Konstribusi Dari Protein Matricellular Periostin Terhadap Fungsi Kolagen Dan Regulasinya Selama...

7/26/2019 Konstribusi Dari Protein Matricellular Periostin Terhadap Fungsi Kolagen Dan Regulasinya Selama Proses Penuaan

1/16

Konstribusi Dari Protein Matricellular Periostin Terhadap Fungsi Kolagen Dan

Penurunan Regulasi Periostin yang Terjadi Selama Proses Penuaan Kulit

ABSTRAK

Latar Belakang

Periostin disekresikan sebagai 90 kDa protein matricellular yang mendominasi dalam jaringan

yang kaya akan kolagen Kolagen adala! protein yang paling banyak jumla!nya pada mamalia

dan memiliki daya tarik yang besar Penelitian terbaru menunjukkan ba!"a periostin

mempengaru!i #ibrillogenesis kolagen dan si#at biomekanik dari jaringan ikat murine

Tujuan$

Kami menyelidiki #ungsi periostin ter!adap !omeostasis kolagen selama proses intrinsic dan

ekstrinsik dari penuaan kulit %ntuk tujuan ini& sampel kulit manusia dari donor muda dan tua

beserta sampel daera! kulit yang terpapar dan terlindung dari sinar mata!ari akan dianalisisuntuk ekspresi periostin Penelitian ini menggunakan model in 'itro& kami menentukan jenis sel

yang bertanggung ja"ab untuk ekspresi periostin dan dilakukan analisis #ungsional dari

knockdo"n sel periostin

(etode$ Ta)(an Real*Time P+R& radiasi %,& percobaan knockdo"n& immunostaining& elektron

mikroskop& uji degradasi kolagen& analisis crosslink kolagen

-asil$ .kspresi Periostin tertinggi dalam papiler dermis dan terjadi penurunan regulasi selama

proses penuaan kulit Prekusor #ibroblas dan kulit non*#olikular diidenti#ikasi sebagai sumber

utama ekspersi periostin di kulit manusia Periostin knockdo"n pada #ibroblas tidak berpengaru!ter!adap ekspresi kolagen& tetapi meng!asilkan peningkatan diameter #ibril dan penyimpangan

struktur kolagen -al ini menyebabkan peningkatan kerentanan kolagen ter!adap protease&

sedangkan periostin rekombinan melindungi kolagen dari degradasi #ibril

Kesimpulan$ Data kami menunjukkan ba!"a periostin memainkan peran penting untuk

pembentukan dan !omeostasis kolagen yang tepat Selama penuaan kulit ekspresi periostin

berkurang dan berkontribusi ter!adap #enotip usia kulit


2/16

Pengantar

Kulit manusia terus terkena pengaru! lingkungan dan ole! sebab itu manusia mengalami

baik proses penuaan intrinsik maupun proses penuaan ekstrinsik Di antara semua #aktor

eksternal& radiasi %, adala! #aktor utama yang mempercepat penuaan kulit Paparan %, kronis

disertai dengan proses penuaan intrinsik meningkatkan tampilan kulit kendor dan keriput /&12(atriks ekstraselular 3.+(4 di dermis yang di!asilkan ole! #ibroblas terdiri dari protein berserat

yang saling ber!ubungan& misalnya kolagen dan serat elastic& dan glikosaminoglikan yang

mempengaru!i penampilan luar kulit 56*907 dari berat kering kolagen mendominasi kulit dan

keutu!an struktural mereka sangat penting untuk memperta!ankan kekencangan -omeostasis

kolagen terutama diatur ole! #ibroblas dermal yang mengekspresikan dan mengeluarkan kolagen&

dan juga mendegradasi kolagen yang rusak Selama proses penuaan kulit& isi kolagen dermal

menurun dan serat yang tersisa tampil lebi! tidak terstruktur dan terpeca! bela!& #enomena yang

pada gilirannya akan merusak #ungsi dan produkti'itas #ibroblas dermal /1&82

Pada ta!un 90*an& sebua! kelompok protein baru ditemukan sebagai mediator ampu! dariinteraksi matriks*matricellular protein sel/2 Protein (atricellular disekresikan ole! protein

ekstraseluler yang tidak menunjukkan #ungsi struktural utama tetapi memodulasi #ungsi sel

dengan berinteraksi dengan reseptor permukaan sel&molekul bioakti#& dan komponen matriks

seperti kolagen /62 90 kDa protein periostin yang disekresikan milik kelompok protein

matricellular Tidak seperti kebanyakan protein matricellular& periostin tidak !anya diekspresikan

selama embriogenesis atau pada proses patogenesis& tetapi juga disaat se!at& pada de"asa

jaringan ikat kaya akan kolagen /:2 Sementara periostin dapat diidenti#ikasi sebagai regulator

penting dari interaksi matriks seluler dalam !ati /;&52& tulang /9&02& dan proses penyembu!an

luka/:&&12& #ungsinya dalam kulit manusia belum diteliti lebi! luas a /52 dan juga ber!ubungan dengan penuaan kulit akibat ca!aya /92 Selain

itu& di!ipotesiskan ba!"a periostin memiliki e#ek pada pembentukan kolagen #ibril dengan

mempromosikan asosiasi tunggal kolagen #ibril/102

Kita meneliti peran periostin dalam !omeostasis kolagen selama proses penuaan kulit Kita bisa

menunjukkan regulasi periostin menurun selama proses penuaan baik intrinsik maupun

ekstrinsik Pada percobaan in 'itro dengan periostin #ibroblas yang diuraikan dinyatakan ba!"a


3/16

kolagen #ibril menebal dan strukturnya terganggu& tapi tidak ada pengaru! pada ekspresi kolagen

Selain itu& kami memiliki bukti ba!"a periostin berperan dalam mengatur kerentanan kolagen

ter!adap protease seperti metaloproteinase matriks 3((P4

2. Bahan dan metode

2.. Pernyataan !ti"a

Biopsi kulit manusia !asil pukulan diperole! dari dua penelitian klinis 3P,1991 dan 09*64&

disetujui ole! komite etika asosiasi medis dari -amburg dan Luebeck& Cerman dan dari operasi

rutin Semua rela"an ditulis& diin#ormasikan mengenai persetujuan& dan sampel dikumpulkan

sesuai dengan Deklarasi -elsinki Persidangan tela! disetujui ole! peninjau de"an kelembagaan

etik 3Beiersdor# A& -amburg& Cerman4

2.2. Studi "linis

%ntuk menganalisis ekspresi periostin selama proses penuaan intrinsik& kulit dibiopsi 3: mm4dari "ilaya! gluteal dari : pemuda 31*8 ta!un4 dan 6 rela"an berusia 3:0*;0 ta!un4 %ntuk

menentukan ekspresi periostin di kulit ekstrinsik& dilakukan punc! biopsi 3 mm4 dari 1 donor

3laki*laki& :6*5 ta!un4 dikumpulkan Sampel kulit dari daera! le!er 3 terkena sinar mata!ari4

dibandingkan dengan sesuai sampel kulit dari lengan atas bagian dalam 3terlindung4 Sampel

penelitian disaring ole! dokter kulit untuk mengeta!ui tanda*tanda elastosis surya di le!er

2.#. Kultur sel

Cika tidak ada indikasi lebi! lanjut& #ibroblast dermal manusia 3-DE4 diperole! melalui !asil dari

biopsi kulit dari donor perempuan yang berbeda seperti dijelaskan sebelumnya /12 %ntuk

stabilitas transduksi #ibroblas dan analisis stabilitas kolagen #ibroblas neonatal 3-DEneo4 berasal

dari preputium 3Tebu*Bio& Le*Perray*en*F'elines& Prancis4 Sel dikultur pada su!u 8;+& ;7 +?1

di masing*masing media Cika tidak& #ibroblas yang ditanam pada media di D(.( 3=n'itrogen&

+arlsbad& +A4 dengan 07 E+S 3PAA& Pasc!ing& Austria4& 00 % G mL penisilin& 1 m( glutamin

3=n'itrogen& +arlsbad& +A4 Penyortiran sel kulit berasal dari prekursor non*#olikel 3SKP4 dan

#ibroblast dermal dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya /112 %ntuk menganalisa

pembuatan matriks kolagen& #ibroblas dikultur diba"a! kondisi multilayer 360000 sel G cm14 dan

dirangsang untuk memproduksi kolagen dengan 0 ng G mL TE*b 3Peprotec!& -amburg&

Cerman4 dan 00 m( asam L*askorbat ses)uimagnesium 1*#os#at !idrat garam 3AA1P& Sigma*

Aldric!4 selama ;* !ari ,iabilitas sel ditentukan dengan proli#erasi sel reagen HST* 3Roc!eDiagnostics mb-& (ann!eim& Cerman4 menurut instruksi manu#aktur =radiasi sel surya dengan

simulasi radiasi 3SSR4 dilakukan seperti sebelumnya dijelaskan /82

2.$. Trans%e"si

Stabil trans#eksi -DEneo dengan periostin s!R


4/16

cm1 dikultur dalam medium standar selama 1 jam Trans#eksi yang dilakukan pada antibiotik

dan serum bebas D(.( dengan 5 mg G mL polybrene 3(illipore& Billerica& %SA4 dan 6 partikel

'irus per sel Suspensi 'irus tela! di!apus setela! inkubasi semalam dan digantikan ole! media

standar Setela! dua !ari& pemili!an sel ditransduksi dimulai dengan mg G mL puromycin

di!idroklorida 3=n'itrogen& +arlsbad& +A4 Sebua! 'ektor dan #ibroblas yang tidak tertransduksi

digunakan sebagai kontrol Knockdo"n Periostin di'eri#ikasi melalui IRT*P+R dan Hestern

blot

2.&. 'nalisis e"spresi gen

%ntuk menentukan ekspresi gen& mR


5/16

dicerna dengan 0&6 mg G mL atau &0 mg G mL rekombinan ((P manusia 3r!((P&

Peprotec!& -amburg& Cerman4 didalam larutan penyangga pencernaan 300 m( Tris& 00 m(

a*Eluor55 dan anti*kelinci*Ale>a*

Eluor69 3=n'itrogen& +arlsbad& +A4 =nti ditandai dengan DAP= 3Sigma*Aldric!4 Sel di#iksasidalam metanol selama 0 menit padaM 10 5+ dan diblok dengan 7 BSA di PBS Protein yang

terdeteksi dengan jenis mouse anti*kolagen = 3a90896& Abcam4 dan kelinci*anti*periostin

3ab0& Abcam4 Pelabelan #luoresensi dilakukan seperti dijelaskan di atas Para#in bagian

kulit tertanam diinkubasi dengan pengambilan sasaran penyangga p- 9 3DAK?& -amburg&

Cerman4 selama 10 menit pada 00 5+ Pe"arnaan dicapai dengan sistem deteksi

SuperSensiti'eT( =-+ 3Bioene>& Eremont& +A4 sesuai dengan instruksi produsen

-emato>ylin digunakan sebagai counterstain Pe"arnaan dianalisis menggunakan con#ocal laser

mikroskop Leica T+S SP6 == 3Leica& Hetlar& Cerman4 atau Pannoramic (idi 38D -istec!&

Budapest& -ongaria4 Daera! bernoda positi# diukur dengan =mageC 3


6/16

minggu Setela! itu& sel lapisan dicuci dengan 0&06 ( -.P.S dan dikumpulkan dalam

microtube Eiksasi& de!idrasi& embedding& dan transmisi mikroskop elektron 3T.(4 analisis

dilakukan seperti tela! dijelaskan sebelumnya/162 Pengukuran diameter kolagen #ibril dilakukan

dengan =mage Access 3=(A=+ Bild'erarbeitung& lattbrugg& S"iss4 %ntuk analisis

ultrastructural #ibril kolagen in 'itro& #ibroblas yang dikultur dalam kultur multilayer !ingga 1

minggu Sel tersingkir dengan inkubasi dengan D?+ penyangga 30&167 Triton @*00& 0&7

SDS& 0&167 natriumdeso>yc!olate 3Sigma* Aldric!& (unic!& Cerman44 di atas es selama 0

menit .+( tetap dengan 7 #ormalde!id 3Polysciences =nc& Harrington& PA& %SA4 dan 1&67

glutaralde!id 3Plano mb-& Hetlar& Cerman4 di 0&06 ( -.P.S .+( tersebut dide!idrasi

dalam etanol Sampel de!idrasi dikumpulkan dalam aseton 007 dan dilakukan pengeringan

titik kritis 3+PD 080& bal* T.+ Leica (icrosystems mb-& Hetlar& Cerman4 Sampel kering

dilapisi dengan 8 nm "ol#ram dan diperiksa dalam bidang*emisi mikroskop elektron 3L.?

emini 680& +arl eiss A& ?berkoc!en& Cerman4 %ntuk pelabelan immunogold& biopsi kulit

dipotong menjadi potongan kecil Pera"atan dilakukan untuk menjaga agar jaringan lembab di

pembekuan menenga! 3*!e>adecen4 Sampel jaringan yang bertekanan beku tinggi di Balers-P(00 tekanan tinggi #reeer 3Balers A& Balers& Liec!tenstein4 .s di sampel beku diganti

lebi! dari 8 !ari dalam aseton an!idrat murni pada *90+ di Perangkat substitusi Leica AES 00

3Leica& Hina& Austria4 Sampel kemudian diin#iltrasi dengan etanol dan Lo"icryl -(10

3Polyscience =nc& .ppel!eim& Cerman4 dan dipolimerisasi dengan %, pada su!u 86+ %ntuk

bagian pelabelan antibodi 3:0 nm4 yang dipasang pada karbon dilapisi Eorm'ar grid emas

3Iuanti#oil& Cena& Cerman4 dan diperlakukan dengan 0&67 BSA dalam PBS selama 0 menit pada

su!u 1+ Pelabelan antibodi dilakukan dengan antibodi periostin 3ab0& Abcam& +ambridge&

=nggris4 dan antibodi sekunder terkonjugasi untuk emas koloid 3Diano'a 5 nm emas kambing*

anti*rabbit4 Setela! itu& sampel yang kontras pada pe"arnaan uranil asetat dan sitrat dili!at

dalam E.= Tecnai BioT"in T.( pada 50 k,

2.. uji a"ti3itas 456

%ntuk analisis akti'itas L?@ di lapisan sel dan supernatant kultur -DE& 60000 sel G cm1

dikultur pada 9: piring dengan persyaratan standar selama 5 jam sebelum penamba!an ng G

mL TE*b dan 00 m( AA1P Setela! ; !ari serum berkurang menjadi 0&17 E+S selama 1

!ari %ntuk membedakan antara L?@ terikat pada .+( dan bebas L?@ dalam supernatan&

lapisan sel dan supernatan diukur secara terpisa! Penentuan akti'itas L?@ dilakukan dengan

AmpliteT( lysyl #luorimetric oksidase assay kit N red #luoresensi N 3AAT Bio)uest =nc&

Sunny'ale& +A4& menurut instruksi manu#aktur Selanjutnya& sel "estern digunakan untukmenentukan normalisasi sinyal sel

2.2. 'nalisis crosslin" "olagen

%ntuk analisis kekurangan crosslink periostin #ibroblas dengan cara dikultur dalam kultur

multilayer selama 8 minggu dengan 0 ng G mL TEb dan 00 m( AA1P untuk menginduksi

produksi matriks Eibroblas ditransduksi dengan mencampur 'ektor dan sel yang tidak


7/16

ditransduksi sebagai kontrol positi# Sebagai kontrol negati# #ibroblas yang tidak ditrasnduksi

pada kultur ditamba!ankan dengan in!ibitor L?@ b*aminopropionitrile*#umarat 3600 m(

BAP


8/16

manusia 3Eig 1A4 dan mendeteksi sinyal periostin terbanyak di sekitar sel +D: yang positi# di

ba"a! membran dasar Analisis ekspresi gen Periostin dalam peca!an sel dermal yang dipili!

dari non*#olikular SKPs dan #ibroblas 3Eig 1B4 mengkon#irmasikan !asil di tingkat mR


9/16

do"nregulation dari periostin yang tergantung ole! #ibroblas 3Eig 8D4& yang berkorelasi dengan

kekurangan periostin dalam kulit yang terkena paparan sinar mata!ari 3Eig B dan .4

#.$. Kehilangan periostin "tida" berpengaruh terhadap e"spresi "olagen tetapi

mempengaruhi stabilitas dan pembentu"an "olagen secara in 3itro

Data yang disajikan menunjukkan ba!"a periostin mengalami penurunan regulasi selama

proses penuaan kulit %ntuk menelaa! konsekuensi dari !ilangnya periostin pada !omeostasis

kolagen& #ibroblas yang stabil ditrans#eksi dengan s!R


10/16

terikat dan bebas dari L?@ menggunakan supernatant Sekali lagi& kita tidak mengamati dampak

akti'itas L?@ pada supernatant dengan model periostin yang diurai& sedangkan sedikit

penurunan dapat dideteksi dalam #raksi dan matriks selular3ambar 6 d4


11/16

pengecetan periostin immunouorescence (merah)!marker "#$%& SKP

(hi'au)! dan nuleus #AP ( biru) pada kulit (paudara! wanita ** tahun) pada

dua perbedaan. (+) data ,-/P"- dari periostin (P0S1) ekspresi m-1A

ditun'ukan sebagai nilai 2#"t$3& sebagai bo4 plot. 5edian diindikasikan

sebagai poin! n6*. (") perwakilan pengecetan periostin immunogold pada

dermis ( abdomen! &* tahun). Pana! mera! menunjuk ke periostin yang ber!ubungan

dengan kolagen #ibril dan pana! !ijau menunjukkan periostin intraseluler ambar diambil dalam

papillary 3O 60 mm4 dan retikuler dermis 3 60 mm di ba"a! basement membran4& n 1

Eig 8 Periostin diatur ole! TE*b dan SSR di #ibroblas secara in 'itro dan colocalies dengan

kolagen 3A& B dan D4 )RT*P+R dilakukan untuk menganalisis periostin 3P?ST


12/16

Diskusi

-omeostasis kolagen adala! banyak proses yang sangat kompleks& terdiri dari ekspresi

kolagen dan modi#ikasi posttranslasi& sekresi& pembuatan& crosslinking& degradasi dan

=nternalisasi seluler /8&19&802 Protein matricellular adala! regulator poten dari interaksi matriks

sel dan tela! dijelaskan beberapa protein matricellular yang memainkan peran dalam

!omeostasis kolagen Termasuk t!rombospondins /8&812& SPAR+ /882& !e'in /82& tenascin*@

/862& ++


13/16

sampel #ibroblas manusia tidak ada penurunan ekspresi kolagen ekspresi yang bisa dideteksi

Sebaliknya& kami menemukan ba!"a kekurangan periostin mengara! pada peningkatan diameter

dan penyimpangan struktur kolagen Penebalan kolagen #ibril adala! #enotipe yang diamati

setela! peng!ambatan L?@& enim bertanggung ja"ab untuk crosslinking kolagen /16&2

Dengan demikian& kami menganalisis akti'itas L?@ pada knockdown periostin #ibroblast

(eskipun -asil mengungkapkan ba!"a penurunan akti'itas L?@ di lapisan sel*matriks

periostin yang dikultur multilayer pada knockdo"n #ibroblas& amplitudo ini tidak cukup untuk

menyebabkan gangguan total akti'itas L?@


14/16

kolagen Dalam konteks ini& postulasi et al


15/16

-PL+ pengukuran di#unctional crosslinks 3D-L


16/16

dilakukan untuk mengukur ekspresi gen kolagen tipe = 3+olA4

Konstribusi Dari Protein Matricellular Periostin Terhadap Fungsi Kolagen Dan Regulasinya Selama...

Documents

Transcript of Konstribusi Dari Protein Matricellular Periostin Terhadap Fungsi Kolagen Dan Regulasinya Selama...