ISOLASI, PURIFIKASI, KINETIKA, DAN KARAKTERISASI ENZIM INVERTASE

Amar Muslim (G84090019)1, Didit Haryadi2, dan Popi Asri Kurniatin3

Mahasiswa Praktikum1, Asisten Praktikum2, Dosen Praktikum3

Pengantar Penelitian BiokimiaDepartemen Biokimia, FMIPA, IPB

2012

AbstrakEnzim invertase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis sukrosa menjadi fruktosa dan glukosa. Enzim ini diketahui dihasilkan oleh Saccharomyces cereviseae sebagai produk intraselulernya. Praktikum ini bertujuan untuk isolasi dan purifikasi enzim invertase. Selain itu, praktikum ini bertujuan juga untuk menentukan karakterisasi enzim invertase. Enzim diisolasi dengan memecah sel menggunakan metode solid shear mechanic dan didapat tiga fraksi,yaitu fraksi I, fraksi II, dan fraksi III. Ketiga fraksi ditentukan kadar protein dan aktivitasnya dengan metode Nelson’s dan Lowry untuk menentukan fraksi terbaik. Unit aktivitas rata-rata tiap fraksi adalah 24.462 Unit untuk fraksi I, 25.76 unit untuk fraksi II, 8.816 unit untuk fraksi III. Aktivitas spesifik fraksi I adalah 82.2575, fraksi 2 adalah 68.4620, dan fraksi III adalah 145.3834 unit/mg. Yield enzim sebesar 300.16 % sedangkan fold purification sebesar 1.7674. Nilai Km dan Vmaks

berturut-turut 0,231 µmol dan -0,146 µmol/menit. Berat molekul enzim yang paling mendekati standar BSA sebesar 56744.0 g/mol.

Kata kunci: enzim invertase, assay Nelson, metode Lowry, kinetika, SDS-PAGE.

Pendahuluan

Invertase atau β-fruktofuranosida fruktohidrolase merupakan enzim yang

mengkatalis ikatan antara molekul α-D-glukosa dan β-D-Fruktosa dari fruktosa

dengan cara menghidrolisisnya menjadi monosakarida-monosakarida glukosa dan

fruktosa (Barlikova et al. 1991). Enzim ini juga menhidrolisis β-fruktan seperti

rafinosa menjaedi gula-gula sederhana (Nakano et al. 2004). Pemanfaatan enzim

invertase banyak dilakukan dalam industri makanan dan minuman khususnya

pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, dan produksi asam laktat dari

fermentasi sirup tebu. Invertase digunakan untuk memproduksi etanol untuk

sumber karbon (Lee Huang 2000). Enzim ini juga digunakan dalam industri

farmasi, seperti pada obat tablet cerna, susu bubuk untuk bayi, dan makanan bayi

lainnya (Sanchez et al. 2001).

Invertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan tingkat tinggi, dan

beberapa sel hewan (Lee Huang 2000). Invertase tumbuhan mengkatalis hidrolisis

pemecahan ikatan pada sukrosa yang merupakan bentuk transport utama dari

karbohidrat pada tumbuhan tingkat tinggi. Sukrosa ditranspor dari jaringan

sumber (daun dewasa) melalui floem ke jaringan sink yang lain (akar, batang,

organ reproduksi, dan organ penyimpanan vegetatif) (Tymowska dan Kries 1998).

Enzim ini verperan dalam metabolisme karbohidrat tumbuhan karena dalam

vakuola sel tumbuhan terjadi reaksi pemecahan sukrosa dalam pembentukan

fruktan (Heldt dan Heldt 2005). Sukrosa merupakan produksi akhir asimilasi

karbon (C) pada proses fotosintesis yang terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan

bentuk karbohidrat yang mudah ditransportasikan ke jaringan simpan atau sink

tissues (Cheng et al. 1996). Organ penting seperti buah atau umbi akan memiliki

aktivitas invertase yang tinggi. Hal ini ditunjukkan pada buah anggur yang akan

meningkat aktivitas invertasenya ketika mendekati maturasi buah (Alam et al.

2007).

Khamir yang kini diketahui menghasilkan dapat memproduksi enzim

invertase adalah Saccharomyces cerevisiae (Bokosa et al. 1992). Khamir ini

memiliki invertase di dinding selnya. Enzim ini akan menghidrolisis sukrosa

untuk memanfaatkan glukosa dan ftuktosa yang dihasilkan dari hidrolisisnya

(Amin et al. 2010). Enzim invertase yang dihasilkan oleh Saccharomyces

cerevisiae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4.5 dan temperature 30 oC

(Bergamasco et al. 2000). Straathof et al. (1986) merupakan orang pertama yang

melaporkan bahwa invertase dari Saccharomyces cerevisiae membentuk 6-kestosa

pada konsentrasi sukrosa tinggi (2.34 M, 800 g/L). Saccharomyces cerevisiae

banyak digunakan sebagai ragi dalam pembuatan roti.

Studi kinetika dan karakterisasi dari invertase ragi ini telah banyak

dilakukan. Pada praktikum ini dilakukan isolasi, purifikasi, studi kinetika, dan

karakterisasi enzim invertase ragi. Isolasi enzim dilakukan dengan menggunakan

metode presipitasi. Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan

metode Lowry sedangkan aktivitasnya diukur dengan menggunakan metode

Nelson’s. Bobot molekul enzim diukur menggunakan metode SDS-PAGE.

Metode Praktikum

Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Departemen Biokimia

FMIPA IPB setiap hari Rabu tanggal 21 Februari-27 Maret 2012 pukul 10.00-

13.00 WIB.

Praktikum dilaksanakan dengan peralatan berupa mortar, sentrifus,

refrigerator Sorvall, rotor S5-34, pipet Pasteur, bulb, tabung sentrifus 50 mL,

inkubator, gelas ukur, gelas piala 100 mL dan 600 mL, magnetic stirer, tabung

reaksi bertutup, waterbath, vortex, spektrofotometer (UV-Vis), stopwatch,

mikropipet, dan seperangkat peralatan SDS-PAGE.

Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu ragi (Saccharomyces

cerevisiae), pasir (glassbead), toluena, akuades, asam asetat 1 N, parafilm, dan

amonium sulfat untuk isolasi invertase ragi. Bahan untuk penentuan aktivitas dan

kadar protein enzim invertase ialah glukosa 4 mM, fruktosa 4 mM, sukrosa 4 mM,

reagen Nelson, reagen arsenomolibdat, bufer asetat 0.2 M pH 4.5, bufer Tris HCl

0.05 M pH 7.3, reagen A (2% Na2CO3 dalam NaOH 0.1 N), reagen B (2.7% Na-

K-tartrat), reagen C (1% CuSO4 dalam H2O), reagen D (Folin Cioucalteu yang

telah diencerkan dengan air sampai 1 N dalam asam), dan fraksi enzim I-III. Studi

kinetika enzim invertase menggunakan bufer asetat 0.2 M pH 4.5, sukrosa 0.5 M,

akuades, reagen Nelson, glukosa 4 mM, dan fraksi terbaik. Prediksi bobot

molekul enzim invertase dengan SDS-PAGE menggunakan bahan berupa larutan

monomer, 4 x running gel bufer (1.5 M Tris-HCl pH 8.8), 4 x stacking gel bufer

(0.5 M Tris HCl pH 6.8), SDS 10%, amonium persulfat 10%, 2 x treatment bufer

(0.125 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% v/v gliserol, 0.2 M DTT, 0.02% bromphenol

blue pH 6.8), tank bufer (0.025 M Tris, 0.192 M glisin, 0.1% SDS pH 8.3), water-

saturated n-butanol, TEMED, standar BM protein campuran (marker), larutan

fiksasi (25% isopropanol, 10% asam asetat), dan larutan pewarna Commasie blue

(0.06 Commasie Blue G-250, 10% asam asetat).

Isolasi invertase ragi

Ekstraksi invertase ragi. Ekstraksi invertase ragi diawali dengan

dicampurkannya 5 g ragi, 2 g glass bead, dan secara perlahan 10 mL toluena

dalam mortar sambil digerus hingga terbentuk pasta. Kemudian ditambah 20 mL

akuades secara bertahap selama 30 menit sambil digerus. Selanjutnya isi mortat

tersebut dipindah dalam tabung sentrifugasi 50 mL dan disentrifus selama 15

menit 12.000 rpm. Lapisan air di tengah hasil sentrifugasi diambil secara hati-hati.

Ekstrak protein dikumpulkan dan diukur volumenya. Sebanyak 3 mL aliquot

diambil sebagai sampel ekstrak kasar (fraksi I). Sisa larutan dipindahkan dalam

tabung sentrifugasi 50 mL dan ditambah 3 tetes asam asetat 1 N.

Pemanasan ekstrak invertase ragi. Ekstrak diinkubasi pada suhu 50 0C

selama 30 menit. Selanjutnya ekstrak didinginkan segera dalam wadah es dan

disentrifugasi 15 menit 15.000 rpm. Volume supernatan diukur volumenya dan

diambil 2 mL aliquot (fraksi II).

Fraksinasi ekstrak invertase ragi. Fraksinasi pengendapan amonium

sulfat dibuat dengan dicampurkannya garam amonium sulfat dengan volume yang

berbeda hingga dicapai konsentrasi 20, 40, 60, dan 80%. Selanjutnya dilakukan

sentrifugasi selama 30 menit 30.000 g. Kemudian supernatan ditambah amonium

sulfat dengan berbagai konsentrasi tersebut dan disimpan pada suhu -20 0C.

sementara itu, endapan dilarutkan dengan bufer 0.05 M Tris-HCl pH 7.3 dan diuji

kadar aktivitasnya.

Uji aktivitas invertase ragi dengan assay Nelson

Pembuatan kurva standar. Sebanyak 8 tabung reaksi diisi masing-

masing dengan glukosa 4 mM sebanyak 0.02 mL, 0.05 mL, 0.1 mL, 0.15 mL, 0.2

mL, 0.25 mL, dan 0.3 mL untuk tabung 2-8. Sementara itu tabung reaksi pertama

digunakan sebagai blanko (1 mL akuades). Selanjutnya ditambahkan masing-

masing untuk tabung reaksi 2-8 akuades sebanyak 0.98 mL, 0.95 mL, 0.9 mL,

0.85 mL, 0.8 mL, 0.75 mL, dan 0.7 mL. Kemudian ditambahkan pada setiap

tabung reaksi 1 mL reagen Nelson dan didihkan dalam waterbath selama 20

menit. Saat dingin dicampurkan 1 mL reagen arsenmolibdat dengan vortex dan

disimpan selama 5 menit. Akhirnya ditambah dengan 1 mL akuades dan divortex

lalu dibaca pada %T pada 510 nm.

Uji aktivitas enzim invertase. Uji ini digunakan 8 tabung reaksi dan

masing-masing diisi dengan bufer asetat 0.2 M pH 4.5 sebanyak 0.2 mL kecuali

tabung 8. Selanjutnya ditambahkan H2O 0.6 mL pada tabung pertama, 0.55 mL

pada tabung 2,4, dan 6, dan 0.1 mL pada tabung 3,5, dan 7. Tabung terakhir berisi

0.8 mL H2O dan 0.2 mL glukosa 4 mM. Untuk tabung 2-7 diisi fraksi secara

berurutan 0.05 mL dan 0.5 mL. Tabung 2 dan 3 merupakan fraksi I, tabung 4 dan

5 diisi dengan fraksi II, dan tabung 6 dan 7 adalah fraksi III. Kemudian mulai

assay dengan penambahan 0.2 mL sukrosa 0.5 M pada setiap tabung dan prosedur

selanjutnya dilakukan seperti pembuatan kurva standar.

Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

Pembuatan kurva standar. Sebanyak 10 tabung reaksi diisi secara

berurutan dengan standar BSA (400 µg/ml) 0.05 mL-0.45 mL (interval 0.05 mL)

kecuali tabung pertama. Kemudian setiap tabung ditambah H2O 0.5 mL-0.05 mL

(interval 0.05 mL). Percobaan dilanjutkan dengan ditambahkannya masing-

masing reagen A 4.9 mL, reagen B 0.05 mL, dan reagen C 0.05 mL lalu divortex

dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah 10 menit, ditambahkan

0.5 mL reagen D pada setiap tabung dengan interval waktu 30 detik untuk

ditambahkannya reagen D pada tabung berikutnya. Semua tabung diinkubasi pada

suhu ruang selama 30 menit dan dibaca pada A700.

Pengukuran kadar protein enzim invertase. Sebanyak 7 tabung reaksi

disiapkan untuk fraksi I dan II yang telah diencerkan dahulu dengan air (1:4).

Tabung 2-4 diisi dengan fraksi I sedangkan tabung 5-7 diisi fraksi II sebanyak

0.05 mL, 0.2 mL, dan 0.5 mL. Selanjutnya ditambahkan H2O hingga volume 0.5

mL. Kemudian prosedur dilanjutkan dengan metode Lowry dalam pembuatan

kurva standar protein. Sementara itu untuk fraksi III disuspensi dalam bufer Tris

dengan pengenceran air (1:1). Tabung reaksi 1-3 diisi dengan bufer Tris 0.5 M

sedangkan tabung 4-6 diisi fraksi tiga dengan volume sama yakni 0.05 mL, 0.2

mL, dan 0.5 mL. Akhirnya setiap tabung diisi dengan H2O hingga volume 0.5 mL

dan prosedur mengikuti metode Lowry dalam pembuatan kurva standar protein.

Studi kinetika enzim invertase

Pengaruh konsentrasi substrat pada aktivitas invertase. Tabung reaksi

1-8 diisi dengan 0.2 ml bufer asetat 0.2 M pH 4.5. Kemudian ditambahkan

sukrosa 0.5 M sebanyak 0.02 mL-0.4 mL (interval 0.02 mL) pada tabung 2-8.

Tabung 2-8 kemudian ditambah dengan H2O hingga volume 0.9 mL sedangkan

tabung 9 dan 10 diisi dengan 1 mL dan 0.8 mL. Semua tabung reaksi diinkubasi

pada suhu ruang selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan ditambahkannya 1

mL reagen Nelson pada semua tabung. Lalu ditambahkan fraksi terbaik pada

tabung 1-8 sebanyak 0.1 mL sedangkan tabung 10 ditambah dengan 0.2 mL

glukosa 4 mM. Selanjutnya tabung ditutup dan diletakkan pada air mendidih

selama 20 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 510 nm.

Prediksi bobot molekul enzim invertase

Pembuatan gel. Semua bahan untuk running gel dicampur dan diaduk

dengan magnetik stirer kecuali amonium persulfat dan TEMED. Bahan tersebut

berupa larutan monomer, 4 x running bufer, 10% SDS, ddH2O dengan berbagai

volume. Amonium persulfat dan TEMED ditambah perlahan agar tidak terbentuk

gelembung udara. Campuran lalu dimasukkan dalam plat kaca hingga diperoleh

ketebalan 4 cm. Selanjutnya ditambah dengan n-butanol pada permukaannya. Saat

gel membeku, n-butanol dibuang dan gel dibilas dengan 1 mL running gel

overlay. Akhirnya dibuat delapan sumur dengan sisir.

Elektroforesis SDS-PAGE. Sampel protein dicampur dengan 2 x

treatmen bufer dalam ependorf dan didihkan selama 90 detik. Sampel disimpan

pada 0 0C hingga siap digunakan. Sampel protein dan standar dimasukkan dalam

sumur gel dengan pipet mikro. Sistem elektroforesis dilakukan pada 50 volt.

Pewarnaan standar. Gel disimpan dalam larutan fiksasi pewarnaan cepat.

Kemudian gel digoyang perlahan selama 15 menit dan larutan pewarna diganti

dengan commasie blue. Lalu gel digoyang perlahan selama 24 jam hingga protein

pita terlihat. Larutan pewarna diganti dengan larutan destaining II hingga latar

belakang jernih. Hasilnya disimpan dalam asam asetat 7% atau ddH2O.

Hasil dan Pembahasan

Isolasi Invertase Ragi. Ragi roti digunakan sebagai sumber enzim

invertase karena ragi banyak mengandung Saccharomyces cereviseae. Tahapan

isolasi yang dilakukan melalui tiga tahap, yaitu isolasi, perlakuan terhadap

pemanasan, dan fraksinasi. Isolasi enzim invertase dilakukan dengan cara

memecah selnya terlebih dahulu menggunakan cara mekanik, yaiut solid shear

mechanic. Metode ini dilakukan dengan cara menggerus sel (tanaman, khamir,

atau bakteri) bersama pasir kuarsa steril. Solid shear tidak digunakan untuk

memecah sel mikroorganisme karena selnya terlalu kecil (Bintang 2010).

Pemecahan sel dilakukan karena enzim invertase merupakan enzim intraseluler.

Enzim ini berada pada lapisan dinding sel khamir (Amin et al. 2010). Ekstrak

toluene digunakan sebagai pelarut untuk mengekstrak enzim invertase. Fraksi I

yang diperoleh dari ekstraksi toluene merupakan ekstrak kasar enzim. Pemisahan

enzim dilakukan dengan cara disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 15

menit. Hal ini berguna untuk memisahkan pecahan dinding dinding sel dari

supernatanya. Prinsipnya yaitu didasarkan pada berat molekul dengan

menggunakan gaya sentrifugal. Berat molekul yang ringan akan berada diatas dan

yang berat berada di bawah (Koolman 2000). Setelah disentrifuse, supernatan

didekantasi dari residu/pecahan dinding-dinding sel, maka hasil yang diperoleh

berupa ekstrak kasar enzim invertase yang berwarna cokelat pada lapisan toluene.

Berdasarkan komposisi tersebut maka jumlah ekstrak kasar enzim invertase yang

diperoleh sebesar 15.74 gram

Penentuan aktivitas dan kadar protein enzim invertase. Penentuan

aktivitas enzim ditentukan dengan menggunakan metode Assay Nelson dengan

prinsipnya yaitu pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas

enzim invertase ditunjukan oleh bertambahnya produk reaksi (glukosa dan

fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan waktu). Kedua

monosakarida yang merupakan gula pereduksi akan bereaksi dengan reagen

Nelson’s dan warna biru yang terbentuk dapat diukur pada panjang gelombang

510 nm (Perumalla 1994).

Penambahan reagen Nelson berguna sebagai pewarna dan selanjutnya

segera dipanaskan untuk memperjelas warna yang dihasilkan (Elok dan Surya

2010). Reagen Nelson berisi ZnSO4, Ba(OH)2, dan pereaksi tembaga alkali

(Bintang 2010). Hasil penambahan kemudian didinginkan sehingga diperoleh

padatan berwarna biru hingga biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula

invert maka warna hijau semakin dominan. Penambahan arsenomolibdat betujuan

untuk melarutkan padatan yang terbentuk sehingga warna biru semakin pekat.

Warna yang terlalu pekat dapat dikurangi dengan penambahan akuades.

Nilai absorbansi yang diperoleh sebanding dengan jumlah gula pereduksi

yang dihasilkan dan dinyatakan sebagai konsentrasi glukosa pada tabel 1. Standar

yang digunakan dalam assay Nelson’s ini adalah glukosa. persamaan garis Y =

0.119x - 0.197 dengan R2 = 0.969 (Gambar 1), melalui persamaan garis ini dapat

ditentukan konsentrasi gula invert yang terbentuk. Nilai R2 = 0.969 setara dengan

96.9% atau mendekati 1, hal ini menunjukkan kelinieran kurva tersebut.

0

0.0800000000000002 0.2 0.4

0.600000000000001 0.8 1 1.20

0.2

0.4

0.6

0.8f(x) = 0.119880952380953 x − 0.197464285714286R² = 0.969567863640752

Gambar 1 Kurva standar pengukuran kadar glukosa

Aktivitas enzim dinyatakan dalam istilah unit (U). Satu unit adalah sejumlah

enzim yang mengkatalisis konversi dari 1 mikromol substrat per unit dalam

kondisi normal. Pada beberapa kasus, ukuran unit terlalu besar, sehingga sesuai

digambarkan dalam ketentuan nmol/menit atau pmol/menit. Unit satuan

internasional (SI) untuk aktivitas enzim adalah katal (kat) yang diwakili oleh

perubahan dari 1 mol substrat per detik. Unit ini besar dan lebih dapat dihitung

sehingga didapatkan gambaran aktivitas enzim yang dinyatakan dalam

mikrokatal, nanokatal, dan pikokatal. Kemurnian suatu enzim didasarkan pada

aktivitas spesifik yaitu sejumlah unit enzim per milligram protein. Aktivitas

spesifik dalam unit SI diperoleh berdasarkan katal molaritasnya, yaitu sejumlah

substrat yang dapat diubah dalam satu menit oleh satu molekul enzim dalam

keadaan optimal. Aktivitas molar dari katalase, misalnya dalam kisaran 5 x 106

(Bintang 2010).

Banyaknya produk yang terbentuk atau berkurangnya suatu substrat

merupakan salah satu pengujian aktifitas enzim invertase. Berdasarkan data tabel

2 dapat terlihat bahwa konsentrasi glukosa rata-rata tertinggi (pada tabel 3)

dihasilkan oleh fraksi I. Konsentrasi glukosa yang paling tinggi juga terdapat pada

fraksi I (0.5 mL ) yakni sebesar 12.2521 µmol. Rendahnya aktivitas enzim

invertase pada fraksi II dan III karena pada fraksi II dilakukan pemisahan fraksi

dengan pemanasan yang kemungkinan merusak enzim sedangkan fraksinasi fraksi

III dilakukan dengan menambahkan garam amonium terlebih dahulu yang dapat

mengganggu aktivitas enzim. Sedangkan fraksi I hanya dimurnikan dengan

sentrifugasi sehingga aktivitas enzim kemungkinan masih lebih tinggi dibanding

dua fraksi lainnya.

Tabel 2 Hasil pengukuran uji aktivitas enzim invertase

Tabung Absorbansi (A) [glukosa] (µmol)Blanko 0,000 0

Fraksi I (0,05 mL) 0,287 4,0672Fraksi I (0,5 mL) 1,261 12,2521

Fraksi II (0,05 mL) 0,015 1,7815Fraksi II (0,5 mL) 0,244 3,7059

Fraksi III (0,05 mL) -0,015 1,5294Fraksi III (0,5 mL) 0,081 2,3361Standar glukosa I -0,100 0,8151Standar glukosa II 0,097 2,4706

Berdasarkan perhitungan unit aktivitas enzim invertase tertinggi yakni

fraksi I (0.05 mL) sebesar 40.672 unit, dan rataan aktivitas tiap fraksi dengan data

tertinggi adalah fraksi I yakni sebesar 26.462 unit, fraksi II sebesar 25.76 unit dan

fraksi III sebesar 8.861 unit (tabel 3). Aktivitas enzim umumya didefinisikan

dalam satuan unit. Untuk enzim invertase, satu unit enzim artinya enzim tersebut

akan menghidrolisis 1.0 μmol sukrosa menjadi gula invert (glukosa dan fruktosa)

dalam waktu satu menit pada pH 4.5 dan suhu 55°C (Watiyasita L. 2011)

Tabel 3 Data uji aktivitas enzim invertase

Sampel[glukosa] (µmol)

Faktor Pengenceran

Unit Enzim(unit/mL)

Unit Aktivitas (unit)

Rataan (unit)

Fraksi I (0,05 mL) 4,0672 5 4.0672 40.67226.462

Fraksi I (0,5 mL) 12,2521 5 1.2252 12.252Fraksi II (0,05 mL) 1,7815 5 1.7815 17.815

25.76Fraksi II (0,5 mL) 3,7059 5 3.3705 33.705

Fraksi III (0,05 mL) 1,5294 5 1.5294 15.2968.816

Fraksi III (0,5 mL) 2,3361 5 0.2336 2.336Standar glukosa I 0,8151 - - - -Standar glukosa II 2,4706 - - - -

Pengukuran kadar protein invertase dilakukan dengan menggunakan

metode Lowry. Kandungan protein yang diukur dalam penelitian ini adalah

protein terlarut dan protein total. Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan

reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan warna biru (Hasanah Putra 2010).

Reduksi cupritartat dan reaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu yang menghasilkan

perubahan warna biru dapat diukur dengan nilai absorbansinya pada panjang

gelombang 750 nm (Harisha 2007). Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur

molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang

(Alexander & Griffiths 1992). Standar yang digunakan adalan BSA. Pembuatan

kurva standar pengukuran konsentrasi protein dilakukan dengan menggunakan

standar Bovine Serum Albumin (BSA), akuades, dan reagen pada berbagai volume

yang berbeda. Doolittle (1995) menyatakan bahwa inkubasi pada suhu ruang

dilakukan sebagai upaya optimalisasi reaksi sehingga warna yang terbentuk

semakin optimal untuk meminimalisasi kesalahan percobaan.

Kurva yang dihasilkan memiliki kelinearan yang cukup baik dengan

persamaan garis y = 0.057x - 0.058 R² = 0.966. Penggunaan BSA sebagai standar

karena sifatnya yang relatif stabil sehingga warna yang ditimbulkannya sebagai

akibat pembentukan kompleks koordinasi antara logam Cu2+ dengan atom

nitrogen pada rantai peptida akan bertahan secara stabil dalam waktu relatifnya

tersebut (Hartree 1972).

Gambar 1 Reaksi Lowry

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.0571575757575758 x − 0.0580666666666666R² = 0.966564288428974

Gambar 2 Kurva standar pengukuran kadar protein

Tabel 5 menunjukkan konsentrasi protein yang diperoleh dari masing-

masing fraksi perlakuan isolasi yang berbeda. Fraksi 1 merupakan ekstrak kasar

dari toluene sehingga seharusnya memiliki konsentrasi protein yang lebih banyak

daripada fraksi lain karena dalam ekstrak kasar dimungkinkan adanya protein lain

sebagai pengotor yang ikut bereaksi dengan reagen Lowry.

Rataan terbanyak ditunjukkan oleh fraksi I (tabel 6). Namun, meski kadar

total protein fraksi I yang paling besar, pada percobaan kami tidak

menggunakannya untuk menentukan kinetika enzim. Hal ini berdasarkan alasan

bahwa kemungkinan besar protein yang terukur pada fraksi I bukan murni berasal

dari enzim invertase melainkan disebabkan adanya komponen sel lain yang masih

bercampur dengan enzim. Karena alasan tersebut, fraksi yang digunakan adalah

fraksi III yang menunjukkan rataan aktivitas spesifik paling tinggi (Tabel 7).

Hasil pengukuran kadar protein tiap fraksi menunjukkan hasil yang

beragam. Nilai absorbansi tertinggi diperoleh pada fraksi I (0.50 mL) yakni 0.371

dengan nilai konsentrasi enzim 7.5263 µg/mL (tabel 5). Hal ini dapat terjadi

karena fraksi I belum mengalami pemanasan dan penambahan ammonium sulfat,

sehingga ikatan peptidanya belum ada yang rusak.

Tabel 5 Hasil pengukuran kadar protein invertase

Tabung Absorbansi [enzim] (µg/mL)Fraksi I 0,05 mL 0,082 2,4561Fraksi I 0,20 mL 0,185 4.2631Fraksi I 0,50 mL 0,371 7.5263Fraksi II 0,05 mL -0,004 0.9474Fraksi II 0,20 mL 0,054 1.9649Fraksi II 0,50 mL 0,168 3.9649Fraksi III 0,05 mL -0,031 0.4737Fraksi III 0,20 mL 0,044 1.7895Fraksi III 0,50 mL 0,044 1.7895

Protein total merupakan pengukuran kandungan nitrogen (N) dalam

sampel. Oleh karena itu, terdapat senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan

terkalkulasi. Namun, interferensi ini relatif kecil dan dapat diabaikan. Berdasarkan

rataan total protein diperoleh fraksi I memiliki nilai tertinggi yakni sebesar 0.321

mg, fraksi II sebesar 0.134 mg dan fraksi III sebesar 0.057 mg (tabel 6).

Tabel 6 Data total protein

Sampel [Enzim] (

µg/mL)

FP [enzim] terkoreksi (mg/mL)

Total protein (mg)

Rataan (mg)

Fraksi 1 0.05 mL 2,4561 5x 0.0491 0.491 0.321Fraksi 1 0.5 mL 7.5263 5x 0.0150 0.150Fraksi 2 0.05 mL 0.9474 5x 0.0189 0.189 0.134Fraksi 2 0.5 mL 3.9649 5x 0.0079 0.079Fraksi 3 0.05 mL 0.4737 5x 0.0095 0.095 0.057Fraksi 3 0.5 mL 1.7895 5x 0.0018 0.018

Aktivitas spesifik enzim tidak menunjukkan kinerja enzim yang spesifik

dalam mengkatalisis reaksi. Aktivitas spesifik enzim merupakan perbandingan

rataan unit enzim dengan konsentrasi protein terkoreksi.Semakin tinggi

konsentrasi protein maka aktivitas spesifik semakin rendah artinya banyak

terdapat kontaminan yang mengganggu perubahan sukrosa menjadi produk.Yield

enzim merupakan perbandingan antara total unit dalam fraksi yang dimurnikan

dengan total unit dalam ekstrak kasar sedangkan fold purifcation merupakan

perbandingan antara aktivitas spesifik dari fraksi yang dimurnikan dengan

aktivitas spesifik ekstrak kasar. Teller (1950) mengemukakan bahwa enzim yang

diinginkan sebagai sumber substrat dalam reaksi adalah yang memiliki aktivitas

tinggi sehingga dapat menyediakan kondisi optimum dalam membuat produk

(lebih cepat). Percobaan ini menghasilkan yield enzim sebesar 300.16 %

sedangkan fold purification sebesar 1.7674 Enzim dalam percobaan diharapkan

memiliki fold purification yang tinggi sehingga juga memiliki aktivitas tinggi

dalam perubahan substrat secara spesifik (Polaina dan McCabe 2007).

Tabel 7 data aktivitas spesifik enzim

Tabung Unit enzim (unit/ml)

[enzim] terkoreksi (mg/mL)

Aktivitas spesifik

(unit/mg)

Rataan (unit/mg)

Fraksi 1 0.05 mL

4.06720.0491 82.8350

82.2575Fraksi 1 0.5 mL 1.2252 0.0150 81.68

Fraksi 2 0.05 mL

1.78150.0189 94.2593

68.4620Fraksi 2 0.5 mL 3.3705 0.0079 42.6646

Fraksi 3 0.05 mL

1.52940.0095 160.989

145.3834Fraksi 3 0.5 mL 0.2336 0.0018 129.7778

Studi Kinetika Eznim Invertase (Penentuan Kinetika Enzim) Variabel

kinetika enzim merupakan salah satu tahapan penentuan dan identifikasi enzim

yang penting. Variabel kinetika enzim terdiri atas nilai Km dan Vmaks. Nilai Km

menunjukkan derajat afinitas suatu enzim terhadap substrat. Nilai Km merupakan

konsentrasi substrat saat kecepatan maksimum enzim dicapai. Penentuan kinetika

enzim dilakukan pada fraksi terbaik enzim, yaitu fraksi I. Sejumlah sampel

percobaan disiapkan sebagai blanko, sampel yang diukur dan standar sukrosa.

Blanko terdiri atas bufer asetat 0.2 M (pH 4.5), sukrosa 0.5 M, air dan fraksi

terbaik enzim (fraksi I), sedangkan sampel yang diukur berisi bufer asetat 0.2 M

(pH 4.5), sukrosa 0.5 M, air dan fraksi enzim terbaik pada interval. Sedangkan

standar sukrosa terdiri atas air dan sukrosa. Semua tabung dicampur dengan

reagen Nelson’s pada saat pengukuran akan dilakukan. Reagen Nelson’s berfungsi

untuk membentuk senyawa kompleks berwarna antara enzim invertase dan reagen

Nelson’s yang membentuk larutan berwarna ungu (Harjadi 1986). Pengukuran

konsentrasi enzim invertase dilakukan pada panjang gelombang 510 nm karena

larutan yang diukur berwarna ungu dengan kuning hijau sebagai warna

komplementer yang menyerap warna radiasi sinar yang dipancarkan saat

pengukuran berlangsung (Bintang 2010). Pengukuran konsentrasi substrat

dilakukan secara stoikiometri menggunakan konsentrasi sukrosa (500 mM),

volume sukrosa (pada berbagai tingkat konsentrasi) dan volume total (1 mL).

Sedangkan pengukuran nilai Vo dilakukan dengan pembagian konsentrasi glukosa

tiap sampel percobaan terhadap waktu inkubasi (10 menit). Hasil perhitungan

tersebut digunakan untuk menentukan nilai Vmaks dan Km.

Menurut Whitaker (1996), nilai Vmaks dan Km dalam studi kinteika

umumnya ditentukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver Burk.

Persamaannya yaitu 1/Vo = 1/Vmaks + (Km/ Vmaks). 1/[S] dengan y = 1/V dan x

= 1/[S]. Kemiringan garis pada persamaan ini banyak dipengaruhi oleh aktivitas

pengukuran substrat pada konsentrasi rendah dan kenyataannya ketepatan yang

didapat ternyata sangat rendah. Alternatif plot lainnya adalah [S]/ Vo terhadap [S]

dan plot ini lebih disukai karena ketelitianya lebih tinggi dari persamaan

Lineweaver Burk (Bintang 2010).

Km (tetapan Michaelis-Menten), yaitu suatu konsentrasi substrat bila

kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah deari kecepatan maksimum.

Nilai Km digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubunga dengan

tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjadi E. Menurut Fayyaz (1995),

bila nilai Km kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap

substrat tinggi, sednagkan bila nilai km besar afinitasnya menjadi rendah. Harga

Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan lingkungan

dan kekuatan ion.

Berdasarkan hasil perhitungan, persamaan Lineweave-Burk yaitu y = -

0.006x + 0.057 Nilai Vmaks dan Km dapat diperoleh dari persamaan tersebut

berturut-turut 17.5438 µmol/menit dan 0.1053 µmol. Nilai Vmaks sebesar 17.5438

µmol/menit menunjukkan bahwa enzim invertase dapat menghidrolisis sukrosa

menjadi glukosa dan fruktosa sebanyak 17.5438 µmol setiap menit. Nilai Km

sebesar 0.1053 µmol menunjukkan bahwa enzim invertase akan aktif setelah

substrat berupa sukrosa sudah mencapai konsentrasi sebesar 0.1053.

Percobaan kali ini menggunakan persamaan Michaelis Menten dan

Lineweaver-Burk (Gambar 3). Kurva Michaelis Menten yaitu y = 0.231x - 0.146

R² = 0.916, sedangkan kurva Lineweaver Burk y = -0.006x + 0.057, R² = 0.212.

Hasil pengukuran berdasarkan dua metode tersebut memberikan nilai Km dan

Vmaks yang berbeda. Metode Michaelis-Menten memberikan nilai nilai Km =

0,231 µmol dan nilai Vmaks = -0,146 µmol/menit sedangkan metode Lineweaver-

Burk memberikan nilai Vmaks = 17,5438 µmol/menit dan Km = 0,1053 µmol. Nilai

Km yang baik ditunjukkan oleh metode Lineweaver-Burk, yaitu nilai terkecil.

Namun jika dilihat berdasarkan nilai R2, perhitungannya Michaelis-Menten dapat

lebih dipercaya karena kurva Michaelis-Menten menunjukkan nilai terbaik yakni

mendekati 1.

Tabel 8 Hasil analisis kinetika enzim invertase

Tabung Absorbansi V0

(µmol/menit)[substrat]

(mM)1/V0

(menit/µmol)1/[substrat]

(1/mM)1 0,000 0,1655 0 6,0423 ∞2 0,054 0,2109 10 4,7416 0,1003 0,683 0,7395 20 1,3523 0,0504 0,340 0,4513 30 2,2158 0,0335 1,023 1,0252 40 0,9754 0,025

6 1,444 1,3790 50 0,7252 0,0207 1,695 1,5899 100 0,6290 0,0108 1,710 1,6025 200 0,6240 0,005

0 10 20 30 40 50 100 2000

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

f(x) = 0.231504761905 x − 0.146296428571R² = 0.916569238751952

[substrat] (mM)

V0(µmol/menit)

6.0423

4.7416

1.3523

2.2158

0.9754

0.7252

0.6290

0.6240

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

f(x) = − 0.006107142857143 x + 0.057857142857143R² = 0.212898716389874

1/[substrat]

1/V0

Gambar 3 Kurva Michaelis-Menten dan Lineweaver-Burk

Prediksi Bobot Molekul Enzim Invertase. Penentuan bobot molekul

enzim invertase menggunakan metode SDS-PAGE. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl

Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis) merupakan salah satu metode PAGE

yang umum digunakan untuk analisis campuran protein secara kualitatif. Prinsip

penggunakan metode ini adalah migrasi komponen akrilamida dengan N,N-

bisakrilamida. Partikel-Partikelnya tersebut berfungsi sebagai saringan molekul

sehingga konsentrasi atau rasio akrilamida dengan bisakrilamida dapat diatur

dengan mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein elain untuk

memurnikan protein (Wilson 1994). Selain untuk pemisahan protein, metode ini

dapat digunakan untuk pemisahan asam nukleat berdasarkan muatan molekul,

ukuran dan massa molekul, dan kekuatan medan listrik (Wenk dan Fernandes

2007).

SDS-PAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion

rendah dan dapat digunakan untuk menentukan suatu protein termasuk

monomerik atau oligometrik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai

polipeptida sebagai subunit atau monomer. Penggunaan SDS-PAGE bertujuan

untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis. Protein yang

terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan

berat molekul protein tersebut (Dunn 1989). SDS merupakan deterjen anionik

yang mendenaturasi protein dengan berikatan pada tulang punggung

polipeptidanya. Hal ini mengakibatkan molekul protein menjadi bermuatan

negatif (Wenk dan Fernendes 2007).

SDS-Page terdiri dari dua bagian yaitu bagian stacking dan resolving gel.

Bagian stacking gel bergungsi untuk menyamakan start dari protein yang

dirunning pada SDS-PAGE, sedangkan bagian resolving gel berfungsi untuk

pemisahan protein. Bagian resolving gel merupakan bagian yang pertama

disiapkan dalam membuat SDS-PAGE. Komposisinya yaitu akrilamida, tris-HCL

pH 8.8, SDS 10%, APS (Ammonium persulphate) 10% (disiapkan dalam keadaan

segar), TEMED(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine), dan aquades. Semua

bahan tersebut dicampur menjadi satu dengan urutan sebagai berikut : aquades,

akrilamida, tris-HCL, SDS, APS, dan terakhir TEMED. Penambahan APS dan

TEMED berfungsi sebagai penginisiasi polimerasi dari akrilamida menjadi

poliakrilamida. Semua bahan yang telah dicampur tersebut dimasukan ke dalam

cetakan SDS-PAGE. Untuk membuat permukaan resolving gel menjadi rata maka

setelah dimasukkan ke dalam cetakan ditambahkan sejumlah n-butanol pada

bagian permukaannya hingga semua bagian cetakan yang tersisa penuh oleh n-

butanol.

Stacking gel ditambahkan pada resolving gel setelah resolving gel

memadat atau membeku. Komposisi dari stacking gel sama dengan komposisi

resolving gel hanya berbeda pada jumlah tiap komponennya. Semua bahan

dicampur dengan urutan seperti pada bagian resolving. Setelah dicampur, bahan

tersebut dimasukkan ke dalam cetakan dibagian permukaan resolving gel hingga

semua bagian cetakan yang tesisa dipenuhi oleh stacking gel. Lalu dibiarkan

hingga membeku.

Persiapan sampel dilakukan dengancara memanaskan sampel protein

untuk mendenaturasi protein enzim sehingga struktur protein tersier akan rusak

membentuk polipeptida struktur primer. Setelah dipanaskan, sampel tersebut

dipipet dan dimasukan ke dalam sumur pada bagian stacking gel yang sebelumnya

gel SDS-PAGE tersebut direndam dalam buffer. Setelah dirunning, gel direndan

dalam Coomassie Briliiant Blue untuk mewarnai (staining) pita-pita protein yang

terbentuk selama lebih dari 2 jam dengan terus digoncang menggunakan shaker

agar terwarnai dengan baik. Pewarna ini akan berikatan dengan semua jenis

protein. Setelah proses staining, dilanjutkan dengan proses destaining untuk

menghilangkan sisa-sisa Coomassie Brilliant Blue yang tidak berikatan degnan

protein menggunakan larutan campluran methanol dan asam asetat sehingga pita-

pita protein yang terwarnai terlihat jelas. Gel direndam dalam larutan destaining

hingga warna biru gelnya hilang.

Berdasarkan hasil percobaan diperoleh data nilai Rf seperti pada tabel 9.

Hasil tersebut menunjukkan bahwa hasil elektroforesis dengan jarak Rf terjauh

adalah meja 7 fraksi 1 sebesar 0.175. Hal lain yang bisa dibandingkan adalah

hanya meja 7 fraksi 1 saja yang menghasilkan 3 pita sekaligus menunjukkan

bahwa hasil pemurnian belum terlalu baik. Hal ini sesuai dengan tabel 6, yaitu

jumlah protein total terbanyak diperoleh dari fraksi I Perbedaan nilai Rf

disebabkan karena keterbatasan pengamatan yang disebabkan kecilnya ukuran

pita yang terbentuk. Hasil elektroforesis SDS-PAGE dapat diamati dari gambar 4.

Tabel 9 Hasil pengukuran berat molekul (BM) protein sampel

Sampel Jarak pita (cm) Jarak gel (cm) RfFraksi 5 pita 1 0.6 5.7 0.105Fraksi 6.1 pita 1 0.5 5.7 0.087Fraksi 6.2 pita 1 0.7 5.7 0.122Fraksi 6.3 pita 1 0 5.7 0.000Fraksi 7.1 pita 1 0.4 5.7 0.070Fraksi 7.1 pita 2 0.7 5.7 0.122Fraksi 7.1 pita 3 1.0 5.7 0.175Fraksi 7.2 pita 1 0.7 5.7 0.122Fraksi 7.3 pita 1 0 5.7 0.000

Gambar 4 Hasil elektroforesis SDS PAGE.Sampel 7.3, 5, 6.1, 6.2, marker, 6.3, 7.1, 7.2 (dari kiri ke kanan)

Simpulan

Isolasi, purifikasi, kinetika, dan karakterisasi enzim invertase dapat

dilakukan dengan melakukan tahapan awal terlebih dahulu dengan mengisolasi

dan purifikasi ragi (mikroorganisme penghasil enzim invertase). Pengukuran

aktivitas enzim invertase dan kadar protein menentukan tingkat kemurnian dari

suatu protein yang merupakan fraksi terbaik dari pengukuran tersebut. Fraksi

terbaik dapat digunakan untuk uji kinetika enzim dan karakterisasi dengan

menggunakan metode elektroforesis SDS PAGE untuk melihat hasil yang terbaik

dan optimal sehingga data yang diperoleh akurat. Berdasarkan percobaan yang

telah dilakukan enzim dengan total protein terbesar dihasilkan oleh fraksi I yakni

0.321 mg. Sedangkan aktivitas spesifik terbesar dihasilkan oleh fraksi III sebesar

145.3834 unit/mg. Yield enzim sebesar 300.16 %, sedangkan fold purification

sebesar 1.7674. Nilai Km dan Vmaks berturut-turut 0,231 µmol dan -0,146

µmol/menit. Hal ini terlihat dari persamaan garis Kurva Michaelis Menten yaitu y

= 0.231x - 0.146, R² = 0.916, sedangkan kurva Lineweaver Burk y = -0.006x +

0.057, R² = 0.212. Bobot molekul yang paling mendekati standar BSA sebesar

56744.0 g/mol.

Daftar PustakaAcosta N, Beldarrain A, Alonso Y. 2000. Characterization of recombinant

invertase expressed in methylotropic yeasts Biotechnology and Applied Biochemistry 32: 179-187.

Alexander RR dan Griffiths JM. 1992. Basic Biochemical Methods. New York: Wiley-Liss.

Amin F, Bhatti HN, dan Asgher M. 2010. Partial purification and characterization of an acid invertase from Saccharum offinarium L. Pak. J. Bot., 42(4): 2531-2540.

Barlikova A, Svorc, Miertus. 1991. Invertase for inverted syrup production and

sugar determination. Anal. Chim. Acta., 247 ; 83-87.

Bergamasco R, Bassetti FJ, Moraes FF, Zanin GM. 2000. Characterization of free and immobilized invertase regarding acrivity and energy of activation. Brazilian Journal of Chemical Engineering 17 :873-880.

Berggren K et al. 2000. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21: 2509-2521.

Bokosa I, Krastanov, Roshkova. 1992. Invertase biosynthesis by Saccharomyce cerevisiae. Nauchni. Tr. J., 39: 269-279.

Bintang M. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta: Erlangga.

Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose phosphate synthase expression at the cell and tissue level is coordinated with sucrose sink’tosource transitions in maize leaf. Plant Physiol 111 : 1021-1029.

Doolittle RF. 1995. The multiplicity of domains in protein. Annu Rev Biochem. 64: 287-314.

Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acid and pectins by polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum Biotechnol. 6: 397-402.

Dunn MJ. 1989. Determination of Total Protein Concentration. Diacu dalam : Protein Methods. Harris, ELV dan S Angal. Editor. Oxford: IRL Pr.

Elok NIH dan Surya RP. 2010. Karakterisasi ekstrak kasar enzim invertase yang diamobilisasi dengan Na-alginat. Skripsi. Fakultas Matematika dan IPA, Institut Teknologi Sepuluh November. Surabaya.

Fayyaz A et al. 1995. Kinetics of papaya pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 : 129-135.

Hames BD dan Rickwood. 1990. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert E Krieger Pub.

Hartree EE. 1972. Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. Anal. Biochem. 48:422-427.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: Mc Graw Hill.

Held, Heldt. 2005. Plant Biochemistry. San Diego: Elsvier Academic Pr.s

Heger A dan Holm L. 2000. Rapid automatic detection and alignment in protein sequences. Protein. 41: 224-237.

Lee WC dan Huang CT. 2000. Modelling of ethanol production using Zymomonas mobilis ATTC 10988 grown on the media containing glucose and fructose. Biochemical Engineering Journal. 4: 13-16.

Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid ke-1. Maggy Thenawidjaja; penerjemah. Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry. Erlangga: Jakarta.

Marks DB et al. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: sebuah pendekata klinis. Pendit BU, penerjemah; Suyono J, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Basic medichal biochemistry: a clinical approach.

Olson dan Markwell. 2007. Assay for determination of protein concentration. New York: John Wiley & Sons.

Polaina J dan McCabe AP. 2007. Industrial Enzymes. Netherland: Springer.

Poedjiadi A. 2006. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Pr.

Teller J. 1950. Measurement of amylase activity. J Biol Chem. 15: 153-156.

Weinken CJ et al. 2010. Protein binding assay in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 10: 1038-1042.

LAMPIRAN

Tabel 1 Kurva standar pengukuran kadar glukosaTabung Absorbansi (A) [glukosa] (µmol)

1 0,000 02 0,039 0,083 0,104 0,24 0,270 0,45 0,365 0,66 0,498 0,87 0,616 1,08 0,844 1,2

Contoh perhitungan pengukuran uji aktivitas enzim invertase (Tabel 2)Fraksi I 0,05 mL y = AbsorbansiA = 0,119 [glukosa] – 0,1970,119 [glukosa] = 0,287 + 0,1970,119 [glukosa] = 0,484[glukosa] = 4,0672 µmol

Contoh perhitungan Tabel 3

Unit enzim invertase/mL = µmol /menitvol fraksi X 2

= 4,0672

0.05 X 2 = 4.0672 unit/mL

Unit aktivitas = unit enzim x FP x vol terkoreksi = 4.0672 unit/mL x 200 kali x 2 mL= 40.672 unit

Rataan = total fraksi

2

= 40.672+12.2 .52

2= 26.462 unit

Tabel 4 Kurva standar pengukuran kadar proteinTabung Absorbansi (A) [BSA] (µmol)

1 0,001 02 0,083 203 0,052 404 0,153 605 0,267 806 0,296 1007 0,377 1208 0,370 1409 0,473 16010 0,491 180

Contoh perhitungan Tabel 5

Persamaan garis kurva standar : y = 0.057x - 0.058Contoh perhitungan (Fraksi I 0,05 mL :y = Absorbansix = [protein/enzim]0,057 [protein/enzim] = 0,082 + 0,058[protein/enzim] = 2,4561 µg/mL

Contoh perhitungan Tabel 6

[ enzim ]terkoreksi mg /mL=2.4561 x 10 -3 mg /❑0.05 mL

= 0.0491 mg / mL

Total Protein = 0.0491 mg /mL x 5 x 2 mL = 0.491 mg

Rataan = total protein fraksi

2

= 0.079+0.189

2= 0.134 mg

Contoh perhitungan Tabel 7

Aktivitas spesifik ( unit /mg ) = unit enzim[enzim ] terkoreksi

=unit /mg

Aktivitas spesifik ( unit /mg ) = 1.78150.0189

= 94.2593 unit/ mg

Yield enzim = rataanunit fraksi dimurnikan

rataan unit ekstrak kasarX 100%

=26.4628.816

X 100 %

= 300.16 %

Fold purification = rataanaktivitas spesifik fraksi yangdimurnikan

rataan ekstrak kasar

= 145.383482.2575

= 1.7674 Contoh perhitungan Tabel 8Persamaan garis kurva standar : y = 0,119x – 0,197dengan y = Absorbansi, x = konsentrasi glukosaTabung 2 :A = 0,0540,054 = 0,119x – 0,1970,119x = 0,054 + 0,1970,119x = 0,251 x = 2,1092 µmol

V0 = x

10 menit =

2,1092 µmol10 menit

= 0,2109 µmol/menit

[Substrat] = [ sukrosa ] x volume sukrosa

volumetotal

= 500 mM x0,02 mL

1 mL

= 10 mM

Persamaan Michaelis-Menten :y = 0.231x - 0.146dengan y = V0 , x = [substrat], a = -0,146 , b = 0,231 Sehingga nilai Km = 0,231 µmol dan nilai Vmaks = -0,146 µmol/menit

Persamaan Lineweaver-Burk :Persamaan garis : y = -0.006x + 0.057dengan y = 1/V0 , x = 1/[substrat], a = 1/Vmaks , b = Km/Vmaks

sehingga,nilai Vmaks = 1/0,057 = 17,5438 µmol/menit Km = Vmaks x b

= 17,5438 µmol/menit x (-0,006) = 0,1053 µmol

Hasil pengukuran elektroforesis

Rf = jarak pitajarak gel

=0.65.7

= 0.105