Karakteristik Bakteri Heterotrofik Penghasil Enzim Amilolitik Diperairan Situ

Cibuntu, Cibinong Bogor

(Heterotroph Bacteria Identification Which Produced Amylolytic in Situ Cibuntu

Freshwaters, Cibinong, Bogor)

Rismawati1, Tri Saptari Haryani

1, S. Y. Srie Rahayu

2

1)Program Studi Biologi, FMIPA-Universitas Pakuan Bogor

Abstrak: Air memegang peranan penting dalam kehidupan manusia dan juga

makhluk hidup lainnya, antara lain air dapat digunakan untuk minum, memasak,

mencuci, dan mandi. Pencemaran air dapat disebabkan oleh berbagai hal, salah

satunya adalah akibat adanya limbah organik. Bakteri heterotrofik merupakan bakteri

yang dapat memanfaatkan dan mendegradasi senyawa organik kompleks menjadi

senyawa sederhana yang digunakan sebagai sumber energi bakteri itu sendiri.

Amilase adalah enzim yang memiliki kemampuan untuk menghidrolisis amilum

menjadi molekul yang lebih sederhana. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

karakterisasi fenotipik dan mengidentifikasi isolat bakteri heterotrofik penghasil

enzim amilolitik dari perairan Situ Cibuntu, Cibinong. Metode pengujian dilakukan

secara makroskopis secara mikroskopis meliputi uji Gram, uji kapsul dan uji spora,

sedangkan morfologi bakteri di lakukan dengan pengamatan secara makroskopis

meliputi warna koloni, elevasi dan permukaan koloni. Pengujian secara molekuler

dilakukan menggunakan alat PCR. Identifikasi bakteri heterotrofik yang diuji

berjumlah 11 isolat, bakteri dengan kode isolat TSi5 merupakan isolat bakteri tidak

pathogen dengan hasil uji gram (+), uji kapsul (-) dan uji spora (-).

Kata kunci: Karakteristik Bakteri Heterotrofik, Bakteri Heterotrofik, Enzim

Amilolitik.

PENDAHULUAN

Air memegang peranan penting

dalam kehidupan manusia dan juga

makhluk lainnya, antara lain air dapat

digunakan untuk minum, memasak,

mencuci, dan mandi. (Effendi, 2003).

Telah diketahui beberapa bakteri

digunakan untuk mendeteksi tingkat

pencemaran di perairan. Pemantauan

kualitas air secara periodik dan

perbaikan pemanfaatan lahan di

wilayah perairan sangat diperlukan

guna memelihara kesehatan

masyarakat yang berada di sekitar

lingkungan perairan. Terdapat

kelompok bakteri heterotrofik yang

berperan penting dalam sistem

perairan karena kemampuan aktivitas

metabolismenya, baik pada lingkungan

aerob ataupun anaerob (Sigee, 2005).

Bakteri heterotrofik merupakan

golongan bakteri yang mampu

memanfaatkan dan mendegradasi

senyawa organik kompleks baik yang

mengandung unsur C, H, dan N

(Parwanayoni, 2008). Sutiknowati dan

Ruyitno (2008) menyatakan bahwa

bakteri heterotrofikdapat digunakan

sebagai salah satu indikator kualitas

kesuburan suatu perairan, karena

kemampuan menguraikan senyawa

organik. Jika kelimpahan bakteri

heterotrofik dalam suatu perairan

tinggi dapat indikasi bahwa dalam

suatu perairan terdapat cemaran bahan

organik.

BAHAN DAN METODE

Peralatan yang digunakan pada

penelitian ini antara lain: cawan petri,

autoclave, tabung reaksi, botol schott,

timbangan analitik, tabung eppendorf,

pipet volumetriks, vorteks,

kulkas,oven dan perangkat PCR.

Bahan yang digunakan adalah

isolat bakteri heterotrofik dari perairan

Situ Cibuntu sebanyak 11 isolat; bahan

media untuk pertumbuhan bakteri

heterotrofik: tripton, glucose, yeast,

agar, dan aquades, seperangkat reagen

untuk identifikasi jenis bakteri

heterotrofik secara makroskopis,

mikroskopis, maupun reagen untuk

reaksi molekular isolat bakteri.

Prosedur Penelitian

Proses ini dilakukan untuk

menghindari adanya mikroorganisme

dari peralatan yang akan digunakan.

Proses sterilisasi dilakukan secara

basah menggunakan autoclave dengan

suhu 1210C, tekanan 1 atm selama 15

menit untuk pembuatan media, dan

sterilisasi secara kering menggunakan

oven dengan suhu 800C selama 2 jam

untuk mensterilkan peralatan yang

terbuat dari gelas dan baja

(Hadioetomo, 1985).

Peremajaan Isolat Bakteri

Heterotofik

Proses ini dilakukan untuk

meremajakan kembali bakteri

heterotrofik yang akan digunakan

dalam pengujian. Peremajaan bakteri

menggunakan media NA. Diambil

sedikit biakan bakteri heterotrofik

kemudian digoreskan pada media NA

miring dan diinkubasi pada suhu

kamar selama 24 jam. Setelah

diinkubasi selama 24 jam, biakan siap

digunakan untuk pengujian

karakteristik fenotipik bakteri.

Pengujian Karakteristik

Fenotipik Isolat Bakteri

Heterotrofik

Pengujian karakterisasi fenotipik

bakteri heterotrofik dilakukan dengan

beberapa pengujian diantaranya

pengamatan morfologi atau

makroskopis koloni bakteri berupa

warna, bentuk, elevasi, permukaan,

tepi, ukuran dan karakteristik optik;

dan karakter mikroskopis koloni

bakteri berupa bentuk sel, reaksi

Gram, reaksi endospora dan uji kapsul.

Pengujian karakterisasi fisiologis

meliputi: UjiIndole, MR-VP, katalase,

Uji motilitas dan uji oksidase. Isolat

bakteri yang sudah diketahui

karakternya kemudian dicocokkan

dengan buku panduan Bergey’s

Manual of Determinative Bacteriology

9th Edition (Holt, et al., 2000).

Amplifikasi PCR

Reaksi PCR menggunakan alat

PCR (Eppendorf German) dengan

predenaturasi pertama pada suhu 94C

selama 90 detik, dilanjutkan dengan 30

siklus yang terdiri dari denaturasi pada

suhu 95C selama 30 detik,

penempelan primer pada suhu 50C

selama 30 detik dan ekstensi pada suhu

72C selama 90 detik. Setelah 30

siklus selesai, diikuti fase

pemanjangan pada suhu 72C selama 5

menit dan pendinginan pada suhu 4C

selama 20 menit (Promega 2012).

Hasil amplifikasi PCR (produk pcr)

dielektroforesis menggunakan agarose

gel 0,8%, dengan volume produk PCR

per lane: 1 uL, voltase elektroforesis

100 V, waktu elektroforesis 25 menit

dan volume 1Kb DNA ladder per lane:

1 uL. Gel hasil elektroforesis direndam

dalam larutan ethidium bromida

selama 30 menit. Gel didokumentasi

menggunakan gel documentation

system. Hasil amplifikasi PCR daerah

sekuen 16S ribosomal DNA bakteri

menghasilkan pita DNA tunggal

dengan ukuran 1500 bp (Promega,

2012). Selanjutnya dipurifikasi dan di

cycle seqencing dengan primer 27F

(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-

3') dan 1492R (5'-

TACGGYTACCTTGTTACGACTT-

3').

Analisis sekuensing dilakukan di

laboratorium First Base (Malaysia).

Data hasil sekuensing selanjutnya di

trimming dan di assembling dengan

program BioEdit dan selanjutnya

dikonversi dalam bentuk FASTA

format. Hasil sekuensing DNA dalam

bentuk FASTA format selanjutnya di

BLAST untuk mencari homologi

secara on line di pusat database DNA

di NCBI.

PARAMETER YANG

DIAMATI

Perbedaan karakter secara

morfologi dan fisiologi dari 11 isolat

bakteri heterotrofik dengan melihat

morfologi bakteri yang disesuaikan

dengan buku Bergey’s Manual of

Determinative Microbiology.

Identifikasi dilakukan dengan cara

melihat bentuk koloni dan morfologi

sel bakteri, sedang pengujian secara

mikroskopis meliputi uji morfologi sel

dan uji fisiologi sel bakteri

Identifikasi isolat bakteri

heterotrofik dilakukan di

mikrobiologi LIPI dengan

metode coloni PCR dilakukan

secara molekuler berdasarkan

analisis genetik secara parsial.

(Pitcher et al., 1990; Modified),

ANALISIS DATA Data yang telah diperoleh dari

berbagai pengujian yang telah

dilaksanakan kemudian dilakukan

analisis data secara deskriptif untuk

mengetahui karakterisasi bakteri

heterotrofik hingga tingkat genera dan

berpedoman pada buku panduan

Bergey’s Manual Of Determinative

Bacteriology 9th

Edition (Holt, et al.,

2000).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Karakteristik Morfologi

Bakteri Heterotrofik

Dari hasil identifikasi 11 isolat

bakteri heterotrofik secara morfologi

diperoleh dua kelompok bakteri yaitu

basilus dan kokus yang tumbuh pada

media Nutrient Agar. Identifikasi

dilakukan secara morfologi meliputi

bentuk dan elevasi koloni, bentuk sel,

uji Gram, uji spora dan uji kapsul.

Hasil selengkapnya dapat dilihat pada

Tabel 3 dan Tabel 4.

Dari Tabel 3 tampak bahwa

warna koloni secara umum berwarna

putih, kecuali isolat TSi5 berwarna

kuning bening dan TSi2 berwarna

transparan. Bentuk koloni tumpul,

elevasi koloni cekung, bentuk sel

didominasi bentuk basil (batang). Hal

ini sesuai dengan pendapat Hatim, W.

(2013), bahwa Situ Cibuntu

didominasi oleh kelompok bakteri

berbentuk batang dikarenakan pH air

berkisar antara 5,5 - 5,8 dan

merupakan pH optimum untuk

pertumbuhan bakteri heterotrofik.

Dari hasil pengujian secara

mikroskopis diperoleh hasil seperti

pada Tabel 4, dimana isolat dengan

kode isolat TSi5 memberikan hasil

Pewarnaan Gram (+), Pewarnaan

Spora (-) dan Pewarnaan Kapsul (-),

berarti isolat TSi5 merupakan isolat

yang bersifat tidak pathogen,

mendominasi diperairan Situ Cibuntu,

dan mampu menghasilkan enzim

amylase yang dapat mengkatalisis

proses hidrolisis pati menjadi senyawa

sederhana yang dimanfaatkan untuk

proses metabolisme bakteri itu sendiri.

Hal ini sesuai dengan pendapat Inggit,

dkk (2013) dan Hatim, W (2013)

bahwa isolat TSi5 mampu membentuk

zona hambat sebesar 5cm dan

menghasilkan enzim amilase.

Hasil Identifikasi Sekuen DNA

Sampel Bakteri Heteroprofik

Isolat kode TSi5 teridentifikasi sebagai

Micrococcus luteus. Sekuen isolat

kode TSi5 dianalisis menggunakan

BLAST di NCBI menunjukkan

homologi dengan max identity 100 %

terhadap Micrococcus luteus.

Karakteristik Molekuler Bakteri

Heterotrofik

Dari hasil pengujian karakteristik

morfologi diperoleh isolat TSi5 merupakan

isolat yang paling efektif menghasilkan

enzim amilase, oleh karena itu isolat TSi5

yang di uji secara molekuler untuk

menentukan jenis bakterinya

menggunakan alat PCR yang dilakukan di

laboratorium Mikrobiologi LIPI Cibinong,

Bogor.

Gambar. 1. Isolat Bakteri Heterotrofik

Amplifikasi PCR Hasil amplifikasi PCR daerah sekuen

16S ribosomal DNA bakteri divisualisasi

menggunakan gel documentation system

sebagai berikut :

Dengan adanya hasil dokumentasi

agarose, maka dapat diketahui bahwa

DNA Micrococcus teramaplifikasi dengan

sempurna dan menunjukkan berat bakteri

tersebut sebesar 1500 bp . Dari hasil

tersebut DNA yg teramplifikasi dapat

diartikan DNA tersebut sesuai dengan

praimer spesifik yg digunakan, sehingga

bakteri dapat teridentifikasi sebangai

bakteri Micrococcus luteus spesifik yaitu

dari praimer.

Hasil Identifikasi Sekuen DNA

Sampel Bakteri Heteroprofik

Isolat kode TSi5 teridentifikasi

sebagai Micrococcus luteus. Sekuen isolat

kode TSi5 dianalisis menggunakan BLAST

di NCBI menunjukkan homologi dengn

max identity 100 % terhadap Micrococcus

luteus. Klasifikasi isolat bakteri tersebut

sebagai berikut (Chen et al., 2009; Wieser,

et al., 2009):

Kingdom : Bacteria

Filum : Actinobacteria

Class : Actinobacteria

Subclass : Actinobateridae

Ordo : Actinomycetatles

Famili : Micrococcaceae

Genus : Micrococcus

Spesies : Micrococcus luteus.

Micrococcus luteus merupakan

bakteri Gram positif, koloni berbentuk

bulat dan berwarna kuning terang pada

medium Nutrient Agar dan bersifat aerobe

obligat. Micrococcus luteus ditemukan di

tanah, air, udara dan sebagian merupakan

flora normal kulit mamalia. Micrococcus

luteus bersifat koagulase negative, sensitif

pada basitrasin dan secara taksonomi

berkerabat dekat dengan Micrococcus

endophyticus (Chen et al.,2009; Wieser, et

al., 2009).

Karakteristik Morfologi Bakteri

Heterotrofik

Dari hasil identifikasi 11 isolat

bakteri heterotrofik secara morfologi

diperoleh dua kelompok bakteri yaitu

basilus dan kokus yang tumbuh pada

media Nutrient Agar. Identifikasi

dilakukan secara morfologi meliputi

bentuk dan elevasi koloni, bentuk sel, uji

Gram, uji spora dan uji kapsul. Hasil

selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 3

dan Tabel 4.

Dari Tabel 3 tampak bahwa warna

koloni secara umum berwarna putih,

kecuali isolat TSi5 berwarna kuning bening

dan TSi2 berwarna transparan. Bentuk

koloni tumpul, elevasi koloni cekung,

bentuk sel didominasi bentuk basil

(batang). Hal ini sesuai dengan pendapat

Hatim, W. (2013), bahwa Situ Cibuntu

didominasi oleh kelompok bakteri

berbentuk batang dikarenakan pH air

berkisar antara 5,5 - 5,8 dan merupakan

Gambar. 3. 17

pH optimum untuk pertumbuhan bakteri

heterotrofik.

Dari hasil pengujian secara

mikroskopis diperoleh hasil seperti pada

Tabel 4, dimana isolat dengan kode isolat

TSi5 memberikan hasil Pewarnaan Gram

(+), Pewarnaan Spora (-) dan Pewarnaan

Kapsul (-), berarti isolat TSi5 merupakan

isolat yang bersifat tidak pathogen,

mendominasi diperairan Situ Cibuntu, dan

mampu menghasilkan enzim amylase yang

dapat mengkatalisis proses hidrolisis pati

menjadi senyawa sederhana yang

dimanfaatkan untuk proses metabolisme

bakteri itu sendiri. Hal ini sesuai dengan

pendapat Inggit, dkk (2013) dan Hatim, W

(2013) bahwa isolat TSi5 mampu

membentuk zona hambat sebesar 5cm dan

menghasilkan enzim amilase.

KESIMPULAN DAN SARAN

Dari hasil penelitian, karakteristik

morfologi bakteri heterotrofik

didominasi oleh kelompok bakteri

berbentuk basil (batang), elevasi dari

isolat makroskopis diperoleh elevasi

isolat bakteri koloni cekung. Bakteri

dengan kode isolat TSi5 merupakan

isolat bakteri tidak pathogen dengan

hasil uji Gram termasuk (+), uji Spora

(-) dan uji Kapsul (-).

Hasil identifikasi bakteri isolat dengan

kode isolat TSi5 teridentifikasi sebagai

Micrococcus luteus, yang dianalisis

menggunakan BLAST di NCBI

menunjukkan homologi terhadap

Micrococcus luteus.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih

lanjut mengenai isolasi enzim amilolitik

dari isolat TSi5 dan isolat-isolat lainnya.

DAFTAR PUSTAKA

Achmad, R. 2004. Kimia Lingkungan.

Penerbit Andi. Yogyakarta.

Chen,H., G.Zhao, D.Park,3 Y.Zhang,L.

Xu, J.Lee, C. Kim and W.Li . 2009.

Micrococcus endophyticus sp. nov.,

isolated from surface-sterilized

Aquilaria sinensis roots.

International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology 59:

1070-1075.

Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia.

Jilid IV. Departemen Kesehatan

Republik Indonesia. Jakarta.

Effendi, Hefni. 2003. Telaah Kualitas Air

Bagi Pengelolaan Sumber Daya dan

Lingkungan Perairan. Kanisuis,

Yogyakarta.

Fatmawati, R. Aniek. M. Dan M. Solichin.

2012. Kajian Identifikasi Daya

Tampung Beban Pencemaran Kali

Ngorowo Dengan Menggunakan

Paket Program QUAL2Kw.

Universitas Brawijaya. Malang.

Jurnal : Teknik Perairan. Vol. 3. No.

2.

Hindarko. 2003. Mengelola air limbah

agar tidak mencemari orang lain.

ESHA. Jakarta.

Hadioetomo, R. S. 1985. Mikrobiologi

Dasar dalam Praktek teknik dan

Prosedur Dasar laboratorium. PT.

Gramedia. Jakarta.

Inggit.W, Tri. S. H , dan Tri R. N . 2013.

Pemanfaatan Enzim Amilolitik

Bakteri Heterotrofik Dalam

Menurunkan Tingkat Pencemaran

Perairan Tawar. Universitas

Terbuka. Tangerang

Janda, J. M. and S. L. Abbott. 2007. 16S

rRNA Gene Sequencing for

Bacterial ldentification in the

Diagnostic Laboratory: Pluses,

Perils, and Pitfalls. Minireview.

Journal of Clinical Microbiology

45(9): 2761-2764.

Jawetz E., J. L Melnick, E. A. Adelberg,

G. F. Brooks, J. S. Butel, L. N.

Ornston. 1995. Mikrobiologi

Kedokteran, ed. 20, Universiti of

California, San Fransisco.

Kristanto, P. 2004. Ekologi Industri.

Penerbit Andi, Yogyakarta.

Lee, T.D. 1978. Handbook of Variables of

Environmental Impact As Sesment

Arbor: An Arbor Science publishor

inc.

Parwanayoni, S. 2008. Pergantian

Populasi Bakteri Heterotrofik, Alga,

dan Protozoa di Lagoon BTDC

Penanganan Limbah Nusa Dua Bali.

Jurnal BumiLestari.

Rahadi, B. Dan N. Lusiana. 2012.

Penentuan Kualitas Air Tanah

Dangkal dan Arahan

Penelolaan (Studi Kasus Kabupaten

Sumenep). Universitas Brawijaya.

Malang. Jurnal: Teknologi Pertanian.

Vol. 13. No. 2.

Tannock, G.W. 1999. ldentification of

Lactobacilli and Bifidobacteria.

Current lssues Molecular Biology 1

(1): 53-64.

Waluyo, L. 2009. Mikrobiologi

Lingkungan. UMM press. Malang.

Wieser M., E.B. M. Denner, P.Kampfer,P.

Schumann, B. Tindall, U. Steiner, D.

Vybiral, W. Lubitz, A. M.

Maszenan, B. K. C. Patel, R.J.

Seviour, C. Radax and H.J.Busse.

2002. Emended descriptions of the

genus Micrococcus, Micrococcus

luteus (Cohn 1872) and Micrococcus

lylae (Kloos et al. 1974).

International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology 52:

629–637.

Wardhana, W.A. 2004. Dampak

Pencemaran Lingkungan. Penerbit

Andi, Yogyakarta