LAPORAN RESMIPRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASIPRAKTIKUM VIUJI AKTIVITAS MIKROBA: METODE DILUSI CAIR

Penyusun :1. Annisa Nilamsari Utami14/362870/FA/10026 ()2. Muhammad Faishal Mahdi14/362873/FA/10029 ()3. Agung Wiranto Setyabudi14/362876/FA/10032 ()4. Cinantya Talia Paramita14/362879/FA/10035 ()Kelas : AGolongan / Kelompok: II / 2Hari, Tanggal Praktikum: Rabu, 29 April 2015 (Tahap I) Rabu, 6 Mei 2015 (Tahap II)Dosen Jaga: Dr. rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si., Apt.Asisten Jaga: Lodyta dan DwiAsisten Koreksi:LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASIBAGIAN BIOLOGI FARMASIFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS GADJAH MADAYOGYAKARTA2015PRAKTIKUM VIUJI AKTIVITAS MIKROBA: METODE DILUSI CAIR

I. TujuanMenentukan kadar hambat minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel terhadap mikroba uji.II. Dasar TeoriAntibiotik adalah suatu substansi kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme, yang dalam konsentrasi kecil mempunyai kemampuan menghambat atau membunuh mikroorganise lain. Antibiotik bersifat selektif toksis pada bakteri, namun tidak toksik pada sel inang. Sedangkan, antimikroba adalah bahan-bahan yang dihasilkan dari mikroorganisme, tanaman, dan lain lain yang digunakan untuk memberantas atau membasmi mikroba, khususnya yang merugikan manusia, terbatas yang bukan parasit di antaranya antibiotika, antiseptik, kemoterapeutika, preservative (Dwidjoseputro, 2003).Antibiotika dan antimikroba dapat melakukan aktivitasnya lewat beberapa mekanisme terutama dengan penghambatan sintesa penting dari bakteri :1. Dinding sel, antibiotik dan antimikroba dapat menghambat biosintesis peptidoglikan sehingga dinding sel menjadi lemah, dan dinding sel akan lisis, sehingga bakteri mati. Contohnya adalah penisilin, vankomisin, dan lain lain.2. Membran sel, antibiotik dan antimikroba akan mempengaruhi permeabilitas dan menyebabkan keluarnya senyawa intraseluler mikroorganisme, sehingga sel rusak dan mati. Contohnya adalah polimiksin dan nistatin.3. Protein sel, berkaitan dengan sub unit ribosom 30S dan mengubah sintesis protein, dan akhirnya sel mati. Contohnya adalah minoglikosida.4. Asam nukleat, antibiotik dan antimikroba akan menghambat RNA polimerase dan topoimerase. Contohnya adalah golongan kuinolon.5. Metabolisme sel, antibiotik dan antimikroba secara struktur seperti sulfonamide mirip dengan PABA yang merupakan metabolit utama bakteri. Antimikroba ini akan bersaing dengan PABA, dan jika menang bersaing dengan PABA, maka akan terbentuk asam folat non fungsional yang akan mengganggu mikroorganisme. Contohnya adalah sulfonamide, dan lain lain.Agen antimikroba yang ideal adalah yang bersifat sebagai berikut :1. Menghambat pertumbuhan atau membunuh pathogen tanpa merusak host.2. Bersifat bakterisida (membunuh mikroba).3. Tidak menyebabkan resistensi terhadap kuman.4. Berspektrum luas, sehingga efektif baik terhadap bakteri Gram positif maupun Gram negatif.5. Tidak menimbulkan alergi dan efek samping jika digunakan dalam jangka waktu lama.6. Aktif dalam plasma, eksudat, atau cairan bahan.7. Larut dalam air secara stabil.8. Bacterial dalam tubuh cepat dicapai dan dapat bertahan dalam jangka waktu yang lama (Hugo & Russell, 1998).Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik (menghambat pertumbuhan mikroba) menjadi bakteriosida bila kadat antimikroba ditingkatkan melebihi nilai KHM dan KBM. KHM (Kadar Hambat Minimum) adalah kadar minimum yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Sedangkan KBM (Kadar Bunuh Minimum) adalah kadar minimum yang diperlukan untuk membunuh organisme atau mikroba. Penentuan kadar antibiotik dari suatu sampel sangat diperlukan untuk memeriksa kadar antibiotik dalam suatu sampel sediaan obat, kadar antibiotik dalam susu dan daging, penetapan kadar antibiotik yang dihasilkan dari prosen fermentasi, dan lain sebagainya.Metode uji antimikroba bermacam-macam, salah satu di antaranya adalah metode dilusi cair (broth dilution). Pada metode ini, diukur KHM dan KBM dari antimikroba yang diuji. Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM, dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji atau agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008).III. Alat dan BahanA. Alat1. Laminar Air Flow (LAF)2. Ose3. Lampu Bunsen4. Eppendorf5. Tabung reaksi ukuran 5 mL beserta raknya6. Kapas7. Aluminium foil8. Mikropipet, blue tip dan yellow tip9. Cawan petri10. Inkubator11. Kulkas12. Kompor listrikB. Bahan1. Minyak atsiri Krangean (Litsea cubeba Pers.)2. Pelarut DMSO3. Media cair Mueller-Hinton (MH)4. Antibiotik Kloramfenikol5. Suspensi bakteri Staphylococcus aureus6. Media cair Nutrien Agar (NA)7. Alkohol 75%IV. Cara Kerja A. Tahap IDibuat stok minyak atsiri Krangean 50% dengan mencampur 0,5 mL minyak atsiri dan 0,5 mL DMSO

Dibuat lima seri pengenceran kelipatan (two-fold dilution)

Diisi tabung reaksi 5 mL pertama dengan media cair MH sebanyak 4 mL dan empat tabung reaksi 5 mL lainnya dengan media cair MH sebanyak 2 mL

Dibuang 0,08 mL media dari tabung I, dimasukkan 0,08 mL stok minyak atsiri ke dalamnya sehingga didapatkan kadar minyak atsiri 1% dalam tabung I

Diambil 2 mL campuran dari tabung I, ditambahkan ke dalam tabung II, sehingga didapatkan kadar minyak atsiri 0,5% dalam tabung II; demikian seterusnya hingga didapatkan kadar minyak atsiri dalam tabung III, IV, dan V masing-masing sebesar 0,25%, 0,125% dan 0,0625%

Dibuang 2 mL campuran dari tabung V sehingga seluruh tabung berisi sampel uji sebanyak 2 mL

Dibuang 0,02 mL campuran dari kelima tabung tersebut, ditambahkan 0,02 mL suspensi bakteri S. aureus ke dalam seluruh tabung

Dibuat kontrol positif berisi: 1,940 mL MH; 0,04 mL suspensi Kloramfenikol 2 mg; serta 0,02 mL suspensi bakteri S. aureus

Dibuat kontrol media berisi: 2 mL MH

Dibuat kontrol pelarut berisi 1,940 mL MH; 0,04 mL DMSO; serta 0,02 mL suspensi bakteri S. aureus

Dibuat kontrol negatif berisi 1,980 mL MH serta 0,02 mL suspensi bakteri S. aureus

Ditutup kelima tabung dengan kapas dan aluminium foil

Diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam

Diambil sampel uji yang masih menunjukkan kejernihan beserta keempat kontrol, dimasukkan ke dalam kulkasB. Tahap IIDikeluarkan sampel uji dari dalam kulkas

Dicairkan media NA yang masih padat, ditunggu hingga suhunya 40C

Dituangkan media cair NA ke dalam cawan petri, dibiarkan memadat

Digoreskan sampel uji pada media dengan bantuan ose

Diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam

Diamati keberadaan koloni bakteri S. aureus yang tumbuh pada media

V. Hasil Pengamatan A. Tahap I

Gambar 1. Sampel uji beserta kontrol setelah diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. Dari kiri ke kanan: Sampel uji konsentrasi 0,0625%, 0,125%, 0,25%, 0,5%, 1%; kontrol media, kontrol positif; kontrol pelarut; kontrol negatif.Setelah sampel uji beserta kontrol diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam, didapatkan hasil sebagai berikut:KejernihanSampel / Kontrol

JernihSampel uji konsentrasi 0,25%, 0,5%, 1%; kontrol media; kontrol positif

KeruhSampel uji konsentrasi 0,0625%, 0,125%; kontrol pelarut; kontrol negatif

Berdasarkan data tersebut, KHM dari minyak atsiri Krangean yang diuji adalah 0,25%. Seluruh sampel yang jernih kemudian disimpan di dalam kulkas untuk dilakukan penentuan KBM pada tahap berikutnya.B. Tahap II

Gambar 2. Sampel uji yang telah digoreskan ke atas media padat NA setelah diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. KR = minyak atsiri Krangean; TL = minyak atsiri Temulawak (percobaan kelompok lain yang diuji dalam cawan petri yang sama dengan kelompok praktikan)

Setelah sampel uji yang digoreskan pada media padat NA diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam, tidak terdapat koloni bakteri yang tumbuh. Dengan demikian, nilai KBM minyak atsiri Krangean yang diuji sama dengan nilai KHMnya, yakni 0,25%.VI. PembahasanPraktikum ini bertujuan untuk menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan kadar Bunuh Minimum (KBM) dari suatu sampel terhadap suatu mikroba uji dengan metode dilusi cair. Prinsip dilusi cair adalah pengujian terhadap suatu senyawa yang diduga memiliki aktivitas antimikroba dengan membuat seri pengenceran senyawa tersebut dalam suatu media cair yang nantinya akan ditambahkan sejumlah tertentu mikroba, kemudian diinkubasi pada suhu 3610C selama 18-24 jam lalu diamati kejernihannya (Istiantoro, 1995)Langkah pertama dalam percobaan ini adalah pembuatan larutan stok minyak atsiri yang akan diuji, yaitu minyak Krangean dengan konsentrasi 50%. Larutan stok ini dibuat dengan mencampurkan minyak atsiri dan pelarut DMSO dalam jumlah yang sama.Kemudian dibuat lima seri pengenceran kelipatan (two-fold dilution). Disiapkan lima buah tabung reaksi ukuran 5 mL, salah satunya diisi media cair MH sebanyak 4 mL sedangkan sisanya sebanyak 2 mL. Pada tabung yang berisi 4 mL media, dikeluarkan 0,08 mL media dan dimasukkan 0,08 mL stok minyak atsiri sehingga campuran dalam tabung tersebut mengandung minyak atsiri Krangean dengan kadar 1%. Selanjutnya diambil 2 mL campuran dari tabung tersebut dan dipindahkan ke dalam tabung kedua, sehingga tabung II mengandung minyak atsiri Krangean dengan kadar 0,5%. Begitu seterusnya sehingga tabung III, IV dan V masing-masing mengandung minyak atsiri dengan kadar 0,25%, 0,125% dan 0,0625%. Pada akhir pengenceran, dalam tabung V akan terdapat 4 mL campuran, untuk menyeragamkan dengan tabung-tabung lain maka dibuang 2 mL campuran dari tabung V sehingga volume campuran dari setiap tabung adalah tepat 2 mL. Pemindahan dan pemasukkan media serta sampel yang akan diuji dilakukan dengan mikropipet dan blue tip yang steril.Selanjutnya dibuang 0,02 mL campuran dari masing-masing tabung dan diisikan 0,02 mL suspensi bakteri Staphylococcus aureus ke dalam setiap tabung. Pengambilan dan pemasukan suspensi bakteri dilakukan dengan mikropipet dan yellow tip yang steril; Mulut tabung wadah suspensi bakteri dipanaskan terlebih dahulu sebelum dan sesudah suspensi bakteri diambil. Seluruh tabung kemudian ditutup dengan kapas dan aluminium foil untuk mencegah kontaminasi.Berikutnya disiapkan empat buah kontrol sebagai berikut: Kontrol positif, berisi 1,940 mL media, 0,04 mL suspensi Kloramfenikol 2 mg dan 0,02 mL suspensi S. aureus; Kontrol media, berisi 2 mL media; Kontrol pelarut, berisi 1,940 mL MH, 0,04 mL DMSO dan 0,02 mL suspensi S. aureus; Kontrol negatif, berisi 1,980 mL MH dan 0,02 mL suspensi S. aureus. Kontrol-kontrol tersebut dibuat sebagai perbandingan terhadap sampel yang akan diuji. Kontrol positif berfungsi sebagai pembanding apakah senyawa uji dapat memberikan efek yang sama dengan antibiotik, sementara kontrol pelarut digunakan untuk mengetahui apakah pelarut mempunyai efek terhadap mikroba yang digunakan (Emrizal dkk., 2012).Lima seri pengenceran sampel uji beserta keempat kontrol kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. Apabila mikroba tidak terpengaruh oleh sampel uji, dengan kata lain sampel uji tidak memiliki aktivitas antimikroba, maka dalam masa inkubasi mikroba akan bereproduksi dan mengakibatkan kekeruhan pada media yang berisi sampel uji tersebut (Leboffe & Pierce, 2010). Setelah masa inkubasi terlewati, diamati kejernihan pada seluruh tabung reaksi untuk menentukan nilai KHM dari sampel uji. Dari kelima seri pengenceran sampel uji, yang masih menunjukkan kejernihan adalah sampel dengan kadar 0,25%, 0,5% dan 1%. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa KHM dari minyak atsiri Krangean yang diuji adalah 0,25%.Pada kontrol positif, larutan tampak jernih yang membuktikan bahwa Kloramfenikol memiliki aktivitas antimikroba. Kloramfenikol merupakan antibiotik yang memberikan efek dengan bereaksi pada unit 50S ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase sehingga ikatan peptida antara asam amino baru yang masih melekat pada tRNA dengan asa amino terakhir yang sedang berkembang tidak dapat terbentuk; Akibatnya, sintesis bakteri akan terhenti seketika (Pratiwi, 2008).Pada kontrol pelarut yang berisi DMSO, larutan menjadi keruh yang menunjukkan bahwa DMSO tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri. DMSO, atau dimetil sulfoksida, merupakan larutan tidak berwarna yang memiliki sifat aprotik dipolar (dapat melarutkan senyawa polar maupun nonpolar) juga amfifilik (memiliki sifat hidrofilik dan hidrofobik). Sifat amfifilik ini mendukung kemampuan DMSO dalam menembus membran sel sehingga dapat melakukan penetrasi ke dalam sel (Sum & Pablo, 2003).Sampel yang masih jernih beserta kontrol kemudian disimpan ke dalam kulkas hingga praktikum tahap kedua yang dilaksanakan seminggu setelah praktikum tahap pertama.Pada tahap kedua, dimana akan ditentukan KBM dari sampel uji, media yang digunakan adalah Nutrien Agar (NA). NA merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa produk kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Media ini mengandung 10 g beef extract, 10 g pepton, 5 g natrium klorida, 1 L aqua destillata dan 15 g agar/L (Jawetz dkk., 1995).Media NA yang masih padat dicairkan dulu dengan bantuan kompor listrik, lalu ditunggu hingga suhu 40C, setelah itu dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan hingga media memadat. Cawan petri sebelumnya telah ditandai dengan spidol di bagian bawahnya untuk memisahkan area yang akan digoreskan sampel uji dengan kadar yang berbeda. Sampel uji digoreskan pada media padat NA menggunakan ose yang dipanaskan sebelum dan sesudah digunakan untuk mencegah kontaminasi. Tahap ini direplikasi sebanyak satu kali. Setelah itu, cawan petri yang berisi media dan sampel uji diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.Setelah masa inkubasi berlalu, diamati keberadaan koloni bakteri pada media padat NA. Dari hasil pengamatan kelompok praktikan, media NA jernih pada seluruh bagian, tidak terdapat koloni bakteri sama sekali sehingga dapat disimpulkan bahwa nilai KBM minyak atsiri Krangean yang diuji sama dengan nilai KHMnya yaitu 0,25%.Hasil yang diperoleh kelompok praktikan tidak bertentangan dengan literatur yang menyatakan bahwa ekstrak air, etanol, etil asetat, dan heksan dari daun Krangean tidak menunjukkan adanya aktifitas antimikrobia baik terhadap bakteri, kapang, maupun jamur (Areekul dkk., 2009) serta minyak esensial dari buah Krangean memiliki aktivitas anti bakteri baik gram negatif maupun positif (Daniel, 2005). Sifat antimikroba ini dikarenakan kandungan asam laurat pada Litsea cubeba yang tinggi; Asam laurat merupakan media pengikatan asam lemak dan dalam tubuh diubah menjadi monolaurin yang memiliki aktivitas antimikroba (Enig, 1998)Seluruh prosedur dalam praktikum ini, kecuali pembuatan larutan stok minyak atsiri 50% dan inkubasi, dilakukan secara aseptis dalam LAF (Laminar Air Flow) untuk menghindari kontaminasi baik terhadap sampel yang diuji maupun terhadap praktikan dan ruangan laboratorium (Nair, 2005).

VII. Kesimpulan1. Percobaan ini dilakukan dengan metode dilusi cair untuk menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) dari senyawa yang ingin diuji.2. Minyak atsiri Krangean yang diuji memiliki nilai KHM dan KBM yang sama, yaitu 0,25%3. Hasil yang diperoleh kelompok praktikan sesuai dengan literatur, bahwa minyak atsiri tumbuhan Litsea cubeba atau dikenal dengan nama Krangean memiliki aktivitas antimikroba.

VIII. Daftar PustakaAreekul, V., Jiapiyasakul, P. & Chandrapatya. A., 2009, In vitro antimicrobial screening of selected traditional Thai plants, Thai Journal of Agricultural Science, 42(2): 81-89.Daniel, M., 2005, Herbal technology - concepts and scope, Current Science, 88(9): 1369-1370.Dwidjoseputro, D., 2003, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.Emrizal, Fernando, A., Suryani, F., Ahmad, F., Sirat, H.M. & Arbain, D., 2012, Isolasi Senyawa dan Uji Aktivitas Anti-inflammasi Ekstrak Metanol Daun Puwar Kincung (Nicolaia speciosa Horan), Jurnal Penelitian Farmasi Indonesia, 1(1): 1-5Enig, M.G., 1998, Health and nutritional benefit from coconut oil, Price Pottenger Nutr Found Health J., 20(1): 1-6.Hugo, W. B. & Russell, A. D., 1998, Pharmaceutical Microbiology, 6th ed., Blackwell Science, Oxford.Istiantoro, 1995, Penisilin, Sefalosporin dan Antibiotik Betalaktam Lainnya, dalam Farmakologi dan Terapi, edisi keempat, Bagian Farmakologi dan Terapi FKUI, Jakarta.Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., Brooks, G.F., Butel, J.S. & Ornston, L.N., 1995, Mikrobiologi Kedokteran, edisi keduapuluh, diterjemahkan oleh Nugroho & R.F. Maulany, EGC, Jakarta.Leboffe, M.J. & Pierce, B.E., 2010, Microbiology: Laboratory Theory & Application, 3rd ed., Morton Publishing, Colorado.Nair, J., 2005, Comprehensive Biotechnology Class XII, Firewall Media, New Delhi.Pratiwi, S.T., 2008, Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta.Sum A.K. & Pablo J.J., 2003, Molecular simulation study on the influence of Dimethylsulfoxide on the structure of phospholipid bilayers, Biophys J 85: 3636-3645.

Yogyakarta, 12 Mei 2015Praktikan, 1. Annisa Nilamsari Utami(10026) ()2. Muhammad Faishal Mahdi(10029) ()3. Agung Wiranto Setyabudi(10032) ()4. Cinantya Talia Paramita(10035) ()