Laporan PraktikumHari, Tanggal: Selasa, 24 Maret 2015Teknologi BioindustriGolongan: P3Dosen: Dr.Ir.Prayoga Suryadarma M.TAsisten:1. Achmad Mujib (F34110085)2. Ana Makrifatul Zana(F34110127)

PRODUKSI ASAM ORGANIK (ASAM SITRAT) DENGAN KULTIVASI CAIR DAN SUBSTRAT PADAT

Oleh Raras Ariandi R (F34120075) Riyadi Cahyo W (F34120083) Ilham Artian S(F34120094) Melia Inosa (F34120102) Atika Trirahmawati(F34120121)

DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIANINSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR2015LEMBAR PERNYATAAN

Dengan ini, kami menyatakan bahwa laporan praktikum Teknologi Bioindustri ini telah dikerjakan secara berkelompok, dengan pembagian tugas sebagai berikut

NamaTugasTanda Tangan

Raras Ariandi R

Riyadi Cahyo W

Ilham Artian S

Melia Inosa

Atika Trirahmawati Pendahuluan, Metodologi, Konten 1

Konten 4, Konten 5

Konten 6

Konten 2, Konten 3

Penutup, Finishing

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Asam sitrat merupakan asam organik lemah yang ditemukan pada daun dan buah tumbuhan genus Citrus (jeruk-jerukan). Senyawa ini merupakan bahan pengawet yang baik dan alami. Dalam biokimia, asam sitrat dikenal sebagai senyawa antara dalam siklus asam sitrat yang terjadi di dalam mitokondria. Zat ini dapat digunakan sebagai zat pembersih yang ramah lingkungan dan sebagai antioksidan.Asam sitrat terdapat pada berbagai jenis buah dan sayuran, namun ditemukan pada konsentrasi tinggi yaitu mencapai 8% bobot kering. pada jeruk lemon dan limau (misalnya jeruk nipis dan jeruk purut). Rumus kimia asam sitrat adalah C6H8O7(strukturnya ditunjukkan pada tabel informasi di sebelah kanan). Struktur asam ini tercermin pada nama IUPAC-nya, asam 2-hidroksi-1,2,3-propanatrikarboksilat (Rahman 1992).Penggunaan utama asam sitrat saat ini adalah sebagai zat pemberi cita rasa serta pengawet makanan dan minuman (minuman ringan). Asam sitrat digunakan untuk memulihkan bahan penukar ion yang digunakan pada alat penghilang kesadahan dengan menghilangkan ion-ion logam yang terakumulasi pada bahan penukar ion tersebut sebagai kompleks sitrat. Dalam industri bioteknologi dan obat-obatan, asam sitrat digunakan untuk melapisi pipa mesin dalam proses kemurnian tinggi sebagai pengganti asam nitrat yang berbahaya setelah digunakan untuk keperluan tersebut. Asam sitrat biasanya juga ditambahkan pada es krim untuk menjaga terpisahnya gelembung-gelembung lemak. Dalam pengolahan makanan, asam sitrat dapat digunakan sebagai pengganti sari jeruk (Schegel 1986).Asam sitrat dapat diproduksi secara kimiawi atau secara fermentasi dengan mikroorganisme. Pada praktikum kali ini dilakukan proses produksi asam sitrat dengan kulrivasi cair dan substrat padat. Sehingga dapat diketahui proses prosuksi terbaik yang akan menghasilkan asam sitrat dengan jumlah yang banyak.

Tujuan

Praktikum kali ini bertujuan untuk mengetahui cara produksi asam sitrat dengan kultivasi cair dan substrat padat dengan memanfaatkan Aspergillus niger dan melakukan pengamatan terhadap nilai pH, biomassa, gula sisa, serta total asam dari produk asam sitrat yang diperoleh.

METODOLOGI

Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini antara lain inkubator, inkubator goyang, erlenmeyer, tabung reaksi, bunsen, jarum ose, clean batch, pH meter, timbangan, penangas air, spektrofotometer, pipet tetes, otoklaf, corong, dan buret. Sedangkan bahan-bahan yang dibutuhkan antara lain gula pasir, medium propagansi, medium fermentasi, suspensi spora Aspergillus niger, NaOH 0,1 N, indikator PP, onggok, dedak halus, aquades, dan kertas saring.

Metode

1. Produksi asam sitrat dengan kultivasi cair

Disiapkan Aspergillus niger berumur 5 hari dalam agar miringMedium propagasi disiapkan dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121oC, 15 menitSuspensi Aspergillus niger diinokulasi pada medium propagasi (inokulum)Media fermentasi disiapkan yaitu sebanyak 5 erlenmeyer yang berisi 50 ml media dan disterilisasiInokulum diinkubasi dengan inkubator goyang 29oC selama 24 jamInokulum diinkubasi dengan inkubator goyang 29oC selama 24 jam

Inokulum diinokulasikan pada masing-masing erlenmeyer yang telah berisi media

Sampel diambil setiap hari selama 5 hari serta dilakukan pengamatan pH, biomassa, gula sisa, dan total asam

Data nilai pH, biomassa, gula sisa, dan total asam diketahui dan dicatat

2. Produksi asam sitrat dengan kultivasi substrat padatSebanyak 25 gram onggok dan 5 gram dedak halus dimasukkan dalam erlenmeyer 250 mlDitambahkan dengan aquades hingga terendamErlenmeyer ditutup dengan kapas dan alufo lalu disterilkan dengan otoklaf 121oC, 15 menit dan dinginkan Dilakukan indubasi dengan suhu kamar selama 5 hari (setiap kelompok berbeda hari)Setelah dingin, diinokulasikan dengan suspensi Aspergillus niger (5 % v/v)Pengujian total asam dilakukan dengan mengambil 10 gram sampel lalu dimasukkan dalam erlenmeyer dan ditambahkan aquades 200 ml Erlenmeyer dipanaskan hingga mendidih lalu disaring, diambil 10 ml filtrat dan ditambahkan 1 atau 2 tetes indikator PP

Titrasi dilakukan dengan larutan NaOH 0,1 N hingga warna merah muda terbentuk dan dilihat jumlah ml NaOH yang dibutuhkan

Perhitungan tota asam dilakukan dengan memasukkan jumlah ml NaOH yang dibutuhkan sehingga data total asam diperoleh

PEMBAHASAN

Hasil(Terlampir)

Pembahasan

Asam sitrat adalah asam organik yang secara alami terdapat pada buah-buahan seperti jeruk, nenas dan pear. Asam sitrat pertama kali diekstraksi dan dikristalisasi dari buah jeruk, sehingga asam sitrat hasil ektraksi dari buah-buahan ini dikenal sebagai asam sitrat alami. Asam sitrat (C6H8O7) banyak digunakan dalam industri terutama industri makanan, minuman, dan obat-obatan. Kurang lebih 60% dari total produksi asam sitrat digunakan dalam industri makanan, dan 30% digunakan dalam industri farmasi, sedangkan sisanya digunakan dalam industri pemacu rasa, pengawet, pencegah rusaknya rasa dan aroma, sebagai antioksidan, pengatur pH dan sebagai pemberi kesan rasa dingin. Dalam industri makanan dan kembang gula, asam sitrat digunakan sebgai pemacu rasa, penginversi sukrosa, penghasil warna gelap dan penghelat ion logam. Dalam industri farmasi asam sitrat digunakan sebgai pelarut dan pembangkit aroma, sedangkan pada industri kosmetik digunakan sebagai antioksidan (Judoamidjojo 1992).Aspergillus nigermerupakan salah satu jenis jamur yang memiliki kemampuan yang tinggi dalam menghasilkan berbagai enzim yang penting peranannya dalam bidang pangan seperti amilase, pektinase, amiloglukosidase dan sellulase. Aspergillus niger adalah salah satu spesies yang paling umum dan mudah diidentifikasi dari genus Aspergillus, famili Moniliaceae, ordo Monoliales dan kelas Fungi imperfecti. Aspergillus niger dapat tumbuh dengan cepat pada suhu 35- 37oC (optimum), 6- 8oC (minimum), 45 -47oC (maksimum) dan memerlukan oksigen yang cukup (aerobik) (Nurhidayat 2009). Koloni Aspergillus niger terdiri dari suatu lapisan basal yang kompak berwarna putih hingga kuning dan suatu lapisan konidofor yang lebat yang berwarna coklat tua hingga hitam. Konidia berbentuk bulat hingga semi bulat, berwarna coklat, memiliki ornamentasi berupa tonjolan dan duri-duri yang tidak beraturan. Mikroba tersebut memilikimiseliumyangterdiri dari hifa yang bercabang-cabang dan bersekat, berwarna terang atau tidak berwarna, sebagian kedalam dan sebagian keluar(Nurhidayat 2009). Menurut Gandjar (2006), ciri-ciri umum dariAspergillus niger lainnyaantara lain: a) Bersifat termifilik, tidak terganggu pertumbuhannya karena adanya peningkatan suhu. b) Dapat hidup dalam kelembaban nisbi 80. c) Dapat menguraikan benzoat dengan hidroksilasi menggunakan enzim benzoate-4 hidroksilase menjadi 4-hidroksibenzoat. d)Natrium dan formalin dapat menghambat pertumbuhanAspergillus niger. e) Dapat hidup dalam spons. f) Dapat merusak bahan pangan yang dikeringkan atau bahan makanan yang memiliki kadar garam tinggi. Di dalam industriAspergillus nigerbanyak dipakai dalam proses produksi asam sitrat. Dewasa ini telah diketahui banyak jenis kapang yang dapat menghasilkan asam sitrat, seperti A. niger, A. awamori, A. fonsecaeus, A. luchuensis, A. wentii, A. saitoi, A. flavus, A. clavatus, A. fumaricus, A. phoenicus, Mucor viriformis, Ustulina vulgarisdll. Selain kapang, beberapa bakteri dan kamir juga dapat memproduksi asam sitrat, diantaranya :Brevibacterium, Corynebacterium, ArthrobacterdanCandida(Grewal dan Kalra 1995).Pada pembentukan asam sitrat beberapa faktor yang dapat mempengaruhinya antara lain: pemilihan strain, konsentrasi substrat, dan pengaruh kondisi fermentasi yang meliputi temperatur, derajat keasaman, serta luas permukaan (Manfaati 2011). Pemilihan strain dalam industri fermentasi harus memenuhi syarat-syarat tertentu yaitu murni, unggul, stabil dan bukan pathogen (Ali et al 2008). Pengaturan konsentrasi subtract perlu dilakukan dengan tepat, tidak telalu tinggi ataupun rendah. Substrat yang terlalu pekat mengakibatkan naiknya tekanan osmosis (Manfaati 2011). Apabila tekanan osmosis lingkungan lebih tinggi dari sitoplasma, akan mengakibatkan sitoplasma kehilangan air yang selanjutnya isi sel akan mengecil dan struktur sel akan hancur. Sedangkan substrat yang terlalu encer akan mengakibatkan laju pertumbuhan menjadi lambat (Manfaati 2011). Substrat nantinya akan dirombak oleh mikroorganisme dengan bantuan enzim untuk pembentukan asam sitrat.Pada kondisi fermentasi , temperatur sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan dan produksi asam sitrat. Agar dihasilkan konsentrasi asam sitrat yang tinggi maka fermentasi harus berlangsung pada temperatur optimal berkisar 25 30oC (Novitasari 2008) atau disesuaikan dengan kondisi optimum bakteri yang digunakan. Di atas temperatur optimum, kecepatan tumbuh sel akan menurun secara cepat yang berlawanan dengan kenaikan temperatur. Temperatur yang terlalu tinggi akan mempengaruhi membran sel mikroorganisme, di mana membran sel akan menjadi cair sehingga sel kehilangan strukturnya. Sedangkan pada temperatur rendah akan menyebabkan membran sel menjadi padat. Hal ini berkaitan dengan struktur membran yang terdiri dari lapisan lemak dan protein yang akan mengeras pada temperatur rendah sehingga proses pemasukan makanan melalui lapisan membran sel tidak terjadi dan dapat menyebabkan kematian dari sel mikroorganisme tersebut (Novitasari 2008).Pengaturan pH penting bagi keberhasilan proses fermentasi. Untuk fermentasi asam sitrat pH optimum adalah 3, sedangkan pH optimum untuk pertumbuhan Aspergillus niger adalah 2,5 3,5 (Nurhidayat 2009). Penurunan pH menyebabkan produksi asam sitrat berkurang. Hal ini disebabkan pada pH rendah ion ferosinida lebih toksik bagi pertumbuhan miselium. Pada pH yang tinggi terjadi akumulasi asam oksalat (Laboratorium Bioindustri TIP, FTP, Unbraw, 2008).Pada metode fermentasi permukaan, faktor luas permukaan juga harus diperhatikan. Proses fermentasi hanya berlangsung pada permukaan bidang media, maka untuk mendapatkan hasil yang maksimal, luas permukaan diusahakan seluas mungkin dengan memperkecil ketebalan cairan (pada media cair) atau memperkecil ukuran partikel pada media padat (Schlegel 1986). Parameter lain yang menentukan produksi asam sitrat maksimum adalah adanya oksigen. Oleh karena itu proses aerasi saat fermentasi harus dikontrol untuk dapat menghasilkan rendemen asam sitrat yang maksimum. kadar oksigen harus antara 20-25%, dengan laju aerasi 0,2-1 vvm (Manfaati 2011). Sedangkan untuk pengadukan, karena viskositas larutan tidak tinggi dan kultivasi yang dilakukan juga pada skala kecil, maka tidak perlu dilakukan pengadukan yang terus menerus dan hanya dibantu dengan shaker saja agar oksigen yang berada diatas permukaan substrat dapat tercampur merata ke substrat sehingga aliran oksigen merata.Proses fermentasi asam sitrat dapat dilakukan dengan sistem terendam, fermentasi kultur permukaan. Fermentasi kultur terendam dibagi dua yaitu dilakukan pada fermentor berpengaduk dan pada air lift fermentor. Sedangkan pada fermentasi kultur permukaan dapat menggunakan media cair maupun media padat. Fermentasi sistem terendam lebih sulit dilakukan dibandingkan prosedur permukaan, tetapi dapat dilakukan secara curah, proses curah terumpani, atau sinambung. Fermentasi curah digunakan untuk substrat glukosa, dan curah terumpani lebih layak diterapkan untuk untuk tetes tebu. Biakan sinambung mempunyai produktivitas yang lebih tinggi (Mangunwidjaja 1994). Produksi asam sitrat pada proses fermentasi dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah jenis media, pH media, waktu fermentasi, suhu, aerasi, dan mikroorganisme yang digunakan. Faktor yang paling menentukan adalah media tumbuh (substrat) dan mikroorganisme yang digunakan (Friedrich 1994). Pada umumnya hasil samping pertanian dan perkebunan seperti jerami padi, onggok, bagas, dan kulit kakao masih mengandung lignoselulosa. Limbah ini masih mengandung pati, protein, lemak, dan senyawa kimia lainnya. Dengan teknologi fermentasi, hasil samping ini dapat dimanfaatkan lebih lanjut menjadi produk lain yang berguna seperti pangan, pakan ternak, pelarut organik, asam-asam organik seperti asam sitrat dan lain-lain (Judoamidjojo 1989).Onggok merupakan media yang umum digunakan untuk produksi asam sitrat. penambahan dedak dimaksudkan sebagai tambahan sumber protein dari substrat. Akan tetapi kecilnya hasil yang diperoleh dalam pembuatan asam sitrat ini dapat dipengaruhi oleh banyak hal, seperti kondisi dari substrat. Onggok merupakan limbah dalam pembuatan tepung tapioka, oleh karena itu di dalam onggok masih terdapat sedikit kandungan karbohidrat. Oleh kapang hasil isolasi, sisa-sisa amilum yang terdapat pada onggok digunakan untuk memproduksi asam sitrat, akan tetapi perlu diingat bahwa karbohidrat yang diperoleh juga digunakan dalam metabolisme primer dalam pembentukan sel dari kapang tersebut. Oleh sebab itu, asam sitrat yang diperoleh cukup sedikit. Selain itu, ada kemungkinan pH media dan suhu yang tidak sesuai untuk pertumbuhan kapang penghasil asam sitrat berpengaruh sehingga tidak dapat memproduksi asam sitrat dengan maksimal (Mangunwidjaja 1994).Bahan atau media lain yang bisa digunakan sebagai bahan pembuatan asam sitrat adalah molases. Penelitian Ali (2002), membahas tentang : proses fermentasi submerged (terendam) pada molase menggunakan Aspergillus niger secara batch dengan menggunakan parameter proses fermentasi, meliputi : laju oksigen, pH, temperatur inkubasi yang digunakan pada bahan baku molase dengan kadar 15 % dan proses dijalankan dalam 144 jam, dalam penelitian dilakukan pengontrolan trace mineral yang ada, didapatkan asam sitrat maximum mencapai 99,56 3,5 g/l.Pada praktikum ini diperoleh hasil bahwa nilai pH semakin menurun dari pH semula yang mendekati netral menjadi asam. Berdasarkan hasil praktikum diketahui bahwa pada kelompok satu dengan waktu nol hari menunjukan nilai pH 5,5. Pada kelompok dua menunjukan pH 3, kelompok tiga pada hari kedua pH 4, kelompok empat pada hari ketiga dengan pH 5, kelompok lima pada hari ke empat nilai pH 12 dan kelompok enam dengan nilai pH adalah 4. Sementara untuk kelompok dua dihitung pada hari keenam. Secara umum jika dilihat berdasarkan hari,pH mulai dari hari pertama sampai hari terakhir menunjukan penurunan yaitu dari pH 5,5 menjadi pH 3 pada hari keenam. Penurunan pH mengindikasikan pembentukan asam sitrat. pH yang semakin menurun menunjukan bahwa jumlah total produk asam sitrat yang terbentuk semakin meningkat. Seperti pada pH menunujukan peningkatan sesuai dengan lamanya fermentasi. Hal itu sesuai dengan literatur dimana semakin lama waktu fermentasi maka produk yang terbentuk juga akan semakin banyak dan pH akan semakin asam.Nilai total asam yang terbentuk masing-masing kelompok adalah 4.224 mg/ml untuk kelompok satu pada hari ke nol, 6.336 mg/ml untuk kelompok tiga pada hari kedua, 7.526 mg/ml untuk kelompok empat pada hari ketiga, 12 mg/ml untuk kelompok limapada hari keempat dan 4,992 mg/ml untuk hari kelima. Sementara itu untuk hari keenam kelompok dua adalah 9,792. Data tersebut menunjukan hasil yang sangat fluktuatif dimana nilai total asam tertinggi terjadi pada hari keempat untuk kelompok dua yakni hingga 12 mg/ml. Sementara niai total asam terendah terjadi pada hari ke-nol yakni 4,224 mg/ml. Penurunan nilai total asam menunjukan indikasi penurunan aktivitas mikroba dalam memproduksi asam sitrat dikarenakan kemampuan mikroba untuk menghasilkan produk telah terhenti dimana mikroba telah berada pada fase stasioner atau fase kematian dimana hal tersebut juga dikarenakan sumber nutrisi dari media fermentasi telah dikonversi oleh mikroba dalam pembentukan produk maupun penambahan jumlah biomassanya. Sedangkan peningkatan nilai total asam menunjukan adanya indikasi kenaikan aktivitas mikroba dalam memproduksi asam sitrat.Sama seperti pada media kultivasi cair, kultivasi pada substrat padat juga menunjukan bahwa semakin lama waktu fermentasi semakin tinggi juga produk asam sitrat yang terbentuk. Hal tersebut sesuai dengan literatur bahwa produksi asam sitrat akan terus meningkat sampai nutrisi yang terkandung dalam media habis. Jika nutrisi yang terkandung dalam media habis maka mikroba akan menghentikan fase eksponensialnya dan akan menjadi fase stasioner dan kemudian fase kematian. oleh karena itu asam sitrat baik dipanen ketika hasil produksi sedang tinggi.Menurut Kubicek dan Rohr (1989), pertumbuhan sel tercepat yaitu ketika berada pada fase eksponensial, selanjutnya akan menurun pada fase stasioner dan fase kematian. Berdasarkan hasil praktikum pembentukan biomassa terbanyak adalah dengan lama hari yaitu empat hari. Hal tersebut menunjukan bahwa produktifitas sel yang terbanyak pada hari ke empat dengan fase eksponensialnya adalah hari ke dua sampai hari ke empat.Berdasarkan data yang telah diregresikan didapatkan berbagai nilai koefisien yang meliputi koefisien Yx/s, Yp/x dan Yp/s. Koefisien Yp/x menunjukan bahwa dalam 1 gram biomassa akan terbentuk berapa produk asam sitrat. Berdasarkan kurva yang diregresikan didapatkan nilai koefisien Yp/x yaitu 25,5 mg/ml. Berdasarkan data tersebut dapat diketahui bahwa setiap penambahan biomassa yang dihasilkan sebesar 1 gram akan terjadi penurunan jumlah asam sitrat yang dihasilkan sebesar 25,5 gram. Semakin tinggi jumlah biomassa yang dihasilkan maka akan menurunkan jumlah asam sitrat yang dihasilkan. Oleh karena itu produksi biomassa dalam pembuatan asam sitrat harus dibatasi sehingga akan didapatkan nilai rendemen yang tinggi. Selanjutnya yaitu koefisien Yp/s yang menunjukan perbandingan antara produk dengan asam sitrat yang terbentuk. Berdasarkan data hasil praktikum nilai koefisien Yp/s yaitu sebesar 9,50 mg/ppm. Berdasarkan literatur telah dijelaskan bahwa semakin tinggi konsentrasi nutrisi maka jumlah asam sitrat yang didapatkan juga semakin tinggi. Koefisien yx/s yang menunjukan perbandingan antara nilai biomassa dengan konsentrasi media yang digunakan. Data hasil praktikum menunjukan nilai koefisien yx/s yaitu 1,478 gr/ppm . Data ini menunjukan bahwa dalam konsentrasi gula terbesar 1 ppm akan didapatkan jumlah bimassa sebesar 1,478 gram. Berdasarkan data yang diperoleh diketahui bahwa laju pertumbuhan maksimum yaitu sebesar 0,258 gram/jam.

PENUTUP

Kesimpulan

Asam sitrat adalah asam organik yang secara alami terdapat pada buah-buahan. Dalam praktikum ini pembuatan asam sitrat dilakukan dengan metode kultivasi cair dan substrat padat yang memanfaatkan Aspergillus niger. Proses fermentasi dipengaruhi oleh beberapa hal diantaranya suhu, ph, waktu fermentasi, aerasi dan jenis media yang digunakan. Pada kultivasi cair digunakan media gula dan ekstrak tauge dilanjutkan dengan pengamatan ph, biomassa, gula sisa dan total asam. Sedangkan media yang digunakan dalam kultivasi substrat padat yaitu onggok dan dedak dengan pengujian asam sitrat yang dilakukan yaitu titrasi. Penurunan nilai total asam menunjukan indikasi penurunan aktivitas mikroba dalam memproduksi asam sitrat dikarenakan kemampuan mikroba untuk menghasilkan produk telah terhenti dimana mikroba telah berada pada fase stasioner atau fase kematian dimana hal tersebut juga dikarenakan sumber nutrisi dari media fermentasi telah dikonversi oleh mikroba dalam pembentukan produk maupun penambahan jumlah biomassanya. Sedangkan peningkatan nilai total asam menunjukan adanya indikasi kenaikan aktivitas mikroba dalam memproduksi asam sitrat. Semakin tinggi jumlah bimassa yang dihasilkan maka akan menurunkan jumlah asam sitrat yang dihasilkan. Penurunan pH mengindikasikan pembentukan asam sitrat. pH yang semakin menurun menunjukan bahwa jumlah total produk asam sitrat yang terbentuk semakin meningkat. Seperti pada pH menunujukan peningkatan sesuai dengan lamanya fermentasi. Hal itu sesuai dengan literatur dimana semakin lama waktu fermentasi maka produk yang terbentuk juga akan semakin banyak dan pH akan semakin asam.

SaranSebaiknya diperlukan ketelitian yang lebih untuk praktikan dalam melakukan analisa praktikum agar data yang dihasilkan lebih akurat.

DAFTAR PUSTAKA

Ali, Ikram, Qadeer, Iqbal. 2002. Production of Citric Acid by Aspergillus niger Using Cane Molasses in a Strirred Fermentor , Electronic Journal of Biotechnology, Vol 5, No.3.Ali Usama F, Hala S, dan Saad El-Dein. 2008. Production and Partial Purification of Cellulase Complex byAspergillus nigerandA. nidulansGrown on Water Hyacinth Blend. Journal of Applied Sciences Research. 4(7): 875-891.Friedrich J, Cimerman A, dan Steiner W. 1994. Concomitant Biosynthesis of Aspergillus niger Pectolytic Enzymes and Citric Acid on Sucrosa. J. Enzym and Microbial Technology.16 : 703-710.Gandjar Indrawati. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. Jakarta(ID): Yayasan Obor Indonesia.Grewal H S dan Kalra L K.1995. Fungal Production of Citric Acid. Biotechnol. Journal Biotechnology. Adv.13 (2) : 209-234Judoamidjojo M, Sa'id EG, dan Hartoto L. 1989. Biokonversi. Bogor (ID): PAU-BIOTEK. IPB.Judoamidjojo M. 1992. Teknologi Fermentasi. Jakarta (ID): CV.Rajawali PressKubicek C.P dan M. Rohr. 1989. Citrit Acid Fermentation. Crit Rev Biotechnol 4: 331-73Laboratorium Bioindustri TIP ,FTP, Unbraw. 2007. Fermentasi Asam Sitrat [Internet]. [diunduh 2015 April 12]. Tersedia pada : http://www.mediakomunikasipermicabangmalang.comManfaati Rintis. 2011. Pengaruh Komposisi Media Fermentasi Terhadap Produksi Asam Sitrat Oleh Aspergillus niger. Jurnal fluida. Vol.VII(1):23-27.Mangunwidjaja D, Suryani A, 1994. Teknologi Bioproses. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.Novitasari. 2008.Pembuatan Etanol Dari Sari Kulit Nenas, Laboratorium Bioindustri TIP-FTP UNIBRAW [Internet]. [diunduh 2015 April 12] Tersedia pada: http://www.academiaedu.comNurhidayat. 2009. Aspergillus dan Makanannya. [internet]. [diunduh 2015 April 12]. Tersedia pada: http://nurhidayat.lecture.ub.ac.id/2009/02/28/aspergillus-dan-makanan/Rahman. 1992. Produksi Metabolit Primer. Jakarta (ID): Penerbit ARCANSchlegel G H. 1986. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta (ID): UGM Press