Kamis, 29 April 2010

“ KROMATOGRAFI KOLOM dan KROMATOGRAFI EKSKLUSI”

MAKALAH KROMATOGRAFI“ KROMATOGRAFI KOLOM dan KROMATOGRAFI EKSKLUSI”

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Kromatografi secara garis besar dibagi menjadi 4 berdasarkan mekanismenya yaitu :• Kromatografi adsorpsio Kromatografi Kolomo Kromatografi Lapis Tipis (TLC)• Kromatografi partisio Kromatografi kertaso Kromatografi gas• Kromatografi Pertukaran ion ( ion-exchange chromatography)• Kromatografi eksklusio Kromatografi gel permeasio Kromatografi gel filtrasi• Kromatografi afinitasKromatografi kolom bertujuan untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Persiapan klasik kromatografi kolom, adalah sebuah tabung kaca dengan diameter dari 50 mm dan tinggi 50 cm sampai 1 m dengan keran di bagian bawah. Kolom• Kolom terbungkus (Packed Column)Baik packed dan open tubular kolom digunakan untuk kromatografi gas-cair. Kolom yang terbungkus (packed column) biasanya terbuat dari gelas atau besi yang berukuran 2-3 m dengan diameter 2-4 mm. Pada bagian dalam kolom terbentuk adanya suatu gulungan kawat dengan diameter 15cm yang memudahkan termostating di dalam oven. Di dalam packed kolom, diletakkan fase diam sedangkan fase gerak diletakkan pada bagian atas. Packed kolom yang ideal adalah kecil, seragam, mengandung partikel-partikel spheris dengan kekuatan mekanis yang baik dan luas permukaan spesifik minimal 1m2/g. Selain itu sampel harus bersifat inert dengan kenaikan temperature dan dapat dengan mudah terbasahi oleh fase gerak. • Kolom tabung terbuka (Open turbular Column)Pada kolom tabung terbuka tau kolom kapiler tersusun dari silica atau gelas yang berdiameter 0.25-0.50 mm dengan panjang 25-50m. Bagian dalam permukaan diselubungi dengan lapisan tipis dari fase diam. Kromatografi kolom terbuka ditandai dengan penambahan fase bergerak di bawah tekanan atmosfer dan fase stasioner dikemas dalam kolom gelas.

Metode pembuatan kolom terbagi menjadi 2 yaitu : metode kering. Untuk metode kering, kolom pertama diisi dengan kering fase diam bubuk, diikuti dengan penambahan fase mobile, yang memerah melalui kolom sampai benar-benar basah, dan dari titik ini tidak pernah diperbolehkan untuk menjalankan kering.

Metode basahUntuk metode basah, sebuah bubur disiapkan dari eluent dengan fase diam bubuk dan kemudian dengan hati-hati dituangkan ke dalam kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru ditambahkan eluent. Eluent perlahan-lahan melewati kolom untuk memajukan bahan organik. Kromatografi kolom terdiri dari 2 fase yaitu :• Fase diam (stationary phase)Fse stationer dalam kromatografi kolom adalah zat padat (adsorben). Yang paling umum digunakan untuk fase diam adalah silica gel yang diikuti alumina. Fungsi dari fase diam adalah untuk menahan sampel bergerak di sepanjang kolom.• Fase gerak (mobile phase)Fase gerak yang digunakan dalam kromatografi kolom berupa campuran pelarut atau pelarut murni (eluent). Fungsi fase gerak adalah mengalirkan analit (sampel) untuk bergerak di sepanjang fase diam sampai akhirnya terelusi.Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didsarkan pada afinitas kepolaran analite dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar kromatografi kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan kompresi (misalnya udara,nitrogen, argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom. Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut. R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

Kromatografi kolom karena memiliki aliran konstan solusi eluted melewati detektor dalam berbagai konsentrasi, detektor harus plot konsentrasi dari sampel eluted selama perjalanan waktu. Plot konsentrasi sampel terhadap waktu disebut kromatogram. Resolusi mengungkapkan tingkat pemisahan antara komponen-komponen dari campuran. Semakin tinggi resolusi kromatogram, semakin baik tingkat pemisahan sampel kolom memberi. Untuk menghitung resolusi, waktu retensi dan lebar kurva diperlukan. Pemisahan campuran dalam kolom, solut-solut dicirikan dengan waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k’) yang berbanding lurus dengan nilai D D => ditentukan oleh afinitas relatif solut pada kedua fase (fase diam & fase gerak)Waktu retensi (tR) merupakan waktu yang diperlukan oleh solute untuk melewati kolom.tR= tM(1+ k’)Tm : waktu mati ( waktu yang diperlukan oleh solute yang tidak tertahan untuk melewati

kolom)Faktor retensi (k’) adalah perbandingan konsentrasi komponen sampel dengan komponen sampel dalam fase stasioner dan mobile masing-masing di dalam kesetimbangan dinamis. K’= jumlah konsentrasi pada fase diam/ jumlah konsentrasi pada fase gerak

Volume RetensiVolume Retensi merupakan volume fasa gerak yang diperlukan untuk mengelusi komponen sample keluar kolom. Jika laju alir fasa gerak adalah F yang harganya konstan, maka volume retensi bisa dituliskan :Volum = waktu x laju alirFaktor-faktor yang digunakan untuk evaluasi kinerja kolom :• Efisiensi Kolom Kromatografi Salah satu karakteristik system kromatografi yang paling penting adalah efisiensi atau jmlah lempeng teoritis (N). Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (plate number,N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi. Jumlah lempeng (N) dihitung dengan :N= (tR/σt)2Nilai N juga dapat dihitung dengan :N= 16 (tR/Wb)2N= 5,54 (tR/Wh/2)2

Keterangan :tR = waktu retensi soluteσt = simpangan baku lebar puncakWh/2 = lebar setengah tinggi puncakWb = lebar dasar puncakTeori LajuPersamaan Van Deemter

H =tinggi lempengA,B,C = tetapan yang mempengaruhi Hμ=laju fase gerak dalam kolomPersamaan berikut digunakan untuk menggambarkan hubungan antara panjang kolom (L) dengan efisien kolom (H) :N= L/HBilangan lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang baik yang nilainya sebanding dengan semakin panjangnya kolom (L) dan semakin kecilnya nilai H. Istilah H merupakan tinggi ekuivalen lempeng teoritis atau HETP (high equivalent theoretical plate) yang mana merupakan panjang kolom yang dibutuhkan untuk menghasilkan satu lempeng teoritis. Kolom yang baik akan mempunyai bilangan kolom yang tinggi dan karenanya kolom yang baik mempunyai nilai H (tinggi kolom) rendah. Ukuran partikel merupakan penyumbang utama pada nilai H. Semakin kecil ukuran partikel, maka semakin tinggi bilangan lempeng teoritis. Kondisi optimum diperoleh dengan melihat hubungan antara tinggi lempeng teoritis dan kecepatan alir (kurva van deemter).Dalam system kromatografi diharapkan untuk mempunyai bilangan lempeng (N) yang tinggi. Bilangan lempeng (N) akan meningkat dengan adanya beberapa factor yaitu : Kolom yang dikemas dengan baik Kolom yang lebih panjang

Partikel fase diam yang lebih kecil Viskositas fase gerak yang lebih rendah dan suhu yang lebih tinggi Molekul-molekul sampel yang lebih kecil Pengaruh di luar kolom yang minimal• Resolusi (daya pisah)Kolom yang lebih efisien akan mempunyai resolusi yang baik. Tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang (overlapping) atau tidak ada tumpang tindih sama sekali. Resolusi komponen-komponen dalam kromatografi tergantung pada waktu retensi relative pada system kromatografi tertentu dan tergantung pada lebar puncak. • Faktor asimetri (factor pengekoran)Suatu situasi yang menunjukkan kinerja kromatografi yang kurang baik adalah ketika ditemukan suatu puncak yang mengalami pengekoran (tailing) sehingga menyebabkan puncak tidak setangkup atau tidak simetri. Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah asimetri (tidak setangkup), maka suatu perhitungan asimetris merupakan cara yang berguna untuk mengontrol atau mengkarakterisasi system kromatografi. Puncak asimetri mucuk karena berbagai factor. Peningkatan puncak yang asimetri akan menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi, dan presisi. Kromatogram yang memberikan harga TF=1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat setangkup atau simetris. Harga TF>1 menunjukkan bahwa kromatogram mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi.Instrumentasi Kromatografi Kolom (untuk kromatografi gas-cair)

Keuntungan kromatografi kolom :• Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative• Digunakan unruk menentukan jumlah komponen campuran • Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi

Kerugian kromatografi kolom :• Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual• Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)

Kromatrografi kolom menunjukkan adanya prinsip yang sama yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapakan pada skala besar untuk pemisahan campuran. Kromatografi kolom seringkali digunakan untuk pemurnian seyawa di laboratorium.

Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampel – sampel tanpa melalui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang – kurangnya 10 kali ukuran diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan diameternya 1 atau 2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan sedikit cairan.

Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan sebaiknya hanya isi kolom yang mempengaruhi gerak relative zat terlarut melalui system. Kolom terbuat dari kaca, kecuali jika dinyatakan lain. Kolom dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara 0,6 m hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair dapat digunakan beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol, ester dan amida berbobot molekul tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan silicon.

Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai keadaan stabil pada suhu yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti yang tertera pada masing – masing monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair dengan polaritas yang rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan menyuntikkan ulang senyawa yang dikromatografi.

MANFAAT KROMATOGRAFI KOLOM DALAM DUNIA KEFARMASIAN

Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya.

Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.

Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.

Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam membantu mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan kehidupan manusia secara umum.