LAPORAN PRAKTIKUM METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK

PERCOBAAN 5PENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT-PIRUVAT DARI SERUM

Nama: Imana MamizarNIM: 10511066Kelompok: 5Nama Asisten: Ertanti Rizki P Tanggal Percobaan: 27 Februari 2014Tanggal Pengumpulan: 6 Maret 2014

LABORATORIUM BIOKIMIAPROGRAM STUDI KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG2014

PENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT-PIRUVAT DARI SERUM

I. TujuanMenentukan jumlah piruvat piruvat yang dihasilkan dari reaksi transaminasi dengan serum darah

II. Teori DasarReaksi transaminasi merupakan reaksi pemindahan gugus -amino dari suatu asam amino ke karbon pada -ketoglutarat menghasilkan asam keto dari asam amino yang dideaminasi. Reaksi ini berlangsung karena pada saat mencapai hati dan mengalami katabolisme, tahap pertama yang harus dilalui adalah menghilangkan gugus amin.

Gambar 2.1Secara keseluruhan, reaksi yang berlansung seperti gambar di atas. Gugus amin pada L-alanin akan dipindahkan ke -ketoglutarat. Asam amino alanin yang telah mengalami deaminasi akan berubah menjadi piruvat dan -ketoglutarat yang telah dimasuki gugus amin berubah menjadi asam L-glutamat. Enzim transaminase memerlukan koenzim untuk membantunya dalam mengakatalisis reaksi transaminasi. Pyridoxal Phosphate (PLP) bertindak sebagai kofaktor enzim transaminase.

III. Data Pengamatan

TabungPengamatan

Setelah ditambah DNFHSetelah ditambah NaOHAbsorbansi terukur(=510 nm)

Sampel0.106

Kontrol0.075

Blanko0

Standar1.094

IV. Pengolahan Data

V. PembahasanPada percobaan kali ini akan ditentukan aktivitas enzim transaminase dengan melihat jumlah piruvat yang terbentuk dari reaksi transaminasi glutamate-piruvat dalam waktu 60 menit oleh 0.05mL serum. Serum digunakan sebagai sumber enzim transaminase,larutan buffer fosfat digunakan untuk melarutkan campuran reaksi, karena enzim berkerja optimum pada pH di sekitar 7. Kemudian penggunaan Dinitrofenil Hidrazin (DNFH) adalah sebagai indikator berjalannya reaksi. DNFH akan bereaksi dengan senyawa yang memiliki gugus aldehid atau keton membentuk kompleks hidrazon yang menghasilkan warna kuning. Pada percobaan ini, DNFH akan bereaksi dengan piruvat dan -ketoglutarat karena pada kedua molekul tersebut terdapat gugus keton, yang reaksinya adalah sebagai berikut :

Ada beberapa larutan yang digunakan untuk memperoleh aktivitas transaminase dalam bentuk konsentrasi piruvat, yaitu larutan sampel, larutan control, larutan blanko dan larutan standar. Pada larutan sampel, substrat ditambahkan terlebih dahulu kemudian langsung direaksikan dengan serum. Substrat berisi -ketoglutarat dan L-alanin yang akan dipertukarkan gugus aminonya. Kemudian dilakukan inkubasi selama 1 jam secara presisi untuk memberi waktu agar reaksi transaminasi berlangsung optimum. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC karena enzim transaminase terdapat di dalam tubuh manusia sehingga suhu optimum enzim tersebut untuk mengakatalisis reaksi adalah sesuai dengan suhu tubuh manusia. Setelah diinkubasi, penambahan DNFH menghasilkan perubahan warna larutan menjadi kuning, artinya DNFH membentuk kompleks baik dengan -ketoglutarat yang belum bereaksi ataupun dengan piruvat yang sudah dihasilkan. Penambahan NaOH selanjutnya akan menghentikan reaksi transaminasi dengan cara menginaktifkan enzim karena NaOH menyebabkan suasana larutan menjadi basa, sedangkan reaksi transaminasi ini optimum jika pH nya di sekitar 7.4, dan juga untuk menghindari terjadinya reaksi yang bolak-balik, karena yang diinginkan hanya pembentukan piruvat dan asam L-glutamat , bukan sebaliknya. Tabung selanjutnya berisi control yang berfungsi sebagai faktor koreksi dari larutan sampel. Pada larutan kontrol, penambahan DNFH dilakukan setelah substrat dimasukkan ke dalam tabung dan diinkubasi. Penggunaan kontrol ini dimaksudkan untuk mengoreksi reaksi pembentukan kompleks hidrazon dari DNFH.Jika DNFH ditambahkan ke dalam sistem reaksi, akan ada kemungkinan 2 reaksi pembentukan kompleks hidrazon yang terjadi, yaitu reaksi DNFH dengan -ketoglutarat dan DNFH dengan piruvat.DNFH hanya akan bereaksi dengan -ketoglutarat karena belum dilakukan penambahan serum. Serum yang ditambahkan setelahnya tidak bereaksi dengan substrat (L-alanin dan -ketoglutarat) karena seluruh -ketoglutarat telah habis bereaksi dengan DNFH membentuk komplek hidrazon-ketoglutarat yang berwarna kuning. Sehingga pada saat perhitungan, absorbansi sampel harus dikurangi dengan absorbansi kontrol, karena absrobansi sampel dihasilkan dari warna kuning dari kompleks hidrazon total (hidrazon- ketoglutarat dan hidrazon-piruvat),sedangkan absorbansi larutan kontrol hanya berasal dari warna kuning kompleks hidrazon--ketoglutarat.Penentuan konsentrasi sampel dilakukan dengan metode spektrofotometer yang berlandaskan hukum Lambert-Beer, di mana absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi larutan, maka perlu adanya larutan standar yang sudah diketahui dengan pasti konsentrasinya yang digunakan sebagai pembanding. Oleh karena itu, diperlukan 2 parameter lain, yaitu larutan standard dan larutan blanko. Pada tabung larutan standar, substrat direaksikan terlebih dahulu dengan piruvat yang sudah diketahui konsentrasinya, kemudian dilakukan penambahan DNFH agar kompleks hidrazon yang terbentuk adalah kompleks hidrazon dengan -ketoglutarat dari substrat dan hidrazon dengan piruvat standar. Penambahan NaOH selanjutnya memiliki fungsi yang sama dengan larutan-larutan sebelumnya. Larutan blanko berfungsi untuk faktor koreksi terhadap larutan standar, maka tidak ada serum yang ditambahkan ke larutan standar, sehingga nanti warna kuning yang terbentuk adalah warna dari kompleks hidrazon dengan -ketoglutarat. Absorbansi masing-masing larutan diukur setelah penambahan NaOH yang mengakibatkan warna larutan berubah menjadi coklat (campuran antara merah-orens). Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 510 nm karena pada panjang gelombang ini, warna yang diserap adalah biru-hijau yang merupakan komplemen dari warna merah-orens dari larutan. Absorbansi larutan sampel, kontrol, standard dan blanko berturut-turut adalah 0.106, 0.075,1.094 dan 0. Mekanisme reaksi transaminasi yang berlangsung adalah sebagai berikut :

VI. KesimpulanJumlah piruvat yang dihasilkan dari transaminase glutamate-piruvat dalam waktu 60 menit adalah VII. Daftar Pustaka Lehninger, A.L. (1982). Principles of Biochemistry 4th edition. Worth Publisher,Inc.,New York. Page 660 https://www3.nd.edu/~aseriann/transam.html diakses tanggal 3 Maret 2014 http://en.wikipedia.org/wiki/2,4-Dinitrophenylhydrazine diakses tanggal 3 Maret 2014