TUJUAN

MANSE LABORATORYJalan Raya Jababeka No.97CikarangNo. Dokumen : 010/IV/088

Revisi : 00

Terbitan : 22 April 2015

Berlaku : 22 September 2015

PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLCHalaman : 1 dari 8

Disetujui oleh : Sarang, S.Farm, Apt.

A. TUJUANUntuk menentukan metode pemeliharaan HPLC.

B. RUANG LINGKUPProsedur ini menjelaskan tentang tatacara pemeliharaan kolom HPLC dengan baik dan benar.

C. ACUANHarmita. 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok: UI.Fortis Technologies. HPLC Column Care. UK: Fortis Technologies LtdGeneral HPLC Column Care

D. TEORIHPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sampel untuk selanjutnya diidentifikasi dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen. Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen. Kolom standar mempunyai diameter dalam antara 4-5 mm. Isi kolom harus berukuran homogel dan stabil secara mekanik. Panjang kolom sekitar 10-30 meter. Kolom dengan diameter dalam yang kecil dibandingkan dengan kolom standar pada kondisi isokratik akan menghasilkan waktu analisis yang sama.Kolom merupakan bagian penting dalam HPLC, karena ikut menentukan keberhasilan analisis. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam memilih kolom yaitu panjang kolom, diameter kolom, pengisi kolom, fase gerak dan tekanan kolom. Karena kolom merupakan instrument penting HPLC, kolom HPLC harus dirawat dengan baik dan benar. Pemeliharaan kolom HPLC yang tidak baik akan menyebabkan kolom akan cepat rusak dan tidak dapat digunakan kembaliE. PROSEDUR1. Column Installation1. Bilas kolom HPLC dengan fase geraknya. Pastikan tidak ada udara yang terjebak dalam sistem2. Hubungkan kolom ke injektor sesuai dengan arah aliran (terletak pada kolom)3. Atur kecepatan aliran pada 0,1 mL/menit (atau pengaturan terendah) dan tingkatkan menjadi laju aliran normal setelah 5 menit4. Hentikan aliran ketika fase gerak sudah dapat terbaca oleh detektor5. Seimbangkan kolom dengan melewatkan fase gerak sekitar 10-30 dari volume kolom dengan kecepatan normal.6. Bagi kolom yang dapat digunakan pada kondisi fase terbalik atau fase normal (yaitu, -CN atau -NH2), bilas dengan IPA atau THF 20-30 volume kolom sebagai pelarut intermediate ketika berpindah dari fase terbalik ke fase normal, atau sebaliknya. Hubungkan kolom ke injektor.

2. Equilibration1. Semua pelarut yang digunakan pada kolom HPLC harus memenuhi standar mutu HPLC.2. Fase gerak harus difilter dan dibebasgaskan sebelum digunakan.3. Alirkan pelarut yang akan digunakan melalui sistem sebelum intalasi kolom.4. Hubungkan kolom untuk menyesuaikan arah aliran.5. Perlahan sesuaikan laju alir yang diinginkan, pastikan tidak terjadi lonjakan tekanan. Kolom analitik harus dijaga di bawah 400 bar.6. Bilas kolom dengan fase gerak dengan volume kolom 20 30.7. Temperature kolom dijaga < 60C untuk menjaga kualitas kolom yang baik. Kolom yang digunakan melebihi temperature tersebut akan mempengaruhi kualitas kolom.8. pH fase gerak dijaga antara 2 8 untuk mengoptimalkan kerja fase gerak. Untuk kolom C18 akan beroperasi pada pH 1 11.9. Penggunaan dapar organik seperti asam format, ammonium asetat akan menjaga umur penggunaan kolom dibandingkan dapar anorganik seperti fosfat.

3. Column Testing1. Lakukan pengetesan kolom dibawah kondisi yang optimum

Kolom : Fortis C18 100x4,6 mm 5 p/n : F18-050505Fase gerak : 60:40 ACN:H2OLaju alir : 1.0 ml/menitSuhu : 25 CPanjang gelombang : 254 nm1. Urasil2. Fenol3. 4-Etilanilin4. N,N-Dimetilanilin5. Naphtalen

2. Perhitungan Efisiensi Efisiensi kolom dapat diperhitungkan menggunakan persamaan berikut:

3. Perhitungan bentuk Peak: Bentuk peak kolom dapat diperhitungkan dengan menggunakan persamaan berikut:

4. Storage of Column1. Kolom yang telah selesai digunakan, kolom harus selalu dicuci.2. Larutan asam ataupun basa tidak boleh dibiarkan berada dalam kolom.3. Untuk penyimpanan jangka pendek, yaitu selama malam, simpan kolom dalam eluen yang digunakan dalam analisis terakhir.4. Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, bilas kolom dengan air murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.5. Untuk penyimpanan jangka panjang, simpan kolom dalam pelarut organik tergantung dari tipe jenis kolom (fase diam).6. Simpan kolom nonpolar dalam metanol. Acetonitril tidak dianjurkan, karena bisa terurai membentuk pengotor dalam kolom.7. Simpan kolom polar dalam heptana atau methanol.8. Simpan kolom silika dalam heptane.9. Simpan kolom pada suhu kamar dan bebas vibrasi.10. Catat pelarut yang digunakan dalam penyimpanan kolom dalam notebook.

5. Column CleaningSebelum memulai prosedur pembersihan, lakukan:1. Bilas kolom dengan air konsentrasi tinggi untuk membebaskan kolom dari dapar2. Kolom harus dibilas dengan arah yang berbeda untuk memastikan tidak ada penyumbatan pada fritsPencucian Kolom dengan Fase Terbalik/Reversed Phase WashGunakan 20 X volume kolom untuk setiap tahap pencucian.Tahap pencucian:1. Cuci kolom dengan Air-Asetonitril (ACN) 95:5 untuk menghilangkan dapar2. Cuci kolom dengan 100% ACN3. Cuci kolom dengan Air-ACN 50:50

Pada keadaan tingginya senyawa sampel yang tertahan atau matrik pada kolom maka dapat ditambahkan tahap injeksi Dimetil Sulfoksida (DMSO) atau Tetra Hidro Furan (THF).Tahap pencucian:1. Cuci kolom dengan Air-ACN 95:5 untuk menghilangkan dapar2. Cuci kolom dengan 100% ACN3. Injek DMSO atau THF sebanyak 4 x 20 l4. Cuci kolom dengan Air-ACN 50:50

Pencucian Kolom dengan Fase Normal/Normal Phase WashGunakan 20 X volume kolom untuk setiap tahap pencucian.Tahap pencucian: 1. Cuci kolom dengan THF2. Cuci kolom dengan Kloroform3. Cuci kolom dengan Metilen Klorida4. Cuci kolom dengan HeksanPencucian Kolom dengan HILIC/Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography WashGunakan 20 X volume kolom untuk setiap tahap pencucian.Tahap pencucian: 1. Cuci kolom dengan ACN-Air 95:5 untuk menghilangkan dapar2. Cuci kolom dengan ACN-Air 50:503. Cuci kolom dengan Metanol-Air 50:504. Cuci kolom dengan ACN-Air 95:5Hitung volume kolom (berupa perkiraan kasar) dengan cara:

Vm 0,5Ldc2Vm: Volume kolomL : Panjang kolom (cm)dc: Diameter dalam dari kolom (cm)

6. Column Regeneration

Penyerapan kotoran yang bersifat ireversible yang berasal dari matriks pada kolom dapat menyebabkan perubahan terhadap selektivitas dan puncak pemisahan. Oleh karena itu perlu dilakukan regenerasi kolom dengan menerapkan prosedur berikut.1. Prosedur regenerasi untuk Kolom Fase Terbalik (C18, C8, C4, C1, C30, CN atau Phenyl)a. Lepaskan kolom dan sambungkan kembali kolom ke kromatografi dengan aliran melalui kolom dalam arah terbalik.b. Bilas kolom dengan air tanpa dapar sebanyak 20 volume kolomc. Bilas kolom dengan asetonitril sebanyak 20 volume kolomd. Bilas kolom dengan isopropanol sebanyak 5 volume kolome. Bilas kolom dengan heptan sebanyak 20 volume kolomf. Bilas kolom dengan isopropanol sebanyak 5 volume kolomg. Bilas kolom dengan asetonitril sebanyak 20 volume kolomh. Sambungkan kembali kolom ke kromatogram dengan arah aliran yang benar.i. Bilas kolom dengan fase gerak tanpa dapar, dan masukkan kembali dapar.j. Seimbangkan kolom dengan fase gerak sebanyak 20 sampai 50 volume kolomk. Suntikkan standar atau sampel untuk melihat apakah kinerja telah pulih.2. Prosedur regenerasi untuk Kolom Fase Normal (Silica, Diol, Nitro dan Amino)a. Hubungkan kolom ke kromatogram dengan aliran dalam arah sebaliknya.b. Bilas kolom dengan heptan sebanyak 20 volume kolomc. Bilas kolom dengan isopropanol sebanyak 5 volume kolomd. Bilas kolom dengan asetonitril sebanyak 20 volume kolome. Bilas kolom dengan air sebanyak 20 volume kolomf. Bilas kolom dengan asetonitril sebanyak 20 volume kolomg. Bilas kolom dengan isopropanol sebanyak 5 volume kolomh. Bilas kolom dengan heptan sebanyak 20 volume kolomi. Sambungkan kembali kolom dalam arah aliran yang tepat.j. Seimbangkan kolom dengan fase gerak sebanyak 50 volume kolom.k. Suntikkan standar atau sampel dan lakukan pengevaluasi kinerja.3. Prosedur regenerasi untuk Kolom Ion Exchange (WCX, SCX, WAX and SAX)a. Bilas kolom dengan eluen yang sama sebanyak 20 volume kolom tetapi dengan konsentrasi dapar ganda.b. Ikuti prossedur regenerasi pada fase terbalikc. Bilas kolom dengan air sebanyak 20 volume kolomd. Sesuaikan kolom dengan kondisi yang sesungguhnya7. Troubleshooting

Retensi dan disolusi

PenyebabSolusi

Hilangnya fase terikatGanti kolom dan guard

Terdapat kontaminasiBersihkan sesuai dengan ketentuan

Pada fase normal terdapat embun pada fase gerakGunakan 2% air dalam fase gerak

Backpressure Change/increase

PenyebabSolusi

Blocked fritsMembalikan kolom dan bersihkan sesuai dengan ketentuan atau dengan mengganti frits dan kolom guard

Fase terkontaminasiMembalikan kolom dan bersihkan sesuai dengan ketentuan

Presipitasi dapar karena tingginya konsentrasi dari organik modifierBilas dengan air (>90%)

Tailing/Split peaks

PenyebabSolusi

KekosonganGanti kolom atau guard

Blocked fritGanti kolom

Sampel overloadSampel diencerkan

Terdapat kontaminasiBersihkan kolom sesuai dengan ketentuan

Sampel sukar larutModifikasi pelarut injeksi atau komposisi fase gerak