Laporan Praktikum KI2221

Cara Pemisahan dan Elektrometri

Percobaan 02

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Nama : Aviv Sigit Cahyono

Nim : 10513035

Kelompok : Kelompok V

Tanggal Percobaan : 06 Maret 2015

Tanggal Pengumpulan : 13 Maret 2015

Asisten : Rista Juni Utami

LABORATORIUM KIMIA ANALITIK

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2015

I. Tujuan1. Penentuan persamaan garis dari data HPLC larutan standar

2. Menentukan kadar kafein dalam teh dan kopi dengan teknik kromatografi cair kinerja tinggi.

II. Teori Dasar

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang berdasarkan atas terpartisinya

senyawa-senyawa antara fasa diam dengan fasa gerak. Saat ini, teknik HPLC yang

banyak digunakan secara luas adalah teknik kromatografi fasa terbalik. Dalam HPLC fasa

terbalik, suatu kolom diisi dengan suatu butiran padatan yang merupakan fasa diam

sedangkan pelarut atau fasa geraknya dialirkan melewati partikel padat.

Pada fasa diam dalam teknik kromatografi ini, telah menunjukkan bahwa jika fasa

diam tersebut tersusun atas butiran-butiran yang sangat kecil, berbentuk bola dan

mempunyai ukuran yang sama, memungkinkan untuk memperoleh hasil pemisahan yang

sangat sempurna dari campuran dengan menggunakan jumlah pelarut yang sedikit dalam

beberapa menit. Kromatografi dengan menggunakan fasa diam,, dikenal dengan nama

kromatografi cair kinerja tinggi. Dengan menggunakan fasa diam, diubutuhkan suatu

pompa tekanan tinggi untuk mendorong fasa geraknya, yang menyebabkan meningkatnya

harga peralatan sampai 10 kali lipat.

Fasa diam yang umum digunakan dalam kromatografi adalah bahan yang bersifat

polar, seperti silica, sementara fasa geraknya adalah pelarut organic yang kepolarannya

kurang bila dibandingkan dengan fasa diamnya. Teknik kromatografi seperti ini dikenal

dengan kromatografi fasa normal. Sedangkan jika fasa diamnya berupa fasa terikat

dimana partikel silica ditutupi dengan melapisinya dengan senyawa silena. Maka dapat

digunakan fasa gerak terbalik karena kepolaran antara fasa-fasa tersebut dibalik. Dalam

kromatografi fasa terbalik, waktu retensi akan meningkat dengan meningkatnya karakter

nonpolar dari suatu senyawa.

Pelarut-pelarut polar seperti air dan metanol merupakan eluen yang banyak digunakan

karena lebih murah dibanding kebanyakan pelarut-pelarut organic lain dan kurang

berbahaya jika dibuang ke lingkungan. Bahwa beberapa biomolekul yang ditemukan

dalam larutan hanya larut dalam pelarut polar. Senyawa-senyawa tersebut tidakn dapat

dikromatografi dalam pelarut nonpolar kalaupun bisa, maka diperlukan penyiapan yang

ekstensif dan membuat turunannya terlebih dahulu.

Dalam percobaan ini, penggunaan HPLC fasa terbalik tidak membutuhkan pekerjaan

mengekstraksi kafein ke dalam pelarut lain. Dengan menyuntikan suatu sampel yang

terlarut atau jika terdapat bahan yang tidak larut, sampel disaring terlebih dahulu sebelum

disuntikan. Eluen dari kolom dimonitor dalam bentuk adsorban. Karena adsorban

sebanding dengan konsentrasi, bentuk kromatogramnya akan sebanding dengan jumlah

kafein total yang terdapat dalam sampel.

III. Cara Kerja

Pembuatan fasa gerak (eluen)

Dibuat fasa mobil dengan komposisi 140 mL aquabidest : 1.4 mL H3PO4 5 % dan

60 mL metanol.

Dihilangkan gas terlarut dalam larutan ini dengan menggunakan ultrasonic bath.

Penyiapan larutan standar

Dengan menggunakan larutan standar 500 ppm kafein, dibuat sederet larutan

standar dengan konsentrasi masing-masing 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm sebanyak 5

mL. Dilakukan pengenceran dengan menggunakan eluen yang telah dibuat di atas.

Penyiapan larutan sampel

Khusus untuk minuman jenis cola, dihilangkan terlebih dahulu gas terlarut dengan

menggunakan ultrasonic bath.

Dilakukan pengenceran sebesar 5 (lima) kali dalam sebuah labu takar 10 mL

dengan menggunakan eluen.

Analisis

Direkam kromatogram masing-masing larutan standard dan sampel yang telah

dipersiapkan.

Dicatat parameter peralatan kromatografi yang digunakan seperti : laju alir eluen,

tekanan, jenis kolom yang digunakan, panjang gelombang detector, kecepatan

kertas perekam.

IV. Data Hasil Pengamatan

Tekanan pada HPLC = 0 – 400 bar

Panjang gelombang detector = 280 nm.

Komposisi eluen methanol : air = 80 : 20

Laju alir eluen = 1 mL/menit.

Volume suntikan = 50 microliter.

Ukuran kolom = 12.5 mm x 0.4 mm

Jenis kolom = C-18

Tabel 1 (Data hasil HPLC untuk larutan standar kafein)

No Konsentrasi (ppm) Area (mAU*s) Tinggi (mAU)

1 20 737.09332 137.527662 40 1715.57813 326.49853 60 2244.7915 444.244354 80 3447.25806 696.474065 100 3800.82715 697.6264

Tabel 2 (Data hasil HPLC untuk larutan sampel)

No Sampel Area (mAU*s) Tinggi (mAU)

1 Teh 3386.18018 307.255862 Kopi 1771.20764 294.77737

Untuk gambar hasil kromatografi HPLC dilampirkan.

V. Perhitungan dan Pengolahan Data

1. Pembuatan deret larutan standar

M1x V1 = M2x V2

Untuk 20 ppm500 x V1 = 20 x 25V1 = 1 ml

Untuk 40 ppm500 x V1 = 40 x 25V1 = 2 ml

Untuk 60 ppm500 x V1 = 60 x 25V1 = 3 ml

Untuk 80 ppm500 x V1 = 80 x 25V1 = 4 ml

Untuk 100 ppm500 x V1 = 100 x 25V1 = 5ml

2. Penentuan persamaan garis dari data HPLC larutan standar

No Konsentrasi (ppm) Area (mAU*s) Tinggi (mAU)

1 20 737.09332 137.527662 40 1715.57813 326.49853 60 2244.7915 444.244354 80 3447.25806 696.474065 100 3800.82715 697.6264

Gambar Kurva kalibrasi HPLC nilai tinggi terhadap konsentrasi

Dari kurva tersebut bisa ditentukan persamaan garisnya melalui regresi, didapat

persamaan garis:

y = 7.4509x + 13.422

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

100200300400500600700800

f(x) = 7.4508652 x + 13.422282R² = 0.947181969285513

Kurva Kalibrasi HPLC

Series2Linear (Series2)

Konsentrasi

Ting

gi (m

AU)

Gambar Kurva kalibrasi HPLC nilai luas area terhadap konsentrasi

Dari kurva tersebut bisa ditentukan persamaan garisnya melalui regresi, didapat

persamaan garis:

y = 39.296x + 31.365

3. Penentuan konsentrasi dari sampel teh

No Sampel Area (mAU*s) Tinggi (mAU)

1 Teh 3386.18018 307.255862 Kopi 1771.20764 294.77737

Dari data table tersebut maka bisa ditentukan konsentrasi sampel teh melalui persamaan

garis luas area terhadap konsentrasi dan persamaan garis dari tinggi terhadap konsentrasi

Konsentrasi sampel teh melalui persamaan garis luas area puncak

y = 39.296x + 31.365

3386.18018 = 39.296x + 31.365

x = 85.372 ppm.

Nilai x tidak dikali faktor pengenceran karena tidak diencerkan

Konsentrasi sampel teh melalui persamaan garis tinggi puncak

y = 7.4509x + 13.422

307.25586 = 7.4509x + 13.422

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

5001000150020002500300035004000

f(x) = 39.29573795 x + 31.3653549999995R² = 0.977892806695783

Kurva Kalibrasi HPLC

Series2Linear (Series2)

Konsentrasi

Area

(mAU

*s)

x = 39.436 ppm.

Nilai x tidak dikali faktor pengenceran karena tidak diencerkan

4. Penentuan konsentrasi dari sampel kopi

No Sampel Area (mAU*s) Tinggi (mAU)

1 Teh 3386.18018 307.255862 Kopi 1771.20764 294.77737

Dari data table tersebut maka bisa ditentukan konsentrasi sampel kopi melalui persamaan

garis luas area terhadap konsentrasi dan persamaan garis dari tinggi terhadap konsentrasi

Konsentrasi sampel kopi melalui persamaan garis luas area puncak

y = 39.296x + 31.365

1771.20764 = 39.296x + 31.365

x = 44.275 ppm.

Konsentrasi sampel kopi awal sebelum diencerkan:

44.275 ppm x faktor pengenceran

44.275 ppm x 25 mL5 mL

x 25 mL5 mL

= 1106.875 ppm.

Konsentrasi sampel kopi melalui persamaan garis tinggi puncak

y = 7.4509x + 13.422

294.77737 = 7.4509x + 13.422

x = 37.761 ppm

Konsentrasi sampel kopi awal sebelum diencerkan:

37.761 ppm x faktor pengenceran

37.761 ppm x 25mL5mL

x 25 mL5mL

= 944.025 ppm.

VI. Pembahasan

Pada percobaan ini, dilakukan penentuan kandungan kafein di dalam larutan sampel teh dan sampel kopi dengan metode pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan atas terpartisinya senyawa-senyawa antara fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padatan. Metode kromatografi ini, mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, memiliki kecepatan analisis yang tinggi dan dapat

menganalisis secara kualitatif dan kuantitatif dengan variable kualitatifnya adalah waktu retensi dari sampel.

Prinsip kerja dari HPLC adalah menggunakan suatu pompa bertekanan tinggi untuk mendorong fasa geraknya yang berupa pelarut agar dapat melewati fasa diam yang berupa kolom berisikan partikel pengemas. Sehingga campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatan untuk sampai kedetektor (waktu retensi) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Pada percobaan ini, fasa diamnya adalah fasa terikat dimana partikel silica ditutupi dengan melapisinya dengan senyawa silena. Maka dapat digunakan fasa gerak terbalik karena kepolaran antara fasa-fasa tersebut dibalik. Dalam kromatografi fasa terbalik, waktu retensi akan meningkat dengan meningkatnya karakter nonpolar dari suatu senyawa.

Suatu system peralatan HPLC memiliki instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas : wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah fasa gerak dan fasa gerakWadah fasa gerak harus bersih dan dapat menampung fasa gerak antara 1 sampai 2 liter pelaut. Fasa gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Dan fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan. Sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detector sehingga akan mengacaukan analisis.

2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat wadah

pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Laju alir eluen adalah 1 mL/menit dan penggunaan pompa bertujuan agar system penghantaran fase gerak adalah untuk

menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, konstan dan bebas dari gangguan,

3. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fasa gerak yang

mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat.

4. Fase diam Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi adalah bahan yang besifat polar seperti

silica, sementara fasa geraknya adalah pelarut organic yang kepolarannya kurang bila dibandingkan dengan fase diamnya. Fasa diamnya adalah silica yang dilapisi oleh silena, maka dapat digunakan fasa gerak terbalik karena kepolaran antara fasa-fasa tersebut terbalik.

5. Detector dan system injeksi Detector HPLC berfungsi untuk mendeteksi komponen-komponen yang telah dipisahkan di dalam kolom. Sedangkan system injeksi adalah ketika suatu sampel dimasukkan ke dalam kolom dengan menggunakan alat penyuntik melalui gerbang injeksi dan volume suntikan pada HPLC 1260 agilent adalah 50 microliter.

6. Kolom adalah bagian dari instrumentasi HPLC yang berfungsi untuk melakukan proses pemisahan komponen-komponen sampel yang akan berlangsung. Pemisahan terjadi akibat perbedaan distribusi/partisi dari masing-masing komponen tersebut. Ukuran kolom sebesar 12.5 mm x 0.4 mm dan kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom terbalik.

Pada percobaan ini, digunakan HPLC dengan jenis fasa terbalik, yaitu fasa diamnya besifat non-polar (C-18) dan fasa geraknya besifat polar (metanol : air = 80 : 20). Pada instrument HPLC, pelarut-pelarut harus dihilangkan komponen gasnya untuk menghalangi terbentuknya gelembung-gelembung dan penghilangan ini dapat dilakukan dengan menggunakan ultrasonic bath. C-18 merupakan senyawa silika yang pada permukaannya diberikan lapisan Xilena, sehingga fasa diam ini bersifat non-polar. Komposisi metanol-air yang digunakan sebagai eluen dipilih 80 : 20 dikarenakan komposisi tersebut yang memberikan hasil pemisahan kromatogram yang baik dengan waktu analisis yang sebentar dengan pembanding hasil percobaan pada komposisi lain. Metoda pengelusian analit yang dilakukan adalah elusi isokratik, yaitu komposisi eluen yang dipakai selama proses elusi adalah tetap 80 : 20 tidak berubah, sedangkan metoda elusi lainnya adalah elusi gradien, komposisi eluen berubah selama proses elusi. Air merupakan fasa gerak yang lemah dan memiliki retensi yang besar, sedangkan metanol memiliki kekuatan elusi yang lebih besar dibandingkan dengan air. Pelarut-pelarut ini sering digunakan karena harga yang lebih murah dibandingkan pelarut organic lain dan tidak berbahaya ketika dibuang ke lingkungan.

Pada HPLC ini, digunakan metode elusi isokrati karena sudah diketahui bahwa komponen penyusun sampel tidaklah terlalu banyak sehingga tidak digunakan pemisahan

dengan jumlah yang banyak, yakni : metode elusi gradien. Suatu komponen dapat terpisah dari komponen penyusun senyawa lainnya dalam kromatografi dikarenakan perbedaan interaksi antara komponen tersebut dengan fasa gerak dan fasa diam. Interaksi yang dimaksudkan dalam HPLC ini adalah interaksi kemiripan sifat kepolaran, komponen suatu senyawa memiliki sifat kepolaran yang berbeda-beda, sifat tersebut dapat dimanfaatkan untuk dilakukan pemisahan. Kemiripan sifat kepolaran akan menyebabkan suatu komponen akan lebih terlarut dalam satu fasa yang kepolarannya lebih mendekati dibandingkan fasa yanglainnya.

Kafein merupakan komponen yang ingin dipisahkan, komponen ini memiliki sifat yang polar, maka dari itu digunakan HPLC fasa terbalik yang tujuannya mempercepat waktu analisis. Kafein yang bersifat polar akan lebih terlarut dalam fasa diam dan akan memiliki waktu retensi yang lebih rendah dibandingkan komponen lainnya yang lebih bersifat non-polar namun akan memiliki waktu retensi yang lebih besar dibandingkan komponen lainnya yang bersifat lebih polar dibandingkan kafein. Waktu retensi akan bervariasi tergantung pada tekanan yang digunakan (mempengaruhi laju alir pelarut), sifat fasa diam (komponen dan ukuran partikel), komposisi pelarut, dan suhu kolom. Detektor yang digunakan pada instrumen HPLC kali ini adalah spektrofotometer UV-VIS, sebuah metoda umum yang mudah untuk menjelaskan menggunakan penyerapan ultra-violet. Banyak senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika seberkas sinar UV dilewatkan pada aliran cairan yang keluar dari kolom, dan detektor UV berada pada bagian berlawanan dari berkas cahaya, maka pembacaan langsung berapa banyak cahaya yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap bergantung kepada jumlah senyawa tertentu yang melewati sinar pada saat itu. Pelarut yang digunakan juga menyerap sinar UV, tetapi senyawa yang berbeda akan menyerap sinar terkuat dalam bagian berbeda pada spektrum UV. 

Metanol menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air dibawah 190 nm. Sehingga jika digunakan campuran metanol-air sebagai pelarut harus digunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nmuntuk mencegah pembacaan pelarut dalam analit. Output  akan direkam sebagairangkaian puncak, masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melewati detektor dan menyerap sinar UV. Tinggi dan luas puncak dapat digunakan untuk mengukur jumlah dari senyawa ini. Konsentrasi kafein dalam percobaan ini ditentukan dengan cara metoda kurva kalibrasi (penggunaan serangkaian larutan standar sebagai pembanding). Perbedaan nilai konsentrasi dari kafein yang diperoleh berdasarkan perhitungan dengan menggunakan luas kromatogram maupun tinggi kromatogram dapat disebabkan oleh adanya udara yang masuk ke dalam kolom sehingga mempengaruhi tekanan dalam kolom. Faktor-faktor yang dapat menjadi penyebab kesalahan antara lain : sampel masih terdapat pengotor sehingga pemisahan tidak baik, pada sampel terdapat juga zat-zat lain yang mempunyai waktu tambat yang berdekatan, dan sampel yang diinjeksikan tidak boleh ada gelembung karena gelembung dapat menganggu proses

pemisahan. Oleh karena itu, perlu dilakukan identifikasi puncak yang dihasilkan oleh sampel untuk memastikan bahwa puncak itu adalah puncak sampel yang dimaksud.

Keselerasan model regresi dapat diterangkan dengan menggunakan nilai R2 semakin

besar nilai tersebut maka model semakin baik. Pada kurva kalibrasi luas area dan tinggi puncak tersebut diperoleh persamaan garisnya melalui regresi, didapat nilai R2 sebesar 0.9472 pada tinggi puncak dan 0.9779 pada luas area. Sehingga nilai R2 mendekati 1 maka model regresi semakin baik. Oleh karena itu, nilai luas area pada kafein lebih baik dari pada nilai tinggi puncak pada kafein. Dari percobaan HPLC ini, diperoleh kandungan kafein, berdasarkan luas area untuk sampel kopi sebesar 1106.875 ppm, dan sampel teh sebesar 85.372 ppm. Berdasarkan tinggi puncak untuk sampel kopi sebesar 944.025 ppm dan sampel teh sebesar 39.436 ppm.

Aplikasi HPLC banyak dimanfaatkan dalam kehidupan pada bidang industri, farmasi, kimia, klinik, forensik, makanan, dan lain-lain. Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus dimurnikan terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, dan vitamin. Dalam bidang klinik, teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Dalam masalah lingkungan, sebagai konsekuensi majunya peradaban manusia, berarti permasalahan pun semakin “maju”. Salah satu permasalahan serius yang dihadapi oleh negara-negara berkembang dan utamanya negara maju adalah persoalan pemanasan global. Seiring dengan hal itu, permasalahan lingkungan pun semakin meningkat. Disinilah, teknik kromatografi mengambil peran paling penting dalam analisis lingkungan ini. Sebagai contoh, kualitas air misalnya pada air ledeng, air sungai, air danau, air permukaan dapat mengetahui jenis anion dan kation yang terkandung dalam sampel tersebut sekaligus jumlahnya. Apakah logam-logam berbahaya atau tidak. Oleh karena itu, aplikasi kromatografi sangat penting dimanfaatkan dalam kehidupan sehingga harus digunakan dengan sebaik-baiknya.

VI. Kesimpulan

Dari percobaan kromatografi cair kinerja tinggi, diperoleh kurva kalibrasi tinggi puncak

persamaan garisnya adalah y = 7.4509x + 13.422 dan R² = 0.9472. Sedangkan untuk kurva

kalibrasi luas area persamaan garisnya adalah y = 39.296x + 31.365 dan R² = 0.9779.

Kandungan kafein, berdasarkan luas area untuk sampel kopi sebesar 1106.875 ppm, dan

sampel teh sebesar 85.372 ppm. Berdasarkan tinggi puncak untuk sampel kopi sebesar

944.025 ppm dan sampel teh sebesar 39.436 ppm.

VII. Daftar Pustaka

Day. R. A., Underwood A. L. 2002. “Analisis Kimia Kuantitatif”. 6th Ed. Jakarta: PT. Penerbit Erlangga.

David Havey. 2000. “Modern Analytical Chemistry”. 1st Ed. Mc Graw-Hill, New York. Halaman 578 – 588.

D. A. Skoog, D. M. West: F. J. Holler “Fundamental of Analytical Chemistry”. 9th Ed. United States: Global. 2014.

Kennedy, J. H. “Analytical Chemistry: Principles”. 2nd Ed. Saunders College Publishing, New York, 1990.

LAMPIRAN