneamente los archivos generados para la cadena sentido y la
antisentido.
3. Convertir el electroferograma obtenido para la cadena antisentido en reversa
complementaria. De esta forma ambas secuencias presentan la misma
lectura.
4. Corroborar las dos secuencias para verificar que los datos sean correctos.
5. Si existe discrepancia entre las dos secuencias, repetir la reacción de
secuenciación.
6. Convertir el electroferograma en archivo de texto el cual será útil en los
análisis de alineación y filogenéticos
b) Búsqueda de identidades en las bases de datos
1. Ingresar a la página del NCBI (National Center of Biotechnology
Information).
2. Ingresar al programa “BLAST”
3. Realizar la búsqueda de homólogos con la herramienta BlastN
(correspondiente a la base de datos de nucleótidos).
4. Ingresar la secuencia obtenida en formato de texto.
5. Utilizar los parámetros de búsqueda del programa.
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6. Iniciar la búsqueda.
7. El programa emite los resultados para su posterior análisis.
LINEAMIENTOS PARA LA SOLICITUD DE INSUMOS DE RABIA
Política para la solicitud de insumos de rabia
La Coordinación de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (CRNLSP)
del InDRE, tiene como política, proporcionar un servicio de calidad y respuestas
oportunas para los laboratorios integrantes de la Red, así como de los particulares
que requieren de los servicios que proporciona el InDRE. La red está integrada
dentro del sistema de gestión de calidad y observa los procedimientos vigentes y
busca la mejora continua de su servicio. Para cumplir con este propósito se
observarán con los siguientes lineamientos:
Los laboratorios estatales de salud pública:
1. Solicitar por escrito sus insumos para el diagnóstico de rabia a través de un
oficio dirigido a el/la Director General Adjunto del InDRE; con atención al
Coordinador de la Red Nacional de Salud Pública de rabia.
2. Deberán enviar su solicitud a más tardar el día jueves de la semana anterior
al envío.
3. Deben enviar su solicitud por correo ordinario, para poder darle trámite de
forma oficial sin embargo, para asegurar una respuesta oportuna se les
solicita hacer el envío de sus oficios de solicitud escaneados (con número de
folio ya asignado y rubricados) por e-mail al correo electrónico
[email protected] o bien por vía fax al teléfono (01 55) 5342-
6942.
4. Deberán indicar de forma explícita los insumos que requieren.
5. Tendrán que asegurar que sus mensajerías tengan un tiempo de entrega de
24 horas para las solicitudes de reactivos.
6. Deben asegurarse que los envíos sean en no más de 48 horas.
7. En caso de tener solicitudes expeditas justificadas y que planee venir por los
insumos al Instituto debido a la premura de tenerlos en existencia en el
laboratorio de la entidad deberá enviar su solicitud, con 24 horas de
antelación y en horario laboral de 8:00 a 16:00 horas, para que se puedan
gestionar sus requerimientos.
8. Será responsable de sancionar a la mensajería contratada y si fuera el caso
recuperar el costo de los daños ocasionados, en caso de retraso y/o extravío
del insumo solicitado.
9. Deben indicar a la coordinación de la Red, el o los correo(s) electrónicos del
contacto con el que se mantendrá comunicación permanente para atender
sus necesidades de insumos para el diagnóstico de rabia.
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Versión 01
10. Debe informar al InDRE de los problemas que pudieran tener con el sistema
de diagnóstico implementado por descompostura o falta de calibración, con
la finalidad de darle seguimiento a su problemática.
11. Hacer los envíos los días martes y miércoles de cada semana, para lo cual
deberemos de contar con su solicitud a más tardar el día jueves de la semana
anterior al envío.
12. El InDRE informará al laboratorio estatal vía correo electrónico, el número
de guía, hora y servicio de mensajería, inmediatamente después de que el
paquete haya sido enviado. Con la finalidad de que el laboratorio estatal este
enterado que su solicitud ya fue atendida.
13. El InDRE proporcionará la información técnica y la de los posibles
proveedores de los insumos con los que no cuente (en caso de que cuenten
con ella), para que el laboratorio estatal pueda solventar sus necesidades de
forma directa. Esta información se le enviará vía correo electrónico y por
oficio en caso de ser necesario.
14. El InDRE a través de la CRNLSP hará el contacto con las áreas técnicas
correspondientes para la información de cursos de capacitación.
El área técnica del INDRE
1. Deberá de tener un tiempo de respuesta no mayor a 24 horas una vez que se
ha recibido la solicitud de insumos por parte de la coordinación de la
RNLSP.
2. Deberá tener los materiales previamente autorizados, de las solicitudes
respectivas, los cuales deberán estar debidamente embalados en cajas de
cartón.
3. Deberá rotular las cajas de envío con los datos del remitente y del lugar a
donde se manda.
4. Deberá entregar sus paquetes a la CRNLSP a la hora acordada, esto
dependerá de cada mensajería.
5. Tendrán que hacer los envíos de reactivos para IFD y caracterización
antigénica utilizando una hielera, con suficientes refrigerantes para asegurar
que el envío llegue en buenas condiciones. En caso de que la hielera se envíe
como un solo envío esta deberá ir a su vez en una caja de cartón para
asegurar la integridad de la misma y por tanto de cada uno de los reactivos.
6. Debe asegurar el contar con suficiente material de empaque para sus envíos;
cajas de 60 cm x 90 cm x 60 cm; 90 cm x 150 cm x 150 cm; hielera con caja
de 20 cm x 30 cm x 30 cm y hieleras con caja de cartón de 15 cm x 22 cm x
20 cm; así como cinta canela.
7. Proporcionará la información solicitada a la CRNLSP sobre las
capacitaciones, así como dudas técnicas de este diagnóstico en un tiempo no
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Versión 01
mayor de 24 horas. Para poder hacer las respuestas a los laboratorios
estatales en tiempo y forma.
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Versión 01
Formato único para el envío de muestras
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
EPIDEMIOLÓGICOS
LABORATORIO DE RABIA
clave/revisión
LRAB-F-01/0
emisión:
24/Enero/2012
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Formato Único para el Envío de Muestras Biológicas de
Rabia FOLIO
NOMBRE DE LA COMPAÑÍA DE MENSAJERIA_____________________________ NUM. DE GUIA: _____________________ FECHA DE ENVÍO: ____/____/____ FECHA DE RECEPCIÓN: ____/____/____ INSTITUCIÓN:___________________________________________________________________________________________________________ CALLE:______________________________________________________COLONIA:___________________________________________________ MUNICIPIO:_________________________________________________ESTADO:_____________________________C.P.___________________ TEL.:_______________________________FAX:(indispensable)________________________________E-mail :______________________________ MÉDICO SOLICITANTE:_____________________________________________________________________________________ ESTUDIO SOLICITADO:___________________/__________________________________________________________________________________ Clave Descripción
INFORMACION DE LA MUESTRA NOMBRE (HUMANOS) O ESPECIE (ANIMALES):________________________________________________________________________________ Nombre(s) Apellido Paterno Apellido Materno NO. DE CASO O CLAVE:_______________________________ JURISDICCION SANITARIA:___________________________________ DOMICILIO DEL PACIENTE___________________________________________ COLONIA:_____________________________________________ MUNICIPIO:_________________________________________________ ESTADO:____________________________________________ EDAD: ____AÑOS____MESES____DIAS SEXO: M F HOSPITALIZACIÓN: SI NO SITUACIÓN DEL PACIENTE: VIVO MUERTO JUSTIFICACIÓN DEL ENVÍO: DIAGNÓSTICO REFERENCIA ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD TIPO DE MUESTRA: PLASMA SUERO LCR SALIVA HISOPO SUBLINGUAL BIOPSIA DE CUERO CABELLUDO
IMPRONTA DE CORNEA TEJIDO CEREBRAL (MEDULA ESPINAL, ASTA DE AMMON, CEREBELO) FECHA DE TOMA: ______/______/_____ FECHA DE INICIO DE SINTOMAS: ______/______/______ EN CASO DE SOSPECHA DE RABIA CONTESTE LO SIGUIENTE: ¿SUFRIO AGRESIÓN POR PARTE DE ALGUN ANIMAL? SÍ NO MENCIONE LA ESPECIE:___________________________________
SITIO ANATÓMICO DE LA LESIÓN:___________________NÚMERO DE PERSONAS QUE ESTUVIERON EN CONTACTO CON EL ANIMAL_____
EDAD DEL ANIMAL:________________FECHA DE MUERTE DEL ANIMAL:____/____/____ CAUSA DE LA MUERTE________________________ (día mes año) VACUNA ANTIRRABICA: SI NO SE IGNORA FECHA DE ÚLTIMA DOSIS ____/____/____ (día mes año) DATOS CLÍNICOS: AGRESIVIDAD FOTOFOBIA AEROFOBIA HIDROFOBIA SALIVACIÓN PROFUSA INCOORDINACIÓN
PARÁLISIS CAMBIOS DE CONDUCTA ALUCINACIONES HIPERTENSIÓN ENDOCRANEAL COMA RESULTADOS DE ORIGEN: NEGATIVO POSITIVO+ POSITIVO++ POSITIVO+++ POSITIVO++++ VARIANTE ANTIGENICA:__________________________
FECHA DEL RESULTADO:____/____/____ NOTAS ADICIONALES Y OBSERVACION
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Versión 01
Cuadro de variables para la base de rabia la cual debe enviarse al correo electrónico
[email protected] de forma mensual:
Estado: ___________
Mes: _______________
Número
de
muestra
Especie Localidad Municipio Centro
antirrábico
Fecha de
recepción
en el
laboratorio
Fecha de
emisión del
resultado de la
muestra.
Resultado
Rabia-RNLSP/InDRE Página 95 de 96
Versión 01
Formato único para envío de reporte de resultados de dRIT
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
EPIDEMIOLÓGICOS
LABORATORIO DE RABIA
clave/revisión
LRAB-F-20/0
emisión:
14/Sept/2012
Página 95 de 96
Formato de reporte de resultados del envío de la
muestra para la técnica de dRIT FOLIO
No de
caso
Fecha del
proceso Especie
Tipo de
muestra
Dx. IFD
Positividad
Dx. DRIT
Positividad Observaciones
Nombre y Firma del Responsable de Diagnóstico__________________________________
Rabia-RNLSP/InDRE Página 96 de 96
Versión 01
Formato de reporte de resultados trimestral para la técnica de dRIT
Nombre y firma del responsable de diagnóstico: ________________________
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
LABORATORIO DE RABIA
clave/revisión
LRAB-F-19/0
emisión:
14/Sept/2012
Página 96 de
96
Formato de reporte de resultados trimestral para la técnica de
dRIT FOLIO
RESULTADO
DE: FOLIO
No.
DE
CASO
No.
DEL
InDRE
INSTITUCIÓN MUNICIPIO JURISDICCIÓN
FECHA
DEL
PROCESO
ESPECIE TIPO DE
MUESTRA
DX IFD
Positividad
DX DRIT
Positividad
OBSERVA-
CIONES
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