KARBOHIDRAT

Karbohidrat adalah polihidroksi aldehid atau polihidroksiketon dan meliputi

kondensat polimer-polimernya yang terbentuk. Nama karbohidrat dipergunakan pada

senyawa-senyawa tersebut, mengingat rumus empirisnya yang berupa CnH2nOn atau

mendekati Cn(H2O)n yaitu karbon yang mengalami hidratasi. Namun demikian nama ini

sebenarnya kurang tepat karena hidrat (H2O) yang melekat pada gugus karbon bukanlah

sebagai hidrat yang sebenarnya, misalnya tidak dapat dipisahkan atau dikristalkan

tersendiri yang terlepas dari gugusnya. Secara alami, ada tiga bentuk karbohidrat yang

terpenting, yaitu :

1. Monosakarida

Sangat sedikit terdapat di alam karena tidak digunakan sebagai bahan simpanan

makanan. Bahan monosakarida yang terdapat dalam perdagangan umumnya dibuat

melalui proses hidrolisa bahan polisakarida. Bahan monosakarida untuk makanan dan

obat-obatan misalnya glukosa dan fruktosa sering dibuat dari jagung, ketela, dan lain-

lain.

2. Oligosakarida

Bentuk yang paling umum dari oligosakarida adalah disakarida (terdiri dari dua unit

monosakarida) yang terjadi dari proses kondensasi dua molekul monosakarida.

Contoh yang paling umum dari disakarida adalah sukrosa (atau sakarosa).

3. Polisakarida

Merupakan kelompok karbohidrat yang paling banyak terdapat di alam. Merupakan

senyawa makromolekul yang terbentuk dari banyak sekali satuan (unit)

monosakarida. Jumlah polisakarida ini terdapat jauh lebih banyak daripada oligo

maupun monosakarida. Sebagian dari polisakarida membentuk struktur tanaman yang

tak dapat larut misalnya selulosa dan hemiselulosa. Sebagian lagi membentuk

senyawa cadangan pangan berbentuk pati dalam tanaman atau glikogen pada sel-sel

hewan. Sebagian lagi membentuk gum (atau gom), pektin, dan derivat-derivatnya.

A. Sifat-sifat Karbohidrat

Mono dan disakarida memiliki rasa manis oleh sebab itu golongan ini disebut

gula. Glukosa (gula anggur) dan fruktosa (gula buah) adalah contoh monosakarida

yang banyak dijumpai di alam. Sukrosa (gula tebu, gula bit) dan laktosa (gula susu)

adalah kelompok disakarida yang juga manis. Rasa manis dari gula-gula ini

disebabkan oleh gugus hidroksilnya. Trihidroksi (gliserol) dan polihidroksi lain juga

berasa manis. Sedangkan polisakarida tidak terasa manis karena molekulnya

sedemikian besarnya sehingga tidak dapat masuk ke dalam sel-sel kuncup rasa (taste

bud) yang terdapat pada permukaan lidah.

Semua jenis karbohidrat baik mono, di maupun polisakarida akan berwarna merah

apabila larutannya (dalam air) dicampur dengan beberapa tetes larutan α-naphthol

(dalam alkohol) dan kemudian dialirkan pada asam sulfat pekat dengan hati-hati

sehingga tidak tercampur. Warna merah akan tampak pada bidang batas antara

campuran karbohidrat dengan α-naphthol dan asam sulfat pekat. Sifat ini dipakai

sebagai dasar uji kualitatif adanya karbohidrat dan dikenal sebagai uji Molisch.

Warna biru kehijauan akan timbul apabila larutan karbohidrat dicampur dengan asam

sulfat pekat dan anthrone. Warna ini timbul karena terbentuknya furfural dan hidroksi

furfural sebagai senyawa derivat dari gula-gula.

O

OH

C

C

α – naphthol H2

anthrone

H H H H

C C C C

H C C CHO C C

O HO H2C O CHO

Furfural Hidroksimetilfurfural

B. Analisa Karbohidrat

Dalam ilmu dan teknologi pangan, analisa karbohidrat yang biasa dilakukan

misalnya penentuan jumlahnya secara kuantitatif dalam rangka menentukan

komposisi suatu bahan makanan, penentuan sifat fisis atau kimiawinya dalam

kaitannya dengan pembentukan kekentalan, kelekatan, stabilitas larutan dan tekstur

hasil olahannya. Dalam ilmu gizi, sangat penting untuk mengadakan analisa biologis

(bioassay) senyawa-senyawa karbohidrat dalam kaitan peranannya membentuk kalori,

pencegahan penyakit (diabetes, karies gigi, kegemukan, dll), serat kasar dalam

percernaan (dietary fibers) dan sebagainya.

Dalam bidang bioteknologi, analisa yang dilakukan untuk menetukan jenis dan

perubahan kimiawi yang dialami karbohidrat selama proses fermentasi misalnya

menjadi sangat penting untuk menentukan kondisi proses yang optimal. Dalam bidang

kimia murni, analisa dilakukan misalnya untuk penentuan struktur polimer

karbohidrat, bentuk rantai polimer yang lurus dan sebagainya. Sedangkan dalam

biokimia, analisa karbohidrat dapat meliputi analisa perubahan-perubahan yang

terjadi selama proses biologis, peranan dan fungsinya dalam pembentukan boimolekul

atau kaitannya dengan struktur sel.

C. Penentuan Karbohidrat

a. Persiapan sampel

Sebelum dilakukan analisa karbohidrat terlebih dahulu bahan dibebaskan

dari zat-zat pencampur dan dilakukan penjernihan terhadap larutan yang akan

dianalisa. Lipida dan khlorofil dihilangkan dengna ekstraksi menggunakan ether.

Supaya selama menghilangkan zat-zat pencampur tidak terjadi inversi dan

hidrolisa dari sukrosa oleh asam-asam organik yang ada dalam bahan makanan

atau pertanian, maka selama ekstraksi ditambah kalsium karbonat untuk

menetralkannya. Apabila dalam bahan banyak mengandung enzim yang dapat

menghidrolisa gula maka harus ditambahkan merkuri khlorida untuk mencegah

hidrolisa atau ekstraksinya dilakukan dengan alkohol (ethanol 80%) dan sampel

dipanaskan selama 30 menit. Zat penjernih yang dipakai harus mempunyai sifat-

sifat yang menguntungkan yaitu antara lain dapat mengendapkan zat bukan gula

tanpa mengabsorbsi atau memodifikasi zat-zat gula; dalam keadaan berlebihan

tidak mengganggu ketepatan analisa dan hasil pengendapan harus mudah

dipisahkan dari larutannya.

Zat penjernih yang dapat digunakan pada Analisa Karbohidrat:

Timbal asetat, dapat mengendapkan asam organik, asam amino, protein,

polifenol

Alumunium hidroksida, dapat mengendapkan zat koloid

Kieselguh, dapat mengendapkan zat koloid

Campuran merkuri nitrat dan alkali, terutama dipakai untuk mengendapkan

protein yang berasal dari jaringan daging.

Penukar ion juga sering dipakai untuk menghilangkan asam amino yang

terdapat dalam larutan gula.

Poliamida, gelatin ataupun polivinil polipirolidon biasa digunakan untuk

menghilangkan zat warna dalam larutan.

Potasium ferrisianida (K3Fe(CN)6 3 H2O) dan biasanya dicampur dengan

ZnSO4. 7 H2O serta dibuat basis dengan NaOH. Kedua garam tersebut disebut

reagen Carrez I dan II, dipakai untuk mengendapakan protein.

Asam trikhloroasetat atau asam fosfotungstat, dapat digunakan untuk

mengendapkan protein pada umumnya.

Campuran Ba(OH)2 dan ZnSO4, bisa dipakai dalm analisa karbohidrat cara

Somogyi. Zat tersebut untuk mengendapkan protein yang berasal dari susu.

Campuran merkuri nitrat dan alkali, terutama dipakai untuk mengendapkan

protein yang berasal dari jaringan daging.

Asam trikhloroasetat atau asam fosfotungstat, dapat digunakan untuk

mengendapkan protein pada umumnya.

Poliamida, gelatin ataupun polivinil polipirolidon biasa digunakan untuk

menghilangkan zat warna dalam larutan

Penukar ion juga sering dipakai untuk menghilangkan asam amino yang

terdapat pada larutan gula.

Dari sekian banyak zat yang dapat digunakan, timbale asetat merupakan

salah satu bahan yang paling banyak dipakai dalam penjernihan larutan gula yang

akan dianalisa. Hal ini karena sifat timbale asetat yang cukup efektif dalam

mengendapkan asam amino, protein, tannin, asam organik pada umumnya.

D. Uji Kualitatif Karbohidrat

Banyak cara untuk mengetahui adanya karbohidrat dalam suatu bahan antara lain :

Uji Molisch

Karbohidrat oleh asam sulfat pekat akan dihidrolisa menjadi monosakarida

dan selanjutnya monosakarida mengalami dehidrasi oleh asam sulfat menjadi

furfural atau hidroksi metil furfural. Fufural atau hidroksi metil furfural dengan

alfa naftol akan berkondensasi memebntuk senyawa kompleks yang berwarna

ungu. Apabila pemberian asam sulfat pada larutan karbohidrat yang telah diberi

alfa naftol melalui dinding gelas dan secara hati-hati maka warna ungu yang

terbentuk berupa cincin pada batas antara larutan karbohidrat dengan asam sulfat.

HC CH HC CH

H

HC C C = O C C C = O

O O

Furfural Hidroksi metil furfural

OH

Alfa naftol

Dehidrasi pentosa oleh asam akan dihasilkan furfural, dehidrasi heksosa

menghasilkan hidroksi metil furfural dan dehidrasi ramnosa dihasilkan metil

furfural.

Uji Seliwanoff

Peristiwa dehidrasi monosakarida ketosa menjadi furfural lebih cepat

dibandingkan dehidrasi monosakarida aldosa. Hal ini dikarenakan aldosa sebelum

mengalami dehidrasi lebih dahulu mengalami transformasi menjadi ketosa.

Dengan demikian, aldosa akan bereaksi negatif pada uji Seliwanoff. Pada

pengujian ini furfural yang terbentuk dari dehidrasi tersebut dapat bereaksi dengan

resorcinol membentuk senyawa kompleks berwarna merah.

OH

OH

Resorcinol (1,3 dihidroksi benzen)

Sebagai zat untuk dehidrator dapat digunakan asam khlorida 12% atau asam asetat

atau asam sulfat alkoholik.

Uji Anthrone

Karbohidrat oleh asam sulfat akan dihidrolisa menjadi monosakarida dan

selanjutnya monosakarida menalami dehidrasi oleh asam sulfat menjadi furfural

atau hidroksi metil furfural. Selanjutnya senyawaan furfural ini dengan anthrone

(9, 10-dihidro-9-oxoanthracene) membentuk senyawaan kompleks yang berwarna

biru kehijauan.

Uji Benedict

Gula reduksi dangan larutan Benedict (campuran garam kuprisulfat,

Natrium sitrat, Natrium karbonat) akan terjadi reaksi reduksi oksidasi dan

dihasilkan endapan berwarna merah dari kupro oksida.

Uji Barfoed

Larutan Barfoed (campuran cupri asetat dan asam asetat) akan bereaksi

dengan gula reduksi (monosakarida) sehingga dihasilkan endapan merah

kuprooksida. Dalam suasana asam ini gula reduksi yang termasuk dalam golongan

disakarida memberikan reaksi yang sangat lambat dengan larutan Barfoed

sehingga tidak meberikan endapan merah kecuali pada waktu percobaan yang

diperlama. Uji ini untuk penunjukkan gula reduksi monosakarida.

O O

R C H + CuO Cu2O + R C OH

Uji Iodin

Karbohidrat golongan polisakarida akan memberikan reaksi dengan

larutan iodin dan memberikan warna spesifik bergantung pada jenis

karbohidratnya. Amilosa dengan iodin akan berwarna biru; amilopektin dengan

iodin akan berwarna merah violet; glikogen maupun dextrin dengan iodin akan

berwarna merah coklat.

Uji Pembentukan Osason

Aldosa ataupun ketosa dengan fenilhidrasine dan dipanaskan akan

membentuk hidrason atau osason. Senyawa ini terjadi karena gugus aldehid

ataupun ketonik dari karbohidrat berikatan dengan fenolhidrasin. Reaksi antar

senyawaan tersebut merupakan reaksi oksido-reduksi, atom C yang mengalami

reaksi adalah atom C nomer satu dan dua dari aldosa atau ketosa. Fruktosa dan

glukosa menunjukkan osason yang sama.

Uji Fehlings

Larutan Fehlings yang terdiri dari campuran kupri sulfat, Na-K-tartrat dan

Natrium hidroksida dengan gula reduksi dan dipanaskan akan terbentuk endapan

yang berwarna hijau, kuning-orange atau merah tergantung dari macam gula

reduksinya.

E. Uji Kuantitatif Karbohidrat

Cara yang dapat digunakan untuk menentukan banyaknya karbohidrat dalam suatu

bahan antara lain :

Cara Kimiawi

a. Metoda oksidasi dengan kupri :

Metoda ini didasarkan pada peristiwa tereduksinya kupri-oksida menjadi

kupro oksida karena danya gula reduksi. Reagen yang digunakan merupakan

campuran kupri sulfat, Na-karbonat dan asam sitrat (reagen Luft), atau

campuran kupri sulfat dan K-Na-tartrat (reagen Soxhlet). K-Na-tartrat berfungsi

sebagi pencegah terjadinya pengendapan kupri oksida yang ada dalam reagen.

Pada kedua macam reagen tersebut yang berfungsi sebagai oksidator adalah

kuprioksida yang dengan gula reduksi akan mengalami reduksi menjadi

kuprooksida dan mengendap berwarna merah bata. Jumlah endapan kuprooksida

ekuivalen dengan banyaknya gula reduksi yang ada. Kuprooksida yang

terbentuk dapat diketahui dengan menimbang setelah dikeringkan atau dengan

melarutkan kembali dan selanjutnya dititrasi. Selain dengan cara tersebut juga

dapat dengan menentukan kelebihan kuprioksida yang ada dalam larutan

sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi. Selisih kuprioksida

sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi adalah ekuivalen dengan

kuprioksida yang terbentuk. Penentuan gula reduksi dalam larutan yang sering

digunakan adalah sebagai berikut :

Cara Luff Schoorl

Pada penentuan gula cara Luff Schoorl, yang ditentukan bukannya

kuprooksida yang mengendap tetapi dengan menentukan kuprioksida dalam

larutan sebelum direaksikan dengan gula reduksi (titrasi blanko) dan sesudah

direaksikan dengan sampel gula reduksi (titrasi sampel). Penentuannya dengan

titrasi menggunakan Na-tiosulfat. Selisih titrasi blanko dengan titrasi sampel

ekuivalen dengan kuprooksida yang terbentuk juga ekuivalen dengan jumlah

gula reduksi yang ada dalam bahan atau larutan. Reaksi yang terjadi selama

penentuan karbohidrat cara ini mula-mula kuprioksida yang ada dalam reagen

akan membebaskan iod dari garam K-iodida. Banyaknya iod yang dibebaskan

ekivalen dengan banyaknya kuprioksida. Banyaknya iod dapat diketahui

dengan titrasi manggunakan Na-tiosulfat. Untuk mengetahui bahwa titrasi

sudah cukup maka diperlukan indikator amilum. Apabila larutan berubah

warnanya dari biru menjadi putih berarti titrasi sudah selesai. Agar perubahan

warna dari biru menjadi putih dapat tepat maka penambahan amilum diberikan

pada saat titrasi hampir selesai. Setelah diketahui selisih banyaknya titrasi

blanko dan titrasi sampel kemudian dikonsultasikan dengan tabel yang sudah

tersedia yang menggambarkan hubungan antara banyaknya Na-tiosulfat

dengan banyaknya gula reduksi. Pada tabel IV.1 tersebut dapat diketahui

jumlah gula reduksi yang ada dalam larutan.

Reaksi yang terjadi dalam penentuan gula cara Luff dapat dituliskan sebagai

berikut :

Cara Munson-Walker

Penentuan gula cara ini adalah dengan menentukan banyaknya

kuprooksida yang terbentuk dengan cara penimbangan atau dengan

melarutkan kembali dengan asam nitrat kemudian menitrasi dengan tiosulfat.

Jumlah kuprooksida yang terbentuk ekivalen dengan banyaknya gula reduksi

yang ada dalam larutan dan telah disediakan dalam bentuk tabel Hammond

hubungan antara banyaknya kuprooksida dengan gula reduksi. Tiap 1 ml Na-

tiosulfat (39 gram, Na2S2O3 5H2O/1) sesuai dengan 11,259 mg Cu2O

Cara Lane-Eynon

Penentuan gula cara ini adalah dengan cara menitrasi reagen Soxhlet

(larutan CuSO4, K-Na-tartat) dengan larutan gula yang diselidiki. Banyaknya

larutan contoh yang dibutuhkan untuk menitrasi reagen Soxhlet dapat

diketahui banyaknya gula yang ada dengan melihat pada tabel Lane-Eynon.

Agar supaya diperoleh penentuan yang tepat maka reagen Soxhlet perlu

distandarisasi dengan larutan gula standar. Standarisasi ini dikerjakan untuk

menentukan besarnya faktor koreksi dalam menggunakan tabel Lane-Eynon.

Pada titrasi reagen Soxhlet dengan larutan gula akan berakhir apabila warna

larutan berubah dari biru menjadi tidak berwarna. Indikator yang digunakan

pada cara ini adalah methilen biru.

Contoh perhitungan :

R COH + CuO Cu2O + R COOH

H2SO4 + CuO CuSO4 + H2O

CuSO4 + 2 KI CuI2 + K2SO4

2 CuI2 Cu2I2 + I2

I2 + Na2S2O3 Na2S4O6 + NaI

I2 + amilum = biru

Sebanyak 10 ml regaen Soxhlet misalnya memerlukan titrasi gula standar

(konsentrasi 2,5 mg/ml) sebanyak 21 ml. Jadi total gula reduksi yang

diperlukan untuk mereduksi 10 ml reagen Soxhlet adalah 21 x 2,5 mg = 52,5

mg. Padahal pada tabel menunjukkan untuk 21 ml larutan gula invert tertera

51,0 mg, jadi faktor korekjsinya adalah 52,5 : 51,0 = 1,03.

Bila pada titrasi sampel memerlukan 20 ml maka dalam bahan terdapat gula

invert sebanyak 50,9 x 1,03 = 52,427 mg.

Dalam 100 ml larutan sampel terdapat gula invert = 100/20 x 52,427 mg

= 262,135 mg

Tabel IV.1 Penentuan glukosa, fruktosa, dan gula invert dalam suatu bahan **)

ml 0,1 N

Thio.

*)

Glukosa, fruktosa, gula

invert

mg C6H12O6

ml 0,1 N

Thio.

*)

Glukosa, fruktosa, gula

invert

mg C6H12O6

Δ Δ

1. 2,4 2,4 13. 33,0 2,7

2. 4,8 2,4 14. 25,7 2,8

3. 7,2 2,5 15. 38,5 2,8

4. 9,7 2,5 16. 38,5 2,9

5. 12,2 2,5 17. 44,2 2,9

6. 14,7 2,5 18. 47,1 2,9

7. 17,2 2,6 19. 50,0 3,0

8. 19,8 2,6 20. 53,0 3,0

9. 22,4 2,6 21. 56,0 3,1

10. 25,0 2,6 22. 59,1 3,1

11. 27,6 2,7 23. 62,0 -

12. 30,3 2,7 24. - -

*) ml 0,1 N Thio = titrasi blanko – titrasi sampel

**) analisa dengan metoda Luff Schoorl

b. Metoda oksidasi dengan larutan ferrisianida alkalis

Cara ini berdasarkan peristiwa tereduksinya ferrisianida menjadi

ferrosianida oleh senyawaan gula reduksi. Jumlah ferrosianida yang terbentuk

ekuivalen dengan jumlah gula reduksi dalam sampel. Ferrosianida yang

terbentuk dapat dihitung sebagai selisih atau perbedaan antara ferrisianida yang

ditambahkan dengan jumlahnya setelah terjadi reaksi reduksi. Reaksinya dapat

dituliskan sebagai berikut :

2 K3Fe (CN)6 + 2 KI 2 K4Fe(CN)6 + I2

Bila ke dalam campuran zat yang dianalisa tersenut diberikan ion Zn++

misalnya dalam bentuk Zink sulfat maka ferrosianida yang terbentuk akan

diendapkan sebagai senyawaan kompleks yang reaksinya dapat dituliskan

sebagai berikut :

2 K4Fe (CN)6 + 3 ZnSO4 K2Zn3 [ Fe(CN)6 ]2 + 3 K2SO4

endapan

Menentukan gula reduksi cara ini dapat ditentukan berdasarkan jumah

iodin yang dibebaskan dengan menitrasi menggunakan Natrium-thiosulfat

standar. Jumlah iodine ekuivalen dengan gula dan dapat dihitung berdasarkan

jumlah thio yang dipergunakan untuk titrasi. Bila diketahui tiap milliliter thio

standar ekuivalen dengan sejumlah gula reduksi (berdasar percobaan

standarisasi) maka mudah diketahui dan dihitung gula yang ada dalam sampel.

Titrasi ini mempergunakan indicator amilum dimana akhir titrasi ini adalah

tepat hilangnya warna biru dari iod-amilum.

Cara lain untuk menentukan jumlah gula cara oksidasi dengan ferrisianida

adalah dengan menentukan jumlah ferrosianida dengan ceric sulfat

menggunakan indicator phenantroline atau ditentukan secara kalorimetri.

Selain itu, juga dapat dilakukan dengan titrasi menggunakan larutan gula dan

indicator yang dipakai adalah asam pikrat atau methilen biru. Pada cara ini

digunakan pula titrasi standarisasi menggunakan larutan gula standar terhadap

ferrisianida yang digunakan.

Penentuan gula dengan cara oksidasi dengan larutan ferrisianida alkalis

lebih baik daripada oksidasi dengan larutan kupri sulfat karena reagen

ferrisianida dalam alkali lebih stabil dan ferrisianida yang terbentuk lebih stabil

daripada kuprooksida. Kelemahan cara ini adalah ferrisianida mudah direduksi

oleh senyawaan reduksi baik gula maupun bukan gula sehingga

penunjukkannya kurang tepat.

c. Metoda iodometri

Iodin dalam medium yang alkalis dapat terkonversi dengan cepat menjadi

hipoiodida. Hipoiodida dapat mengoksidasi aldosa, sedangkan untuk ketosa

hanya sedikit yang mengalami oksidasi. Larutan sampel ditambah iodine encer

dan NaOH kemudian dicampur secepatnya (karena iodin dapat berubah

menjadi iodat dan tidak reaktif terhadap gula dalam larutan alkalis). Setelah itu

diasamkan dengan asam khlorida atau asam sulfat dan dibiarkan beberapa

menit. Kemudian kelebihan iodine dititrasi dengan larutan thiosulfat standar.

Reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut :

Titrasi sampel

O O

R – C – H + I2 + 3 NaOH R – C – ONa + 2 NaI + 2 H2O

I2 (sisa) + 2 Na2S2O3 Na2S4O6 + 2 NaI

I2 + amilum iod-amilum (biru)

Titrasi blanko

I2 (total) + 2 Na2S2O3 Na2S4O6 + 2 NaI

Dalam keadaan optimal dan kondisi terkontrol hanya = 1 % dari ketosa

yang ada dalam sampel teroksidasi sehingga tidak mempengaruhi dalam

penentuan aldosa. Untuk memperbesar ketelitian penentuan cara ini maka

adanya zat yang dapat mempengaruhi harus dihilangkan misalnya etanol,

aseton, mannitol, gliserin, Na laktat, Na format, dan Urea. Zat – zat tersebut

dapat bereaksi dengan iodin.

Cara Ensimatis

a. Penentuan glukosa dan fruktosa

Dasar penentuan cara ini adalah glukosa dan fruktosa difosforilasikan

menjadi glukosa-6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P) dengan bantuan

enzim heksokinase (HK) dan Adenosin-5-trifosfat (ATP).

1. Glukosa + ATP G-6-P + ADP

2. Fruktosa + ATP F-6-P + ADP

Dengan adanya enzim glukosa-6-fosfat dehidrogenase (G6P-DH), G-6-P

dioksidasi oleh Nikotinamida Adenin Dinukleotida (NADP) menjadi glukonat-

6-fosfat

Jumlah NADPH yang terbentuk setara dengan banyaknya glukosa yang bereaksi

sehingga NADPH inilah yang diukur dengan spektrofotometer pada serapan

sinar dengan panjang gelombang 334 atau 340 atau 365 nm. Setelah reaksi (3)

selesai, F-6-P perlu diubah menjadi G-6-P dengan bantuan enzim fosfoglukosa

isomerasi (PGI)

Glukosa-6-fosfat dengan NADP membentuk glukonat-6-fosfat dan NADPH.

Jumlah NADPH yang terbentuk setara dengan jumlah fruktosa yang ada.

b. Penentuan laktosa dan galaktosa

Dasar penentuan laktosa dan galaktosa dengan enzim adalah laktosa dapat

dihidrolisis menjadi glukosa dan β galaktosa oleh enzim β galaktosidase dan air.

Selanjutnya β galaktose dioksidasi oleh Nikotinamida Adenin-Dinukleotida

(NAD) menjadi asam galatonat dengan bantuan enzim galalosa dehidrogenase

(GAL-DH)

Jumlah NADH yang terbentuk setara dengan jumlah laktosa yang ada. Kenaikan

jumlah NADH diukur dari serapan sinar pada panjang gelombang 334,340 atau

365 nm

Β-galaktosidaseLaktosa + H2O Glukosa + β galaktosa

GAL - DHβ Galaktosa + NAD Asam galatonat + NADH + H+

G6P-DH3. Glukosa-6-fosfat + NADP Glukosa-6-fosfat + NADPH + H+

PGI4. Fruktosa-6-fosfat Glukosa-6-fosfat

Cara Khromatografi

Penentuan karbohidrat dengan cara khromatografi adalah dengan

mengisolasi dan mengidentifikasi karbohidrat dalam suatu campuran. Isolasi

karbohidrat ini berdasarkan prinsip pemisahan suatu campuran berdasarkan atas

perbedaan distribusi rationya pada fase tetap dengan fase bergerak. Fase bergerak

dapat berupa zat cair atau gas, sedangkan fase tetap dapat berupa zat padat atau

zat cair. Apabila zat padat sebagai fase tetapnya maka disebut khromatografi

serapan, sedang bila zat cair sebagai fase tetapnya disebut khromatografi partisi.

Dalam khromatografil ekstrak yang akan ditentukan karbohidratnya perlu

dimurnikan dan dijernihkan. Selain itu senyawa-senyawa anorganik yang ada

harus dihilangkan misalnya dengan jalan melewatkan ekstrak di dalam suatu alat

penukar ion (ion exchanger). Perlakuan ini dikerjakan untuk mencegah terjadinya

tailing misalnya pada khromatografi kertas atau khromatografi lapis tipis. Tailing

menyebabkan kesukaran dalam analisa kuantitatif selanjutnya. Untuk mengurangi

tailing dapat dikerjakan dengan nelarutkan kembali zat-zat yang terabsorbsi pada

zat penyerap (absorbent) dengan mencuci menggunakan asam. Selain itu dengan

melakukan elusi terhadap pelarut secara bertahap dengan fase bergerak (mobil)

yaitu pelarut yang lebih polar.

Di dalam analisa khromatografi kertas atau lapis tipis diukur besarnya R f

(Retardation factor) tiap komponen karbohidrat yaitu perbandingan jarak

perpindahan molekul zat dengan jarak perpindahan pelarut,

Rf = Jarak perpindahan molekul zat

Jarak perpindahan pelarut

Harga Rf tiap jenis gula adal tertentu untuk suatu perlakuan yang sama. Nilai R f

suatu jenis gula dipengaruhi oleh berbagai factor antara lainmacam zat pelarut,

suhu, ukuran bejana, macam fase tetap dan sifat zat yang dianalisa. Dengan

demikian dalam mencantumkan harga Rf dari suatu zat harus dicantumkan pula

kondisi analisanya.

Salah satu contoh penentuan karbohidrat yang akan diuraikan adalah

khromatografi kertas.

a. Khromatografi kertas

Penentuan karbohidrat cara ini merupakan cara yang sederhana yaitu

menggunakan kertas yang tersusun oleh selulosa murni sebagai penyokong fase

tetap (air). Selulosa merupakan zat inert sehingga dapat digunakan sebagai zat

penyangga. Kertas yang digunakan untuk khromatografi merupakan ikatan

serabut-serabut selulosa yang saling berhubungan dengan ikatan hydrogen, dan

di antara sel terdapat air sebanyak kurang lebih 2 – 5%. Kertas yang dipakai

adalah kertas Whatman yang dapat dibedakan menjadi 3 berdasarkan kecepatan

merambat zat yaitu cepat, sedang, dan lambat. Biasanya dipakai kertas

whatman dengan kecepatan sedang yaitu whatman no. 1. Kertas yang akan

digunakan harus disimpan dalam tempat yang kering, bersih dan bebas dari gas

atau uap terutama yang mempunyai affinitas tinggi terhadap selulosa serta

dalam ruang yang tertutup.

Pada garis besarnya penentuan karbohidrat secara kromatografi kertas

dilakukan sebagai berikut :

kawat pengembang

kertas

botol pengembang

spot

pelarut

Pertama kali dibuat potongan kertas ukuran tertentu sesuai dengan

kebutuhan. Sampel yang telah disiapkan diteteskan pada salah satu ujung kertas

dengan menggunakan mikro pipet sehingga diperoleh spot yang bulat. Agar

diperoleh spot yang cukup besar konsentrasinya maka penetesan sampel

dilakukan 3 – 4 kali dengan cara penetesan berikutnya setelah penetasa pertama

sudah kering. Spot yang terbentuk harus sekecil mungkin karena spot yang

besar akan menyebabkan pemisahan tidak sempurna atau terjadi tailing.

Selanjutnya kertas dimasukkan ke dalam wadah yang berisi zat pelarut

tertentu sehingga kedudukan kertas tegak lurus dan spot berada kurang lebih 1

cm di atas permukaan pelarut. Pelarut yang digunakan dapat berbentuk larutan

murni atau campuran. Untuk penentuan gula-gula sederhana pelarut yang

dipakai adalah campuran butanol : asetat : air atau propanol : asam asetat : air

atau asam asetat : pyridin : air dengan perbandingan 4 : 1 : 5. Campuran pelarut

tersebut pada umumnya terdiri atas pelarut organic air dan asam atau basa.

Setelah wadah ditutup dan dibiarkan beberapa lama maka pelarut akan

merambat pada kertas sampai pada ujung kertas yang lain untuk itu perlu diberi

tanda batas akhir perambatan pelarut pada kertas. Apabila pelarut sudah

merambat sampai tanda tersebut maka kertas diambil dan dikeringkan. Perlu

dicatat pada pemilihan pelarut yang digunakan sebaiknya tidak memberi reaksi

warna pada kertas. Agar supaya antara fase tetap, fase bergerak dan molekul zat

yang akan dipisahkan.

Setelah kertas menjadi menjadi kering maka untuk mengetahui adanya

pemisahan antara zat-zat yang ada perlu diidentifikasi. Deteksi dan identifikasi

gula-gula dalam kertas khromatografi dapat dilakukan dengan cara fisis atau

kimiawi. Secara fisis dapat dilakukan dengan menyinari kertas dengan sinar

ultraviolet dengan panjang gelombang sinar 254 nm – 370 nm. Dapat pula

dengan cara kimiawi yaitu dengan menyemprotkan larutan kimia tertentu

misalnya anilinphtalet atau m-phenyleneidamine atau perak nitrat untuk gula

reduksi. Untuk gula non reduksi dapat menggunakan naphotoresorsinol dalam

asam fosfat. Larutan phloroglusinol dan asam khlorida dapat digunakan untuk

aldosapentosa (memberikan warna violet); ketopentosa (hijau tua); ketoheksosa

(kuning coklat) dan dengan methyl pentose memberikan warna hijau. Selain

larutan tersebut di atas pula dipakai uap iodin. Reagen kimia tersebut pada

kertas d ruang asam karena dapat mengganggu kesehatan operatornya.

Kemudian setelah dikeringkan akan timbul noda berwarna dan dapat dihitung

Rf-nya dan dapat ditentukan macam gulanya sesuai dengan standar gula yang

digunakan.

Cara Optik (fisis)

Penentuan karbohidrat dengan cara fisis antara lain dengan menentukan

indeks biasnya menggunakan refraktrometer. Ada beberapa model refraktometer

yang dapat dipakai antara lain refraktometer Abbe. Alat ini mempunyai

keunggulan antara lain :

1. mempunyai skala indeks bias cukup lebar intervalnya, yaitu antara 1,30 – 1,75

2. sampel yang digunakan sangat sedikit, yaitu beberapa tetes

3. ketelitiannya sampai ± 0,0002.

Indeks bias suatu zat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu panjang

gelombang sinar dan suhu pengukuran. Indeks bias dapat digunakan untuk

identifikasi dan determinasi kemurnian suatu bahan dan komposisi suatu

campuran homogen yang diketajui konstituennya. Indeks bias dinyatakan dengan

notasi artinya : pengukuran indeks bias pada suhu 20OC dengan menggunakan

sinar Natrium sebagai sumber sinar monokromatis.

a. Penentuan karbohidrat dengan Polarimeter

Karbohidrat bersifat optis aktif sehingga dapat dianalisa secara polarimetri

hal ini disebabkan karena molekul penyusun karbohidrat mempunyai susunan

yang asimetri sehingga mempunyai kemampuan untuk memutar bidang sinar

terpolarisasi. Putaran optic dapt diukur dengan menggunakan

polarimeter/sakharimeter. Analisa gula/karbohidrat secara polarimetri

mempunyai keuntungan antara lain sampel tidak mengalami kerusakan dan

dapat dilakukan dengan cepat.

Untuk memperoleh hasil yang diteliti harus diperhatikan :

a) Larutan harus jernih dan tidak berwarna

b) Larutan tidak mengandung bahan asing yang bersifat optis aktif, sehingga

perlu penjernihan sebelumnya

c) Konsentrasi sampel pada daerah yang optimum untuk alat yang

bersangkutan, tidak terlalu pekat ataupun encer.

Pada penentuan gula cara polarimetri mendasarkan pada hukum Biot yaitu

kapasitas rotasi untuk tiap individu gula adalah sebanding dengan konsentrasi

larutan dan panjang cairan dalam tabung, dan dapat dirumuskan sebagai

berikut :

[ α ] : putaran/rotasi spesifikt : suhu pengukuran (C)

D : sinar natrium (589 nm)α : sudut putar yang diamatiC : konsentrasi ( g sampel dalam 100 ml pelarut )I : panjang tabung (dm)

b. Penentuan Sukrosa

Penentuan sukrosa dapat langsung ditentukan jumlahnya dengan cara

Polarimeter atau dengan refraktometer seperti yang telah diuraikan pada pasal

di depan. Selain itu dapat dianalisa dengan cara kimia yaitu dengan

menentukan gula reduksi yang dihasilkan setelah sukrosa dihidrolisa denagan

asam atau dengan enzim. Penentuannya dapat secara Luff Schoorl, Munson-

Walker, iodometri atau cara enzimatis atau spektrofotometri.

Hidrolisa sukrosa akan dihasilkan 2 mol gula reduksi yang berupa fruktosa

dan glukosa yang dapat dituliskan sebagai berikut :

Setelah diketahui jumlah gula reduksi yang dihasilkan dari hidrolisa sukrosa

maka dapat dihitung jumlah sukrosa yaitu dengan mangalikan dengan suatu

faktor sebesar 0,95. Faktor ini diperoleh dari perbandingan BM sukrosa

dengan BM dua molekul gula reduksi

c. Penentuan Pati

Pati disusun oleh amilosa dan amilopektin. Amilosa merupakan

polisakarida yang linier sedangkan amilopektin adalah yang bercabang. Tiap

jenis pati tertentu disusun oleh kedua fraksi tersebut dalam perbandinga yang

berbeda-beda. Pati jenis jenis yang rekat (addesif) amilosa pada pati berkisar

20-30%. Pati pada beras dan sorgum (cantel) sebagian terbesar penyusunnya

adalah amilopektin. Pemisahan antara fraksi amilosa dan amilopektin dapat

menggunakan elektrodialisa atau dengan n-butanol atau thymol. Amilopektin

larut dalam n-butanol sedangkan amilosa tidak larut. Amilosa memberikan

C6H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

Sukrosa Fruktosa Glukosa

BM = 342 BM = 180 BM = 180

Faktor konversi = BM sukrosa = 342 = 0,95 2 BM gula reduksi 2 x 180

warna biru dengan larutan iodine dan amilopektin memberikan warna merah

violet.

Untuk penentuan kadar pati dalam suatu bahan dapat dikerjakan dengan

menghidrolisa pati dengan asam atau ensim sehingga diperoleh gula reduksi.

(C6H10O5)m + m H2O m C6H12O6

pati m glukosa

BM = 162 m BM = 180 m

Setelah diketahui jumlah gula reduksi hasil hidrolisa pati tersebut maka dapat

dihitung jumlah pati yaitu dengan mengalikan dengan suatu faktor konversi

sebesar 0,90. Faktor konversi ini diperoleh dari perbandingan berat molekul

pati dengan jumlah berat molekul gula reduksi yang dihasilkan.

Faktor konversi = BM pati

m . BM gula reduksi

= m x 162

m x 180

= 0,90

Selain cara di atas, penentuan pati dapat ditentukan dengan cara mula-

mula pati diekstraksi dan didispersikan menjadi suatu larutan koloidal hingga

terpisah dari zat lainnya. Pati yang terdapat dalam dispersi tersebut dapat

ditentukan dengan jalan pengendapan dan dilakukan penimbangan. Pati

bersifat tidak larut dalam air sehingga mudah dipisahkan dari zat lainnya. Pada

bahan yang mengandung lemak dan protein yang tinggi pati dapat direaksikan

lebih dahulu dengan alkali sehingga membentuk senyawa alkohol kompleks

yang bersifat tidak larut dan secara langsung dipisahkan dan ditimbang. Untuk

bahan yang berasal dari tanaman yang banyak mengandung berbagai macam

polisakarida lain, ekstraksinya dijalankan dengan dua tahap yaitu pertama

dengan alkohol etanol (etanol 80%), kedua dengan asam perklorat.

Selanjutnya pati terekstrak diendapkan dengan iodin dan akhirnya senyawa

kompleks pati-iodin ini didekomposi dengan alkali. Penentuan selanjutnya

dapat dikerjakan dengan cara kimia atau secara gravimetri.

d. Penentuan serat kasar

Serat kasar adalah senyawaan yang tidak dapat dicerna dalam organ

pencernaan manusia maupun binatang. Dalam analisa penentuan serat kasar

diperhitungkan banyaknya zat-zat yang tak larut dalam asam encer ataupun

basa encer dengan kondisi tertentu. Langkah-langkah yang dilakukan dalam

analisa adalah:

Defatting, yaitu menghilangkan lemak yang terkandung dalam sampel

menggunakan pelarut lemak.

Digestion. Terdiri dari dua tahap yaitu pelarutan dengan asam dan

pelarutan dengan basa. Dilakukan dalam keadaan tertutup pada suhu

terkontrol (mendidih) dan sedapat mungkin dihilangkan dari pengaruh

luar.

Penyaringan harus segera dilakukan setelah digestion selesai karena

penundaan penyaringan dapat mengakibatkan lebih rendahnya hasil analisa

karena terjadi perusakan serat lebih lanjut oleh bahan kimia yang dipakai.

Serat kasar sangat penting dalam penilaian kualitas bahan makanan karena

angka ini merupakan indeks dan menentukan nilai gizi bahan makanan

tersebut. Kandungan serat kasar dapat digunakan untuk mengevaluasi suatu

proses pengolahan sehingga persentase serat kasar dapat dipakai untuk

menentukan kemurnian bahan atau efisiensi suatu proses.