LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PANGAN

PRAKTIKUM IV PEWARNAAN ATAU PENGECATAN BAKTERI NAMA NIM KELOMPOK TGL PERCOBAAN ASISTEN : DESY RUCTISAYANA TAMI : K21110261 : II (DUA) : 28 APRIL 2012 : RISKAYATI, S.Si

PROGRAM STUDI ILMU GIZI FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2012

BAB I PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang Semua jenis mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut

disuspensikan1. Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, substrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis

mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, kapang dan lain-lain. Populasi mikroba di lingkungan sangat beranekaragam sehingga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penenaman sehingga berhasil diperoleh koloni tunggal. Koloni tunggal ini kemudian diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk mengisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang resisten terhadap suatu antibiotik2. Ada beberapa macam teknik pewarnaan mikroba, yaitu pengecatan negatif, pengecatan sederhana, pengecatan tahan asam (Ziehl-Neelsen), dan pengecatan differnsial (pengecatan gram)2. Dalam percobaan ini, kami melakukan tiga metode pengecatan, yakni pengecatan negatif, pengecatan sederhan, dan pengecatan gram.

I.2 Tujuan Percobaan Tujuan dilakukannya peercobaan ini adalah: 1. Untuk mengetahui bentuk bakteri dalam pengecatan negatif. 2. Untuk mengetahui bentuk bakteri dalam pengecatan sederhana. 3. Untuk membedakan bakteri gram negatif dan gram positif.

1.3 Waktu dan Tempat Adapun praktikum ini dilaksanakan pada: Hari/tanggal : Sabtu. 28 April 2012 Waktu Tempat : 08.30 sampai selesai : Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Universitas Hassanuddin.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati selsel bakteri. Untuk membedakan berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat digunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktorfaktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies1. Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk3: 1. mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi. 2. memperjelas ukuran dan bentuk jasad 3. melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad. 4. melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO-. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup1. Bakteri memiliki beberapa bentuk tubuh. Bentuk-bentuk tubuh dari bakteri yaitu1: 1. Bentuk bola atau Cocci (tunggal = coccus) 2. Bentuk batang atau bacilli (tunggal = bacillus) 3. Bentuk spiral atau sprilli (tunggal = sprilum) 4. Bentuk koma atau vibrios (tunggal = vibrio) Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu4: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)

Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan

2.

Struktur

tambahan

(dimiliki

oleh

jenis

bakteri

tertentu)

Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora Beberapa macam teknik pewarnaan mikroba, yaitu2: 1. Pengecatan negatif Pengecatan negatif menggunakan cat asam seperti eosin atau nigrosin. Pewarnaan negatif dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna. 2. Pengecatan sederhana Pewarnaan sederhanan dilakukan dengan hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai mikroba tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik. Zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkali (komponen kromatofornya bermuatan positif). Contohnya metilen biru, karbol fuksin, dll. 3. Pengecatan tahan asam (Ziehl-Neelsen) Termasuk pengecatan differensial karena dapat membedakan bakteri acid fash (tahan terhadap pencucian asam) dan yang non acid fast (tidak tahan terhadap pencucian asam). Cat bahan asam menggunakan 3 reagen: cat utama, kobal fuchsin, dan fenol. 4. Pengecatan differensial: gram Pewarnaan gram adalah Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi,

karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel5. Perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, yaitu2: 1. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak dapat diwarnai lagi oleh cat lawan. Sel-sel bakteri ini berwarna biru ungu (violet) 2. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang daya mengikat cat utamanya tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan. Sel-sel bakteri ini tampak berwarna merah.

BAB III METODE PERCOBAAN

III.1 Alat III.1.1 Pengecatan Negatif Gelas objek, jarum ose, pipet tetes, pembakar spirtus, dan mikroskop. III.1.2 Pengecatan Sederhana Gelas objek, jarum ose, pipet tetes, pembakar spirtus, mikroskop III.1.3 Pengecatan Gram Gelas objek, jarum ose, pipet tetes, pembakar spirtus, mikroskop dan dan

III.2 Bahan III.2.1 Pengecatan Negatif Bakteri Salmonella Thypi, tinta china, alkohol 70%, air, dan minyak imersi III.2.2 Pengecatan Sederhana Bakteri Staphilococcu aureus, larutan safranin, alkohol 70%, minyak imersi, dan air III.2.3 Pengecatan Gram Bakteri Staphilococcu aureus, larutan Kristal violet (Gram A),

larutan Modan Lugols iodine (Gram B), larutan alkohol aseton (Gram C), larutan safranin (Gram D), alkohol 70%, minyak imersi, dan air.

III.3 Prosedur Percobaan III.3.1 Pengecatan Negatif 1. Dibersihkan gelas objek dengan alkohol 70% agar bebas lemak. 2. Diambil 1 ose biarkan mikroba dan letakkan pada objek gelas lalu difiksasi dengan menggunan spirtus, kemudian campurakan dengan 2 tetes tinta china. 3. Dengan menggunakan objek gelas yang lain, sentuhkan sisi objek gelas tersebut pada sampel sehingga membentuk sudut 300 selanjutnya objek gelas tersebut ditarik ke arah yang berlawanan hingga membentuk film tipis. 4. Dibiarkan mengering, lalu diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran kecil besar. 5. Di gambar dan dicatat apa yang diamati. III.3.2 Pengecatan Sederhana 1. Dibuat preparat olesan bakteri lalu difiksasi dengan pembakar spirtus. 2. Diteteskan larutan safranin di atas preparat olesan tersebut

sebanyak 2 tetes, biarkan 2 menit. 3. Dicuci dengan air mengalir sampai sisa cat tercuci habis

kemudian dikeringkan dengan hati-hati. 4. Diamati di bawah mikroskop dengan menggunakan perbesan 10x100 kali, menggunakan minyak imersi. 5. Digambar dan dicatat yang diamati. III.3.3 Pengecatan Gram 1. Dibersihkan gelas objek dengan alkohol 70% bebas lemak. 2. Dibuat preparat olesan bakteri di atas prepat, lalu difiksasi pada pembakar spirtus. 3. Diteteskan larutan gram A (kristal violet) sebanyak 2-3 tetas pada olesan bakteri. Biarkan selama 3 menit. 4. Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan hati-hati. 5. Diteteskan larutan gram B (mordan lugols iodine) biarkan selama 1 menit. 6. Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengn hati-hati. 7. Ditetesi dengan larutan gram C (aseton), diamkan beberapa detik. 8. Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan hati-hati. 9. Ditetesi dengan larutan gram D (safranin), birkan selama 2 menit, lalu dicuci dengan air dan dikeringkan. 10. Diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10x100 kali menggunakan minyak imersi.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil Percobaan Gambar Keterangan Gambar Pengecatan negatif I. Bakteri Salmonella Thypy, berwarna kuning II. Latar berwarna hitam tinta china III. Berbentuk basil Pengecatan sederhana I. Bakteri Staphylococcis aureus, berwarna merah II. Latar berwarna bening III. Berbentuk bulat-bulat dan bertumpuk Pengecatan gram positif I. Bakteri Staphylococcis aureus, berwarna ungu mudah II. Latar berwarna bening III. Berbentuk bulat-bulat dan berkoloni

IV.2 Pembahasan IV.2.1 Pengecatan Negatif Percobaan pengecatan negatif ini menggunakan tinta china. Pengecatan negatif dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat, agar memudahkan kita untuk melihat bentuk-baktuk dari

bakteri itu sendiri yang tidak berwarna. Bakteri yang digunakan pada percobaan ini adalah Salmonella Thypi. Pada percobaan ini, pertama dilakukan pembersihan kaca preparat dengan menggunakan alkohol 70% agar preparat steril dari berbagai mikroorganisme lainnya. Setelah itu preparat difiksasi, fiksasi disini bertujuan untuk membunuh bakteri dan melekatkan sel bakteri pada preparat tanpa merusak struktur selnya. Setelah itu diteteskan tinta china. Fungsi dari tinta china ini yaitu untuk memberi warna pada preparat (latar belakang) agar memudahkan kita untuk melihat bentuk-bentuk bakteri yang tersebut, karena bakterinya sendiri tidak berwarna. Setelah dibilas pada air mengalir dan dikeringkan, maka dilakukan pengamatan dibawah mikroskop, tetapi sebelum itu ditetesi dahulu dengan minyak imersi yang bertujuan untuk membiaskan

(memudarkan) cahaya agar saat diamati di bawah mikroskop tidak terlalu menyilaukan sehingga memudahkan melihat bakteri tersebut. Hasil akhir dari gambar yang diamati adalah bakteri Salmonella Thypi berbentuk basil dan berwarna bening dengan latar belakang preparat berwarna hitam (warna dari tinta china). IV.2.2 Pengacatan Sederhana Pengecatan sederhana dilakukan dengan hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai bakteri tersebut. Pada pengecatan sederhana ini bakteri yang digunakan adalah

Staphylococcis aureus. Terlebih dahulu dilakukan pembersihan kaca

preparat menggunakan alkohol 70% agar terbebas dari lemak dan kemudian di fiksasi yang bertujuan untuk mensterilkan preparat tersebut. Selanjutnya diletakkan bakteri Staphylococcis aureus pada preparat dan ditetesi dengan safranin yang merupakan cat pewarna untuk mewarnai bakteri tersebut. Setalah itu dibilas dengan air mengalir untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang ada dan melekat pada bakteri dan agar bakteri lebih mudah terlihat saat dilihat pada mikroskop. Setelah kering, maka diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 100 kali, dan ditetesi dengan minyak imersi agar cahaya yang dari mikroskop tidak terlalu silau yang dapat menghalangi pandangan saat mengamati bakteri tersebut. Hasil pengamatan yang dilakukan adalah bakteri tersebut berbentuk bulatan-bulatan kecil dan bertumpuk sehingga tampak seperti buah anggur serta berwarna merah yang berasal dari pewarna safranin, sebab pada pengacatan sederhana ini warna bakteri akan mengikuti warna cat yang digunakan untuk mewarnainya karena sitoplasma bakterinya bersifat basofilik, sedangkan zat warna yang digunkana umumnya bersifat alkalin (komponen kromatofornya bermuatan positif). IV.2.3 Pengecatan Gram Percobaan ini bertujuan untuk membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pada percobaan ini, bakteri yang digunakan adalah Staphylococcis aureus. Percobaan ini dilakukan

dengan membersihkan kaca preparat dengan alkohol 70%, kemudian difiksasi. Fiksasi disini bertujuan untuk mensterilkan preparat. Lalu preparat diolesi dengan bakteri Staphylococcis aureus, setelah itu ditetesi dengan larutan kristal ungu (gram A) untuk memberi warna utama pada bakteri dan didiamkan selama 3 menit agar cat benarbenar meresap. Kemudian dibilas pada air mengalir yang bertujuan untuk melunturkan cat-cat yang terlalu tebal dan menumpuk kemudian dikeringkan, setelah itu ditetesi dengan larutan Mordan Lugols iodine (gram B) untuk menguatkan cat utama tadi. Kemudian dibilas lagi dan dikeringkan, dan ditetesi dengan alkohol aseton (gram C). Pemberian alkohol ini bertujuan sebagai pencuci atau melunturkan kristal violet yang terlalu menumpuk, pada pemberian larutan ini hanya didiamkan beberpa detik saja (tidak terlalu lama) agar bakterinya tidak ikut hilang saat pelunturan. Kemudian dibilas lagi dan dikeringkan dan ditetesi dengan larutan safranin (gram D) sebagai cat penutup. Setelah itu dicuci lagi dan dikeringkan. Kemudian pebesaran 10 x 100 kali. Hasil yang diperoleh adalah bakteri Staphylococcis aureus berbentuk bulatan-bulatan kecil dan berkoloni sepertui buah anggur dengan warna ungu muda. Warna ungu muda ini menadakan bahwa bakteri ini termasuk bakteri gram positif. Sebab ciri dari bakteri gram positif yaitu mengikat kuat cat utama, dan pada percobaan diamati dibawah mikroskop dengan

bakteri tersebut mengikat kuat cat utama yaitu kristal violet meskipun telah dilunturkan dengan peluntur dan diberi cat warna lawan. Hal tersebut dapat terjadi karena dinding sel pada baketri garam positif lebih tebal dari gram negatif. Dan pada bakteri gram negatif lebih banyak kandungan lemaknya dari pada bakteri gram positif

BAB V PENUTUP

V.1 Kesimpulan 1. Secara mikroskopik bentuk bakteri Salmonella thypi pada pengecatan negatif adalah berbentuk basil, tidak berwarna namun memiliki latar belakang preparat hitam. 2. Secara mikroskopik bentuk bakteri Staphilococcus aureus pada pengecatan sederhana adalah bulat berkoloni seperti anggur dengan warna merah yang merupakan warna dari safranin. 3. Secara mikroskopik bentuk bakteri Staphilococcus aureus pada pengecatan gram adalah bulat berkoloni dan seperti buah anggur dengan warna ungu muda dan termasuk dalam bakteri gram positif, dibuktikan dengan warna bakteri tersebut ungu muda yang murupakan warna dasar dari Kristal violet yang tidak luntur saat proses pelunturan.

V.2 Saran Adapun saran untuk laboratorium adalah: 1. Laboratorium mohon dibersihkan debunya, karena terlihat laboratorium tersebut sangat berdebu. 2. Laboratorium hendaknya dibuka lebih awal agar praktikum dapat berjalan dengan tepat waktu.

DAFTAR PUSTAKA 1. Anonim. 2010. Teknik Pengecatan atau Pewarnaan Bakteri. Tersedia: http://www.inforedia.com/2010/04/teknik-pengecatan-atau-pewarnaan.html. Diakses pada tanggal 29 April 2012. 2. Nawir, Nurhaedar, dkk. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Makassar: Universitas Hasanuddin. 3. Hamdiyati, Yanti. 2010. Pertumbuhan dan Pengendalian Mikroorganisme I. Tersedia:http://file.upi.edu/Direktori/FPMIPA/JUR._PEND._BIOLOGI/19661 1031991012YANTI_HAMDIYATI/Pertumbuhan_pada_mikroorganisme_I.pd f. Diakses pada tanggal 29 April 2012. 4. Junidi, Wawan. 2010. Makalah Tentang Pewarnaan Gram atau Pengacatan Bakteri. Tersedia: http://wawan-junaidi.blogspot.com/2010/02/makalahtentang-pewarnaan-gram-atau.html. Diakses pada tanggal 29 April 2012. 5. Tim Penyusun Praktikum Biologi Dasar. 2008. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar. Tersedia: http://www.freewebs.com/. Diakses pada tanggal 29 April 2012.