Laporan Penelitian Fundamental

KARAKTERISASI SEL-SEL TERINFEKSI VIRUS JEMBRANADARI SAPI BALI, SECARA IN VIVO DAN IN VITRO

Oleh

Drh. I Ketut Berata, MSiDrh. I Nyoman Mantik Astawa, PhD

Dibiayai oleh Direktorat Jendral Pendidikan TinggiDepartemen Pendidikan Nasional

Sesuai denganSurat Perjanjian Pelaksanaan Kegiatan Penelitian

Nomor : 027/SP2H/PP/DP2M/III/2008Tanggal 6 Maret 2008

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWANUNIVERSITAS UDAYANA

Oktober 2008

RINGKASAN

Penelitian karakterisasi sel-sel terinfeksi virus penyakit Jembrana (JDV) sapi

Bali secara in vivo dan in vitro, merupakan penelitian tahap kedua. Pada tahap kedua

diteliti tentang pola sel-sel terinfeksi JDV pada limpa dan kultur heterohibrida serta

respon kekebalan seluler vaksin kultur dan vaksin limpa pada sapi Bali.

Pola sel-sel terinfeksi JDV pada limpa yang terinfeksi secara in vivo dan pada

kultur (in vitro) diperiksa dengan teknik imunoperoksidase tidak langsung sesuai

metode Dharma (2002). Pada uji respon kekebalan seluler dilakukan dengan uji MTT

(methyl thyazole tetrazolium) berdasarkan daya proliferasi limfosit. Uji respon

kekebalan seluler ini dimulai dengan pemberian vaksin kultur pada 4 ekor sapi Bali

dengan dosis 3 ml secara intramuskuler. Booster dilakukan 4 minggu kemudian.

Sebagai pembanding 4 ekor sapi diberikan vaksin limpa dengan dosis dan rute yang

sama. Seminggu setelah vaksinasi kedua, dilakukan isolasi limfosit dari darah perifer.

Limfosit sapi yang telah divaksinasi tersebut dilakukan uji MTT. Mitogen yang

digunakan adalah protein Ca JDV, protein JDV dan Con A.

Hasil pemeriksaan sel-sel terinfeksi JDV pada limpa tampak berpola klon

multifokal yang menunjukkan bahwa hanya sel-sel tertentu yang terinfeksi JDV.

Karena sel-sel terinfeksi JDV berlokasi di parafolikel limpa, maka sel limfosit T

disimpulkan sebagai sel target JDV. Pada kultur sel heterohibrida tampak sel-sel

terinfeksi hampir mencapai 100%. Hal ini menunjukkan bahwa teknik kultur

heterohibrida berhasil meningkatkan jumlah sel-sel terinfeksi JDV. Sehingga sel

heterohibrida potensial sebagai pembiak JDV untuk sumber antigen vaksin kultur. Uji

respon kekebalan seluler diperoleh hasil bahwa akibat pemberian vaksin kultur

menimbulkan respon kekebalan seluler yang lebih tinggi dari pada vaksin limpa. Hal

ini kemungkinan berkaitan dengan jumlah sel terinfeksi JDV yang lebih banyak pada

kultur heterohibrida. Dari faktor mitogen yang digunakan, tampak protein capsid

menimbulkan respon yang paling rendah dibandingkan protein JDV dan Con A. Hasil

ini sangat berbeda dengan uji respon kekebalan seluler pada mencit BALB/c. dimana

protein Ca menimbulkan respon yang sama dengan mitogen lainnya.

Dari hasil penelitian ini maka JDV dalam kultur sel heterohibrida potensial

dikembangkan sebagai sumber antigen vaksin terhadap penyakit Jembrana..

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat

rahmatNya penelitian fundamental ini dapat diselesaikan dengan baik.

Penelitian ini dapat terlaksana dengan lancar adalah juga berkat bantuan dari

berbagai pihak. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang tidak terhingga

kepada Direktorat Pembinaan Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat, (DP2M)

Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional di Jakarta,

atas bantuan dana penelitian fundamental tahun 2008 ini. Ucapan terimakasih juga

penulis sampaikan kepada Ketua Lembaga Penelitian Universitas Udayana, Dekan

Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Kepala Laboratorium Biomedik

FKH Unud dan Kepala Balai Besar Veteriner Denpasar terutama kepala laboratorium

Bioteknologi, atas segala fasilitas penelitian sehingga dapat berjalan sesuai dengan

yang direncanakan. Semoga kebaikan dari berbagai pihak tersebut mendapat pahala

yang setimpal dari Tuhan Yang Maha Esa.

Laporan penelitian fundamental ini mungkin masih jauh dari sempurna,

sehingga segala saran dan kritik yang bersifat kontruktif dari berbagai pihak sangat

penulis hargai.

Denpasar, 4 Nopember 2008

Penulis

DAFTAR ISI

LAPORAN AKHIR HASIL PENELITIAN FUNDAMENTALTAHUN ANGGARAN 2008

LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN ………………… i

RINGKASAN DAN SUMMARY ………………………………… ii

PRAKATA ………………………………………………………… iv

DAFTAR ISI ………………………………………………………… v

DAFTAR TABEL ………………………………………………… vi

DAFTAR GAMBAR/ ILUSTRASI ………………………………… vii

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………… viii

I. PENDAHULUAN ………………………………………… 1

II. TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………… 2

III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN ………………… 10

IV. METODE PENELITIAN ………………………………… 11

V. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………… 18

VI. KESIMPULAN DAN SARAN ………………………… 22

DAFTAR PUSTAKA ………………………………………… 23

LAMPIRAN ………………………………………………………… 26

DAFTAR TABEL

1. Hasil Uji Respon Kekebalan Seluler dengan Uji MTT 19

2. Rerata uji respon kekebalan seluler sesuai mitogen yang digunakan 19

DAFTAR GAMBAR

1. Pola Sel-sel Terinfeksi JDV pada Limpa dan Sel Heterohibrida......... 19

2. Perbandingan respon kekebalan seluler akibat pemberian vaksin kultur

dan vaksin limpa. .................................................................. 20

DAFTAR LAMPIRAN

1. Anova Respon Seluler Pemberian Vaksin Kultur dan Vaksin Limpa 26

2. Anova Respon Kekebalan Seluler Antar Mitogen ................ 26

3. Uji Duncan Antara Mitogen .................................................... 26

I PENDAHULUAN

Vaksin terhadap penyakit Jembrana pada sapi Bali yang tersedia saat ini

adalah vaksin yang dibuat dari suspensi 20% limpa sapi terinfeksi virus penyakit

Jembrana (JDV). Vaksin limpa dengan kode produksi JD.Vac.sp.15 (Hartaningsih, et

al, 2001) ini memiliki kelemahan yaitu dari cara pembuatan vaksin karena harus

membunuh sapi donor vaksin. Oleh karena itu dikembangkan berbagai alternatif

untuk memperoleh antigen JDV sebagai bahan vaksin. Sebagaimana diketahui bahwa

JDV hanya tumbuh dalam kultur limfosit sapi Bali. Oleh karena itu, teknik kultur

limfosit yang memiliki sifat sama dengan limfosit sapi Bali diantaranya sel

heteroihibrida dan kultur limfosit sapi Bali yang dirangsang dengan lektin Con A

penting dikembangkan.

Sel heterohibrida yang merupakan hasil fusi limfosit sapi Bali dan mieloma

mencit, dengan teknik kultur telah dapat diinfeksikan virus penyakit Jembrana

(Astawa, et al., 2005). Sel-sel heterohibrida yang terinfeksi JDV merupakan sumber

antigen untuk pembuatan vaksin kultur terhadap penyakit Jembrana. Limfosit

terinfeksi JDV dari kultur, perlu dikarakterisasi terlebih dahulu sebelum digunakan

sebagai kandidat vaksin. Karakteristik yang penting diteliti adalah karakteristik sel-

sel terinfeksi JDV serta respon kekebalan seluler akibat pemberian vaksin kultur pada

sapi Bali.

II TINJAUAN PUSTAKA

Karakteristik sel-sel terinfeksi JDV pada organ ( infeksi in vivo) atau kultur

(infeksi in vitro), serta respon kekebalan seluler yang ditimbulkan merupakan

kesatuan mekanisme yang terkait.

2.1. Karakteristik Sel-sel Terinfeksi JDV dan Penentuannya.

Sel-sel terinfeksi JDV pada limpa sapi Bali terserang penyakit Jembrana

dilaporkan memiliki pola berupa cluster di sekitar parafolikel limpa. Diperkirakan

10-15% sel-sel yang terinfeksi JDV berada di zona tersebut, sedangkan di folikel

limpa lebih sedikit (Chadwick, et al., 1998). Limfosit limpa yang berada di zona

parafolikel merupakan lokasi limfosit T (Tizard, 2002). Dari data tersebut awalnya

muncul dugaan bahwa JDV memiliki sel target limfosit T. Tetapi lebih jauh Dharma

(1996) melaporkan bahwa sel target JDV kemungkinan besar sel T yang bermarker

BoCD4+. Hal ini didasarkan pada timbulnya penurunan rasio BoCD4+/BoCD8+ pada

sapi terinfeksi JDV. Penelitian sekuensial tentang subset limfosit pada limpa dan

limfonodus dengan teknik imunohistokimia, diketahui bahwa terjadi penurunan rasio

BoCD4/BoCD8 pada folikel limfonodus terutama pada fase akut penyakit jembrana

(Dharma, 1993). Rasio normal CD4/CD8 pada hewan maupun manusia berkisar 2:1

(Tizard, 2002). Penurunan rasio BoCD4+/BoCD8+ ini memperkuat dugaan bahwa sel

BoCD4+ merupakan sel target JDV. Dugaan ini didasarkan pada analogi pada infeksi

HIV (human immunodeficiency virus) yang disebabkan oleh virus subfamili

Lentivirinae, juga menyebabkan terjadinya penurunan rasio CD4+/CD8+ sampai 1:2

(Amadori, et al.,1996; Taylor, et al., 1989) Sel target virus HIV telah diketahui yaitu

sel CD4+ dan makrofag (Merati, 2001). Pada infeksi FIV (feline immunodeficiency

virus), dilaporkan juga terjadi penurunan rasio CD4/CD8 sampai 1,6 (Hoffman-Fezer,

et al., 1992). Pada kera yang terinfeksi SIV (simian immunodeficiency virus), juga

terjadi penurunan rasio CD4/CD8 (Linhart, et al., 1997). Identifikasi sel-sel target

virus penyakit Jembrana di masa yang akan datang, dapat dideteksi dengan teknik

pewarnaan ganda (double labeling immunostaining (Dharma, 1996). Rasio

CD4+/CD8+ diperhatikan apabila virus tidak bersifat sitopatik pada sel-sel terinfeksi

(Miller, et al., 2000)

Untuk menentukan adanya sel limfosit yang terinfeksi JDV, baik dalam limpa

maupun dalam kultur sel limfosit darah tepi, dapat dilakukan uji imunositokimia

dengan teknik imunoperoksidase tidak langsung sesuai prosedur Dharma (2002) .

2.2. Pengembangan Vaksin Kultur

Virus penyakit Jembrana (JDV) memiliki sifat yang unik diantaranya sulit

tumbuh dalam kultur jaringan, kecuali dalam kultur limfosit sapi Bali. Limfosit sapi

Bali sebagaimana halnya limfosit hewan umumnya tidak dapat bertahan lama dalam

kultur. Keadaan ini menghambat penelitian karakterisasi JDV dan pengembangan

vaksin, karena agen penyebab suatu penyakit akan mudah dikarakterisasi jika dapat

tumbuh dalam kultur jaringan (Kertayadnya, et al., 1993). Agen suatu penyakit yang

mudah tumbuh dalam kultur, sangat memungkinkan dapat dikembangkan vaksin

kultur. Vaksin kultur telah banyak dikembangkan, karena kemurnian vaksin lebih

terjamin (Pasaribu dan Mansjoer, 1993).

Jenis vaksin penyakit Jembrana yang tersedia saat ini adalah vaksin dari

suspensi 20% limpa sapi Bali yang diinfeksikan JDV, yang telah diaplikasikan di

lapangan dengan kode JD.Vac.sp.15 (Hartaningsih, et al., 2001). Setiap ekor sapi

donor diperoleh antigen untuk 2000 dosis vaksin. Daya proteksi dari jenis vaksin ini

sekitar 70 % (Hartaningsih, et al., 1996). Keharusan membunuh sapi donor pada

pembuatan vaksin lima, menyebabkan pengembangan berbagai teknik untuk

pembuatan vaksin baru terus dilakukan (Wilcox, 2001). Upaya perbaikan mutu

vaksin Jembrana terus dilakukan. Salah satu upaya tersebut adalah dengan

menumbuhkan JDV dalam kultur limfosit. Berbagai kultur sel, baik kultur sel primer

maupun kultur sel lestari telah dilakukan. Kultur sel primer yang pernah dicoba

adalah kultur sel embrio sapi Bali, seperti ginjal, paru-paru, makrofag dan jenis sel

lainnya. Kultur sel tersebut diinokulasikan dengan material infektif JDV. Ternyata

tidak satupun jenis sel tersebut dapat dipakai untuk menumbuhkan JDV. Percobaan

dengan berbagai kultur sel lestari seperti Vero, CVI, BHK-21, EBTr, MDHK, juga

tidak menunjukkan hasil positif ( Kertayadnya, et al., 1997). Percobaan dengan

limfosit dari darah tepi, kemudian dirangsang pertumbuhannya dengan ConA dan

interleukin (IL-2), ternyata mampu tumbuh secara terbatas pada in vitro. Secara

terbatas juga sel-sel kultur tersebut dapat sebagai tempat replikasi JDV (Astawa, et

al., 2005). Keterbatasan tersebut memperkuat dugaan bahwa JDV hanya menyerang

limfosit T tertentu, yang diduga kuat sel BoCD4+ (Dharma, 1996).

Fusi limfosit sapi Bali dengan sel mieloma asal mencit, yang disebut sel

heterohibrida telah berhasil tumbuh dalam kultur (Astawa, et al., 2005).

Pengembangan sel-sel heterohibrida sebagai sel tempat kultur JDV, berpotensi

sebagai sumber antigen untuk vaksin kultur. Tetapi dalam upaya pengembangan sel

heterohibrida menjadi sel lestari sebagai media infeksi JDV, perlu dilakukan

karakterisasi lengkap dari sel tersebut (Priosoeryanto, 2003). Karakterisasi JDV

dalam kultur sel heterohibrida, dengan uji Western Blotting menunjukkan adanya

susunan protein yang konsisten dengan JDV kasus lapangan (Astawa, et al., 2005).

Respon kekebalan seluler secara umum dipengaruhi oleh interaksi 2 faktor

yaitu hospes dan antigen (Miller, et al., 2000). Penelitian infeksi Lentivirus terutama

human immunodeficiency virus (HIV) pada mencit, ternyata respon kekebalan seluler

yang diperoleh sama baiknya dengan respon kekebalan humoral (Sharma and

Khuller, 2001). Variasi antar hospes dilaporkan karena adanya variasi molekul

mediator (sitokin) yang terlibat dalam interaksi hospes dan antigen (Patrick, et al.,

2002). Respon kekebalan seluler prinsipnya merupakan interaksi antigen dengan sel

limfosit T dari hospes. Tahap respon kekebalan adaptif meliputi beberapa fase yaitu

fase pengenalan antigen, fase aktivasi limfosit dan fase efektor. Fase pengenalan

antigen sangat dibantu dengan tingginya determinan antigen yang dimiliki oleh

mamalia umumnya yaitu berkisar 109-1011. Pada fase aktivasi sel limfosit terjadi

sintesa protein baru, proliferasi sel limfosit dan diferensiasi ke bentuk sel efektor dan

sel memori. Proliferasi sel limfosit pada penyakit viral yang akut, dapat mencapai

100.000 kali dari pada sel limfosit yang tidak terpapar virus. Selain proliferasi,

terjadi juga peningkatan ukuran sel-sel limfosit, sehingga lebih dikenal sebagai sel

limfoblastoid (Abbas, et al., 2000)

Respon kekebalan seluler dipicu oleh pengikatan antigen dengan reseptor

antigen pada permukaan sel limfosit T yang tersensitisasi. Stadium ini melibatkan sel

penyaji antigen yaitu makrofag. Makrofag menyajikan dalam bentuk kompleks

peptida-MHC, ditangkap oleh TCR (Abbas, et al., 2000). Selain sel penyaji antigen,

ada zat lain yang dapat mengikat permukaan sel limfosit T dan mengaktifkannya,

misalnya mitogen atau eritrosit kambing (reaksi roset E). Mitogen yang sering

digunakan dalam hal ini adalah lektin Con A, pokeweed mitogen (PWM) dan

phytohaemagglutinin (PHA) (Constantinides, 1994; Wareing, 1996). Selanjutnya

terjadi serangkaian peristiwa morfologik dan biokimiawi yang disebut sebagai

stadium sekunder. Stadium sekunder merupakan manifestasi in vitro respon

kekebalan seluler sebagai akibat gangguan membran sel yang terjadi setelah interaksi

primer sel limfosit T. Perubahan morfologik sel limfosit pada kultur jaringan terdiri

dari transformasi sel blas dan selanjutnya terjadi mitosis. Peristiwa biokimia yang

terjadi pada stadium sekunder ditunjukkan oleh DNA, RNA atau sintesis protein yang

dideteksi dengan menggunakan prekursor-prekursor yang beradiolabel. Stadium

tersier respon kekebalan seluler merupakan ekspresi biologik dari peristiwa stadium

sekunder. Ekspresi biologik tersebut antara lain 1) Pembengkakan sel limfosit T

helper atau sel sitotoksik untuk interaksi sel limfosit T-T dan sel limfosit T-B

termasuk peran makrofag; 2). Pembangkitan sel-sel limfosit T sitotoksik; 3)

Pembangkitan sel limfosit T yang menghasilkan molekul-molekul efektor (mediator)

dari respon kekebalan seluler; 4. Pembangkitan sel-sel memori (Herscowitz, 1993).

Mekanisme lisisnya sel-sel terinfeksi virus atau patogen intraseluler lainnya

yang sedang mengalami replikasi, diawali dengan pemecahan protein panjang dalam

sel, oleh komplek proteasome menjadi peptida-peptida. Peptida-peptida ini pindah ke

retikulum endoplasma, dimana protein terkait transkripsi sebagai pembawa. Dalam

retikulum endoplasma, peptida berikatan dengan MHC klas I dan 2-mikroglobulin.

Komplek ketiga molekul ini dibawa ke permukaan sel untuk dikenali oleh sel limfosit

T dalam sirkulasi. Pengenalan kompleks ini, diikuti dengan aktivasi sel limfosit T

CD8+. Sel limfosit T CD8+ atau sel limfosit T sitotoksik melisiskan sel-sel terinfeksi

dan langsung membatasi perbanyakan virus atau patogen serta penyebaran

penyakitnya (Sharma and Khuller, 2001). Sel limfosit T CD4+ memegang peranan

utama dalam mengeleminasi infeksi Lentivirus. Domain dari sel limfosit T CD4+

adalah pada ikatan peptida dari bagian SU (surface unit) maupun transmembran

(TM) Lentivirus (Sarkar, et al., 2002).

Pengaturan interaksi antara sel limfosit T CD8+ dan sel limfosit T CD4+

sangat komplek. Interaksi ini melibatkan mekanisme antigen spesifik maupun non

spesifik. Pengaturan antigen spesifik terjadi dari 2 cara. 1). Sel limfosit T CD4+ dan

sel limfosit T CD8+ mengenali kompleks peptida-MHC pada sel penyaji antigen

konvensional (makrofag atau sel dendrit). Sel limfosit T sitotoksik (CD8+) kemudian

menekan atau menginaktivasi sel limfosit T CD4+ dan membunuh sel penyaji antigen

dengan limfokin yang dihasilkan atau dengan kontak sel. 2). Sel limfosit T CD8+

mengenali sel limfosit T CD4+ teraktivasi langsung pada spesifik peptidanya. Sel

limfosit T CD8+ teraktivasi kemudian melisiskan atau dengan menginaktivasi

perangsang sel limfosit T CD4+ (Sharma and Khuller, 2001). Interaksi antigen

dengan sel limfosit T CD8+ maupun dengan sel limfosit T CD4+, juga dilaporkan

melibatkan sitokin dan kemokin (Patrick, et al., 2002).

Mekanisme proliferasi limfosit dilaporkan melalui 2 signal. Signal 1 dipicu

dengan ikatan reseptor sel T (TCR) pada kompleks peptida-MHC. Ikatan ini analog

dengan ikatan imunoglobulin pada kompleks peptida-MHC, pada respon kekebalan

humoral. Struktur TCR dari sel limfosit T sama dengan struktur imunoglobulin.

Ikatan TCR dengan kompleks peptida-MHC sangat lemah, maka diperlukan penstabil

dan pengantar signal yaitu molekul CD3 dan ς yang dikenal sebagai immunoreceptor

tyrosine-based activation motive (ITAM). Selanjutnya molekul CD3 dan ς

merangsang signal 2 dengan terbentuknya ko-stimulator yaitu sel CD28 yang bersifat

antiapoptosis terhadap protein. Molekul CD28 merupakan molekul 90% dari sel

limfosit T CD4+ dan 50% dari sel limfosit T CD8+ (Abbas, et al., 2000).

Respon kekebalan seluler dapat diukur berdasarkan daya proliferasi sel

limfosit dan produksi limfokin (Wareing, 1996). Daya proliferasi sel limfosit akibat

mitosis pada stadium sekunder interaksi antigen-limfosit T, dapat diukur dengan

teknik radiolabel thymidin (Wareing, 1996), uji MTT ( Denizot and Lang, 1986,

Wareing, 1996) dan Flow cytometry (Hofmann-Lehmann, et al., 1995). Prinsip dari

uji MTT ini adalah kemampuan enzim mitokondria sel limfosit mengkonversi garam

tetrazolium menjadi formazan yang berwarna biru (Denizot and Lang, 1986). Garam

tetrazolium tersebut adalah {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

bromide}. Teknik ini dimodifikasi oleh Hansen, et al. (1989), sehingga hasilnya lebih

memuaskan. Garam tetrazolium (CH2N4-) merupakan akseptor hidrogen buatan,

tereduksi oleh NaDH atau NaDPH dan dikatalis oleh enzim diaphorase, menjadi

substansi berwarna biru formazan (CH2N4-H). Diaphorase adalah enzim yang

terdapat dalam mitokondria semua sel. Jika terbentuk monoformazan, maka

warnanya merah. Sedangkan jika terbentuk diformazan, maka warnanya biru atau

ungu kehitaman (Kiernan, 1990). Teknik ini lebih aman dan murah dari pada teknik

yang menggunakan radiolabel thymidin, karena diperlukan radioisotop. Pada kasus

penyakit Jembrana, disesuaikan dengan keadaan di Indonesia, maka teknik uji MTT

lebih tepat (Wareing, 1996). Teknik berdasarkan adanya perubahan warna seperti

teknik uji MTT, juga dapat dipergunakan untuk menentukan tingkat pertumbuhan

dari limfosit T (Mosmann, 1983). Prinsip kerja uji MTT adalah dimulai dengan

membuat sel yang dipekakan (sensitized cells) dengan cara vaksinasi. Sel yang peka

antigen ini diinkubasikan bersama mitogen, baik berupa antigen utuhnya atau

subunitnya maupun mitogen lektin. Pada kasus penyakit Jembrana, mitogennya dapat

berupa protein virus penyakit Jembrana atau protein subunitnya yaitu Ca, SU, dan

Tat. Sebagai kontrol positif digunakan lektin Con A, karena Con A merupakan

mitogen non-spesifik yang dapat mengikat dan merangsang sel limfosit untuk

berproliferasi (Kalvatchev, et al., 1995). Lektin Con A dilaporkan lebih merangsang

proliferasi sel limfosit T BoCD4+, sedangkan lektin PHA lebih merangsang

proliferasi sel limfosit T BoCD8+ (Wareing, 1996). Lektin Con A, secara luas

digunakan dalam penelitian yang berkaitan dengan proliferasi sel limfosit atau

penyakit imunodefisiensi, sehingga merupakan standar untuk lektin yang lainnya

(Damjanov, 1987). Penurunan respon proliferasi sel limfosit jika direaksikan dengan

lektin, merupakan tanda abnormalitas dari respon kekebalan seluler. Hal ini juga

berkaitan dengan kasus limfoma dan AIDS pada manusia dan orang utan (Hunt, et

al., 1983). Penelitian penurunan respon proliferasi sel limfosit pada sel limfosit darah

tepi kelinci yang sebelumnya diinfeksikan BIV, juga digunakan lektin Con A sebagai

mitogen (Kalvatchev, 1995).

Teknik yang lain untuk mendeteksi daya proliferasi sel limfosit adalah teknik

flow cytometry atau lebih dikenal dengan Fluorescence-Activated Cell Sorting

(FACS), merupakan teknik yang sangat sensitif, tetapi diperlukan reagen dan alat

yang mahal. Di samping itu juga diperlukan kehati-hatian terutama dalam tahap

pengenceran antibodi berlabel fluorescence yang diinkubasi dengan sel yang

mengandung antigen (Hofmann-Lehmann, et al.,1995). Hasil yang sangat baik

dengan teknik flow cytometry, dilaporkan pada herpesvirus sapi (Denis, et al., 1994).

Teknik pewarnaan dengan fluorescent dan teknik flow cytometry, dapat dilakukan

untuk kasus-kasus dengan penelitian yang bersifat retrospektif. Teknik ini dapat

dipergunakan untuk tingkat DNA ataupun seluler (Geissel and Griffin, 1994)

III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristk berupa pola dan

jumlah sel-sel terinfeksi JDV serta uji potensi bahan vaksin kultur berdasarkan uji

respon kekebalan seluler pada sapi Bali.

3.2. Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah untuk pengembangan sel-sel yang terinfeksi

JDV sebagai sumber antigen untuk kandidat vaksin kultur terhadap penyakit

Jembrana pada sapi Bali.

IV METODE PENELITIAN

4.1. Isolasi Limfosit Sapi

Sapi Bali sehat diambil dari Nusa Penida (daerah bebas penyakit Jembrana)

diadaptasikan selama 2 minggu. Pada minggu pertama adaptasi, disuntikkan vaksin

terhadap penyakit SE (septicemia epizootica) dan diberikan obat cacing. Setelah masa

adaptasi, darah dari vena jugularis diambil sebanyak 20 ml dan ditampung pada

tabung yang telah diisi antikoagulan EDTA. Darah ini disentrifus 12.000 rpm selama

30 menit. Dengan pipet transfer, buffy coat diambil dan dimasukkan ke tabung yang

telah diisi picoll-paque. Tabung dengan isi picoll-paque dan buffy coat ini disentrifus

lagi 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang secara perlahan dan pelet

dibiarkan pada tabung. Pelet ini disuspensi dengan PBS steril dan disentrifus lagi

12.000 rpm selama 10 menit sebagai langkah pencucian limfosit. Pelet hasil sentrifus

ini merupakan limfosit yang siap digunakan sesuai keperluan.

4.2. Penyiapan Sel Heterohibrida

Penyiapan sel heterohibrida dilakukan sesuai dengan metode yang dilakukan

oleh Astawa, et al, (2005). Sel mieloma mencit ditumbuhkan pada media DMEM

(Dulbeco”s Modified Essintial Medium) yang mengandung serum (foetal calf serum/

FCS) 10%, antibiotik, glutamin dan sodium piruvat. Sebanyak 2x106 sel mieloma

yang sehat dan sedang aktif membelah, difusikan dengan 108 limfosit sapi Bali

normal menggunakan larutan PEG (polyethelene glycol) 45%). Hasil fusi ini

dibiakkan pada media selektif DMEM yang mengandung hypoxantine, aminopterin

dan thymidin (HAT). Sel yang tumbuh kemudian diidentifikasi, diseleksi, diisolasi

dan diinfeksikan virus penyakit Jembrana. Pertumbuhan JDV dalam sel heterohibrida

ditentukan dengan uji ELISA sandwich. Uji ini melacak virus penyakit Jembrana

yang dilepaskan dari dalam sel. Klon sel heterohibrida yang mendukung

pertumbuhan JDV diisolasi, diklon ulang dan diperbanyak, sehingga diperoleh klon

sel yang sama persis dalam jumlah besar.

4.3. Inokulasi Sel Heterohibrida dengan Jembrana Disease Virus (JDV)

Klon sel heterohibrida yang mendukung pertumbuhan JDV secara in vitro,

diinokulasikan dengan virus penyakit Jembrana dari limfosit sapi penderita penyakit

Jembrana. Limfosit diisolasi dari darah perifer sapi Bali terserang penyakit Jembrana.

Darah sapi Bali yang diambil secara aseptis, disentrifus 3000 rpm selama 10 menit.

Lapisan buffy coat diambil, dan limfosit dipisahkan dengan sentrifus menggunakan

gradien picoll-paque. Lapisan putih di perbatasan picoll dan plasma yang merupakan

limfosit itu, diambil dan dicuci 2 x dengan media bebas serum. Limfosit ini diko-

infeksikan ke sel heterohibrida yang mendukung pertumbuhan JDV. Klon sel

heterohinrida yang mendukung adanya pertumbuhan JDV dikoleksi dan selanjutnya

digunakan sebagai bahan vaksin kultur.

4.4. Penentuan Sel-sel Terinfeksi JDV pada Limpa dan Limfosit Kultur

Limpa yang dipakai dalam penelitian ini adalah limpa sapi bali terinfeksi JDV

yang dinekropsi pada demam hari kedua. Jaringan limpa kira-kira sebesar 1 cm3

diambil secara aseptis, dan dibekukan pada suhu -20OC. Jaringan limpa kemudian

diberi OCT (Sigma, USA), kemudian dibekukan secara cepat dengan cara

mencelupkan ke dalam nitrogen cair. Jaringan yang beku tersebut kemudian dipotong

dengan cryomicrotome yang diset pada suhu -20OC. Potongan jaringan segar setebal

4-5 µm, selanjutnya ditempatkan di atas gelas objek yang telah dilapisi poly-l-lysine

0,001% (Sigma, USA). Setelah dikeringkan di udara, jaringan difiksasi dengan aseton

dingin yang mengandung H2O2 3%, selama 30 menit. Kemudian dikeringkan,

dibungkus dengan aluminium foil dan disimpan pada -20OC jika tidak segera

diwarnai imunohistokimia.

Untuk menentukan adanya sel limfosit yang terinfeksi JDV, baik dalam limpa

maupun dalam kultur sel limfosit darah tepi, dilakukan uji imunositokimia dengan

teknik imunoperoksidase tidak langsung sesuai prosedur Dharma (2002) . Preparat

ulas yang disimpan pada suhu -20OC, dikeluarkan dan dibiarkan 15 menit pada suhu

4OC sambil memberi kode seperlunya. Dalam suasana lembab, preparat digenangi

dengan serum kambing normal 10% dalam PBS. Selanjutnya tambahkan AbMo

primer berupa AbMo anti-Ca, atau SU, atau Tat, dengan pengenceran 1:200 dalam

BSA 1%. Setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar, dilakukan pencucian 3x5

menit dengan PBS pH 7,4. Selanjutnya preparat ulas digenangi dengan mouse IgG-

HRP (ICN-USA), dengan pengenceran 1:100. Antibodi ini berfungsi sebagai

perangkai silang (cross linker) antibodi. Setelah pencucian 3x5 menit dengan PBS,

preparat digenangi dengan mouse peroxidase-anti-peroxidase complex (PAP) (Sigma,

USA), dengan pengenceran 1:800. Inkubasi selama 40 menit pada suhu kamar, dan

kemudian dicuci 3x5 menit dengan PBS. Kemudian tambahkan substrat DAB (Sigma

USA) 0,01% dalam PBS yang mengandung 2% H2O2. Setelah inkubasi 6 menit pada

suhu kamar, reaksi substrat dihentikan dengan cara dicuci pada air mengalir selama

15 menit. Selanjutnya diwarnai latar belakang (counterstain) dengan Mayer’s

haematoksilin selama 5 menit pada suhu kamar. Mayer’s haematoksilin mewarnai

inti sel, sehingga tampak berwarna biru / ungu. Sel limfosit yang terinfeksi JDV

dengan pewarnaan ini akan tampak coklat pada sitoplasmanya dengan inti berwarna

biru/ungu. Sisa warna dalam sel limfosit dibersihkan dengan air kran mengalir selama

5 menit. Berikutnya didehidrasi dengan alkohol absolut 2x5 menit, dan dibersihkan

dengan mencelupkan ke xylol 2x5 menit. Setelah dikeringkan, preparat diisi

permount dan ditutup dengan coverslip. Jumlah sel limfosit terinfeksi JDV diperiksa

dan dihitung dibawah mikroskop (perbesaran 10x40) dalam 5 lapang pandang.

Persentase sel limfosit terinfeksi JDV dihitung dengan rumus :

∑ sel terinfeksi JDV

Persentase sel terinfeksi JDV = ---------------------------------- x 100%

∑ total sel yang diperiksa

4.5. Pembuatan Vaksin Kultur

Pembuatan vaksin kultur dilakukan sebagaimana halnya pada pembuatan

vaksin limpa di Balai Besar Veteriner Denpasar. Kultur sel heterohibrida yang telah

diko-infeksikan JDV selama 2 minggu, dikumpulkan dari beberapa flask. Sel-sel dari

kultur sel heterohibrida tersebut ditampung dengan tabung steril, dan disentrifus

3.000 rpm selama 10 menit. Cairan supernatan dibuang dan selnya disuspensikan

dalam PBS steril yang mengandung 1% triton-X-100 sampai konsentrasi sel

mencapai 15%. Setelah homogenisasi dengan penyedotan dan pengeluaran berulang-

ulang menggunakan pipet Pasteur, campuran tersebut ditambahkan sama banyak

dengan adjuvan minyak mineral. Emulsifikasi dilakukan dengan cara manual, yaitu

dengan penyedotan dan pengeluaran secara berulang-ulang, menggunakan spuite 3 ml

dengan jarum 18G. Emulsifikasi dilakukan sampai terbentuk emulsi yang sempurna

antara fase air (suspensi sel limfosit dalam PBS) dan fase minyak (adjuvan), yang

ditandai dengan tidak pecahnya campuran jika diteteskan di atas permukaan air.

4.6. Vaksinasi pada Sapi dan Pengukuran Respon Kekebalan Seluler

Pada uji potensi vaksin ini digunakan 8 ekor sapi Bali yang dibagi 2 secara

acak, yaitu 4 ekor diberikan vaksin kultur dan 4 ekor lainnya diberikan vaksin limpa.

Masing-masing sapi disuntikkan 3 ml vaksin secara intramuskuler. Satu bulan

kemudian disuntikkan lagi vaksin dengan dosis yang sama, sebagai booster.

Seminggu pasca vaksinasi yang kedua, diambil darah perifernya dari vena Jugularis.

Tabung steril yang telah diberikan EDTA 5% digunakan untuk menampung darah,

selanjutnya diproses untuk mengisolasi limfosit. Limfosit masing-masing sapi

dikultur untuk pemeriksaan respon kekebalan seluler dengan uji MTT. Uji MTT

(Methyl Thiazole Tetrazolium) merupakan uji untuk mengukur daya proliferasi

limfosit sebagai manifestasi dari respon kekebalan seluler. Mitogen yang digunakan

pada uji MTT adalah protein virus Jembrana, lektin Con A dan protein capsid dari

JDV (Murdoch University). Protein virus Jembrana disiapkan dari limfosit asal limpa

sapi Bali yang terinfeksi virus penyakit Jembrana. Limpa seberat 0,2 gram ditampung

dalam cawan petri yang berisi 1,5 ml PBS. Limpa kemudian dikorek-korek untuk

menguraikan limfositnya dengan jarum suntik 23 G yang ujungnya telah

dibengkokkan. Limfosit yang keluar dari limpa ditampung dalam tabung dan dicuci

satu kali dalam PBS dengan cara sentrifus 3.000 rpm selama 5 menit. Cairan

supernatan dibuang dan diganti dengan larutan NH4Cl 0,8% (Sigma, USA) sampai

semua sel darah merah mengalami lisis. Setelah sentrifus 900 rpm selama 5 menit,

limfosit dilisiskan dengan penambahan 0,5 ml triton X-100 1% dalam PBS, dan

inkubasi selama 1 jam pada suhu -20OC. Campuran kemudian disentrifus 3.000 rpm

selama 10 menit. Supernatan ditampung ke dalam tabung sentrifus 10 ml. Protein

dalam cairan supernatan dipresipitasi dengan penambahan alkohol absolut

(perbandingan 1 bagian supernatan : 5 bagian alkohol absolut). Presipitasi protein

dalam supernatan kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1

menit. Supernatan dibuang dan endapan kemudian dikeringkan sampai semua bagian

alkoholnya menguap. Endapan protein kemudian dilarutkan kembali dalam PBS, dan

disterilkan dengan cara filtrasi dengan milipore filter 0,22 µm.

Setelah mitogen disiapkan, maka seminggu pasca vaksinasi ke2, limfosit

darah perifer secara aseptis diambil dan ditampung dalam cawan petri berisi media

DMEM. Limfositnya dihomogenkan dalam media dengan cara penyedotan dan

pengeluaran secara berulang menggunakan pipet Pasteur steril. Limfosit dalam cawan

petri kemudian dipindahkan ke dalam tabung steril dan dicuci 1 kali dengan 10 ml

media DMEM steril. Setelah dihitung dengan hemositometer, maka limfosit

disuspensikan dalam media DMEM yang mengandung 15% FCS. Limfosit kemudian

ditumbuhkan dalam mikroplat 96 sumuran, yang telah diisi mitogen dengan tingkat

kepadatan 2x106 sel/ml media.

Limfosit dari setiap sapi, diinkubasikan dalam mikroplat yang berisi mitogen

berupa protein virus Jembrana dengan konsentrasi 2 µg / ml media, mitogen Con A

10 unit/ ml media dan mitogen protein capsid JDV. Sedangkan sebagai kontrol

negatif digunakan media tanpa mitogen. Campuran limfosit dan mitogen

diinkubasikan bersama selama 3 hari pada suhu 37OC dalam lingkungan lembab yang

mengandung 5% CO2. Setelah inkubasi selama 3 hari, ke dalam setiap sumuran

ditambahkan 25 µl MTT 5% (Sigma). Sel kembali diinkubasi selama 18 jam pada

suhu 37OC. Sebagian media kemudian dibuang dan sel kemudian dilisiskan dengan

lysis buffer dimethyl sulfoxide atau DMSO 5% (Analar)

Tingkat kepekatan warna biru dalam setiap sumuran dibaca dengan multiscan

spectrophotometer, dengan λ = 595 nm. Nilai absorbannya dari masing-masing

sumuran kemudian dicatat. Tingkat warna biru merupakan hasil perubahan sodium

MTT menjadi formazan akibat aktivitas oleh enzim mitokondria limfosit yang hidup.

Semakin banyak sel yang hidup, semakin pekat pula warna biru. Nilai ini

menunjukkan tingkat daya proliferasi limfosit sebagai manifestasi dari derajat respon

kekebalan seluler.

4.7. Pengumpulan Data Hasil Penelitian

Hasil pewarnaan imunositokimia sel-sel terinfeksi JDV pada limpa dan kultur

dikumpulkan setelah dilakukan lima kali pengulangan. Sedangkan hasil uji respon

kekebalan seluler ditabulasi setelah dilakukan pengulangan pemeriksaan masing-

masing 4 kali.

4.8. Analisis Data

Data pola sel-sel terinfeksi JDV dianalisis secara deskriptif. Sedangkan uji

potensi vaksin berdasarkan uji respon kekebalan seluler dianalisis dengan sidik ragam

(ANOVA) dan Duncan sesuai prosedur SPSS for Windows

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Hasil

Pola sel terinfeksi JDV pada limpa tampak berbentuk klon besar maupun kecil

dan pada sel heterohibrida tersaji dalam Gambar 1

.

Gambar 1. Pola sel terinfeksi JDV pada limpa sapi (A)(10x), sel heterohibrida (B)(40x). Warna coklat menunjukkan sel-sel terinfeksi JDV

Hasil uji respon kekebalan seluler akibat pemberian vaksin kultur tampak

lebih tinggi dari pada vaksin limpa, seperti tersaji pada Tabel 1. Hasil analisis statistik

menunjukkan bahwa respon kekebalan seluler akibat pemberian vaksin kultur secara

bermakna (p<0,05) lebih tinggi dari pada vaksin limpa (Lampiran).

Tabel 1. Hasil Uji Respon Kekebalan Seluler dengan Uji MTT

Jenis Vaksin Rerata MTT N Std. Deviasi

vaksin kultur 0,7647 32 0,32994

vaksin limpa 0,4934 32 0,43705

Total 0,6291 64 0,40773

Berdasarkan mitogen yang digunakan dalam uji respon kekebalan seluler

tampak mitogen protein capsid JDV menyebabkan respon terendah dari pada protein

JDV dan lektin Con A, seperti terlihat pada Tabel 2 dan Gambar 2. Analisis statistik

diperoleh hasil bahwa respon kekebalan seluler akibat mitogen capsid bermakna

(p<0,05) lebih rendah dari pada mitogen lektin Con A, tetapi tidak berbeda bermakna

dengan protein JDV (p>0,05)(Lampiran)

Tabel 2. Rerata hasil uji respon kekebalan seluler sesuai mitogen yang digunakan

MITOGEN Rerata MTT N Std. Deviasitanpa mitogen 0,4200 16 0,32705

protein capsid (ca) 0,5856 16 0,24122protein JDV 0,6812 16 0,38126

Lektin Con A 0,8294 16 0,54165Total 0,6291 64 0,40773

Gambar 2. Perbandingan respon kekebalan seluler akibat pemberian vaksin kulturdan vaksin limpa, masing-masing dengan mitogen capsid, protein JDVdan Con A. Tampak secara berurutan Con A menyebabkan respon palingtinggi disusul protein JDV dan capsid.

5.2. Pembahasan

Pola sel-sel terinfeksi JDV pada limpa berbentuk klon multifokal yang

menandakan sel-sel tertentu merupakan target JDV. Pola ini telah dilaporkan oleh

Chadwick, et al (1998) yang menyatakan bahwa sel-sel di parafolikel limpa paling

banyak terinfeksi JDV. Se-sel yang berlokasi di parafolikel limpa adalah limfosit T

(Tizard, 2002). Dengan demikian limfosit T merupakan sel target JDV. Lebih jauh

Dharma (1996) melaporkan bahwa sel T yang menjadi target JDV adalah yang

bermarka BoCD4+, karena pada sapi terinfeksi JDV terjadi penurunan rasio

BoCD4+/BoCD8+. Untuk memastikan hal tersebut perlu penelitian penentuan sel

target JDV dengan teknik double labeling.

Sel-sel terinfeksi JDV pada limfosit kultur heterohibrida tampak sangat

banyak. Hal ini menunjukkan bahwa dengan teknik kultur, sel-sel terinfeksi dapat

ditingkatkan jumlahnya sampai 100%. Teknik ini sangat baik dikembangkan untuk

memperoleh jumlah antigen JDV dalam jumlah banyak sebagai sumber antigen

dalam vaksin. Banyaknya jumlah sel terinfeksi JDV pada teknik kultur heterohibrida

kemungkinan akibat dari teknik kultur yang menggunakan Con A sebagai perangsang

pertumbuhan limfosit. Lektin Con A merupakan lektin yang cenderung merangsang

proliferasi limfosit T bermarka BoCD4+ (Wareing, 1996).

Hasil uji potensi vaksin dari sel heterohibrida (vaksin kultur) tampak respon

kekebalan yang ditimbulkan lebih tinggi dari pada vaksin limpa. Tingginya respon

kekebalan seluler akibat vaksin kultur heterohibrida tersebut kemungkinan akibat

lebih tingginya jumlah sel terinfeksi virus penyakit Jembrana pada sel heterohibrida.

Hal ini dapat dilihat dari hasil penelitian terdahulu bahwa jumlah sel terinfeksi JDV

pada limpa sapi Bali berkisar 10-15% (Chadwick, et al., 1998). Sedangkan jumlah sel

terinfeksi virus penyakit Jembrana pada sel heterohibrida hampir mencapai 100%

(Astawa, belum dipublikasikan). Hasil penelitian ini membuktikan bahwa sel

heterohibrida potensial sebagai media biakan virus penyakit Jembrana untuk

dikembangkan sebagai sumber antigen vaksin terhadap penyakit Jembrana.

Berdasarkan mitogen yang digunakan dalam uji respon kekebalan

seluler tampak akibat mitogen protein capsid lebih rendah dari pada protein JDV dan

Con A. Hal ini berbeda dengan hasil uji dengan menggunakan mencit BALB/c,

dimana respon kekebalan seluler akibat protein capsid sama dengan protein JDV, Tat,

SU dan Con A (Berata dan Astawa, 2007). Perbedaan respon kekebalan yang timbul

tersebut kemungkinan akibat perbedaan hospes. Perbedaan hospes (host factor). dapat

menimbulkan respon kekebalan yang berbeda (Miller, et al., 2000). Penelitian yang

lebih mendalam melaporkan bahwa variasi respon hospes terhadap infeksi Lentivirus

adalah terletak pada interaksi langsung regio Ca Lentivirus pasca tahap uncoating

virus untuk berintegrasi dengan genom hospes (Peyerl, et al., 2004). Hal serupa juga

dilaporkan bahwa sifat antigenik protein Ca Lentivirus sangat bervariasi pada spesies

hospes yang berbeda, karena. sifat antigenisitas dari Lentivirus terletak pada protein

Ca (Grund, et al., 1994). Adanya variasi respon kekebalan diantara spesies hospes,

mendorong penelitian-penelitian Lentivirus secara kolaborasi dengan berbagai jenis

hospes dalam upaya pengembangan vaksin Lentivirus (Sharma and Khuller, 2001).

VI. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian di atas, maka dapat disimpulkan sebagai berikut

1. Pola sel terinfeksi virus penyakit Jembrana (JDV) berbentuk klon multifokal yang

menunjukkan sel-sel tertentu (limfosit T) yang menjadi sel target virus.

2. Teknik kultur sel heterohibrida dapat meningkatkan jumlah sel-sel terinfeksi JDV

hampir 100%, sehingga sangat potensial dikembangkan sebagai sumber antigen

untuk vaksin penyakit Jembrana.

3. Respon kekebalan seluler akibat pemberian vaksin kultur lebih tinggi dari pada

akibat vaksin limpa. Hal ini menunjukkan bahwa vaksin kultur sel heterohibrida

berpotensi dikembangkan sebagai kandidat vaksin terhadap penyakit Jembrana.

6.2. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang keamanan (safety test) vaksin kultur

sel heterohibrida pada sapi.

2. Perlu dilakukan penelitian yang lebih rinci tentang respon humoral dari vaksin

kultur heterohibrida pada sapi.

DAFTAR PUSTAKA

Abbas,A.K., Lichtman,A.H., and Pober, J.S. 2000.Cellular and MolecularImmunology. 4th.Ed. Saunders Co.

Amadori, A., Zamarchi, R., and Bianchi, L.C. 1996. CD4 : CD8 Ratio and HIVInfection, The “Tap and Drain” Hypothesis. Viewpoint Immunology Today.Vol.17 (9)

Astawa, N.M., Hartaningsih, N., Dharma, D.M.N., Tenaya, W.M., Budiantono, danEkaana,W. 2005. Replikasi Virus Jembrana pada Kultur Limfosit DarahTepi asal Sapi Bali. J.Vet.6(4).

Berata, I K dan Astawa, N.M.2007. Protein Capsid Virus Penyakit Jembrana dapatMenimbulkan Respon Kekebalan Seluler J.Vet.Vol.8(3) akred. No.55/Dikti/Kep/2005

Chadwick, B.J., Desport, M., Brownlie, J., Wilcox, G.E., and Dharma, D.M.N.1998. Detection of Jembrana Disease Virus in Spleen, Lymphnodes, BoneMarrow and Other Tissues by In Situ Hybridization of Paraffin-Emmbeded Sections. J.of General Virol. 79

Constantinides, P. 1994. General Pathobiology. Appleton and Lange.USA.Damjanov, I. 1987. Biology of Disease : Lectin Cytochemistry and Histochemistry.

Laboratory Investigation. No.57.Denis, M., Kaashock, M.J., van Oirschot, J.T., Pastoret, P.P., and Thiry, E. 1994.

Quantitative Assessment of the Specific CD4+ T Lymphocyte ProliferativeResponse in Bovine Herpesvirus 1 Immune Cattle. Veterinary Immunol. andImmunopathol. No.42.

Denizot, F., and Lang, R. 1986. Rapid Colorimetric Assay for Cell Growth andSurvival, Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure GivingImproved Sensitivity and Reliability. J. of Immunol Methods. No.89.

Dharma, D.M.N. 1996. The Pathology of Jembrana Disease. In : Wilcox, G.E.,Soeharsono, S., Dharma, D.M.N., Copland, J.W., Editors. Jembrana Diseaseand The Bovine Lentiviruses. ACIAR Proceedings No. 75.

Dharma, D.M.N. 2002. Teknik Imunohisokimia. In : Hartaningsih, N. Editor. ManualDiagnosa Laboratorik Penyakit Jembrana. Materi kursus peningkatan metodediagnosa penyakit jembrana. ACIAR-BPPV VI Denpasar.

Geissel, A., and Griffin, J.L. 1994. Preparation of Nuclei for Flow Cytometry. In :Mikel, U.V. Editor. Adavanced Laboratory Methods in Histology andPathology. Armed Forces Institute of Pathology, Washington.

Grund, C.H., Lechman, E.R., Issel, C.J., Montelaro, R.C., and Rushlow, K.E. 1994.Lentivirus Cross-Reactive Determinants Present in the Capsid Protein ofEquine Infectious Anaemia Virus. J.of Gen. Virol. 75.

Hartaningsih, N., Dharma, D.M.N., Soeharsono, S., and Wilcox, G.E.. 2001. TheInduction of Protective Immunity Against Jembrana Disease in Cattle byVaccination With Inactivated Tissue-Derived Virus Antigens. Vet. Immunol.and Immunopathol. 78.

Herscowitz, H.B. 1993. Imunofisiologi : Fungsi Sel dan Interaksi Seluler dalamPembentukan Antibodi. In : Bellanti, J.A. Editor. Imunologi III. UI press

Hoffmann-Fezer, G.H., Thum,J., Ackley,C., Herbold, M., Myslewietz, J., Thefeld, S.,Hartmann,K., and Kraft, W. 1992. Decline in CD4+ Cell Numbers in Catswith Naturallly Acquired Feline Immunodeficiency Virus Infection. Journalof Virology. 6(3).

Hofmann-Lehmann, R., Holznagel, E., Aubert, A., Bauer-Pham, K., and Lutz, H.1995. FIV Vaccine Studies, II. Clinical Findings, Haematological Changesand Kinetics of Blood Lymphocyte Subsets. Vet. Immunol. andImmunopathol. No.46.

Hunt, R.D., Blake, B.J., Chalifoux, L.V., Sehgal, P.K., King, N.W., and Letvin,A.L.1983. Transmission of Naturally Occurring Lymphoma in MacaqueMonkeys. Proc.Natl.Acad.Sci. 80.

Kalvatchev, Z., Walder, R., Barrios, M., and Garzaro, D. 1995. Acquired ImmuneDysfunction in Rabbits Experimentally Infected with an Infectious MolecularClone of the Bovine Immunodeficiency Virus (BIV127). J.Viral Immunol.Vol.8 (3).

Kertayadnya, G., Wilcox, G.E., Soeharsono, S., Hartaningsih, N., Coelen, R.J.,Cook, R.D., Collins, M.E., and Brownlie, J. 1993. Characteristics of ARetrovirus Associated With Jembrana Disease in Bali Cattle.J.of.Gen.Virol. 74

Kertayadnya, G., Soeharsono, S., Hartaningsih, N., and Wilcox, G.E. 1997.Physicochemical Characteristics of A Virus Associated with JembranaDisease.Workshop on Jembrana Disease and the Bovine Lentivirus.Denpasar Bali.ACIAR Proceeding No.75.

Kiernan, J.A.1990. Histological & Histochemical Methods : Theory & Practice. 2nd

Ed. Pergamon Press.Miller, R.J., Cairns, J.S., Bridges, S., and Sarver, N, 2000. Human

Immunodeficiency Virus and AIDS : Insight from Animal Lentiviruses. J.ofVirol.Vol.74. No,16.

Mosmann, T. 1983. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival;Application to Proliferation and Cytotoxic Assays. J. of ImmunologicalMethods. No.65.

Pasaribu, F.H., and Mansjoer, S.S. 1993. Vaksin. Buku Bioteknologi Pertanian.Bogor : PAU Bioteknologi IPB

Patrick, M.K., Johnston, J.B., and Power, C. 2002. Lentiviral Neuropathogenesis :Comparative Neuroinvasion, Neurotrpism, Neurovirulence, and HostNeurosusceptibility. J.of Virol. 76(16).

Peyerl, F.W., Bazick, H.S., Newberg, M.H., Barouch, D.H., Sodroski, J., andLetvin, N.L. 2004. Fitness Costs Limit Viral Escape from Cytotoxic TLymphocytes at A Structurally Constrained Epitope. J. Virol. 78 (24).

Priosoeryanto, B.P. 2003. Penggunaan Teknik Biakan Sel Dalam BerbagaiPengujian Di Bidang Biomedis. Modul : Pemanfaatan Teknik KulturJaringan dan Histokimia. Pelatihan Dosen Universitas/PerguruanTinggi.Bogor 16 – 26 Juni 2003.

Sarkar, S., Kalia, V., Murphey-Corb, M., and Montelaro, R.C. 2002.Characterization of CD4+ T Helper Cell Fine Specificity to the EnvelopeGlycoproteins of Simian Immunodeficiency Virus. J.of MedicalPrimatology. 31(4-5).

Sharma, A.K., and Khuller, G.K. 2001.. Review Article DNA Vaccines : FutureStrategies and Relevance to Intracellular Pathogens. Immunology and CellBiology. Vol.79.

Wareing, S. 1996. Investigation of The Cell Mediated Immune Response toJembrana Disease Virus Proteins in Cattle. In. Wilcox, G.E., Soeharsono, S.,Dharma, D.M.N., Copland, J.W. Editors. Jembrana Disease and BovineLentiviruses. ACIAR Proceedings No.75.

Wilcox, G.E. 2001. The Development of A Vaccine and Improved Diagnostics forJembrana Disease in Cattle. Naskah Lengkap Seminar Nasional PenyakitJembrana : Tiga Puluh Tahun Menaklukan Penyakit Jembrana. BPPV VIDenpasar 9 Oktober 2001.

Lampiran

1. Anova Respon Kekebalan Seluler Pemberian Vaksin Kultur dan Vaksin Limpa

JumlahKuadrat

DerajatBebas

Kuadrat Rata-rata F Signifikansi.

Antara Kelompok 1.177 1 1.177 7.851 .007Dalam Kelompok 9.296 62 .150Total 10.473 63

2. Anova Respon Kekebalan Seluler Antar Mitogen

Jumlahkuadrat

derajatbebas

Kuadrat rata-rata F Sig.

Antara kelompok 1.415 3 .472 3.124 .032Dalam Kelompok 9.058 60 .151Total 10.473 63

MTT

3. Uji Duncan Antara Mitogen

MITOGEN N

Subset for alpha = .05

1 2tanpa mitogen 16 .4200protein capsid (ca) 16 .5856 .5856protein JDV 16 .6812 .6812Lektin Con A 16 .8294Sig. .076 .098

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.a Uses Harmonic Mean Sample Size = 16.000.