7/16/2019 Kromatografi Afinitas Dan Kromatograji Gel

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografi-afinitas-dan-kromatograji-gel 1/8

kromatografi afinitasTeknik kromatografi yang memanfaatkan kemampuan molekul biologis untuk membungkuk 

dengan ligan tertentu secara khusus dan reversibel; digunakan dalam biokimia protein.

Kromatografi Afinitas

Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat

 populer dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau

 protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor, substrat atau

 produknya, afinitas antibodi terhadap antigennya, atau afinitas hormon terhadap reseptornya

Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam

kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik 2)

.

Tujuan dari afinitas kromatografi adalah untuk memisahkan semua molekul dari kekhususan

tertentu dari keseluruhan seluruh molekul dalam campuran

Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut pemurnian satu tahap (one step purification) Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan

interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan.

Dalam kasus ini. pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.

Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada

kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai

(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang

sangat kompleks'2'.Skema yang paling urnum untuk melakukan krmatografi afinitas adalah dengan melakukan tahapelusi gradien Skema ini melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom afinitas dengan adanya fase

gerak (dengan pH yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan solut-ligan. Pelarut ini, yang

menggambarkan fase geraklemah pada kolom afinitas, disebut dengan bufer aplikasi. Selamafase aplikasi pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan ligan afinitas akan

 berikatan karena sampel dilewatkan kolom dengan bufer aplikasi. Meskipun demikian, karena

selektifitas interaksi solut-Iigan yang tinggi, sampel-sampel lain yang tidak terikat akan melewati

kolom tanpa tertahan. Setelah komponen-komponen yang tidak t'ertahan telah tercuci secara

sempurna dari kolom, solut yang tertahan dapat dielusi dengan menggunakan pelarut yangmampu mengeluarkannya dari kolom atau yang mampu memecah kompleks ligan-solut. Pelarut

ini merupakan fase gerak yang kuat dan seringkali dikenal sebagai bufer elusi. Begitu solut yangdikehendaki keluar dari kolom, maka solut dapat diukur atau dikumpulkan untuk penggunaanlebih lanjut. Kolom selanjutnya diiregenerasi dengan cara mensetimbangkan kembali

menggunakan bufer aplikasi sebelum injeksi lanjut

Komplementer molekul yang mengikat (ligan) pertama kovalen digabungkan ke larut matriks,

seperti kecil agarosa manik-manik, dan matriks dituangkan ke dalam kolom. Suatu campuran

tidak murni mengandung protein untuk diisolasi ini kemudian diterapkan pada kolom dan

7/16/2019 Kromatografi Afinitas Dan Kromatograji Gel

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografi-afinitas-dan-kromatograji-gel 2/8

memungkinkan untuk berinteraksi dengan ligan amobil Pada tahap ini, protein yang akan

diisolasi mengikat secara khusus untuk ligan amobil sementara sisa molekul dalam aliran

campuran melalui kolom. Protein kepentingan kemudian dapat dielusi dari kolom di bawahkondisi yang mengganggu interaksinya dengan ligan

 bufer pengelusi mengandung zat yang berfungsi untuk memutuskan ikatan antara protein yangakan diambil dengan lingannya. Jadi, buffer pengelusi ini dapat berkompetisi tempat dengan

ligan terikat, sehingga protein lepas dan selanjutnya keluar bersama eluen.

Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein hasil pemurnian tergantung pada

 bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan antara ligan dengan

 protein, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang melebar. Selain itu, volume matriks jugamempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang ada semakin banyak. Jadi, semakin besar 

volume matriks semakin lebar puncak serapan, sehingga protein yang dihasilkan lebih banyak 

Bahan terisolasi oleh Kromatografi Affinity dan Ligan komplementer 

Zat Terisolasi oleh Afinitas Ligan 

Chromatography Kromatografi 

Enzim Substrat, kofaktor 

Antibodi Antigen, Virus, Cell

Polisakarida, glikoprotein Lektin

Mengikat protein asam nukleat Asam Nukleat

Hormon reseptor Hormon

Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi

secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi secara

spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap. Namun Keterbatasan ini sekarangdapat diatasi dengan adanya teknologi fusi protein. Idenya adalah membuat suatu protein fusi

yang terdiri dari protein yang akan dimurnikan dengan protein yang diketahui dapat berikatan

spesifik dengan ligan tertentu.

Afinitas Kromatografi Metode

Kromatografi afinitas dirancang untuk memurnikan protein tertentu dari sampel campuran.

7/16/2019 Kromatografi Afinitas Dan Kromatograji Gel

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografi-afinitas-dan-kromatograji-gel 3/8

 

Di siapkan kolom afinitas dengan matriks dan ligan yang sesuai

Sampel Protein dimasukkan k kolom dan protein akan melalui saringan matriks afinitas manik-

manik.

Protein berinteraksi dengan afinitas ligan dengan beberapa protein yang mengikat dengan erat,

longgar dan tak berikatan

Protein yang tidak mengikat akan tercuci oleh buffer aplikasi.

7/16/2019 Kromatografi Afinitas Dan Kromatograji Gel

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografi-afinitas-dan-kromatograji-gel 4/8

 

 protein yang mengikat di cuci dengan buffer elusi.

 protein elusi yang mengikat erat ligan dan mengumpulkan protein murni penting

KROMATOGRAFI PERMEASI GEL  

Kromatografi berasal dari bahasa Yunani ‘Kromatos’ yang berarti warna dan

 ‘Graphos’ yang berart i menulis. Kromatografi mencakup berbagai proses yang

berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa.

Sa tu fasa t i ngga l pada sys t em dan d inamakan fasa d i am. Fasa

l a innya,dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa

menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Ada banyak teknik 

pemi sahan t e t ap i k romatograf i merupakan t ekn i k pa l i ng banyak  

d i gunakan . K romatogra f i merupakan metode pemi sahan yang sederhana .

Prosedur kromatografi masih dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat

7/16/2019 Kromatografi Afinitas Dan Kromatograji Gel

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografi-afinitas-dan-kromatograji-gel 5/8

di lakukan karena jumlah cupl ikan rendah,kompleksitas campuran yang

hendak d i p i sahkan a t au s i f a t be r ke raba t za t yang

dipisah.Kromatograf i ada bermacam-macam diantaranya kromatograf i

kertas, kromatografi lapis tipis, penukar ion, penyaringan gel dan

e l e k t r o f o r e s i s .  

K r o m a t o g r a f i P e r t u k a r a n M o l e k u l a t a u s e r i n g d i s e b u t d e n g a n

K r o m a t o g r a f i P e r m e a s i G e l ( G P C ) m e r u p a k a n m e t o d e k r o m a t o g r a f i

baru, meliputi kromatografi eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan

kromatografi permeasi gel. Kromatografi ini paling mudah dimengerti dan paling

mudah dikerjakan.Selain kesederhanaannya, teknik ini sangat berguna. Me t o d e i n i

d a p a t d i g u n a k a n t e r h a d a p s u a t u c u p l i k a n y a n g l a r u t d a n penggunaan

utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini.Pertama,

kromatografi gel sangat berguna untuk untk pemisahan spesies dengan berat

molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusi dari setiap

makro molekuler seper ti protein dan asam nukleat , kromatografi gel dapat digunakan

untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana

dapat dipisahkan secara mudah dengan kromatografigel, terutama jika penyusun

campuran itu memilik i berat molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan

dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografigel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan

eksplorasi dar i cupl ikan yang tak di ket ahu i. Pem isa han ini mem be rik an

ga mba ran is i cup l ik an, seh ing ga dap atdiketahui dengan cepat apakah cuplikan

itu memi liki berat molekul rendah atau berat molekul tinggi. 

 A.  Kromatografi gel memiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya: 

1 . P i t a - p i t a s e m p i t .  

2 . W a k t u p e m i s a h a n p e n d e k .  

3.Waktu pemisahan mudah d i ramalkan.  

4.Harga Tr sesua i dengan ukuran cup l i kan .  

5.Tidak terjadi kehilangan cuplikan atau reaksi selama pemisahan.  

6.Hanya terjadi sedikit masalah dalam deaktivasi kolom.  

7/16/2019 Kromatografi Afinitas Dan Kromatograji Gel

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografi-afinitas-dan-kromatograji-gel 6/8

 

B.  Kromatografi gel juga memiliki kelemahan: 

1 . K a p a s i t a s t e r b a t a  

2.Tidak dapat d igunakan untuk cuplikan yang mempunyai ukuran hampir sama. 

3.Prinsip pemisahan tidak seperti kromatografi lain.  

Kekurangan yang paling menonjol adalah kapasitas puncak yang terbatas.

Ini berarti hanya ada sedikit pita yang dapat dihubungkan dengan kromatogram

total, karena kromatogram cukup pendek semua senyawa terelusi sebelum total. Pada

kromatografi gel jarang terlihat lebih dari enam pita pada satu kromatogram.

Ini berarti bahwa kromatografi gel biasanya tidak dapat memisahkan secara sempurna suatu

cuplikan kompleks, tanpa pemisahan lebih lanjut dengan metode lain. 

Kekurangan kedua adalah tidak dapat memisahkan senyawa-senyawa yang mempunyai

ukuran hampir sama. Perbedaan pada kromatografi gel adalah prinsip pemisahan yang berbeda

denganyang digunakan metode kromatografi lain. Konsep factor pemisahan α, dan

factor kapasitas k’ tidak bisa digunakan. Susunan fasa gerak juga relativ e tidak 

pent ing pada kromatografi gel. 

Pengelompokkan berbagai penggunaan kromatografi gel biasanya dibagi

dalam dua teknik yaitu teknik filtrasi gel (pelarut air) dan kromatografi permeasi

gel (pelarut oragnik). 

  Teknik kromatografi permeasi gel (GPC) 

Berkembang sebagai cara penentuan bobot molekul polimer yang digunakan sejak 

tahun 1960-an. Kromatografi gel merupakan metode kromatografi baru, meliputi kromatografi

eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan kromatografi permeasi gel. Kromatografi ini paling

mudah dimengerti dan paling mudah dikerjakan dan sederhana. Diantara aplikasinya dapat

digunakan untuk menentukan bobot molekul polimer 

7/16/2019 Kromatografi Afinitas Dan Kromatograji Gel

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografi-afinitas-dan-kromatograji-gel 7/8

Metode ini dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan penggunaan utama

kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini. Pertama, kromatografi gel sangat

berguna untuk untk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM >2000), terutama

yang tak terionkan. Selain dariresolusi dari setiap makromolekuler seperti protein dan asam

nukleat, kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari

polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan

kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat

berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografi gel sangat

cocok untuk kerja awal, pemisahan eksplorasi dari cuplikan yang tak diketahui. Pemisahan ini

memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah cuplikan itu

memiliki berat molekul rendah atau berat molekul tinggi. 

Metode ini didasarkan pada teknik fraksinasi yang tergantung dari ukuran molekul

polimer yang diinjeksikan ke dalam suatu kolom yang terdiri atas gel berpori berjari  – jari

sekitar 50 –1060A.Kolom dapat melewatkan molekul pelarut yang merupakan fasa bergerak,

sedangkan molekul polimer yang lebih kecil dapat memasuki pori – pori gel, karena itu bergerak 

lebih lambat disepanjang kolom dibanding molekul besar. Elemen yang keluar dideteksi dengan

cara spektroskopi atau cara  – cara fisik lainnya dan dikalibrasi dengan larutan polimer standar

untuk menghasilkan kurva distribusi bobot molekul.

  FASA DIAM

Pemisahan dalam kromatografi gel sebagian besar ditentukan oleh jenisfasa

diam yang digunakan. Oleh karena itu, pemilihan gel at au fasa d iam untuk suatu

pemisahan merupakan langkah penting.Fasa diam yang digunakan untuk 

kromatograf i gel merupakan bahandalam ukuran por i berbeda-beda dimana

setiap ukuran cocok untuk pemisahansenyawa yang tertentu berat

mol eku lny a. Keb any aka n d eng an kro mat ogr af i permeasi gel digunakan fasa

diam polistirena berpori yang mempunyai ikatansilang divinil benzena. Poragel dan

Bio-Bead dapat untuk memisahkan senyawayang relative kecil sampai dengan berat

moleku l sekitar 20.000. Sty ragel untuk memisahkan senyawa besar dengan berat

molekul 20 juta. Gel vinil asetat berporiserupa dengan gel polistirena, tetapi untuk senyawa

7/16/2019 Kromatografi Afinitas Dan Kromatograji Gel

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografi-afinitas-dan-kromatograji-gel 8/8

dengan berat molekul rendah.Merkogels pori kecil lebih baik digunakan untuk 

pemisahan senyawa dengan berat molekul kurang dari 2000, dan kurang dari sejuta. 

  FASA GERAK 

Dalam kromatografi gel, tidak seperti pada kromatografi cairan lainnya,fasa gerak 

tidak diubah – ubah untuk mengatur resolusi. Fasa gerak dipilih denganke kenta lan rendah

pada suhu p emisahan ( supaya harga N t i ngg i ) dan untuk melarutkan

cuplikan. Fasa gerak dengan kekentalan rendah itu mempunyai titik didih sekitar

25-50°C diatas suhu kolom. Jika cuplikan sukar larut, fasa gerak dipilih supaya dapat

melarutkan cuplikan.Jika d igunakan detector refraktometer, fasa gerak dipili h dengan

i n d e k s r e f r a k s i o p t i m u m . J i k a d i p e r l u k a n k e p e k a a n d e t e c t o r

m a k s i m u m , i n d e k s refraksifasa gerak harus berbeda besar dengan indeks refraksi

cuplikan.Pengaruh fasa gerak pada fasa diam yang tak kaku untuk kromatografi gelharus

dipertimbangkan. Berbagai gel untk kromatografi permeasi gel dapat tahante rhadap

berbaga i pe laru t o rgan ic , te tap i ada perkecua l i an untuk aseton dana lcoho l

tidak boleh digunakan dengan fasa diam polistirena