KROMATOGRAFI AFINITAS

KROMATOGRAFI AFINITAS

Kromatografi Afinitas merupakan salah satu metode isolasi.Pertama kali digunakan pada proses adsorpsi selektif enzim amilase oleh pati yang tidak larut.

PRINSIP Terjadinya interaksi secara biologis antara molekul target (seperti pasangan enzim-substrat) dengan ligan yang diikatkan secara kovalen kepada suatu matrks. Molkul yang terikat pada padatan ini akan mengadsorpsi secara spesifik analit yang berada dalam campuran, semantara itu molekul- molekul pengotor tidak diadsorpsi

MATRIKS

syarat Matriks:1. inert2. interaksi non-spesifik kecil3. longgar dan berpori4. kaku5. stabil pH6. suhu dan kekuatan ion7. mempunyai gugus yang dapat dimodifikasi untuk memudahkan subsitusi lengan pada

matriks

Contoh Matriks

•Agarosa•Sellulosa•Dextran•Sepharosa 4B•Silika berpori•Poliakrilamida•Kombinasi polimer

AKTIVASI MATRIKS

Matriks perlu diaktivasi karena gugus fungsionalnya tidak cukup aktif

Metoda CNBr untuk aktivasi gugus hidroksil

amida diubah menjadi karboksilat

Sianol diubah menjadi aminopropilsilil

GUGUS FUNGSIONAL PADA MATRIKS

Hidroksil (agarosa, dextran, selulosa) Karboksil( karboksimetilselulosa ) silanol (silika ) Amida ( poliakrilamida )

LENGAN

Agar terjadi interaksi antara ligan yang terikat kepada matriks dengan pusat aktif enzim diperlukan lengan pengatur jarak yang menghubumgkan ligan dengan pusat aktif enzim. Panjang lengan merupakan faktor yang kritis.

LIGAN

Ligan yang digunakan dalam kromatografi afinitas harus memiliki afinitas yang spesifik terhada makromolekul yang akan dipisahkan dan reversibel.

Rintangan ruang dari matriks dikurangi dengan menyisipkan rantai alkil pendek (etilendiamin,pripendiamin)

Ligan spesifik mengikat hanya satu solut Ligan spesifik terhadap gugus: mengikat

gugus-gugus tertentu

PENGARUH KONSENTRASI LIGAN

Interaksi molekul target dengan ligan dipengaruhi oleh konsentrasi ligan.

Konsentrasi ligan yang tinggi melibatkan : Efisiensi pengikatan berkurang, interaksi ligan dan molekul target akan lebih kuat, kemungkinan terjadinya interaksi yang non-spesifik

PROSES ADSORPSI

Suhu efektif untuk kromatografi afinitas umumnya 0-10ºC. Secara umum besarnya adsorpsi menurun dengan naiknya suhu. Pengikatan molekul target kepada permukaan tergantung kepada kemungkinan tumbukan antara biomolekul dengan ligan, terutama pada pusat aktif.

PROSES DESORPSI

Proses desorpsi dapat dilakukan melalui beberapa cara antara lain menggunakan buffer denaturasi, ligan saingan atau senyawa saingan. Bila interaksi antara molekul target (enzim) dengan ligan lemah maka elusi bisa dilakukan dengan menggunakan larutan buffer yang sama dengan yang digunakan untuk proses adsorpsi. Bila interaksi antara ligan dengan molekul target (enzim) kuat untuk dilepaskan, maka elusi harus dilakukan dengan cara mendenaturasikan enzim.