Klt

I. Nomor Percobaan : V (lima)

II. Tanggal Percobaan : 6 November 2014

III. Nama Percobaan : Kromatografi Lapis Tipis

IV. Tujuan Percobaan :1. Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan

Kromatografi Lapis Tipis

2. Mengetahui harga Rf asam amino

V. Alat dan Bahan :

Alat Bahan

1. pipet tetes

2. gelas ukur

3. beker gelas

4. neraca analitik

5. bunsen

6. tabung reaksi

7. rak tabung reaksi

8. pengaduk

9. penjepit tabung

10. stirrer

1. silika gel G

2. pelarut etanol

3. larutan ninhidrin

4. larutan Kuprinitrat

5. larutan asam amino (arginin,

asam glutamate,histidin dan

alanin)

6. aquadest

VI. Dasar Teori

Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-

komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen di

antara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Perbedaan kecepatan perpindahan

tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan kemampuan masing-masing komponen untuk

diserap (adsorpsi) atau perbedaan distribusi di antara dua fasa yang tidak bercampur

(partisi). (Tim Dosen Kimia Organik, 2012: 39).

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan

kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi,

komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase

gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran, sedangkan fase gerak akan

melarutkan zat komponen campuran. (Anonymous, 2008)

Kromatografi adalah suatu metoda pemisahan campuran senyawa atau

komponen tersebut antara dua fasa yaitu

Fase diam (stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam

proses pemisahan dengan kromatografi karena adanya interaksi dengan fase diamlah

terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit. Fase

diam dapat berupa bahan atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan

yang umumnya dilapisi pada padatan pendukung (Denikrisna, 2010).

Fase gerak (eluen) merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun

berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak ini tidak hanya dalam bentuk cairan

tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas

senyawa mudah menguap (volatile) (Denikrisna, 2010).

Dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan sebagai

berikut; (a) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan;

(b) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada permukaan padatan

halus (adsorpsi=penyerapan); (c) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk

bereaksi secara kimia (penukar ion). Komponen yang dipisahkan harus larut dalam fasa

gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan fasa diam dengan

cara melarut di dalamnya, teradsorpsi, atau bereaksi secara kimia (penukar ion).

Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel.

Hasil pemisahan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif),

penetapan kadar (analisis kuantitatif), dan pemurnian suatu senyawa (pekerjaan

preparatif) (Soebagio, 2000:54).

Kromatografi jenis ini menggunakan alumunium oksida, serbuk selulosa atau

silika gel sebagai adsorben yang berupa lapis tipis yang diletakkan di atas selmbar kaca.

Seperti halnya kromatografi kertas, larutan yang mengandung beberapa asam amino

diteteskan di atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Penggunaan fase gerak pada

kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan pelarut seperti : metanol, asam asetat,

etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform.

Sebagai persiapan untuk menggunakan kromatografi lapis tipis, bubuk serbuk

fasa diam diratakan terlebih dahulu pada lempeng kaca, ketebalan kaca tergantung pada

tujuan pemisahan kromatografi. Untuk tujuan analisis, tebalnya kira0kira 0,25 mm

sedangkan untuk praparatif 5 mm. Kecuali dipakai lapisan tipis gel maka setalah bubur

merata maka lempeng dikeringkan.

Kromatografi lapis tipis (KLT) seperti halnya kromatografi kertas tidak mahal

dan sesederhan melakukannya, kromatografi ini memiliki keuntungan kecepatan diatas

kromatografi kertas, prosesnya mungkin memerlukan waktu kira-kira setengah jam.

Kromatografi lapis taipis sangat terkenal dan digunakan secara rutin dalam banyak

laboratorium.

Teknik KLT dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schaiber. Adsorbent

dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase

bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal

juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan

dan sensitive. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali

senyawa-senyawa yang terpisahkan. (Khopkar, 2010: 164).

Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silica gel, tetapi

kadangkala bubuk selulosa dan tanah diatome, kieselguhr juga dapat digunakan. Untuk

fase diam hidrofilik dapat digunakan pengikat seperti semen Paris, kanji, dispersi koloid

plastik, silica terhidarsi. Untuk meratakan pengikat dan zat pada pengadsorpsi

digunakan suatu aplikator. Sekarang ini telah banyak tersedia kromatografi lapisan tipis

siap pakai yang dapat berupa gelas kaca yang telah terlapisi, kromatotube dan

sebagainya. Kadar air dalam lapisan ini harus terkendali agar didapat hasil analisis yang

reprodusibel (Khopkar, 2010:164).

Pada identifikasi suatu kandungan tumbuhan, setelah kandungan itu diisolasi dan

dimurnikan, pertama-tama yang harus kita tentukan dahulu golonannya, kemudian

barulah ditentukan jenis senyawa dalam golongan tersebut. Sebelum itu, keserbasamaan

senyawa tersebut harus diperiksa dengan cermat, artinya senyawa harus membentuk

bercak tunggal dalam beberapa system KLT dan/atau KKt. Golongan senyawa biasanya

dapat ditentukan dengan uji warna, penentuan kelarutan, bilangan Rf, dan ciri spektrum

UV. Identifikasi lengkap dalam golongan senyawa bergantung pada pengukuran sifat

atau cirri lain, yang kemudian dibandingkan dengan data dalam pustaka. (Harborne,

1987:20).

Kromatografi bermanfaat untuk menguraikan suatu campuran. Dalam

kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase, fase diam dan fase

gerak. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul

campuran terserap pada permukaan partikel-partikel ke dalam sejumlah cairan yang

terikat pada permukaan. Laju perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu di dalam

kolom atau lapisan tipis zat penyerap secara langsung berhubungan dengan bagian-

bagian molekul tersebut di antara fase bergerak dan fase diam. Jika ada perbedaan

penahanan secara selektif, maka masing-masing komponen akan bergerak sepanjang

kolom dengan laju yang tergantung pada karakteristik masing-masing penyerapan.

(Khopkar, 2008)

Kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan jika dibandingkan dengan

kromatografi kertas, diantaranya : Noda zat yang timbul sesudah kromatografi tidak

banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya

sedikit saja senyawa yang diperlukan, tidak memerlukan waktu yang banyak, senyawa-

senyawa yang tidak menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis

dengan KLT, dapat memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut.

Untuk mengidentifikasi komponen yang satu dengan yang lainnya digunakan

faktor refensi (Rf). Jarak ynag ditempuh komponen dapat diperbesar menggunakan

pelarut polar, sebaliknya ukuran identitas bercak dapat untuk mempekirakan kadar dari

masing-masing komponen yang terdapat dalam campuran. Untuk zat yang bersifat asam

/ basa kuat yang tidak dapat dilakukan dengan kromotografi kertas dapat dipisahkan

dengan KLT.

Pemisahan pada KLT didasarkan pada penyerapan, pembagian, pertukaran ion,

dan gabungan dari ketiganya. Sedangkan faktor-faktor yang mempengaruhi Rf adalah

adanya ion, kesamaan larutan lainnya, adanya kation dlam kosentrasinya. Dan faktor

yang mempengaruhi gerak dan harga Rf yaitu sifat dari penyerap dan derajat aktivitas,

Struktur kimia dari senyawa dipisahkan, Kerapan dari satu pasang penyerap, Pelarut.

VII. Prosedur Percobaan

Pembuatan lapis tipis.

Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25

gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai

homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat

buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini

ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan

kering diudara selama semalam.

Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa.

Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 – 2,0 ug dalam 0,5 ul,

diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat

yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara

dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati

seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh

(ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil

yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil

ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda.

Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai

kering.

Ruang Kromatografi.

Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan

eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam

sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi

dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah

dan cepat dijenuhi dengan uap eluen.

Cara melakukan elusi.

Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke

dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki.

Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10

cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat

diambil dan dikeringkan pada suhu kamar.

Cara perwarnaan.

(a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan

dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerak yang dipakai bersifat

alkali.

Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit.

Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose.

(b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat

kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial).

Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil

apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap

amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau

disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel

VIII. Hasil Pengamatan

Sampel Jarak Warna

Alanin 3,5 cm orange

Glisin 2,6 cm ungu

Glutamat 2,2 cm merah

Arginin 3,3 cm kuning

IX. Persamaan Reaksi

X. Analisa Data

Alanin :

Data yang diperoleh pada saat praktikum 3,5cm

Rf = 3,5 / 10 = 0,35

Rf(t) = 0,38

Glisin :


Rf = 2,6 / 10 = 0,26

Rf(t) = 0,26

Arginin :


Rf = 2,2 / 10 = 0,22

Rf(t) = 0,20

Glutamat :


Rf = 3,3 / 10 = 0,33

Rf(t) = 0,36

XI. Pembahasan

Pada percobaan mengennai kromatografi lapis tipis ini dilakukan untuk

mengetahui cara pemisahan dengan kromatografi lapis tipis serta menentukan harga Rf

dari beberapa macam asam amino yang diujikan. Asam amino yang diuji dalam

percobaan ini ialah alanin, glisin,arginin dan glutamat . keempat asam amino ini

mewakili masing-masing dari golongan asam amino.

Pada percobaan yang dilakukan kaca yang digunakan harus benar-benar bersih

bebas dari lemak oleh karena itu dibersihkan menggunakan sabun yang tidak

mengandung lemak seperti sunlight;, dan dikeringkan di udara. Fase gerak dan fase

diamnya adalah eluen dalam hal ini adalah campuran ethanol:air dan silica gel.

Pada awalnya dilakukan pembuatan lapisan dari silica gel. pembuatan lapisan

tipis dengan menambahkan 10 gr silika gel dengan 25 ml air yang diaduk menggunakan

stirrer dan dituangkan keatas plat kaca. Kami melakukan pengulangan sebanyak satu

kali karena lapisan silica gel kami pada awalnya terlalu tebal dan bergelombang. Oleh

karena itu untuk membuat lapis tipisnya frame pada pinggiran kacanya harus dibuat rata

serta pada saat penarikan seilikanya harus dalam satu kali tarikkan agar permukaannya

tidak bergelombang dan rata.

Pada penetesan asam amino perlu dilakukan secara hati-hati agar lapis tipis

silika gelnya tidak rusak. Penetesan asam amino yang kami lakukan dengan jarak 1,5

cm dari tepi bawah dan tepi samping. Eluen yang akan dijalankan diukur sepanjang 10

cm. Eluen pun berjalan tergantung dengan lapis silikan gel yang dibuat. Bila lapisan

silika gel yang kita buat terlalu tebal maka eluen pun akan berjalan lambat, dan juga

sebaliknya. Oleh karena itu, pembuatan lapisan silikanya diusahakan setipis mungkin

dan merata. Dan bila sudah sampai 10 cm, maka eluen yang berjalan dihentikan.

Kemudian dikeringkan.

Untuk melihat bercak noda dari jarak asam amino dapat disemprotkan dengan

larutan ninhidrin agar terbentuk warna. Di sini, ninhidrin berfungsi untuk melacak

jalannya asam amino dengan menimbulkan warna merah pada asam amino. Kemudian,

plat kacanya harus dikeringkan kembali pada suhu kamar.

Selain itu, warna yang terbentuk tidaklah stabil. Maka perlu adanya penyemprotan

larutan lagi dengan larutan Kuprinitrat. Sehingga terbentuklah noda yang berwarna

ungu. Hal ini terjadi karena terbentuknya Cu-ninhidrin. Bagus tidak hasilnya sangat

dipengaruhi oleh tebal atau tipisnya silika gel yang dibuat. Setelah disemprot, pada

silica gel muncul bercak – bercak atau noda. Noda yang dihasilkan untuk alanin

bewarna orange dengan nilai Rf 0,35 , glisin berwarna ungu dengan nilai Rf 0,26 ,

arginin berwarna kuning dengan nilai Rf 0,22 , sedangkan asam glutamat merah dengan

nilai Rf 0,33.

Dari analisa data yang diperoleh, Rf untuk teori dan praktek agak berbeda. Hal

ini dapat saja disebabkan oleh kesalahan pada saat membuat lapisan silika gelnya,

kesalahan pada pembuatan larutan sampel yang digunakan, penetesan sampel pada plat

yang tidak merata serta dengan jarak yang terlalu dekat.

XII. Kesimpulan

1. Kaca yang digunakan harus bebas dari lemak. Hal ini bias menyebabkan terganggu

nya jalan kromatografi

2. Pada percobaan kromatografi lapis tipis menggunakan silika gel sebagai fase diam

serta eluen yaitu campuran etanol dan aquadest sebagai fase gerak.

3. Identifikasi asam amino dapat dilihat pada noda atau bintik yang dihasilkan,

sehingga kita dapat menghitung Rf dari asam amino dengan cara membandingkan jarak

yang ditempuh oleh asam amino dengan jarak yang ditempuh oleh eluen pada plat.

4. Untuk memberikan warna pada noda atau bintik yang dihasilkan kita dapat

menggunakan larutan ninhidrin dan larutan kuprinitrat sebagai penstabil warnanya

karena terjadi ikatan kompleks Cu- ninhidrin yang berwarna.

5. Nilai Rf terbesar yang didapatkan pada percobaan kromatografi lapis tipis adalah

nilai pada asam amino alanin sebesar 0,35 yang merupakan golongan asam amino gugus

non polar.

6. Ketidakberhasilan dalam melakukan percobaan ini disebabkan pada saat lapisan

silika gelnya yang terlalu tebal atau bergelombang , kesalahan pada pembuatan larutan

sampel yang digunakan, penetesan sampel pada plat yang tidak merata serta dengan

jarak yang terlalu dekat.

XIII. Daftar Pustaka

Anonim.2013.Laporan Kromatografi Kolom dan Lapis Tipis(online). http://nurulcuxma.

blogspot.com/2013/04/laporan-kromatografi-kolom-dan.html.(diakses pada 11

november 2014)

Anonim .2012.Laporan Kromatografi Lapis Tipis(online ) .http://imeldagustia.blogspo

t.com/2012/05/laporan-kromatografi-lapis-tipis.html. (diakses pada 11

november 2014)

Anonim.2013.Laporan Pemisahan Senyawa-Senyawa(online). http://qworo.blogspot.

com/2013/10/laporan-pemisahan-senyawa-dengan.html .(diakses pada 11

november 2014)

Lehninger, 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: ERLANGGA

Poedjadi, Anna, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI

Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press

XIV. Lampiran

1. Menganalisa secara kualitatif dengan cara kromatografi lapis tipis satu dimensi. Suatu

larutan asam amino yang bersedia dan hitung berapa harga Rfnya?

Jawab :

10 gram silica gel G dalam 25 ml air diaduk sampai homogen, kemudian dituangkan ke

atas lempeng kaca yang telah diukur pinggir kanan dan kirinya 1 cm dan ditempeli

dengan plester. Setelah itu larutan silica gel G dituangkan dan diratakan. Keringkan.

Setelah kering silica gel G tersebut dikur dari bawah sepanjang 1,5 cm dan diberikan

tanda atau garis dengan pensil. Pada garis itu ditotolkan dengan asam amnio, masing-

masing adalah alanin, glisin,asam glutmat, dan arginin. Lalu masukkan plat tersebut ke

dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen (etanol : aquadest). Setelah itu

dikeringkan. Kemudian disemprotkan dengan ninhidrin dan dikeringkan kembali selama

30 menit. Kemudian disemprotkan kembali dengan kuprinitrat. Setelah itu diukur jarak

asam amino tersebut adalah sebagai berikut serta harga Rf nya :

Dari hasil pengamatan diketahui jarak yang ditempuh oleh pelarut untuk plat adalah 10

cm. sedangkan untuk asam amino adalah :

Harga Rf pada Alanin sebesar 0,35

Harga Rf pada Glisin sebesar 0,26

Harga Rf pada Arginin sebesar 0,22

Harga Rf pada Asam Glutamat sebesar 0,33

2. Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino!

Reaksi Asam amino dengan ninhidrin

3. Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi Rf pada KLT?

Jawab :

Kepolaran senyawa, jenis pelarut, jarak penetesan, dan fasa diam (adsorbennya).

4. Terangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif suatu zat tertentu dengan

cara kromatografi lapis tipis?

Jawab :

Dengan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat 50% atau 25% dalam etanol

kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak sebagai

noda-noda coklat. Mengamati lempeng dengansinar UV sehingga noda-noda yang

menyerap sinar UV atau sebaliknya dengan memancarkannya. Bahan sample ditotolkan

pada salah satu sudut lempeng sebagai suatu titik dan pemisahahn dilakukan setelah

lempeng kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan satu system solven yang lain dengan

arah tegak luus dari arah semula.

5. Terangkan bagaimana cara melakukan kromatografi lapis tipis dua dimensi dan

bilakah orang terpaksa melakukan cara itu?

Jawab:

Dengan mengamati kepekatan warna yang diperoleh. Untuk cara ini, sample diteteskan

dipojok kanan bawah dari plat TLC yang berukuran 20 x 20 cm, kira-kira 2 cm dari tepi

kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan pertama selesai, plat dikeringkan. Untuk

mencegah terjadinya kerusakan senyawa yang dipisahkan selama pengeringan

sebaiknya dilakukan dengan aliran gas N2. setelah dikeringkan, plat dikembangkan

dengan menggunakan system pelarut yang kedua dengan memutar arah plat 90o.

menggunakan cara ini mendapatkan hasil pengembangan yang lebih baik dengan

penggunaan dua macam system pelarut, dan apabila pengembangan satu dimensi

mendapatkan hasil yang kurang sempurna.

Klt

Documents

Transcript of Klt