STERILISASI ALAT DAN BAHAN PADA PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

I. TUJUAN Dapat memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk alat dan bahan yang akan digunakan dalam pengujian mikrobiologi.

Mampu menyiapkan dan membuat media steril untuk pengujian. dapat mengamati hasil dari proses sterilisasi alat dan bahan pada pengujian mikrobiologi.II. TEORI DASAR

Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Sebelum melakukan suatu percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri atau virus. Upaya untuk mengeleminasi mikroba patogen dengan memanfaatkan bahan kimia yaitu antiseptik dan disinfektan, serta memanfaatkan metode disinfeksi dengan memanfaatkan energi panas. Semua metode tersebut dapat membunuh mikroba patogen kecuali endospora bakteri. Pemusnahan digunakan dengan cara sterilisasi, agar semua mikroba patogen dan endosporanya dapat hancur. Dalam bakteriologi, sterilisasi dipakai untuk menggambarkan langkah yang diambil agar mencapai tujuan untuk meniadakan atau membunuh semua bentuk kehidupan mikroorganisme.(1)Dekontaminasi adalah proses menghilangkan atau membunuh mikroorganisme sehingga objek aman untuk ditangani yang bertujuan untuk melindungi praktikan yang melakukan percobaan menggunakan bakteri atau semacamnya. Ada beberapa metode dekontaminasi, yaitu:

1. Sterilisasi : proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya.2. Desinfeksi : metode untuk memusnahkan atau menghancurkan mikroorganisme patogen.3. Sanitasi : metode untuk mengurangi tingkat organisme yang hidup.

Beberapa mikroorganisme memiliki resistensi terhadap dekontaminan kimia, seperti : bakteri vegetatif, jamur, dan virus yang mengandung lipida relatif yang mudah didekontaminasi dengan senyawa kimia. Virus yang tidak mengandung lipida dan bakteri berlapis lilin memiliki tingkat resistensi tinggi. Resistensi terhadap dekontaminan kimia dipengaruhi beberapa faktor, seperti : konsentrasi dari zat aktif, lamanya kontak, pH, suhu, kelembapan, dan kehadiran senyawa organik.(1)Inaktivasi mikroorganisme dengan dekontaminan kimia dapat melalui mekanisme sebagai berikut :

Koagulasi dan denaturasi protein

Lisis

Ikatan dengan enzim atau destruksi substrat enzim

OksidasiBerikut adalah beberapa Hal penting yang harus diperhatikan dalam melakukan dekontaminasi :1. Target mikroorganisme.

2. Dekontaminan yang digunakan (bentuk dan target yang diinginkan).

3. Tingkat inaktivasi yang diperlukan.

4. Adanya substrat organik seperti darah, agar, dsb.

5. Tipe permukaan dari target seperti : padat, berpori atau mudah diterbangkan udara.

6. Konsentrasi tertinggi dari sel yang dapat ditanggulangi dengan inaktivasi.

7. Kemampuan dekontaminan kontak dengan mikroorganisme.

8. Prosedur antisipasi yang diperlukan dalam dekontaminasi agar efisien dalam waktu dan konsentrasi yang digunakan.

9. Toksisitas dari dekontaminan yang dapat membahayakan praktikan di area tersebut.Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya(2). Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu :

1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)

2. Sterilisasi Panas Kering

3. Sterilisasi dengan Penyaringan (Filtrasi)

4. Sterilisasi Gas

5. Sterilisasi dengan Radiasi

Metode yang biasa digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembab) dan metode sterilisasi panas kering.1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)

Sterilisasi Uap dilakukan menggunakan autoclave dengan prinsipnya menggunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Adanya kelembapan ( uap air ) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan tidak adanya kelembapan. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas karena terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organisme. Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoclave adalah :

- Suhu 115,5 , waktu 30 menit

- Suhu 121,5 , waktu 20 menit

- Suhu 126,5 , waktu 15 menit

Temperatur sterilisasi yang digunakan adalah 121, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Metode sterilisasi uap umumnya digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan lain yang tahan terhadap temperatur yang dipergunakan dan tahan terhadap penembusan uap air, larutan dengan pembawa air, alat-alat gelas, pembalut untuk bedah, penutup karet dan plastik, dan media untuk pekerjaan mikrobiologi.(2)

Metode ini digunakan untuk :

Larutan dengan pembawa air

Alat-alat gelas

Pembalut untuk bedah

Penutup karet dan plastik

Media untuk pekerjaan mikrobiologi

Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :

1. Penguraian gula.

2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.

3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.

4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar. 2. Sterilisasi Panas Kering

Sterilisasi Panas Kering dilakukan menggunakan oven pensteril, karena metode sterilisasi panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan sterilisasi uap air panas. Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati.(2) Metode ini memerlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang, sterilisasi panas kering ditetapkan pada temperatur 160-170 dengan waktu 1-2 jam. Umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air, seperti minyak lemak, minyak mineral, gliserin (berbagai jenis minyak), petrolatum jelly, lilin, wax, dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah.(2)

Karena tingginya suhu yang diterapkan dalam sterilisasi panas kering, maka metode ini dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan. Contohnya alat ukur dan penutup karet atau plastik. Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi panas kering dengan menggunakan oven steril adalah :

Suhu 170C, waktu 1 jam

Suhu 160C, waktu 2 jam

Suhu 150C, waktu 2,5 jam

Suhu 140C, waktu 3 jam3.Sterilisasi dengan Penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) digunakan untuk sterilisasi larutan yang termolabil, penyaringan ini menggunakan filter bakteri. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba hanya akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Dibutuhkan penguasaan teknik aseptik yang baik dalam melakukan metode ini. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus. Cara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Penghilangan mikroorganisme secara fisik melalui penyaring dengan matriks pori ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme untuk dapat melaluinya. Cara sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang dapat disaring atau bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara sterilisasi lain. Teknologi tinggi membran filtrasi meningkatkan penggunaan sterilisasi filtrasi, khususnya jika digunakan berpasangan dengan sistem proses aseptik. (2)4. Sterilisasi Gas

Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya terhadap bahan yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan protein ketika disterilkan dengan etilen oksida. Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85C dan 50% kelembaban relatif dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi gugus SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba mati.(2)

Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas. (2)5. Sterilisasi dengan Radiasi

Sterilisasi dengan radiasi digunakan untuk bahan/produk dan alat-alat medis yang peka terhadap panas (termolabil) dan jika residu etilen oksida tidak diharapkan. Pengukuran presisi dari dosis radiasi, yang tidak berhubungan dengan suhu, adalah merupakan faktor kontrol dalam sterilisasi radiasi selama dengan waktu radiasi. Monitoring dan kotrol proses sangat sederhana, tetapi kehati-hatian akan keamanan harus dilakukan oleh operator sterilisasi. Prinsip sterilisasi radiasi adalah radiasi menembus dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga mikroba mengalami mutasi. Ada dua macam radiasi yang digunakan yakni gelombang elektromagnetik (sinar x, sinar ) dan arus partikel kecil (sinar dan ).(2)III. ALAT DAN BAHANIV. PROSEDUR Persiapan dan Sterilisasi AlatAlat alat yang akan disterilkan dicuci dan dikeringkan terlebih dahulu. Alat-alat yang mempunyai mulut ditutup dengan kapas berlemak, seperti tabung reaksi, erlenmeyer, botol media, gelas ukur, labu takar, dan pipet dengan cara sepotong kapas di lipat kedua ujungnya membentuk segi empat sebesar mulut alat. Lalu kapas digulung silinder cukup padat. Kemudian dibungkus dengan kain kasa, lalu dimasukkan ke dalam mulut alat sedalam 2/3. Khusus untuk pipet, ditutup dengan kapas yang dimasukkan dengan sebatang kawat dan kapas yang terurai keluar dari bagian mulut pipet dihilangkan dengan melewatkan mulut pada api Bunsen. Setelah itu kapas penutup ditutup dengan alumunium foil, lalu di ikat dengan benang kasur.Alat yang permukaannya harus steril ditutup dengan alumunium foil satu per satu. Untuk cawan petri dibungkus seluruhnya dengan kertas bekas yang masih bersih.Alat-alat gelas ataupun bukan di sterilkan di autoklaf pada suhu 1210C, selama 15-20 menit. Lalu disimpan ditempat terbuka. Sterilisasi media serta larutan pengencerNutrient agar ditimbang sebanyak 8,8 gram untuk pembuatan 440 mL dan nutrient broth ditimbang sebanyak 2,2 untuk pembuatan 275 mL. masing-masing media yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang sudah diberi tanda sesuai nama media. Ditambahkan akuades lalu dipanaskan di atas penangas air dan diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer sampai larutan jernih.

Setelah itu ditutup dengan kapas dan alumunium foil dan diikat dengan benang kasur dan diberi etiket (tanggal pembuatan, nama media, dan nama pembuat). Lalu disterilisasi dengan autoklaf. Setelah steril, didinginkan pada suhu kamar, kemudian dimasukkan ke dalam lemari pendingin untuk disimpan. Diamati kondisi media dalam waktu 24 jam.V. DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN Perhitungan jumlah nutrient Agar20 gram untuk 1000 mL.

Maka, untuk 400 mL = 400/1000 20 gram = 8 gram (belum ditambah 10 %)Nutrient agar: 10 % 8 = 0,8 gram.

Total : 8 + 0,8 = 8,8 gram

Akuades: 10% 400 ml = 40 mL

Total : 400 + 40 = 440 mL

Perhitungan jumlah nutrient Broth

8 gram untuk 1000 mL.

Maka, untuk 250 mL = 200/1000 8 gram = 2 gram (belum ditambah 10 %)

10 % 2 = 0,2 gram.

Total : 2 + 0,2 = 2,2 gram

Akuades: 10% 250 ml = 25 mL

Total : 250 + 25 = 275 mL

Untuk pembuatan media kami tidak melakukan pengamatan dalam waktu 24 jam karena lab tutup saat akan dilakukan pengamatan (Jumat, pukul 13.00)VI. PEMBAHASAN Persiapan dan Sterilisasi AlatPada percobaan dilakukan pensterilan terhadap beberapa alat gelas, seperti erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, labu takar, batang pegaduk, dan cawan petri. Sterilisasi adalah suatu proses untuk membuat benda menjadi steril. Suatu benda dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikroba, baik dalam bentuk vegetatif maupun spora. Metode pensterilan yang digunakan adalah metode panas lembab dengan alat autoklaf. Autoklaf adalah alat yang berfungsi untuk sterilisasi dengan uap panas bertekanan. Pada saat persiapan dan sterilisasi alat, dilakukan pencucian dan pengeringan alat. Hal ini bertujuan agar alat terbebas dari zat zat yang mungkin masih menempel pada alat. Lalu alat-alat yang mempunyai mulut ditutup dengan kapas berlemak. Pemilihan kapas yang berjenis kapas berlemak dikarenakan saat alat-alat disterilkan dengan metode panas lembab, pada kapas biasa akan menjadi basah oleh uap yang menjadi air dan akan memicu pertumbuhan mikroba. Sedangkan pada kapas berlemak, uap yang dihasilkan dari autoklaf tidak membuat kapas berlemak basah sehingga akan terbebas dari timbulnya mikroba di sekitar kapas. Setelah alat-alat tersebut disumbat dengan kapas berlemak, lalu di tutup lagi dengan alumunium foil dan seluruh bagian alat dilapisi dengan kertas bekas yang bersih. Hal ini dilakukan agar proses sterilisasi lebih maksimal.Lalu semua alat yang telah terbungkus dimasukkan kedalam autoklaf pada suhu 121C selama 20 menit. Menurut Wetherell (1976), dalam waktu 10-15 menit hampir semua sel-sel mikroba dapat terbunuh oleh uap air 250F (121C) dalam waktu 15 menit. Untuk menaikkan suhu yang lebih tinggi dari titik didih tersebut yaitu dengan menaikkan tekanan uap air.Setelah disterilisasi, kemudian alat di simpan ditempat terbuka untuk menghilangkan uap air yang masih tersisa. Pembuatan dan sterilisasi mediaMasing-masing nutrient ditimbang sebanyak yang diperlukan. Jumlah nutrient dan akuades masing-masing ditambah 10% karena saat dipanaskan, akan terjadi penguapan. Sehingga apabila larutannya tidak ditambah 10% jumlah larutannya akan berkurang. Larutannya akan kurang dari 400 mL (untuk larutan nutrient agar) dan kurang dari 250 mL (untuk larutan nutrient Broth). Larutan nutrient agar ini akan berfungsi sebagai media padat sedangkan larutan nutrient broth akan berfungsi sebagai media cair. Masing-masing media yang telah ditimbang dimasukan kedalam erlenmeyer yang telah diberi label nama media masing-masing agar tidak tertukar. Saat praktikum, larutan nutrient agar yang kami buat dimasukkan ke dalam dua erlenmeyer yang berbeda masing-masing sebanyak 220 mL karena kami menggunakan Erlenmeyer 500 mL sehingga dikhawatirkan saat diaduk dan dipanaskan Erlenmeyer 500 mL akan sangat penuh dan menjadi over cavacity. Selain itu, dengan dituangkan kedalam dua Erlenmeyer yang berbeda akan mempercepat kerja di laboratorium karena waktu yang diperlukan untuk membuat larutan nutrient agar menjadi panas dan jernih menjadi lebih sedikit. Dalam pengadukkan digunakan magnetic stirrer karena dengan magnetic stirrer akan mempermudah dan mempercepat kerja pengadukkan sehingga tidak merepotkan praktikan untuk mengaduk larutan. Setelah larutan jernih, Erlenmeyer ditutup dengan kapas berlemak dan kasa kemudian dengan alumunium foil. Hal ini dilakukan karena seperti telah dijelaskan sebelumnya bahwa dengan menggunakan kapas berlemak uap yang dihasilkan dari autoklaf tidak membuat kapas berlemak basah sehingga akan terbebas dari timbulnya mikroba di sekitar kapas. Setelah alat-alat tersebut disumbat dengan kapas berlemak, lalu di tutup lagi dengan alumunium foil. Hal ini dilakukan agar proses sterilisasi lebih maksimal. Setelah disterilisasi dibiarkan dingin pada suhu kamar terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam lemari pendingin, hal ini bertujuan agar uap panas nya hilang terlebih dahulu sehingga saat dimasukkan ke dalam lemari pendingin tidak akan merusak komponen lemari pendingin karena suhu nya telah sesuai.Setelah dimasukkan ke dalam lemari pendingin dilakukan pengamatan dalam waktu 24 jam. Dilihat apakah ada petumbuhan bakteri atau kapang. Namun shift kami tidak melakukan pengamatan dalam waktu 24 jam tersebut karena saat kami akan melakukan pengamatan pada hari berikutnya lab mikrobiologi dalam keadaan tutup, sehingga kami tidak dapat melakukan pengecekkan dan mengamati media yang kami buat sehari sebelumnya. Tetapi disini kami tetap akan membahas apabila terjadi pertumbuhan kapang atau bakteri pada media yang telah dibuat, hal itu menunjukkan bahwa proses sterilisasi tidak berlangsung maksimal. Bisa disebabkan oleh beberapa faktor yang mempengaruhi seperti penutup kapas yang tidak pas, kelembaban yang tidak sesuai saat dalam autoklaf, dan lain sebagainya. Tetapi apabila tidak terjadi pertumbuhan bakteri atau kapang berarti hal itu menunjukkan bahwa proses sterilisasi berlangsung maksimal.VII. KESIMPULAN1. Sterilisasi merupakan suatu proses penghancuran mikroba pada benda, baik dalam bentuk vegetatif maupun sporanya.2. Metode sterilisasi ada 5, yaitu sterilisasi uap (panas lembab), sterilisasi panas kering, sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi), sterilisasi gas, dan sterilisasi dengan radiasi.VIII. DAFTAR PUSTAKA

Razuna. 2010. Sterilisasi Alat dan Bahan pada Pengujian Mikrobiologi (1)Sandra, Rantika. 2012. Sterilisasi Alat dan Bahan. Bandung: UNISBA (2)Wetherell, dkk. 1976. Biologi. Jakarta: Erlangga (3)