LAPORAN RESMI

ISOLASI MIKROORGANISME DARI SUATU CAMPURAN, UJI BIOKIMIA, DAN UJI HIDROLISAI. Tujuan

I.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran

Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari isolasi mikroorganisme dari suatu campuran dengan teknik cawan gores dan cawan tuang.I.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dihasilkan atau tidaknya asam organik oleh suatu mikroorganisme.I.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan jenis mikroorganisme yang memiliki enzim gelatinase, yakni eksoenzim yang mempunyai kemampuan menguraikan gelatin menjadi asam amino.II. Pengamatan

II.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran

II.1.1 Metode Cawan GoresTabel II.1 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan Gores pada Media NBA Setelah 24 JamBentuk koloni dilihat dari:Hasil Pengamatan

Sektor 0Sektor ISektor IISektor III

Atas keseluruhan

Atas tepi

Permukaan (samping)

Keterangan:

Warna

Diameter

KepekatanPutih susu4,5 cmSedikit pekatPutih susu

1,9 cm

Sedikit pekatPutih susu

0,6 cm

Sedikit pekatPutih susu

0,5 cm

Sedikit pekat

Tabel II.2 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan Gores pada Media NBA Setelah 48 Jam

Bentuk koloni dilihat dari:Hasil Pengamatan

Sektor 0Sektor ISektor IISektor III

Atas keseluruhan

Atas tepi

Keterangan:

Warna

Diameter

KepekatanPutih susu4,5 cmPekat putihPutih susu

2,1 cm

Pekat putihPutih susu

0,9 cm

Pekat putihPutih susu

0,8 cm

Pekat putih

II.1.2 Metode Cawan TuangTabel II.3 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan Tuang pada Media PDA Setelah 24 JamBentuk koloni dilihat dari:Hasil Pengamatan

Petridish 1Petridish 2Petridish 3

Atas keseluruhan

Keterangan:

Warna

Diameter

KepekatanPutih agak bening4,1 cmTidak pekatPutih agak bening

2,6 cm

Tidak pekatPutih agak bening

2,2 cm

Tidak pekat

Tabel II.4 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan Tuang pada Media PDA Setelah 48 Jam

Bentuk koloni dilihat dari:Hasil Pengamatan

Petridish 1Petridish 2Petridish 3

Atas keseluruhan

Atas tepi

Keterangan:

Warna

Diameter

KepekatanPutih susu8,9 cmAgak pekatPutih

5,6 cm

Agak pekatPutih

4,2 cm

Agak pekat

II.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))Tabel II.5 Hasil Pengamatan Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test) Setelah 24 JamNama MikroorganismeUji Methyl-RedUji Voges-Proskauer

Rhyzopus oligosporus

KeteranganPositif (+)

Negatif (-)

Tabel II.6 Hasil Pengamatan Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test) Setelah 48 JamNama MikroorganismeUji Methyl-RedUji Voges-Proskauer

Rhyzopus oligosporus

KeteranganPositif (+)

Negatif (-)

II.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)Tabel II.8 Hasil Pengamatan Uji Gelatin pada Media Gelatin Cair Setelah 48 JamJenis UjiHasil PengamatanKeterangan

Uji Hidrolisa GelatinBlanko (+)

III.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran

Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari isolasi mikroorganisme dari suatu campuran dengan teknik cawan gores dan cawan tuang. Dalam percobaan yang telah dilakukan, terdapat 2 jenis biakan campuran yang digunakan, untuk metode cawan gores digunakan campuran bakteri Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis dan untuk metode cawan tuang digunakan campuran jamur Aspergillus niger, Thiobacillus harzianum dan Rizhopus oligosporus.

Dalam melakukan isolasi, media yang digunakan adalah Potato Dextrose Agar (PDA) dan Nutrient Broth Agar (NBA). PDA terdiri dari sari kentang yang sangat mendukung pertumbuhan mikroorganisme jenis jamur. Bentuk dari PDA yang digunakan sebagai agar awal mulanya adalah padatan yang kemudian dicairkan, namun ketika dituangkan ke petridish maka dalam beberapa menit media PDA akan memadat.

(http://www.neogen.com/)

PDA memiliki komposisi dalam pembuatannya, menurut literatur PDA mengandung(dalam takaran massa) 200 g infusi kentang, 20 g dextrosa, 20 g agar, dan 1 lt air distilasi. Medium tidak boleh di lelehkan lebih dari satu kali. Dan diketahui bahwa PDA memiliki pH pada kisaran 5,6 0,2.

(http://www.fda.gov/)

NBA merupakan media yang sangat cocok untuk budidaya bakteri, karena bakteri yang memerlukan nutrient yang terdapat dalam NBA. Oleh sebab itu, media ini banyak digunakan dalam pemeliharaan kultur bakteri selain itu, media NBA berguna sebagai media pembelajaran. Komposisi dari NBA terdiri dari bubuk campuran pepton yang telah di dehidrasi, ekstrak daging sapi, dan natrium klorida. (http://www.mastgrp.com/)

Penggunaan media agar sebagai media tumbuh mikroorganisme dalam percobaan ini dikarenakan oleh beberapa hal, yaitu karena agar tidak dapat diuraikan oleh hampir semua jenis mikroorganisme, agar tetap berbentuk padat pada kisaran suhu inkubasi yang luas (0-80oC), dan agar mencair pada titik didih air, tetapi tidak segera memadat pada suhu pendingan 42oC. Hal ini memungkinkan pembuatan suspensi biakan pada suhu 45oC untuk tujuan pengenceran biakan dan isolasi mikroorganisme. (Hendrianie, 2001, hal 5-8)

Proses yang harus dilakukan sebelum memasukkan media agar pada tabung reaksi dan petridish, merupakan proses sterilisasi. Proses sterilisasi ini di lakukan dalam alat sterilisasi, yakni autoclave. Tabung reaksi dan petridish dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan sebelum memasuki autoclave, hal ini dilakukan untuk mengurangi terdapatnya kontaminan dalam media kultur mikroorganisme. Sebelum memasuki autoclave, petridish dibungkus dengan kertas warna coklat. Tujuan membungkus kertas coklat adalah mengurangi potensi kontaminasi saat melakukan sterilisasi. Bagian kertas yang yang bertekstur licin diletakkan pada sisi luar, karena bagian yang licin ini mengandung lapisan lilin yang dapat menghalangi uap air dari autoclave untuk masuk ke dalam petridish. Sedangkan untuk tabung reaksi, disumbat dengan menggunakan kapas. Setelah itu, tabung reaksi dan petridish dimasukan ke dalam autoclave untuk disterilisasi. Proses sterilisasi ini dilakukan dengan menggunakan suhu sebesar 121oC selama kurun waktu 15 menit. Yang dimaksud dengan proses sterilisasi, merupakan suatu usaha untuk membebaskan alat-alat dan bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan, terutama mikroba, sehingga dalam sterilisasi nanti alat-alat tidak terkontaminasi dengan pihak luar (kontaminan). Kondisi saat memasukkan petridish ke dalam autoclave selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 15 psi atau 0,01 mPa dapat membunuh semua organisme sehingga alat dalam keadaan bersih dan steril dan akhirnya tidak terdapat kontaminan yang berdampak pada pengamatan.(Tortora, 2010, halaman 188)

Percobaan isolasi mikroorganisme dari suatu campuran ini dilakukan dengan 2 metode, yakni metoda cawan gores, dan cawan tuang. Selanjutnya adalah pembahasan tentang metode cawan gores dan cawang tuang.II.1.1 Metode Cawan Gores

Yang dimaksud dengan metode cawan gores, merupakan metode yang dilakukan dengan cara mengencerkan biakan campuran hingga setiap individu spesies dapat dipisahkan, sehingga setiap koloni yang terbentuk merupakan hasil dari pembelahan satu sel, kemudian menggoreskan pada permukaan media agar, mulai dari sektor 0 hingga sektor 3. Hal pertama yang dilakukan untuk melakukan isolasi mikroorganisme dengan metode cawan gores adalah membagi bagian pada petridish menjadi empat sektor. Sektor 0 sebagai sektor yang digores pertama kali dengan sample biakan campuran. Sektor 1 merupakan bagian/sektor goresan mikroorganisme yang berasal dari goresan sektor 0. Sektor 2 sebagai sektor goresan mikroorganisme yang berasal dari goresan sektor 1 dan begitu juga sektor 3 sebagai sektor goresan mikroorganisme yang berasal dari sektor 2. Pembagian kuadran sektor 0 hingga sektor 3 pada petridish dapat di gambarkan sebagai berikut:

Gambar III.1 kuadran sektor pada petridish

Petridish yang sudah dibagi menjadi 4 sektor kemudian melalui proses sterilisasi. Setelah proses sterilisasi dilakukan, maka langkah selanjutnya adalah memasukan media NBA (Nutrient Broth Agar) pada petridish. Media NBA digunakan untuk mengisolasi campuran bakteri Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis. Selanjutnya melakukan inokulasi mikroorganisme yang dilakukan di dalam incase. Incase merupakan suatu ruangan yang di design tertutup untuk melakukan inokulasi sehingga faktor kontaminan dari lingkungan luar dapat di minimalisir, karena incase bersifat tertutup dari lingkungan luar. Incase biasa disebut dengan anaerobic chamber, yang merupakan ruangan tertutup yang hanya bisa digunakan dengan peng-oprasian menggunakan tangan pada tempat operasional.(Pelczar, 2007, halaman 111)Di dalam incase terdapat biakan induk mikroorganisme, api spirtus, kawat ose. Penggunaan kawat ose memiliki fungsi sebagai alat untuk memindahkan mikroorganisme dari media lama ke dalam media baru yang lebih steril, dengan menggunakan teknik aseptik. Fungsi dari penggunaan teknik aseptik dalam meng-inokulasi mikroorganisme ini adalah untuk mencegah adanya kontaminasi terhadap mikroorganisme yang akan menjadi objek penelitian. Selain itu, juga untuk mencegah kontaminasi terhadap ruang serta para praktikan yang sedang meneliti.

(htttp://www.biolabs.tmcc.edu/)Sebelum memindahkan biakan yang akan di inokulasikan, kawat ose dipijarkan terlebih dahulu di atas api spirtus hingga berwarna merah membara. Tujuan dari pemijaran kawat ose ini adalah sterilisasi kawat ose yang akan digunakan. Tetapi jangan memasukkan kawat ose dalam keadaan masih panas memijar, karena dikhawatirkan akan mengakibatkan mikroorganisme yang diinokulasikan telah terbunuh akibat panas yang dibawa oleh kawat ose yang tengah berpijar.

Dalam proses inokulasi, hal pertama yang dilakukan pada media NBA adalah dengan menggoreskan kawat ose yang telah berisi campuran biakan bakteri Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis dari sektor 0. Kemudian meneruskan goresan dari sektor 0 dan meneruskan inokulasi (dengan menggoreskan) hingga ke sektor 1. Begitu seterusnya, hingga goresan telah sampai ke sektor 3. Dengan catatan, setiap akan berpindah ke lain sektor, kawat ose harus di sterilisasi terlebih dahulu dengan menggunakan metode aseptik. Tujuan dari metode penggoresan secara berkala dan berkesinambungan ini adalah untuk mengencerkan biakan campuran hingga setiap individu spesies dapat dipisahkan, dan setiap koloni yang terbentuk merupakan hasil dari pembelahan satu sel induk. Inokulasi dilakukan dengan cara menggoreskan kawat ose yang berisi biakan, dengan menggunakan pola zig-zag agar permukaan yang di gores lebih luas. Ada beberapa teknik penggoresan, yaitu quadrant streak, radiant streak, T streak, dan continuous streak. Teknik penggoresan yang digunakan pada percobaan ini menyerupai teknik T streak. Isolasi sendiri pada dasarnya dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan biakan murni dimana isolasi bakteri menggunakan metode media cawan membentuk koloni pada media padat sehingga mudah diisolasi dengan cara menyebarkan sel-sel tersebut pada agar cawan sehingga timbul koloni-koloni yang terpisah. Koloni adalah sejumlah besar sel bakteri dalam medium solid, yang dapat dilihat secara kasat mata. Dalam prosedur ini, sebuah asumsi bahwa koloni merupakan keturunan dari satu sel dan me-representasikan sebuah clone dari biakan murni. Setelah inkubasi, bentuk umum dari koloni dan bentuk bagian ujung dari koloni dapat diperoleh dengan cara melihatnya dari bagian atas. Setelah koloni yang telah terisolasi dengan baik dapat ditemukan, maka dapat dipindahkan ke dalam media baru untuk mendapatkan biakan murni(Prescott, 2002, halaman 94)Keuntungan dari metode cawan gores adalah praktis, hemat biaya dan waktu, serta hanya membutuhkan keterampilan. Kesalahan-kesalahan yang umum dilakukan dalam metode ini, antara lain: 1. Tidak memanfaatkan permukaan medium untuk digores sehingga pengenceran kurang optimal.2. Penggunaan inokulum yang terlalau banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel waktu digores.(http://repository.usu.ac.id/)

Langkah berikutnya yaitu melakukan inkubasi di dalam inkubator. Namun sebelumnya, petridish dibungkus kembali dengan kertas warna coklat. Kemudian memasukkan semua hasil inokulasi ke dalam inkubator. Proses inkubasi dilakukan selama 24 jam dan 48 jam pada suhu kamar karena pada suhu 300 ini merupakan suhu optimum dalam pertumbuhan mikroorganisme. Di dalam inkubator, petridish diletakkan dengan posisi terbalik. Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kondensasi dari media di dalam petridish, sehingga dapat menyebabkan uap air turun ke media dan pada akhirnya mengakibatkan terbatasnya pergerakan koloni di dalam media mikroorganisme yang dapat merusak bakteri.(Tortora, 2010, halaman 158)

Pengamatan pertama dilakukan 24 jam setelah proses inkubasi berlangsung. Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, didapatkan koloni mikroorganisme pada sektor 0, sektor 1, sektor 2, dan sektor 3. Pada sektor 0 terlihat bakteri dengan warna putih susu dan sedikit pekat dengan diameter sekitar 4,5 cm. Untuk sektor 1, koloni bakteri yang tumbuh terlihat lebih sedikit bila dibandingkan dengan sektor 0. Koloni yang tumbuh berwarna putih tulang dan pekat dengan diameter sekitar 1,9 cm sedangkan pada sektor 2 ditemukan sedikit koloni bakteri bila dibandingkan dengan sektor 0 dan 1 dengan warna putih susu, sedikit pekat dan diameter sekitar 0,6 cm. Sedangkan untuk sektor 3 didapatkan sedikit bakteri berwarna putih susu, sedikit pekat dengan diameter 0,5 cm. Hal ini wajar terjadi, karena yang diinokulasikan pada sektor 0 adalah berasal dari campuran suspensi biakan yang diberikan, sedangkan pada sektor 1 merupakan inokulasi berasal dari sektor 0, sektor 2 merupakan hasil inokukasi dari sektor 1, dan sektor 3 merupakan inokulasi dari sektor 2.Pada pengamatan kedua yaitu 48 jam menunjukkan adanya pertumbuhan koloni. Hal ini terlihat dengan semakin bertambahnya diameter koloni di masing-masing sektor. Pada sektor 0 yang semula diameternya 4,5 cm tetap menjadi 4,5 cm, dan pada sektor 1 yang semula 1,9 cm menjadi 2,1 cm, pada sektor 2 yang semula 0,6 cm menjadi 0,9 cm dan pada sektor 3 yang semula diameternya 0,5 cm menjadi 0,8 cm. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyebutkan bahwa setelah diinkubasi, sel-sel individu akan tumbuh memperbanyak diri hingga membentuk koloni. Tetapi untuk ukuran dari bakteri sendiri tidak membesar, karena pertumbuhan dari bakteri itu sendiri adalah pertumbuhan secara eksponensial yang membelah semakin banyak bukan bertumbuh menjadi besar. Hal ini menunjukkan bahwa terjadi peningkatan populasi bakteri yang cukup signifikan dalam kurun waktu 48 jam setelah pembiakan. Pada saat dilihat dari permukaan samping bentuk koloni terlihat seperti lingkaran dan tepinya berbentuk seperti setengah bola dan hampir di semua sektor bentuk koloninya seperti yang disebutkan diatas. Terbentuknya massa sel yang dapat dilihat oleh mata telanjang dinamakan koloni. Setiap koloni yang berlainan dapat mewakili macam organisme yang berbeda-beda. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme.

(Pelczar, 2008, halaman 135-136)

Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan maka dapat diketahui bahwa bakteri yang tumbuh pada sektor 3 merupakan sektor yang ditumbuhi kultur murni. Bila dilihat dari literatur mengenai morfologi dan ciri-ciri lain dari mikroorganisme suspensi campuran Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis, maka untuk bakteri yang terisolasi pada cawan gores di sektor 3 lebih mengarah ke bakteri Bacillus subtilis. Dimana menyebutkan pada media agar koloni Bacillus subtilis tumbuh dengan warna putih agak pekat sampai kekuningan suram sedangkan untuk bakteri Escherichia coli, pada media agar tumbuh koloni dengan warna putih kekuningan cerah. Selain itu, Bacillus subtilis memiliki ciri-ciri dapat ditumbuhkan pada media agar, berbentuk sel batang pendek dan merupakan bakteri gram positif bersifat aerobik.

(Madigan, 2012, halaman 759)

Gambar III.2 Hasil isolasi Bacillus subtilis (http://imgkid.com/) Gambar III.3 Hasil isolasi campuran A pada percobaan

III.1.2 Metode Cawan Tuang

Metode cawan tuang merupakan teknik lain dalam tujuan yang sama seperti metode cawan gores, yakni mendapatkan koloni murni mikroorganisme. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan tinggi. Biakan campuran diencerkan dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal.(http://repository.usu.ac.id/)Seperti halnya pada metode cawan gores, dalam cawan tuang ini sebelum melakukan inokulasi, maka perlu dilakukan proses sterilisasi petridish, tabung reaksi, serta media terlebih dahulu. Dengan tujuan untuk menghindari kontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan, hal ini dilakukan dengan cara memasukkan ke dalam autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit. Selanjutnya memasukkan media PDA kurang lebih 1/2 ml pada tabung reaksi yang telah ditandai dengan angka 1, 2, dan 3. Kemudian menginokulasikan biakan suspensi campuran mikroorganisme Aspergillus niger, Thiobacillus harzianum dan Rizhopus oligosporus ke dalam tabung reaksi 1, yang dilakukan dengan menggunakan teknik aseptik di dalam incase. Kemudian mengocok tabung reaksi 1 perlahan dengan cara memuntir-nya agar campuran biakan mikroorganisme tersebar merata dalam larutan media (homogen), lalu menginokulasikan biakan campuran dari tabung reaksi 1 ke tabung reaksi 2. Sementara itu, sisa inokulasi pada tabung 1 dituangkan ke dalam petridish 1. Selanjutnya, setelah tabung reaksi 2 tercampur rata dengan cara mengocok tabung reaksi 2, kemudian menginokulasikan tabung 2 tersebut ke dalam tabung reaksi 3. Sementara itu, sisa inokulasi pada tabung 2 dituangkan ke dalam petridish 2. Kemudian hasil inokulasi pada tabung 3 di kocok agar tercampur rata lalu dituangkan langsung ke petridish 3. Setiap menginokulasi, hal yang perlu diperhatikan adalah memijarkan kawat ose terlebih dahulu untuk mengurangi kontaminasi oleh mikroorganisme yang tidak diinginkan. Pengocokan tabung reaksi yaitu dengan cara memutarnya diantara kedua telapak tangan dengan perlahan, hal ini dimaksudkan agar tidak mengenai kapas penyumbat karena akan menyebabkan terkontaminasinya biakan mikroorganisme sehingga dapat mengurangi populasi sesungguhnya dari mikroorganisme, dan juga agar tidak timbul gelembung-gelembung udara pada media agar. Sebab beberapa mikroorganisme membutuhkan oksigen bebas dalam pertumbuhannya, sedangkan yang lain dihambat oleh oksigen. Karena alasan inilah maka kondisi media tumbuh harus disesuaikan sedemikian, sehingga menguntungkan bagi kelompok mikroorganisme yang ingin diamati.

(Pelczar, 2007, halaman 110)

Pada pengamatan 24 jam, hampir seluruh petridish telah ditumbuhi oleh koloni bakteri. Dalam petridish 1, bakteri tumbuh merata dalam media, dengan diameter koloni 4,1 cm berwarna putih agak bening. Pada petridish 2, koloni bakteri ukurannya lebih kecil daripada pada petridish 1 dengan diameter berkisar 2,6 cm berwarna putih agak bening. Sedangkan pada petridish 3, terdapat koloni bakteri dengan diameter 2,2 cm berwarna putih agak bening. Pada pengamatan dari atas tepi terlihat bentuk koloni mikroba berbentuk bulat lingkaran sedangkan pada permukaan samping berbentuk seperti setengah bola. Sedangkan pada pengamatan 48 jam, kita mendapatkan koloni mikroorganisme yang telah tumbuh menjadi lebih besar dari petridish 1, 2, dan 3, dengan diameter pada petridish 1 sebesar 8,9 cm, petridish 2 sebesar 5,6 cm, dan pada petridish 3 sebesar 4,2 cm. Pada petridish 3, koloni tersebut telah terisolasi dengan baik dibandingkan dengan petridish 1 dan 2, yang mikroorganismenya belum terisolasi dengan sempurna. Hal ini dikarenakan pengaruh pengenceran, terbukti dengan terlihatnya jarak antar koloni yang lebih jauh serta hanya terdapat sedikit koloni. Berbeda dengan petridish yang lain yang koloninya banyak meyebar pada petridish, sehingga pada petridish 3 ini sudah didapatkan koloni bakteri. Dari pengamatan mengenai ciri morfologinya, diketahui bentuk bakteri tersebut adalah bulat lonjong, dengan sebagian ada yang berlekuk-lekuk tidak beraturan dan berwarna putih kekuningan (putih tulang). Dengan demikian, bila dibandingkan antara ciri morfologi bakteri yang didapat dengan literatur, maka bakteri yang terisolasi pada cawan tuang lebih mengarah pada Thiobacillus harzianum yang merupakan bakteri gram positif.

(Sri Sumarsih, 2003, halaman 24)

Gambar III.6 Hasil isolasi metode cawan tuang setelah 48 jamIII.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))Percobaan uji biokimia (uji methyl red Voges Proskauer (MR-VP Test)) ini adalah untuk mempelajari dihasilkan tidaknya asam organik atau asam campuran (metilen glikol) oleh suatu mikroorganisme. Dalam percobaan ini, asam organik yang dihasilkan adalah asetil metil karbinol (asetolin) yang diproduksi mikroorganisme. Dalam metode ini, digunakan 2 jenis indikator, yakni indikator methyl red dan juga indikator barrits reagen(campuran KOH dan naphtol). Sementara itu, mikroorganisme yang digunakan dalam uji MR-VP ini adalah jamur Rhizopus oligosporus. Untuk pengamatan selama 48 jam, sebelumnya larutan media kultur yang telah diinkubasi selama 24 jam terlebih dahulu dibagi menjadi 2 bagian(2 tabung reaksi). Sehingga 1 larutan dalam tabung reaksi dapat disimpan kembali di dalam inkubator untuk melakukan pengamatan selama selama 48 jam nantinya. Media kultur mikroorganisme yang digunakan dalam percobaan ini adalah MR-VP Broth. Media ini juga dikenal dengan media buffered peptone-glucose broth yang digunakan dalam reaksi uji MR-VP.(http://catalog.hardydiagnostics.com/)

III.2.1. Methyl Red Test

Methyl red merupakan indikator yang memiliki trayek pH dengan range 6,3 (kuning) sampai 4,2 (merah). Nama kimiawi dari methyl red adalah o-Carboxybenzene-azo-dimethylaniline(Svehla, 1979, halaman 54)Pengukuran keasaman yang dideteksi oleh indikator methyl red biasanya lebih rendah dari pada indikator lainnya (pada media kultur bakteri). Karena itu, untuk dapat terjadi perubahan warna, mikroba yang digunakan dalam uji MR-VP ini harus menghasilkan asam kuat dalam jumlah yang banyak. Asam yang dihasilkan berbentuk asam organik atau asam campuran (metilen glikol) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP Broth. Saat indikator methyl red diberikan, jika muncul warna merah, maka hasil tes positif. Hal ini menunjukkan bahwa mikroba menghasilkan asam organik. Pertama-tama, hal yang dilakukan adalah meng-inokulasikan Rhizopus oligosporus ke dalam 2 tabung reaksi yang telah melalui proses sterilisasi pada autoclave yang berisikan 1/3 volume tabung reaksi dengan media kultur MR-VP. Kemudian, diberikan indikator methyl red setelah melalui proses inkubasi selama 24 jam dan 48 jam. Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, didapatkan hasil negatif untuk uji methyl red yang dilakukan selama 24 jam, dan juga pada selang waktu 48 jam. Hal ini dapat dilihat dari gambar hasil pengamatan . Uji akan bersifat positif bila kaldu berwarna merah setelah penambahan reagensia methy red dan akan bersifat negatif bila kaldu MR-VP berubah warna menjadi kuning atau jingga setelah penambahan reagensia.(Direktorat Pembinaan SMK, 2013, halaman 89)

III.1. 2. Voges-Proskauer testPada percobaan ini, indikator yang digunakan adalah Barrits reagen, yaitu gabungan senyawa naphtol dan KOH. Jumlah kuantitas dari larutan KOH dan naphtol yang digunakan pada uji Voges-Proskauer adalah sebanyak 10 tetes untuk larutan KOH dan 15 tetes untuk larutan naphtol. Pada uji ini, hasil positif ditunjukkan dengan munculnya warna merah (endapan). Endapan berwarna merah dihasilkan oleh penambahan H2O2 dan terbentuknya asetoin (asetil metal karbinol) dari proses fermentasi dextrose. Karena ada oksigen dari udara dan H2O2, asetoin direduksi menjadi diasetil, dan alpha-naphtol menjadi katalis untuk menghasilkan warna merah. Perubahan warna medium ini diperjelas dengan penambahan larutan alpha-naphtol. Perubahan warna medium biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena 2,3 butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehinggal memperjelas hasil reaksi.(Direktorat Pembinaan SMK, 2013, halaman 91)

Pertama-tama, hal yang dilakukan adalah meng-inokulasikan Rhizopus oligosporus ke dalam 2 tabung reaksi yang telah melalui proses sterilisasi pada autoclave yang berisikan 1/3 volume tabung reaksi dengan media kultur MR-VP. Kemudian, diberikan 10 tetes KOH dan 15 naphtol (Barrits reagen) setelah melalui proses inkubasi selama 24 jam dan 48 jam. Dari hasil percobaan uji VP pada jamur Rhizopus oligosporus adalah sebagai berikut. Pada waktu 24 jam, sudah . Hal ini menandakan jamur Rhizopus oligosporus menghasilkan asetoin. Pada waktu 48 jam, Rhizopus oligosporus tetap menghasilkan endapan berwarna merah yang hampir serupa dengan percobaan pada waktu 24 jam. Ini menandakan jamur Rhizopus oligosporus tetap menghasilkan asetoin dalam kurun waktu 48 jam. Hal ini dapat dilihat pada gambar hasil pengamatan. Hal lainnya yang dapat membuat kesalahan dalam praktikum uji Voges-Proskauer ini dapat disebabkan oleh suhu inkubasi yang tidak sesuai dengan mikroorganisme yang di uji. Selain itu juga urutan dalam penambahan reagent sangatlah penting, karena jika urutan penambahan reagent tidak tepat, maka akan menyebabkan hasil positif yang lemah ataupun hasil negatif yang tidak dapat dipastikan kebenarannya.(http://catalog.hardydiagnostics.com/)III.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)Percobaan ini bertujuan untuk menentukan jenis mikroorganisme yang memiliki gelatinase, yaitu eksoenzim yang mempunyai kemampuan menguraikan gelatin menjadi asam amino. Dalam percobaan yang telah dilakukan, mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri Zymomonas mobilis. Bakteri Zymomonas mobilis mengandung 2 enzim yang memiliki peran berbeda, salah satu bertanggung jawab terhadap glukosa, dan satu lagi bertanggung jawab terhadap fruktosa dan fosforilasi. (http://link.springer.com/)Media yang digunakan dalam praktikum ini adalah nutrient gelatin, yang memiliki fungsi untuk mendeteksi adanya pencairan gelatin oleh mikroorganisme proteolytic. Komposisi takaran (dalam satuan Gms / Litre) dari nutrient gelatin ini adalah 5 Gms/lt jaringan pencernaan peptisasi hewan (peptone), 3 Gms/lt ekstrak daging sapi, dan 120 Gms/lt gelatin. Dari literatur, didapatkan hasil pH akhir (ketika suhu 25C) adalah 6,80,2.(http://himedialabs.com/)Hal pertama yang dilakukan dalam percobaan ini adalah, memasukkan media nutrient gelatin cair ke dalam 2 tabung reaksi (1 tabung sebagai blanko). Kemudian, memasukkan tabung reaksi yang telah berisikan medai nutrient gelatin cair kedalam autoclave untuk memulai proses sterilisasi. Setelah proses sterilisasi dalam autoclave berakhir, maka dilanjutkan dengan proses inkubasi dalam inkubator selama kurun waktu 48 jam. Setelah selesai kemudian dilakukan pengamatan dengan cara mendinginkannya di dalam freezer (0-4C) selama 10-15 menit. Kemudian mencatat hasil pengamatan, dengan menandai positif apabila gelatin mencair setelah di dinginkan, dan menandai dengan tanda negatif apabila gelatin tidak mencair setelah didinginkan.(http://www.thermoscientific.com/)

Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, ditemukan hasil uji hidrolisis gelatin terhadap mikroorganisme bakteri Zymomonas mobilis menghasilkan gelatin yang tidak mencair ketika didinginkan (selama kurun waktu 48 jam). Sehingga dapat diberi tanda negatif (-). Hal ini dikarenakan media yang digunakan dalam percobaan ini adalah nutrient gelatin yang memiliki komposisi (secara teoritis) peptone, ekstrak daging sapi, dan gelatin. Namun dalam percobaan, media kultur mikroorganisme yang digunakan diberi tambahan agar, yakni NBA (Nutrient Broth Agar). Penambahan dari medium NBA, menjadi salah satu dari penyebab hasil uji hidrolisa gelatin tetap menjadi padatan ketika didinginkan. Selain itu, suhu dari inkubasi tidaklah merupakan suhu optimal dalam pendeteksian dari degradasi gelatin oleh beberapa media, tetapi jika temparture diatas 30-35C, gelatin dapat berwujud fluid dibandingkan gel. Lalu dari data tabel pada literatur yang mengambil beberapa sample mikroorganisme, ditemukan bahwa keadaan konsentrasi nutrient gelatin yang digunakan lebih optimal (berdasarkan fungsi waktu) pada konsentrasi 4% dibandingkan dengan konsentrasi 12%. Dan suhu optimal (berdasarkan fungsi waktu) inkubasi pada beberapa mikroorganisme adalah 30C dibandingkan dengan suhu 35C.(Greenwood, 1991, halaman 2)Dari tabel pada literatur, yakni tabel phenotypic characteristic of some new Zymomonas strains. Dijelaskan bahwa untuk bakteri Zymomonas dengan sub spesies mobilis memiliki strains negatif (-) untuk uji coba liquifikasi gelatin, dalam hal ini tidak dapat menguraikan gelatin karena tidak adanya eksoenzim gelatinase.(http://ijs.sgmjournals.org/)IV. Jawaban Pertanyaan1. ISOLASI MIKROORGANISMEa. Bagaimanakah keadaan media pembanding (blanko)? Apakah kegunaannya?Keadaan media pembanding (blanko) dalam percobaan isolasi mikroorganisme dari suatu campuran adalah steril dan tidak ditumbuhi bakteri. Fungsi blanko disini adalah sebagai pembanding keadaan media sebelum dan sesudah dilakukan penanaman bakteri.b. Setelah melakukan isolasi bakteri dengan metode cawan gores, pada daerah manakah bakteri terisolasi? Bandingkan dengan media pembanding!

Pada isolasi bakteri dengan menggunakan metode cawan gores, daerah yang terkena isolasi adalah sektor 1, 2, dan 3 namun mikroorganisme yang terisolasi sempurna terdapat pada sektor 3. Jika dibandingkan dengan blanko maka sektor 3 terlihat lebih pekat dan pada media blanko sendiri tetap steril (tidak ada bakteri yang tumbuh).

c. Apakah pada permukaan agar yang tidak saudara gores tampak koloni? Jelaskan! (jika terdapat ataupun tidak)

Pada permukaan yang tidak digores (blanko) sedikit terdapat koloni setelah pengamatan 42 jam, hal ini menunjukkan bahwa media telah terkontaminasi yang disebabkan waktu membuka media pada pengamatan pertama terlalu lebar sehingga media terkontaminasi oleh bakteri di udara meskipun dilakukan didalam incase.d. Apakah keunggulan dan kekurangan dari dua metode di atas?

Perbandingan kelebihan dan kekurangan metode cawan gores dan cawan tuangMetodeKelebihanKekurangan

Cawan GoresHanya membutuhkan sedikit media untuk membiakkan mikroorganisme dan menghemat waktu.Membutuhkan ketelitian dan ketepatan dalam menggores, agar mikroorganisme dapat terisolasi dengan sempurna.

Cawan TuangCukup mudah, tidak membutuhkan keterampilan yang terlalu tinggi untuk menginokulasikan mikroorganisme.Boros dalam waktu dan penggunaan media.

2. UJI BIOKIMIA

e. Media yang digunakan pada beberapa test

Produksi Butadienol menggunakan media MRVP Hidrolisa kanji menggunakan media kanji agar Hidrolisa lemak menggunakan nutrient agar cair dan minyak nabati Hidrolis kasein menggunakan kasein agar

f. Pasangan reagent dan test

Voges-Proskaeuer test pada Reagen Barrit Katalase test pada Hidrogen Peroksida Hidrolisa kanji pada Gram Ioding. Enzim yang terlibat pada reaksi dan produk hasil hidrolisanya

Jenis HidrolisaReaktanEnzimProduk

Hidrolisa KaseinKasein (protein susu)KaseinaseGlukosa+glukosa

Hidrolisa KanjiPolysakaridaAmilaseDisakarida/monosakarida

Hidrolisa LemakLemakLipaseAsam lemak + gliserol

Hidrolisa GelatinGelatingelatinaseAsam amino

h. Perbedaan Methyl Red test dan Voges Proskauer Test

No.VariabelMethyl-RedVoges-Proskaeuer

1

2

3Indikator

Test positif

Test negatifMethyl-Red

Warna merah

Warna kuning setelah 15 menitBarrit Reagent (KOH + Reagent)

Warna merah muda, merah, orangeTidak berwarna merah muda, merah, orange setelah 30 menit

i. Manfaat enzim

Untuk mengurangi hambatan energi aktivasi pada suatu reaksi sehingga proses terjadinya reaksi lebih cepat.

V. Kesimpulan

V.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran

V.1.1 Metode Cawan GoresHasil isolasi dengan metode cawan gores menghasilkan koloni Bacillus subtilis dari campuran mikroorganisme Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis.V.1.2 Metode Cawan Tuang

Hasil isolasi dengan metode tuang menghasilkan koloni dari Trichoderma harzianum dari campuran mikroorganisme Rhizopus oligosprorus, Trichoderma harzianum, dan Aspergillus niger.V.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))

Dari hasil percobaan dan pengamatan dapat diperoleh kesimpulan bahwa jamur Rhizopus oligosporus tidak dapat membentuk asetil methyl carbinol sebagai asam organik.V.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)Dari hasil percobaan dan pengamatan dapat disimpulkan bahwa jamur Rhizopus oligosporus tidak memiliki enzim gelatinase, yakni suatu enzim yang memiliki kemampuan menghidrolisis gelatin menjadi asam amino yang ditunjukkan dengan tidak adanya perubahan menjadi fase cair setelah didinginkan pada suhu 0-5C.Daftar PustakaDirektorat Pembinaan Sekolah Menengah Kejuruan. 2013. Mikrobiologi. Jakarta : Kementrian Pendidikan dan KebudayaanGreenwood, J.R. dkk. 1991. Test for Detecting Degradation of Gelatin : Comparison of Five Methods. California : American Society for Microbiology.Hendrianie, Nunik. 2001. Diktat Kuliah Mikrobiologi Industri. Surabaya: Institut Teknologi Sepuluh Nopember.Madigan, Michael dkk. 2012. Biology of Microorganism. Wageningen : Pearson Education Inc.Pelczar, Michael dan Chan . 2007. DASAR-DASAR MIKROBIOLOGI. Jakarta : Universitas Indonesia.Prescott, Harley. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. New York : The Mc Graw-Hill Company.

Sumarsih, Sri. 2003. MIKROBIOLOGI DASAR. Yogyakarta : Universitas Pembangunan Nasional Veteran Yogyakarta.

Svehla, G. 1979. TEXTBOOK OF MACRO AND SEMIMICRO QUALITATIVE INORGANIC ANALYSIS. Belfast : Queens University.Tortora, G. dkk. 2010. Microbiology : An Introduction, 10th edition. San Francisco : Pearson Education Inc.http://www.neogen.com/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 19.10 WIB.http://www.fda.gov/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 22.01 WIB.http://www.mastgpr.com/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 19.20 WIB.http://www.biolabs.tmcc.edu/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 22.30 WIB.http://www.repository.usu.ac.id/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 23.40 WIB.http://www.catalog.hardydiagnostics.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 09.03 WIB.http://www.catalog.hardydiagnostics.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 10.26 WIB.http://www.link.springer.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 11.18 WIB.

http://www.himedialabs.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 11.40 WIB.http://www.thermoscientific.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 12.26 WIBhttp://www.ijs.sgmjournals.org/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 22.30 WIB http://www.imgkid.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 23.04 WIBNegatif (-)

21